Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The use of herbal medicines as an alternative treatment has increased by the belief that natural products do not cause damage to health. However cases in which natural products are added of synthetic drugs not declared, presumably to enhance the effectiveness them have been reported in the literature. In the case of weight loss formulations the main adulterants found are appetite suppressants, antidepressants, benzodiazepines, diuretics and laxatives. The identification of these frauds is only possible by applying the analytical methods able to detect the presence of adulterants in the formulations. This paper describes the development of two methods employing separation techniques with electrochemical detection for the determination of diuretics and laxatives as adulterants in herbal products. The method employing capillary zone electrophoresis (CZE) with contactless conductivity detection (C4D) allows the simultaneous determination of amiloride, chlorthalidone, hydrochlorothiazide, furosemide and phenolphthalein in the following optimized conditions: working electrolyte phosphate buffer 20 mmol L-1 (pH 9.2) containing 30% methanol (v/v) separation potential -15 kV, temperature 25 °C, injection hydrodynamic by gravity in 20 cm for 60 seconds. The method employing ion pair chromatography (IPC) with pulsed amperometric detection (PAD) allows the determination of hydrochlorothiazide, chlorthalidone and furosemide on the following conditions: mobile phase phosphate buffer 5 mmol L-1 (pH 4.5) containing SDS 0.3 mmol L-1 and 50% methanol (v/v), sample potential of +0.8 V, the cleaning potential of -0.2 V and +1.0 V, and flow rate of 1.0 mL/min. Both methods were validated in the parameters of linearity, limit of detection limit of quantification, precision, accuracy and selectivity, and were applied in the analysis of 26 samples of natural weight loss products purchased from pharmacies in nine Brazilian states. In three of 26 samples were identified the presence of illegal diuretic hydrochlorothiazide in concentrations ranging from 0.6 to 7.0 mg/capsule. In addition, five other samples called naturals contained declared on the label of the packaging the presence of synthetic diuretics hydrochlorothiazide or furosemide. Both methods were able to identify the adulterants present in samples with high selectivity and sensitivity. Furthermore, they presented very approximate results in the concentration of adulterants found in the formulations. There is still no unified regulation established by the government for control of herbal products. Each country has its laws, but the marketing is global. Maybe this is the reason why the adulteration of natural products has been a recurring practice in various parts of the world. Therefore, effective regulation for the natural products can result in the reduction of these offenses, and punishment of offenders, thus ensuring the rights of consumers to make quality treatment, safe and effective, without prejudice to health. Keywords: Pharmaceutical formulations, adulterants, diuretics, laxatives, methods of separation, electrochemical detection. / O uso de ervas medicinais como tratamento alternativo tem crescido por se acreditar que produtos naturais não causam danos à saúde. No entanto casos de adulteração de produtos naturais com adição não declarada de fármacos sintéticos, presumidamente para aumentar a eficácia dos mesmos, têm sido relatados na literatura. No caso de formulações emagrecedoras os principais adulterantes já encontrados são anorexígenos, antidepressivos, benzodiazepínicos, diuréticos e laxantes. A identificação destas fraudes só é possível com a aplicação de metodologias analíticas capazes de detectar a presença destes adulterantes nas formulações. Este trabalho descreve o desenvolvimento de duas metodologias empregando técnicas de separação com detecção eletroquímica para a determinação de diuréticos e laxantes como adulterantes em produtos naturais. O método empregando eletroforese capilar de zona (CZE) com detecção por condutividade sem contato (C4D) permite a determinação simultânea de amilorida, clortalidona, hidroclorotiazida, furosemida e fenolftaleína nas condições otimizadas: eletrólito de trabalho tampão fosfato 20 mmol L-1 (pH 9,2) contendo metanol 30% (v/v), potencial de separação -15 Kv, temperatura 25 °C; injeção hidrodinâmica por gravidade em 20 cm durante 60 s. O método empregando cromatografia de par iônico (IPC) com detecção por amperometria pulsada (PAD) permite a determinação de hidroclorotiazida, clortalidona e furosemida