Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 AISLAN SENA STIVAL.pdf: 587198 bytes, checksum: e198d94f5ca28a047840fd9b7bf9147c (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Introduction: Today, Brazil has the second position among the countries with more richness of reptiles in their territory. The Bothrops moojeni is a poisonous snake found abundantly in the Midwest region of Brazil. Neurotoxins are complex mixtures containing neurotoxins, cytotoxins, myotoxins, proteases and nucleases. The venom of Bothrops moojeni and composed a great number of bioactive components that may eventually be a potential therapeutic use in scientific research focused on health. Objectives: The objective of this project was to evaluate the activity of noncytotoxic venom Bothrops moojeni in peripheral blood mononuclear cells (CMN). Methodology: In this work were obtained CMN donations from healthy individuals, MNCs were separated in the density gradient. After activation of CMN with phytohemagglutinin (PHA) and interleukin (IL2) was added different concentrations of cobra venom B. moojeni to evaluate its activity is not cytotoxic. Results: The levels of 0.5 and 0.05 mg / mL crude venom of Bothrops moojeni showed no cytotoxic activity on human peripheral blood CMN. Conclusion: The crude venom of Bothrops moojeni by not showing cytotoxicity at levels of 0.5 and 0.05 mg / mL, is potentially useful for evaluating potential therapeutic effects on these cells infected with microorganisms such as HIV - 1. / Introdução: O Brasil possui hoje a segunda colocação dentre os países com maior riqueza de répteis em seu território. A Bothrops moojeni é uma serpente venenosa encontrada abundantemente na região Centro Oeste do Brasil. O veneno das serpentes são misturas complexas contendo neurotoxinas, citotoxinas, miotoxinas, proteases e nucleases. O veneno da Bothrops moojeni e composto de um grande numero componentes bioativos que poderá ser no futuro um potencial uso terapêutico nas pesquisas científicas voltadas para a área da saúde. Objetivos: O objetivo deste projeto foi o de avaliar a atividade não citotóxica do veneno bruto Bothrops moojeni em células mononucleares de sangue periférico (CMN). Metodologia: Neste trabalho foram obtidas CMN de doações de pessoas sadias, as CMN foram separadas em meio de gradiente de densidade. Após ativação das CMN com fitohemaglutinina (PHA) e interleucina (IL2) foram adicionadas diferentes concentrações do veneno da cobra Bothrops moojeni para avaliar sua atividade não citotóxica. Resultados: As concentrações 0,5 e 0,05 μg/mL do veneno bruto da serpente Bothrops moojeni não apresentou atividade citotóxica sobre CMN do sangue periférico humano. Conclusão: O veneno bruto da serpente Bothrops moojeni por não apresentar citotoxicidade nas concentrações 0,5 e 0,05 μg/mL, é potencialmente útil para verificar possível efeito terapêutico sobre estas células infectadas por microorganismos como por exemplo o HIV - 1.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:56:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MARAISA DELMUT BORGES.pdf: 2802865 bytes, checksum: 16472cb529ca2063653b711ead77427b (MD5) Previous issue date: 2011-08-12 / INTRODUCTION: The snake bites caused by Bothrops snakes constitute a major public health problem in tropical regions around the world. Research is being developed with the goal of finding therapies and substances that can be used to decrease local reaction caused by the snake bite, among them is the use of medicinal plants such as Cassia occidentalis. OBJECTIVES: Evaluate the healing activity of ethanolic extracts of roots and leaves of Cassia occidentalis in skin wounds in mice induced by the venom of Bothrops moojeni. METHODS: The hydroalcoholic extract was obtained by the method of percolation. The extracts of leaves and root of C. occidentalis a occidentalis at 10% were incorporated in Lanette cream. The study used 36 female Swiss albino mice, 60 days old, divided randomly into two groups (n = 18) and subdivided into three subgroups (n = 6). For the wound induction, the animals were anesthetized the dorsal-cervical region was shaved and intradermal inoculation was made with 4 mg of the venom of Bothrops moojeni diluted in saline in order to cause local necrosis.RESULTS: The leaves extract of C. occidentalis at 10% cream Lanette stimulated angiogenesis in wounds at the 7th and 14th day after the inoculation of the venom of Bothrops moojeni. CONCLUSIONS: The leaf extract of Cassia occidentalis at 10% cream Lanette, had a positive effect on healing, that justifies the use of this plant in the treatment of snakebites wounds. / INTRODUÇÃO:Os acidentes ofídicos provocados por serpentes do gênero Bothrops constituem importante problema de Saúde Pública em regiões tropicais de todo o mundo. Pesquisas estão sendo desenvolvidas com o objetivo de diminuir a reação local provocada pelo envenenamento botrópico, com o uso de várias substâncias e terapias e entre elas, o uso de plantas medicinais, como a Cassia occidentalis usada popularmente para picada de cobra.OBJETIVOS:Avaliar a atividade cicatrizante dos extratos etanólicos da raiz e das folhas da Cassia occidentalis em feridas cutâneas em camundongos induzidas pelo veneno da Bothrops moojeni.METODOLOGIA:O extrato hidroalcoólico foi obtido através do método de percolação,10% dos extratos de folhas e raiz da C. occidentalis foram incorporados em creme Lanette. Foram utilizados 36 camundongos albinos Swiss, fêmeas, com 60 dias de idade, peso entre 20 a 40 g. Os animais (n=36) foram pesados e divididos de forma aleatória, em dois grupos (n=18) e subdivididos em três subgrupos (n=6), Para a indução da ferida, os animais foram anestesiados, por via muscular, com uma associação de cloridrato de cetamina e cloridrato de xilazina nas doses de 70 mg Kg-1 e 10 mg Kg-1, respectivamente. Após a tricotomia da região dorsocervical, foram inoculados intradermicamente com 4 µg da peçonha da B. moojeni diluída em salina, a fim de se provocar uma necrose local.RESULTADOS:O extrato das folhas da C. occidentalis a 10% em creme Lanette estimulou a angiogênese em feridas na derme de camundongos no 7º e 14º dias após a inoculação do veneno da B. moojeni.CONCLUSÕES:Dessa forma, a atividade angiogênica do extrato da folha da Cassia occidentalis evidenciada pode justificar os achados observados na macroscopia, onde foi evidenciada melhor resolução do processo cicatricial.

A variabilidade na composição e nas atividades biológicas dos venenos de serpentes vem sendo documentada por diversos autores e pode ser observada em diversos níveis. As diferenças na composição dos venenos apresentam relevância na terapêutica dos envenenamentos ofídicos, tornando o estudo da variação dos venenos de extrema importância para a confecção de antivenenos mais específicos e de maior eficácia nos tratamentos de envenenamentos ofídicos em humanos. Os estudos das variações do veneno de serpentes em populações isoladas são raros, sendo no Brasil os casos mais conhecidos os da Bothrops insularis e Bothrops alcatraz. Diversos estudos sugerem que as oscilações do nível marinho, ocorridas há 11.000 anos, teriam isolado populações de serpentes nas ilhas recentemente formadas, resultando em duas diferentes rotas evolutivas que deram origem a estas espécies. Tendo em vista que a formação da Ilha de São Sebastião-SP ocorreu no mesmo período, isolando populações de animais ali existentes, nos propusemos a avaliar a variação nas atividades do veneno de 80 exemplares de serpentes Bothrops jararaca provenientes da ilha e da sua área de distribuição continental, comparando-as com o Veneno Referência Nacional, para as atividades proteolítica sobre caseína, fosfolipásica indireta, hemorrágica e amidolítica, assim como de seus perfis eletroforéticos (SDS-PAGE) e seu reconhecimento pelo soro antibotrópico comercial através da técnica de Western Blot. A análise eletroforética (SDS-PAGE 12,5%) através de densitometria óptica evidenciou, em sua maioria bandas protéicas de baixo peso molecular e a presença de duas áreas majoritárias com grande variação no número, disposição e intensidade das bandas nas faixas de pesos moleculares de 45 kDa e 25 kDa. A variação da disposição das bandas apresentadas nos géis correlacionou-se com a variação nas atividades. Amostras que apresentaram baixa atividade fosfolipásica foram exatamente aquelas que apresentaram poucas e tênues bandas com aproximadamente 14 kDa. A análise das atividades proteolítica sobre caseína, fosfolipásica e esterásica apresentou um padrão de similaridade que nos permitiu estabelecer duas grandes subpopulações de venenos; uma ao norte da distribuição geográfica amostrada, apresentando altas atividades proteolítica sobre caseína, fosfolipásica e amidolítica e outra ao sul apresentando menores valores para tais variedades. Não foi possível estabelecer uma relação direta entre o padrão de distribuição geográfica com a variação nas atividades hemorrágicas dos venenos amostrados. A técnica de Western Blot permitiu concluir que o soro antibotrópico comercial não apresenta um bom reconhecimento para proteínas de baixo peso molecular. A análise das atividades dos venenos dos exemplares insulares apresentou similaridade com as atividades das amostras de veneno de serpentes coletadas próximas à ilha, sugerindo que o intercâmbio gênico não tenha sido de todo interrompido, provavelmente devido à sua proximidade para com o continente. / The variability in composition and biological activities of snake venoms has been documented by several authors and can be observed in different levels. The study of the differences in venom composition is relevant for the therapeutic of snake envenoming, enabling the confection of more specific sera for the treatment of humans. The studies of snake venom variations in isolated population are scarce, and in Brazil, such studies concern mostly Bothrops Alcatraz and Bothrops insularis. Several studies suggest that the oscillations of the sea level which occurred 11,000 years ago might have isolated snake populations on the recently formed islands, resulting in two different evolutive routes which originated these species. Considering that the formation of Island of São Sebastião occurred within the same period, we decided to investigate the variability of 80 individual venom samples collected from specimens from the island and the continent, comparing these samples with the National Reference Venom for their caseinolytic, phospholipase, hemorrhagic and amidolytic activities, as well as electrophoretic profiles and immunoreactivity against the commercial anti-bothropic serum. Optical densitometry of the polyacrylamide gels indicated the presence of low molecular weight components and a molecular weight range with a high degree of variation of band number, migration pattern and intensity between 45 and 25 kDa. The variations in the electrophoretic profiles correlated with the differences observed in the enzymatic activities. Samples that presented low phospholipase activity also showed faint bands in the 14 kDa region. Taken together, the activities profiles enabled us to distinguish two distinct populations, one more to the north with higher activities, and another to the south with lower activities. There was no detectable correlation between geographic origin of the venom and hemorrhagic activity. By western blot we were able to observe the commercial antiserum fails in recognizing the low molecular weight components. These analyses showed that the insular venoms were very similar to the venoms obtained from continental areas close to the island, suggesting that the genic flow might not have been interrupted, probably due to the close vicinity of the island and the continent.