nas seguintes condições: fase móvel tampão fosfato 5 mmol L-1 (pH 4,5) contendo SDS 0,3 mmol L-1 e metanol 50% (v/v); potencial de amostragem de +0,8 V; potenciais de limpeza de -0,2 V e +1,0 V; e fluxo de 1,0 mL/min. Os dois métodos foram validados nos parâmetros de linearidade, limite de detecção, limite de quantificação, precisão, exatidão e seletividade e, foram aplicados na análise de 26 amostras de produtos naturais emagrecedores adquiridos de farmácias de manipulação de nove estados brasileiros. Em três das 26 amostras foi identificada a presença ilegal do diurético hidroclorotiazida em concentrações que variaram de 0,6 a 7,0 mg/cápsula. Além disso, outras cinco amostras ditas naturais continham declarado no rótulo das embalagens a presença dos diuréticos sintéticos hidroclorotiazida ou furosemida. Os dois métodos foram capazes de identificar os adulterantes presentes nas amostras com alta seletividade e sensibilidade. Além disso, apresentaram resultados bastante aproximados com relação às concentrações encontradas dos adulterantes nas formulações. Ainda não existe uma regulamentação unificada estabelecida pelos órgãos governamentais para o controle de produtos fitoterápicos. Cada país tem a sua legislação, porém a comercialização destes produtos é globalizada. Talvez por isso a adulteração de produtos naturais vem sendo uma prática recorrente em diversas partes do mundo. Logo, uma regulamentação efetiva para os produtos de origem natural, pode resultar na redução destas infrações, ou punição dos infratores, garantindo assim os direitos dos consumidores de realizar um tratamento de qualidade, seguro e eficaz, sem prejuízo à saúde.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Mycotoxins are secondary metabolites, produced by fungi species of the genus Aspergillus, Fusarium, Penicillium and Claviceps. The high incidence of toxicity is by ingestion of contaminated plant products and by consuming products derived from food. Among the 400 different mycotoxins; there are the fumonisins, especially fumonisin B1 (FB1), which corresponds to about 70% of total fumonisins. It has been demonstrated that toxicity of this mycotoxin may be related to toxic effects on the central nervous system, engaging in inflammatory processes and seizures. The mechanism of toxicity of fumonisins is related to the metabolism of sphingolipids in which the breakdown of these sphingolipids complexes and accumulation of sphingoid bases alter important cellular functions, favoring oxidative stress, inhibition of protein secondary and excitotoxicity. Thus, this work tried to investigate whether FB1 is able to enhance the inductive effect of the model of pentylenetetrazole (PTZ) seizures. We also evaluated the mechanism of action responsible for this effect, in order to study strategies that make it possible to prevent or minimize their toxic effects. So, C57BL/6 mice were exposed to FB1 (8 mg/kg i.p.) or vehicle (1.6% DMSO + 0.9% NaCl i.p.) and elapsed 30 minutes were injected with PTZ (30 mg/kg i.p.) or vehicle (0,9% NaCl i.p.). Behind 15 minutes observation, mice were euthanized and cerebral cortex and hippocampus were collected for analysis of Na+, K+-ATPase activity, membrane potential and mitochondrial complex I and II activities. FB1 reduced latency for myoclonic jerks and increased myoclonus number. Even, Na+, K+-ATPase total activity as well as subunit �1of this enzyme were increased in cerebral cortex of animals treated with FB1, but in hippocampus it was reduced. FB1 elevated mitochondrial membrane potential in cerebral cortex however mitochondrial complex I and II activity weren t changed in both structures with this treatment. PTZ was able to enhance Na+, K+-ATPase �2/�3 subunit activity in hippocampus. Thus, we showed that FB1 induces neurotoxicity, since this mycotoxin FB1 facilitates seizures induced by PTZ, altered mitochondrial membrane potential and the enzyme Na+, K+ - ATPase activity, which are possibly mediating the mechanism of toxicity. / As micotoxinas são metabólitos secundários, produzidas por espécies de fungos dos gêneros Aspergillus, Fusarium, Claviceps e Penicillium. Geralmente as intoxicações se dão pela ingestão de produtos vegetais contaminados, bem como pelo consumo de alimentos derivados. Dentre os 400 diferentes tipos de micotoxinas, destacam-se as fumonisinas, em especial a fumonisina B1 (FB1) que corresponde a cerca de 70% das fumonisinas totais. Tem sido demonstrado que a toxicidade desta micotoxina pode estar relacionada com efeitos tóxicos no sistema nervoso central, envolvendo-se em processos inflamatórios e crises