A radiação ionizante tem sido empregada com sucesso na modificação das propriedades imunológicas das biomoléculas e tem se mostrado uma potente ferramenta para destoxicar venenos de serpentes sem afetar e, muitas vezes, melhorando suas propriedades imunogênicas. Resultados promissores foram obtidos com o tratamento, tanto de veneno total quanto de frações isoladas, com a radiação gama de 60Co. No presente trabalho, foram avaliados os efeitos da Bothropstoxina-1 (Bthx-1) e do veneno total de Bothrops jararacussu sobre o sistema imune de camundongos B10.PL e BALB/c, visando caracterizar a resposta imune contra proteínas irradiadas. Modificações estruturais foram observadas por meio de técnicas eletroforéticas - SDS-PAGE. Para os ensaios imunológicos, camundongos de diferentes linhagens foram imunizados com ambas as formas da Bthx-1 e os anticorpos circulantes foram isotipados e titulados pelo método de ELISA. Os resultados mostraram que tanto o veneno total como a toxina isolada, mesmo após o processo de irradiação, se mostraram imunogênicos e os anticorpos produzidos reconheciam as formas nativas. Para a caracterização antigênica a técnica de Western Blot permitiu demonstrar que a Bthx-1 irradiada induziu à produção de anticorpos responsivos para ambas as formas da toxina isolada e do veneno total. Os resultados do ensaio de citotoxicidade mostram que a viabilidade dos macrófagos ensaiados com a Bthx-1 ou com o veneno total irradiados foi maior quando comparada com os resultados obtidos para as formas nativas. Analisando-se o resultado do ensaio de LDH, observou-se que a Bthx-1 irradiada promoveu menor dano muscular que a toxina nativa. Conclui-se que a irradiação de proteínas promove modificações estruturais significativas, mantendo, contudo, suas propriedades imunológicas originais, representando uma potencial ferramenta na melhoria do processo de imunização. / Ionizing radiation has been successfully employed to modify the immunological properties of biomolecules and has been proven to be a powerful tool to attenuate snake venoms toxicity without affecting and even increasing their immunogenic properties. Very promising results were obtained when crude animal venoms, as well as isolated toxins, were treated with 60Co gamma rays, yielding toxoids with good immunogenicity, however, little is known about the modifications that irradiated molecules undergo and even less about the immunological response that such antigens elicit. At the present work, we have evaluated the effects on immune system of B10.PL and BALB/c mice of Bothrops jararacussu crude venom and isolated bothropstoxin-1 (Bthx-1), before and after gamma radiation exposition. According to our data, irradiation process promoted structural modifications on both isolated toxin and crude venom, characterized by higher molecular weight protein (aggregates and oligomers) formation. Irradiated samples were immunogenic and the antibodies elicited by them were able to recognize the native toxin in ELISA. These results indicate that irradiation of toxic proteins can promote significant modifications in their structures, but still retain many of the original antigenic and immunological properties. Also, our data indicate that the irradiated protein induced higher titers of IgG2b, suggesting that Th1 cells were predominantly involved. Results from Western blot assay showed that antibodies raised against irradiated bothropstoxin-1 recognize both native isolated toxin or crude venom. Citotoxicity assay showed that irradiated toxin and crude venom were less toxic than their native counterpart. Thus, the viability of the macrophages cultured in the presence of irradiated Bthx-1 or crude venom was higher if compared with their native forms. LDH Assay showed that irradiated Bthx-1 promotes less muscular damage than the native form. Our data confirm a potential use of ionizing radiation for immunization process improvement.

O fibrinogênio é uma glicoproteína presente no plasma composta por duas subunidades idênticas formadas por três pares de cadeias polipeptídicas (Aα Bβ e ϒ), interligadas por pontes dissulfeto. A trombina cliva o fibrinogênio, liberando os fibrinopeptídeos A e B, formando fibrina e, conseqüentemente, o coágulo. Esse trabalho descreve a purificação e caracterização do fibrinogênio a partir do plasma da serpente Bothrops jararaca (B. jararaca). O fibrinogênio purificado foi obtido através de adsorção com cloreto de bário, precipitações com sulfato de amônio e cromatografia de gel filtração. O fibrinogênio de B. jararaca apresentou massa molecular de 370 kDa em condições não reduzidas e, em condições reduzidas, apresentou massas moleculares de 71, 60 e 55 kDa, similares às cadeias Aα Bβ e ϒ dos fibrinogênio humano e bovino (64, 56 e 47 kDa, respectivamente). Através do seqüenciamento da região amino-terminal das cadeias polipeptídicas por degradação de Edman, foram obtidos os oito primeiros aminoácidos de cada cadeia do fibrinogênio de B. jararaca. As seqüências foram: Gly-Asp-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-Gly para a cadeia Aα, Gly-Ser-Asp-His-Asp-Asp-Glu para a cadeia Bβ e Glu-Ser-X-Leu-Asp-Glu-Glu-Gly para a cadeia ϒ . As seqüências foram então comparadas com a de outros animais já descritos (NCBI-National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov), mas devido ao pequeno número de aminoácidos obtidos não foi possível observar similaridades. Através de espectrometria de massa (MALDI-TOF) foram observadas algumas seqüências peptídicas, mas não foi possível obter a seqüência completa do fibrinogênio de B. jararaca. Essas seqüências não apresentaram homologia significante com outras seqüências já descritas. O fibrinogênio de B. jararaca foi coagulado pela trombina bovina enquanto que os venenos das serpentes B. jararaca, Crotalus durissus terrificus e Lachesis muta rhombeata não foram capazes de induzir a formação de coágulo. Além disso, os anticorpos anti-fibrinogênio de B. jararaca produzidos em coelho não reconheceram o fibrinogênio humano. Contudo, os anticorpos anti-fibrinogênio humano reconheceram o fibrinogênio de B. jararaca. Assim, mesmo apresentando similaridades entre os fibrinogênios de B. jararaca e de mamíferos, eles possuem comportamentos distintos, podendo sugerir que a B. jararaca apresenta uma molécula de fibrinogênio diferente do humano para evitar um possível auto-envenenamento. / Fibrinogen is a plasma glycoprotein that is composed of two sets of three nonidentical polypeptide chains (Aα Bβ and ϒ ) which are covalently linked by disulfide bonds. Thrombin cleaves fibrinogen to form fibrin and, consequently, the fibrin clot. This work describes the purification and characterization of fibrinogen from Bothrops jararaca (B. jararaca) snake plasma. Purified fibrinogen was obtained by barium chloride adsorption, ammonium sulfate precipitation and gel filtration chromatography. B. jararaca fibrinogen showed a molecular mass of 370 kDa in non-reducing conditions, similar to human and bovine fibrinogen with 340 kDa. Reduced fibrinogen showed three chains of 71, 60 and 55 kDa, which are similar to the molecular masses of human and bovine Aα Bβ and ϒ fibrinogen chains (64, 56 and 47 kDa, respectively). B. jararaca fibrinogen was clotted by bovine thrombin, however, B. jararaca, Crotalus durissus terrificus and Lachesis muta rhombeata venoms were not able to induce fibrin formation. The N-terminal sequence of B. jararaca fibrinogen chains from PVDF membranes showed only the first eight amino acids residues from each chain. The Nterminal sequence was Gly-Asp-Pro-Glu-Asp-Tyr-Leu-Gly for Aα chain, Gly-Ser-Asp- His-Asp-Asp-Glu for Bβ chain, and Glu-Ser-X-Leu-Asp-Glu-Glu-Gly for ϒ chain. The B. jararaca fibrinogen chains N-terminal sequences were compared to other animal Nterminal sequences previously described. However, due to low signal detection during Edman degradation, the sequence results were not sufficient to provide an accurate Blast search identity (NCBI-National Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nih.gov). Mass spectrometry (MALDI-TOF) analysis provides some peptide sequences that did not present the complete sequences. Besides, anti-B. jararaca fibrinogen produced in rabbit did not recognize human fibrinogen while anti-human fibrinogen recognized B. jararaca fibrinogen. Thus, despite B. jararaca fibrinogen presents a molecular mass similar to human fibrinogen, the former shows distinctive features, which protect B. jararaca snakes from a fortuitous ingress of snake venom proteins into snake circulation, which could cause a self-envenomation