convulsivas. O mecanismo de toxicidade das fumonisinas está relacionado ao metabolismo dos esfingolipídios no qual o esgotamento desses esfingolipídios complexos e o acúmulo das bases esfingóides alteram funções celulares importantes, favorecendo estresse oxidativo, a inibição secundária de proteínas e excitotoxicidade. Deste modo, este estudo investigou se a FB1 é capaz de facilitar o efeito indutor de convulsões do modelo do pentilenotetrazol (PTZ). Avaliamos também o mecanismo de ação responsável por tal efeito, a fim de estudar estratégias que tornem possível a prevenção ou minimização dos seus efeitos tóxicos. Assim, camundongos machos C57BL/6 foram expostos a FB1 (8 mg/kg i.p.) ou veículo (1,6% DMSO + 0,9% NaCl i.p.) e após 30 minutos injetados com PTZ (30 mg/kg i.p.) ou veículo (0,9% NaCl i.p.). Após 15 minutos de observação, os camundongos foram eutanasiados e o córtex cerebral e o hipocampo foram coletados para a análise das enzimas Na+, K+-ATPase e o potencial de membrana mitocondrial e as atividades dos complexos I e II mitocondriais. A FB1 reduziu a latência para mioclonias e aumentou o número de mioclonias. Da mesma forma, a atividade total e da subunidade �1 da Na+, K+-ATPase foi aumentada no córtex cerebral de animais tratados com FB1, mas no hipocampo foi reduzida. A FB1 elevou o potencial de membrana mitocondrial no córtex cerebral, porém a atividade dos complexos I e II da cadeia respiratória não foram alteradas em ambas estruturas com este tratamento. O PTZ foi capaz de aumentar a subunidade �2/�3 da Na+, K+-ATPase no hipocampo. Assim, mostramos que a FB1 induz a neurotoxidade, pois esta micotoxina facilitou as convulsões induzidas por PTZ, alterou o potencial de membrana mitocondrial e a atividade da enzima Na+, K+-ATPase, que possivelmente estão mediando o mecanismo da toxicidade.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The Moraceae family consists of approximately 1000 species, distributed in 61 genera. Morus alba has small flowers, simple stems up to 33 feet tall and whole leaves, serrated or lobed, fruit September to November. M. alba is used in traditional medicine as hypoglycemic, antioxidant, anti-inflammatory and in the treatment of menopausal symptoms. Flavonoids such as quercetin, rutin and alkaloid 1- deoxinojirimicina were isolated and identified in their leaves. The physico-chemical quality control was performed with M. Alba s leaves collected in four seasons. The values found in the analysis of loss on drying and foreign matter are agreement with established for herbal drugs. The collection made in March had the highest content of total ash and acid insoluble and swelling index was higher in September. The dosages of polyphenols and flavonoids were higher in summer. The evaluation of anti-inflammatory activity of M. alba in induction of granulomatous tissue showed that animals treated with hydroethanolic extract presented 20.24 ± 6.94% inhibition of the formation of granulomatous tissue while those treated with nimesulide has 21.42 ± 6.52%, confirming significant anti-inflammatory activity. The dosages of AST, ALT and creatinine were performed with the same animals, demonstrating absence of toxicity in liver and kidney. In determining the in vitro antimicrobial activity, the fractions ethyl acetate and chloroform showed the best responses front of Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus fumigatus, Prothoteca zophii and Candida albicans. The cytotoxicity of the hydroethanolic extract by cell cultures of Chinese hamster ovary (CHO) and cells of connective tissue of mouse (NCTC) clone 929 showed, respectively, IC50 of 0.34 mg/mL and 3.24 mg/mL. / A família Moraceae compreende aproximadamente 1000 espécies, distribuídas em 61 gêneros. Morus alba possui flores pequenas, caule simples com até 10 metros de altura e folhas inteiras, serreadas ou lobadas, frutifica de setembro a novembro. M. alba é utilizada na medicina tradicional como hipoglicemiante, antioxidante, anti-inflamatória e no tratamento dos sintomas da menopausa. Flavonóides como quercetina, rutina e o alcalóide 1-deoxinojirimicina foram isolados e identificados nas suas folhas. O controle de qualidade físico-químico foi realizado com folhas de M. alba coletadas nas quatro estações. Os valores encontrados nas análises de perda por dessecação e matéria estranha estão de acordo com os estabelecidos para drogas vegetais. A coleta realizada em março apresentou o maior conteúdo de cinzas totais e insolúveis em ácido e o índice de intumescência foi mais elevado em setembro. As dosagens de polifenóis e flavonóides foram mais elevadas no