A finalidade desse trabalho foi a análise de aspectos estruturais e biológicos de uma lectina do veneno de B. atrox, denominada galatrox. A purificação da galatrox envolveu dois passos cromatográficos, sendo o primeiro por afinidade em coluna de agarose-lactose e o segundo referente a aplicação do material retido no gel de agarose-lactose (LacR), em coluna de Sephadex G-25. As etapas de purificação foram monitoradas por leitura de absorbância em 280nm e SDS-PAGE. Preparações de galatrox foram submetidas à digestão in situ com tripsina e a massa molecular e o sequenciamento dos peptídeos obtidos foram determinados por espectrometria de massa (MALDI-TOF-MS e ESI-CID-MS/MS). A seqüência N-terminal de aminoácidos da galatrox foi obtida pela reação automatizada de Edman (PROCISE-419®). A atividade lectínica dessa proteína foi caracterizada por meio de testes de aglutinação de eritrócitos humanos, na presença ou ausência de diferentes carboidratos como lactose (4mM) e galactose (20mM), EDTA (5mM) e aquecimento (100ºC/10min). A desgranulação mastocitária foi determinada pela liberação de -Hexosaminidase por células RBL-2H3 sensibilizadas com IgE anti-DNP(dinitrofenil) e estimuladas com galatrox, veneno bruto, fração não retida na coluna de agarose-lactose (Lac-nR), HSA-DNP (controle positivo) ou PBS (controle negativo). O nível de indução de apoptpse e/ou necrose de células RBL-2H3 tratadas com galatrox foi avaliado pela marcação com anexina V-FITC e/ou iodeto de propídeo e analisado por citometria de fluxo (FACScanto®) com o auxílio do software (CBA-DIVA®). A camptotecina foi utilizada como referência de apoptose/necrose. A atividade edematogênica foi testada em camundongos pela injeção intraplantar de galatrox; fração Lac-nR, veneno bruto e PBS. Análise por SDS-PAGE indicou que as preparações de galatrox eram homogêneas e continham bandas de 14.000 e 28.000 de massa molecular relativa em condições redutoras ou não, respectivamente. A seqüência N-terminal foi correspondente aos seguintes aminoácidos: NNXPQDWLPMNGLXYKIFD, e a seqüência de alguns aminoácidos internos corresponderam a KDFSWEWTDR e GHSEVWLGLWDK. A atividade hemaglutinante dessa lectina foi dose-dependente e inibida por EDTA (5mM), aquecimento (100ºC/10min) e lactose (32mM, 16mM, 8mM, 4mM, 2mM, 1mM, 0,5mM). Ao contrário do veneno bruto e da fração Lac-nR, esta lectina não foi edematogênica e nem promoveu apoptose e necrose de células RBL- 2H3. A galatrox induziu uma discreta desgranulação mastocitária em comparação com o veneno bruto e a fração Lac-nR. Com base nos dados obtidos sugere-se que a galatrox é uma lectina homodímérica com 28.000 de massa molecular relativa, ligante de -galactosídeos e que apresenta similaridade estrutural com outras lectinas tipo-C do veneno de Bothrops ssp. Além disso, a galatrox comportou-se como um fraco agente pró-inflamatório e não induziu efeitos apoptótico e necrótico significantes. Finalmente, esse trabalho poderá contribuir para o melhor entendimento do impacto biológico da presença de lectinas no veneno e nos envenenamentos, bem como na geração de novos produtos biotecnológicos. / The aim of this work was the analysis of structural and biological aspects of a B. atrox venom lectin, named galatrox. The galatrox purification involved two chromatographic steps, starting with an affinity column of Lactosyl-Sepharose followed by application of the retained material on a Lactosyl-Sepharose gel (LacR) in Sephadex G-25 column. The purification steps were monitored by absorbance at 280nm and SDSPAGE. Galatrox samples were submitted to digestion in situ with trypsin and the sequencing mass of the obtained peptides were determined by mass spectrometry (MALDI-TOF-MS and ESI-CID-MS/MS). The N-terminal sequence of amino acids from galatrox was obtained by automatized Edman degradation (PROCISE-491®). The lectin activity of this protein was characterized by human erytrocytes agglutination test in presence or absence of different carbohydrates as lactose (4mM) and galactose (20mM), EDTA (5mM) and heat. The mast cells degranulation was determined by -hexosaminidase release in RBL-2H3 cells sensibilized with anti-DNP IgE and challenged with galatrox, crude venom in a non retained fraction in Lactosyl-Sepharose (Lac-nR) , HAS-DNP (positive control) or PBS (negative control). The apoptosis and/or necrosi induced level in treated RBL- 2H3 cells with galatrox was evaluated using AnnexinV and/or Propidium iodide and analysed by flow citometry (FACSCanto®) with the help software (CBA-DIVA®). The camptotecin was used with apoptosi/necrosi reference. The edematogenic was tested in mice by the intraplantar injection of galatrox, Lac-nR fraction, crude venom and PBS. SDS-PAGE analyse indicated that the galatrox preparations were homogenous and contained a single band of 14,000 or 28,000 relative molecular weight showed in reducting or non-reducting conditions, respectively. N-terminal amino acid sequence was determined as following: NNXPQDWLPMNGLXYKIFD, and some internal amino acid sequence was obtained which correspond to KDFSWEWTDR and GHSEVWLGLWDK. The hemagglutination activity of this lectin was dose dependent and inhibited by EDTA (5mM), heating (100ºC/10min) and lactose (32mM, 16mM, 8mM, 4mM, 2mM, 1mM, 0,5mM). In the other hand, the crude venom and Lac-nR fraction, this lectin was not edematogenic nor promoted apoptosis and necrosi of RBL-2H3 cells. The galatrox induced a discret mast cells degranulation compared with crude venom and Lac-nR fraction. Based in obtained datas is suggested that galatrox is a homodimeric lectin with relative molecular mass of 28,000, -galactoside bindings and that shows structural similarity with other Ctype lectins from Bothrops ssp. venom. Even more the galatrox showed to be a weak proinflamatory agent and did not induced significant apoptotic and necrotic effect. Finally this work would contribute to better understanding of the biological impact that the lectin presence in venom and in poisonings as well in the generation of a new biotechnological products.

O gênero Bothrops apresenta ampla distribuição pelo território brasileiro, sendo a espécie B. jararaca seu representante de maior importância médica na região sudeste. Análises genéticas e filogeográficas descrevem a existência de um grupo monofilético, denominado grupo Jararaca, que inclui, além da espécie B. jararaca, as espécies insulares B. alcatraz e B. insularis. A proximidade evolutiva entre estas espécies, cujo desenvolvimento se iniciou no Pleistoceno, e suas diferenças quanto à dieta, levantam subsídios para o entendimento de seus venenos e suas atividades biológicas. O objetivo deste estudo foi a caracterização dos componentes do veneno de B. alcatraz por diferentes metodologias analíticas com a finalidade de aprofundar o conhecimento sobre os venenos do gênero Bothrops e sobre a evolução dos venenos das espécies do grupo Jararaca. As abordagens analíticas utilizadas foram a avaliação do proteoma dos venenos do grupo Jararaca por eletroforese e identificação de proteínas por digestão com tripsina e análise por cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas (LC-MS/MS), análise do N-terminoma e do peptidoma do veneno de B. alcatraz por LC-MS/MS e análise da glicosilação dos venenos do grupo Jararaca pelo tratamento com glicosidases, cromatografia de afinidade à lectinas (concanavalin A, ConA; wheat germ agglutinin, WGA; peanut agglutininin, PNA) e caracterização do N-glicoma por MSn. Os perfis eletroforéticos unidimensionais, obtidos com e sem redução das proteínas, mostraram que o veneno de B. alcatraz difere dos venenos de B. jararaca (adultos e filhotes) e do veneno de B. insularis (adultos). O perfil eletroforético bidimensional do veneno de B. alcatraz corroborou estas diferenças e revelou que a coleta do veneno na presença ou ausência de inibidores de proteinases tem influência no número de spots visualizados. Os resultados da análise dos proteomas dos venenos do grupo Jararaca mostraram que não há diferenças qualitativas significantes entre eles, e que os três apresentam um padrão similar de distribuição das classes de toxinas. A análise quantitativa label free dos proteomas revelou algumas diferenças, indicando que o veneno de B. alcatraz apresenta maior conteúdo de metaloproteinses e fosfolipases A2, que os venenos de B. jararaca e B. insularis. A identificação do peptidoma do veneno de B. alcatraz mostrou diversas formas de peptídeos potenciadores de bradicinina, além de produtos de degradação de diferentes classes de toxinas. A avaliação da glicosilação das proteínas dos três venenos revelou que após a remoção das cadeias de N-glicanos e O-glicanos os perfis eletroforéticos se mostram mais parecidos. A identificação das proteínas do veneno de B. alcatraz que mostraram afinidade pelas lectinas revelou que a ConA interagiu com um número maior de componentes, seguida por WGA e PNA. As análises qualitativa e quantitativa do N-glicoma dos venenos do grupo Jararaca mostrou que os três venenos compartilham as mesmas estruturas de N-glicanos e em abundância relativa similar. Em conjunto, os resultados deste estudo indicaram que no grupo Jararaca, os proteomas dos venenos das espécies B. jararaca e B. insularis apresentam similaridade entre si, e se diferem do veneno de B. alcatraz, principalmente com relação ao grau de glicosilação de suas proteínas. / The Brothrops genus is largely distributed on the Brazilian territory, and B. jararaca is the species of most medical importance in the Southeastern region. Genetic and phylogeographic analyses describe the existence of a monophyletic group, named Jararaca group, which is composed of B. jararaca and of the insular species B. alcatraz and B. insularis. The close evolutionary relationship between these species, which started in the Pleistocene era, and their diet-related differences, are important aspects for the understanding of their venoms and biological activities. The aim of this study was to characterize the venom of B. alcatraz by different analytical methodologies, in order to advance the knowledge on the venoms of Bothrops genus and on the evolution of the venoms of species of the Jararaca group. The analytical approaches used in this study included the charactrization of the proteomes of the venoms of the Jararaca group by electrophoresis and protein identification by trypsin digestion and analysis by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS), N-terminomic and peptidomic analyses of the venom of B. alcatraz by LC-MS/MS and glycosylation analyses of the venoms of the Jararaca group by treatment with glycosidases, affinity chromatography to lectins (concanavalin A, Con A; wheat germ agglutinin, WGA; peanut agglutininin, PNA) and characterization of the N-glicomes by MSn. The one-dimensional electrophoretic profiles were evaluated under reducing and non-reducing conditions and showed that the venom of B. alcatraz differs from B. jararaca (newborn and adult) and B. insularis (adult) venoms. The two-dimensional electrophoretic profile of B. alcatraz venom corroborated these differences and revealed that the milking of the venom in the presence or in the absence of proteinase inhibitors influences the number of spots visualized on the gel. The results of the analysis of venom proteomes of the Jararaca group showed no significant qualitative differences between them; moreover, the three venoms showed a similar pattern of distribution of toxins classes. However, the label free quantitative analysis of these proteomes revealed some differences, and indicated that the venom of B. alcatraz has a higher content metaloproteinses and phospholipase A2 than B. jararaca and B. insularis venoms. The identification of B. alcatraz venom peptidome showed various forms of bradykinin-potentiating peptides, as well as products of the degradation of different toxins classes. The assessment of the glycosylation level of proteins of the three venoms showed that after removal of N-glycan and O-glycan chains their electrophoretic profiles become more similar. The identification of B. alcatraz venom proteins that showed affinity for lectins indicated that ConA interacted with a larger number of components, followed by WGA and PNA. The qualitative and quantitative analysis of the N-glicome of the venoms of the Jararaca group showed that they share the same N-glycan structures, which were also found in similar relative abundance. Taken together, the results of this study indicate that in the Jararaca group, the venom proteomes of B. jararaca and B. insularis show similarity to each other and differ from the venom of B. alcatraz, especially with respect to the degree of protein glycosylation.