verão. A avaliação da atividade anti-inflamatória de M. alba em modelo de indução de tecido granulomatoso demonstrou que os animais tratados com o extrato hidroetanólico apresentaram 20,24 ± 6,94% de inibição da formação de tecido granulomatoso enquanto que os tratados com nimesulida apresentaram 21,42 ± 6,52%, confirmando significativa atividade anti-inflamatória. As dosagens de AST, ALT e creatinina foram realizadas com os mesmos animais, demonstrando ausência de indícios de toxicidade hepática e renal. Na determinação da atividade antimicrobiana in vitro, as frações acetato de etila e clorofórmio apresentaram as melhores atividades frente à Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Aspergillus fumigatus, Prothoteca zophii e Candida albicans. A citotoxicidade do extrato hidroetanólico por culturas de células de ovário de hamster chinês (CHO) e células do tecido conectivo de camundongo (NCTC) clone 929 apresentaram, respectivamente, IC50 de 0,34 mg/mL e 3,24 mg/mL, demonstrando ação citotóxica in vitro.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Neuroinflammation is a neuropathological finding in a number of neurodegenerative diseases. Intraperitoneal injection of lipopolysaccharide (LPS) induces neuroinflammation and memory deficit. Spermine and spermidine are endogenous polyamines that physiologically modulate the N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor in mammals by binding to the polyamine-binding site at the NMDA receptor. Since polyamines improve memory in cognitive tasks, we tested whether the post-training administration of spermine reverses the deficits of memory induced by LPS in the object recognition task in mice. While spermine (1 mg/kg, i.p.) increased, ifenprodil (10 mg/kg, i.p.), a noncompetitive GluN2B-containing NMDA receptor antagonist, decreased the discrimination score on novel object recognition task. Spermine, at dose that did not alter memory (0.3 mg/kg, i.p.), reversed the cognitive impairment induced by LPS (250 μg/kg, i.p.). Ifenprodil (0.3 mg/kg, i.p.) reversed the protective effect of spermine against LPS-induced memory deficits in the novel object recognition task. However, spermine failed to reverse the LPS-induced increased of cortical and hippocampal cytokines levels. The results indicate that spermine protects from LPS-induced memory deficits in mice by mechanisms other than decreasing LPS-induced cytokine production. / A inflamação periférica desencadeia a produção central de citocinas inflamatórias, gerando um quadro de neuroinflamação. Essa condição altera as transmissões no receptor N-Metil-D-Aspartato (NMDA) o que prejudica a memória e a plasticidade sináptica. A injeção de Lipopolissacarídeo (LPS) induz a neuroinflamação e prejudica a memória. A espermina e a espermidina são poliaminas endógenas que modulam fisiologicamente o receptor NMDA em mamíferos. Uma vez que as poliaminas melhoram a memória em tarefas cognitivas, investigamos se a administração pós-treino de espermina reverte o prejuízo de memória induzido por LPS sistêmico na tarefa de reconhecimento de objetos em camundongos. Enquanto a espermina (1 mg/kg, ip) aumentou, o ifenprodil (10 mg/kg, ip), antagonista não competitivo do receptor NMDA contendo GluN2B, diminuiu a discriminação na tarefa de reconhecimento de objetos. A espermina, em doses que não alteram a memória (0,3 mg/kg, ip), reverteu o dano cognitivo induzido por LPS (250 μg/kg, ip). O ifenprodil (0,3 mg/kg, ip) impediu o efeito protetor da espermina contra o prejuízo de memória induzido por LPS na tarefa de reconhecimento de objetos. No entanto, a espermina não reverteu o aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias induzido por LPS no hipocampo e córtex cerebral. Os resultados do presente estudo indicam que a espermina protege a piora da memória induzida por LPS em camundongos. O mecanismo desta proteção envolve o sítio de ligação das poliaminas no receptor NMDA, e não envolve mecanismos anti-inflamatórios.