A jararaca-ilhoa (Bothrops insularis) é uma serpente criticamente ameaçada, endêmica da Ilha da Queimada Grande (IQG), litoral sul de São Paulo. Com a sua população em declínio, foi estabelecido um programa de reprodução em cativeiro, porém o conhecimento da sua biologia reprodutiva ainda é incipiente. Até o momento considera-se essa espécie como sazonal, com período de espermatogênese e cópulas associado, ocorrendo do outono até início da primavera, porém não existem estudos a cerca da endocrinologia reprodutiva. O objetivo desse trabalho foi validar um método de avaliação hormonal não invasiva por meio das fezes e realizar o monitoramento dos metabólitos fecais de testosterona em conjunto com avaliação plasmática de testosterona. Ao longo de 36 meses foram coletadas 156 amostras de fezes e 30 amostras de sangue de oito machos cativos. As concentrações de metabólitos fecais de testosterona variaram entre 10,9 à 249,3 ng/g de fezes, enquanto as concentrações de testosterona plasmática variaram de 0,07 à 0,30 ng/mL de plasma. Não houve diferença significativa entre as concentrações plasmáticas de testosterona e de metabólitos fecais de testosterona ao longo do ano, apesar dos machos demonstrarem comportamento reprodutivo durante esse período. Os dados corroboram com outros estudos de estocagem espermática, qualidade seminal e volume gonadal, porém vão de encontro à resultados de histologia testicular. São discutidas a possibilidade da espécie ser assazonal ou desses resultados serem uma consequência das condições do cativeiro. Esse estudo contribui com a validação de um novo método de avaliação longitudinal de esteroides sexuais em B. insularis, com o conhecimento da biologia reprodutiva de serpentes tropicais e com a conservação de animais ameaçados de extinção / The golden lancehead pitviper (Bothrops insularis) is a critically endangered snake, endemic of the Queimada Grande Island, southeastern Brazil. With its declining population, a captive breeding program was established, but the knowledge of its reproductive biology is incipient. By the time this species is considered as seasonal, with spermatogenesis period and matting associated, occurring from autumn until early spring, but there are no studies about their reproductive endocrinology. The aim of this study was to validate a noninvasively hormonal evaluation method through feces and carry out the monitoring of androgens in conjunction with plasma testosterone evaluation. Over 36 months 156 stool samples and 30 blood samples were collected from eight captive males. The fecal androgen concentrations ranged from 10.9 to 249.3 ng / g of feces and the plasma testosterone concentrations ranged from 0.07 to 0.30 ng / mL of plasma. There was no significant difference between the concentrations of fecal androgens and plasma throughout the year, although the males had shown successfully reproductive behavior during this period. The data corroborate whith other studies of sperm storage, sperm quality and gonadal volume, but disagreeded of the results of testicular histology. We discuss the possibility of the species be assazonal or these results are a consequence of the captivity conditions. This study contributes to the validation of a new longitudinal evaluation method of sex steroids in B. insularis, with the knowledge of the reproductive biology of tropical snakes and the conservation of endangered animals

A DisBa-01, uma desintegrina RGD recombinante ainda não isolada do veneno de Bothrops alternatus, exibe alta afinidade pela integrina aIIbB3, contribuindo para inibição da agregação plaquetária (RAMOS, 2005). DisBa-01 possui também atividades anti-trombótica e anti-metastática comprovadas in vivo (Ramos, 2005). A fim de obter moléculas menores mantendo as atividades da DisBa-01, dois mutantes estão em estudo. Moléculas chamadas DisBa (1-32) e DisBa (1-36) apresentam 32 e 36 resíduos a menos que a DisBa-01, respectivamente, na região N-terminal. Oligonucleotídeos foram construídos e os DNAs foram amplificados por PCR utilizando o plasmídeo pET28a-DisBa-01 como o molde. Os produtos de PCR foram clonados no vetor de expressão pET32a. Análises das seqüências revelaram que os genes e sua fase de leitura estavam completamente corretos. Os plasmídeos recombinantes foram introduzidos em linhagem de E.coli BL21 (DE3). Os plasmídeos recombinantes foram induzidos com IPTG para expressar as proteínas em fusão com a tiorredoxina. As proteínas foram expressas na forma solúvel e com massa molecular coincidente com a previsão. As proteínas de fusão foram purificadas por cromatografia de afinidade em resina de níquel e clivadas com a enzima enteroquinase. As amostras clivadas foram purificadas por cromatografia de filtração a gel. Os passos de purificação e clivagem foram analisados por SDS-PAGE e reação de immunoblotting utilizando o anticorpo anti-Echistatin. Testes de inibição da adesão celular, usando células de melanoma de camundongo B16F10 ricas em integrina avb3, mostraram que a DisBa (1-32) e a DisBa (1-36) são capazes de inibir, aproximadamente, 70% da