Desonide is a nonfluorinated corticosteroid with glucorticoid activity. It is used topically in the treatment of atopic dermatitis, inflammation, pruritus and seborrheic dermatitis of mild to moderate severity. In Brazil, this drug is available as ointment, cream, lotion, hair lotion and cream gel. Until now, there are no official methods focused in the quality control of desonide raw material or its pharmaceutical forms. In this work, methods were developed and validated by high performance liquid chromatography (HPLC) for quantitation of desonide in lotion and cream gel. Furthermore, photostability studies of these formulations were conducted. The HPLC methods were validated by parameters of linearity, precision, accuracy, robustness and specificity, which results showed that both methods are stability-indicating. Chemometric tools were used to study the robustness of the proposed methods (desonide lotion and cream gel) and also for the optimization of chromatographic conditions (cream gel). Photostability studies were conducted with an equivalent procedure, by exposure to UVA radiation (352 nm) portions of the samples for a period of 48 h. The results showed that both formulations undergo photodegradation, and the lotion exhibits a degradation rate greater than the cream gel (t90% 1.58 h for the lotion and 3.65 h for the gel). The study of the kinetics of the reactions indicated that lotion follows second-order kinetics, while the cream gel follows first order kinetics. / A desonida é um corticosteroide não fluorado com atividade glicocorticoide usada topicamente no tratamento de dermatite atópica, doenças inflamatórias e pruriginosas e dermatite seborreica de intensidade leve a moderada. No mercado brasileiro estão disponíveis as formas farmacêuticas pomada, creme, loção cremosa, gel creme e loção capilar. Até o momento, não constam monografias da desonida em compêndios oficiais, tanto para o controle de qualidade da matéria-prima, quanto das formas farmacêuticas. No presente trabalho, foram desenvolvidos e validados métodos por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) para quantificação da desonida em loção cremosa e gel creme, e foram realizados estudos de fotoestabilidade dessas formulações. Os métodos por CLAE para ambas as formulações foram validados frente aos parâmetros de linearidade, precisão, exatidão, robustez e especificidade, cujos resultados indicaram que ambos os métodos são indicativos de estabilidade. Ferramentas quimiométricas foram usadas para o estudo da robustez dos métodos propostos (loção e gel creme), bem como na etapa de otimização das condições cromatográficas (gel creme). Os estudos de fotoestabilidade para ambas as amostras foram conduzidos de maneira equivalente, através de exposição à radiação UVA (352 nm) de porções da amostra, por até 48h, e demonstraram que as duas formulações analisadas sofrem fotodegradação, sendo que a velocidade de degradação da loção é maior do que a observada para o gel creme (t90% de 1,58 h para a loção e de 3,65 h para o gel). O estudo da cinética das reações indicou que a loção cremosa segue cinética de segunda ordem, enquanto o gel creme segue cinética de primeira ordem.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The reactivation of a memory results in its destabilization, requiring a process of memory reconsolidation to maintain it. Spermidine is an endogenous aliphatic amine with polycationic structure that modulates N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor activity and improves memory. Recent evidence suggests that systemic administration of spermidine improves the reconsolidation of fear memory. Here we determined whether the calcium-dependent protein kinase (PKC) signaling pathway is involved in the improvement of fear memory reconsolidation induced by intrahippocampal (ih) administration of spermidine in rats. Male Wistar rats were trained in a fear conditioning apparatus using a 0.4 mA footshock as unconditioned stimulus. Twenty-four hours after training, animals were re-exposed to the apparatus in the absence of shock (reactivation session). Immediately after the reactivation session, spermidine (2-200 ρmol/site); the PKC inhibitor, 3-[1- (dimethylaminopropyl)indol-3-yl]-4-(indol-3-yl) maleimide hydrochloride (GF 109203X, 0.3 - 30 ρg/site); the antagonist of the polyamine-binding site at the NMDA receptor, arcaine (0.2 - 200 ρmol/site) or the PKC activator, phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA, 0.02 - 2 nmol/site) were injected intra-hipocampally (i.h.). Testing was carried out in the same apparatus, twenty-four hours after reactivation. Freezing scores at testing were considered a measure of memory. While the post-reactivation administration of spermidine (20 and 200 ρmol/site) improved, GF 109203X (1, 10 and 30 ρg/site) impaired memory reconsolidation. GF 109203X (0.3 ρg/site) prevented spermidine (200 ρmol/site)-induced improvement of memory reconsolidation. The post-reactivation administration of arcaine (200 pmol/site) impaired and PMA (2 nmol/site) improved memory reconsolidation. PMA (0.2 nmol/site) prevented arcaine (200 ρmol/site)-induced impairment of memory reconsolidation. The protein synthesis inhibitor anisomycin (2 μg/site) prevented spermidine (200 ρmol/site)-induced improvement of memory reconsolidation. These drugs had no effect on memory if they were administered in the absence of reactivation. These results suggest that the enhancement of memory reconsolidation induced by the administration of spermidine involves PKC activation. / A reativação de uma memória resulta na sua desestabilização, que exigem um processo de reconsolidação de memória para mantê-la. A espermidina é uma amina alifática endógena com estrutura policatiônica que modula a atividade do receptor Nmetil- D-aspartato (NMDA) e melhora a memória. Evidências recentes sugerem que a administração sistêmica de espermidina melhora a reconsolidação da memória de medo. No entanto não se sabe se a administração intra hipocampal de espermidina melhora a reconsolidação da memória e nem se a proteína cinase dependente de cálcio (PKC) e síntese proteica estão envolvidas neste efeito. Portanto, no presente estudo verificou-se o envolvimento da PKC e da síntese proteica na melhora da reconsolidação da memória do medo induzida pela administração intrahipocampal (ih) de espermidina em ratos. Ratos Wistar machos foram treinados na tarefa de medo condicionado contextual utilizando-se choque de 0,4 mA como estímulo incondicionado. Vinte e quatro horas após o treino, os animais foram re-expostos ao aparelho na ausência de choque (sessão reativação). Imediatamente após a sessão de reativação foram administradas, por via ih, espermidina (2-200 ρmol/sítio); o inibidor da PKC, 3- [1- (dimetilaminopropil) indol-3-il] -4- (indol-3-il) maleimida (GF 109203X, 0,3-30 ρg/sítio); o antagonista do sítio de ligação das poliaminas no receptor de NMDA, arcaína (0,2-200 ρmol/sítio) ou o ativador de PKC, 12-miristato 13-acetato de forbol (PMA, 0,02-2 nmol/sítio). Os testes foram realizados no mesmo aparelho, 24 horas após a sessão de reativação. O tempo de imobilidade dos animais durante o teste foi considerado como medida de memória. Enquanto a administração de espermidina (20 e 200 ρmol/sítio) melhorou, GF 109203X (1, 10 e 30 ρg/sítio) prejudicou a reconsolidação da memória. O GF 109203X (0,3 ρg/sítio) preveniu a melhora da reconsolidação da memória induzida por espermidina (200 ρmol/sítio). A administração da arcaína (200 pmol/sítio) prejudicou e PMA (2 nmol/sítio) melhorou a reconsolidação da memória. O PMA (0,2 nmol/sítio) preveniu o prejuízo na reconsolidação da memória induzido por arcaína (200 ρmol/sítio). O inibidor de síntese de proteica, anisomicina (2 ug/sítio) preveniu a melhora da reconsolidação da memória induzida por espermidina (200 ρmol/sítio). Estas drogas não tiveram nenhum efeito sobre a memória quando foram administrados na ausência da sessão de reativação. Estes resultados sugerem que a melhora da reconsolidação da memória induzida pela administração ih de espermidina envolve a síntese proteica e a ativação de PKC.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fatty acids (FA) are constituents of neuronal phospholipid membranes, where they are essential for the development and functioning of the brain. During the peak of neuronal growth, occurring during the last week of gestation and lactation, there is a rapid accumulation of long-chain polyunsaturated FA (LC-PUFAs), which are synthesized from a physiologically appropriate supply of essential fatty acids (EFA) for normal fetal and neonatal development , ensuring the development of neurological functions. During the last decades, there occurred changes in dietary habits in Western countries, mainly with increased consumption of trans fatty acids (TFA) and omega-6 (n-6) at the expense of consumption of omega-3 (n-3). These changes may increase oxidative damage and alter neuronal neuroplasticity, thereby facilitating the development of neuropsychiatric diseases such as bipolar disorder (BD). Through a model of amphetamine-induced mania in rats, we evaluated comparatively the influence of daily supplementation of different fats since pre-conception until weaning of 1st and 2nd generation litters on behavioral parameters in conjunction with biochemical changes in brain regions. Three groups of female Wistar rats were supplemented (3g/kg; p.o. per day) from one week before conception through pregnancy and breast-feeding with fish oil (FO, rich in n-3 PUFA), soybean oil (SO; rich in PUFA n-6) or hydrogenated vegetable fat (HVF; rich in TFA). During weaning, pups of both sexes were kept under the original supplementation until 90 days of age. While male offspring were included in the study of the 1st generation, females were mated and maintained in the same