adesão celular, um resultado semelhante ao encontrado para a molécula de DisBa-01. Portanto, as duas moléculas mutantes da DisBa-01 obtidas apresentaram atividades que podem ser exploradas no desenho de novos medicamentos contra câncer. / DisBa-01, a recombinant RGD-disintegrin still not isolated from B. alternatus venom exhibits high affinity for aIIbB3 integrin, contributing for the inhibition of platelet aggregation (Ramos, 2005). DisBa-01 possesses also antithrombotic and antimetatatic activities in vivo (Ramos, 2005). In order to obtain shorter molecules maintaining activities of DisBa-01 two mutants were studied. Molecules called DisBa (1-32) and DisBa (1-36) have 32 and 36 residues unless DisBa-01, respectively, in the N-terminal region. Oligonucleotides were constructed and the DNAs were amplified by PCR using pET28a-DisBa-01 vector as the template. PCR products were cloned into expression vector pET32a. Sequence analysis showed that reading frames were completely correct. The recombinant plasmids were introduced in BL21(DE3) E.coli strain. The recombinant plasmids were induced with IPTG to express the proteins in fusion with thioredoxin. Proteins were expressed in a soluble form and with molecular mass coincident with prediction. Fusion proteins were purified by affinity chromatography in nickel resin and cleaved with enterokinase enzyme. Samples of cleavage were purified by the gel filtration chromatography. Purification and cleavage steps were analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting reaction using anti-Echistatin antibody. Tests inhibition of cell adhesion, using cells from mice B16F10 melanoma rich in integrin avb3, showed that DisBa (1-32) and DisBa (1-36) are able to inhibit approximately 70% of cell adhesion. Therefore the two mutants molecules of the DisBa-01 obtained in this work present activities that can be explored in the design of new medicines against cancer.

Bothrops insularis é uma espécie de serpente endêmica da Ilha da Queimada Grande. Atualmente é considerada criticamente ameaçada de extinção. A espécie mais próxima filogeneticamente é a jararaca encontrada no continente (B. jararaca). Considerando a importância da alimentação e do crescimento em vários aspectos de vida das serpentes, o estudo dos diferentes tipos de presas em relação ao crescimento e maturidade sexual, é de grande importância para promover melhorias nos programas de reprodução e manejo de espécies ameaçadas mantidas em cativeiros conservacionistas. Portanto, este estudo tem como objetivo acompanhar o desenvolvimento (massa e crescimento) de B. jararaca e B. insularis até a maturidade sexual avaliando a influência de dois tipos de presas (anfíbio e mamífero). Os indivíduos foram divididos em grupos pelo tipo de presa oferecida, sexo e frequência alimentar (grupos alimentados a cada 15 e 30 dias) e alimentados com uma proporção de 30% da massa corporal de cada indivíduo. Observamos que nos primeiros seis meses de vida as serpentes exibem preferência por anfíbios. A alimentação com camundongo e a maior frequência (a cada 15 dias) proporcionou um maior crescimento comparado aos animais alimentados com rã inicialmente. Além disso, para B. insularis os animais alimentados com camundongo a cada 15 dias ficaram sexualmente maduros mais jovens e com um maior tamanho, enquanto que em B. jararaca o tipo de presa não influenciou na maturidade dos machos, porém teve influência evidente nas fêmeas. Concluímos que a dieta oferecida em cativeiro exerce influência no crescimento e no tamanho da maturidade sexual de serpentes. / Bothrops insularis is a species of serpent endemic to the Island of Queimada Grande. It is currently critically endangered. The phylogenetically closest species is the jararaca found on the continent (B. jararaca). Considering the importance of feeding and growth in various aspects of snake life, the study of different types of prey in relation to growth and sexual maturity is of great importance to promote improvements in breeding programs and management of endangered species kept in captivity conservationists. Therefore, this study aims to follow the development (mass and growth) of B. jararaca and B. insularis until sexual maturity evaluating the influence of two types of prey (amphibian and mammal). Individuals were divided into groups by type of prey offered, sex and feeding frequency (groups fed every 15 and 30 days) and fed with a proportion of 30% of the body mass of each individual. We observe that in the first six months of life the snakes exhibit preference for amphibians. Feeding with mouse and higher frequency (every 15 days) provided a higher growth compared to the animals fed with frog initially. In addition, for B. insularis, the animals fed with mouse every 15 days were sexually mature younger and with a larger size, whereas in B. jararaca the prey type did not influence the maturity of the males, however it had an evident influence on the females. We conclude that the diet offered in captivity influences the growth and size of the sexual maturity of snakes.