supplementation, thus obtaining animals of the 2nd generation, which were used in the 2nd study and divided into 3 experiments. In the study of the 1st generation at 90 days of age, one half of each supplementation group was treated with a daily dose of amphetamine (AMPH 4mg/kg, ip) or saline (control) for 14 days, when they were subjected to behavioral tests and biochemical assessments in the cortex, striatum and hippocampus. HVF supplementation was associated with TFA incorporation in the three structures, increased AMPH-induced locomotor activity, and increased oxidative damage. Since FO supplementation increased DHA percentage and decreased the n6/n3 ratio in the three regions analyzed, it may have improved membrane fluidity and reduced oxidative stress in such animals. Adult male rats born from the 2nd generation were also exposed to an animal model of mania induced by amphetamine and used in two different experiments. In the first experiment, animals were evaluated for memory behavior and biochemical and molecular analysis in the hippocampus, in which these parameters were decreased by HVF supplementation and improved by FO supplementation. In the second experiment, animals were evaluated regarding hyperactivity and biochemical and molecular analyses in the cortex, where again HVF supplementation was associated with loss in some parameters. In a third experiment we evaluated the influence of trans fat supplementation in rats exposed to the same mania animal model and the response to lithium (a mood stabilizing drug) treatment in 1st and 2nd generation animals. Lithium was able to reverse all AMPH-induced effects. Taken together, our findings suggest that the increased consumption of processed foods, which are rich in trans fat, may be related to an increased incidence of neuropsychiatric conditions. Conversely, a balanced diet, which includes omega-3 sources , reduces susceptibility to developing such conditions, possibly by changing the composition of the neuronal phospholipid membrane. / Ácidos graxos (AG) são fosfolipídeos constituintes das membranas neuronais onde são fundamentais para o desenvolvimento e funcionamento do cérebro. Durante o pico do crescimento neuronal, o qual ocorre durante a última semana de gestação e período de aleitamento, há um rápido acúmulo de AG poliinsaturados de cadeia longa (AGPI-CL) para o desenvolvimento fetal e neonatal normal, garantindo o desenvolvimento de suas funções neurológicas. Durante as últimas décadas foram observadas mudanças nos hábitos alimentares, principalmente em países ocidentais, devido ao aumento do consumo de AG trans e ômega-6 (n-6) em detrimento do consumo de AG ômega-3 (n-3). Estas mudanças podem favorecer o desenvolvimento de processos oxidativos e alterar a neuroplasticidade neuronal, facilitando assim o desenvolvimento de doenças neuropsiquiátricas, e dentre estas, o transtorno bipolar (TB). Através de um modelo animal de mania induzido por anfetamina, avaliamos comparativamente a influência da suplementação diária de óleos ou gordura desde o período pré-concepcional até o desmame das ninhadas em regiões cerebrais dos filhotes de 1ª e de 2ª geração. Três grupos de ratas Wistar foram suplementadas diariamente (3g/kg/v.o.) desde uma semana antes da concepção, durante a gestação e aleitamento com óleo de peixe (OP, rico em AGPI n-3); óleo de soja (rico em AGPI n-6) ou gordura vegetal hidrogenada (GVH; rica em AGT). No período de desmame, filhotes de ambos os sexos foram mantidos sob a mesma suplementação original até 90 dias de idade. Enquanto os filhotes machos foram incluídos no estudo da 1ª geração, as fêmeas foram separadas e acasaladas nas mesmas condições de suplementação já descritas, obtendo-se assim, animais adultos de 2ª geração, os quais foram incluídos no 2º estudo e divididos em 3 experimentos. No estudo de 1ª geração, aos 90 dias de idade, metade de cada suplementação foi tratada com uma dose diária de anfetamina (4mg/Kg, ip) ou solução salina (controle), durante 14 dias, quando foram submetidos aos testes comportamentais e avaliações bioquímicas no córtex, estriado e hipocampo. A suplementação com GVH favoreceu a incorporação de AGT nas três estruturas cerebrais descritas, aumentou a atividade locomotora induzida por ANF e aumentou os danos oxidativos. Já a suplementação com OP permitiu um aumento da porcentagem de DHA, diminuindo a razão AGPI n6/n3 nas três regiões avaliadas, o que pode ter contribuído para uma maior fluidez das membranas neurais e menor incidência de danos oxidativos. Ratos machos adultos da 2ª geração foram também expostos ao modelo animal de mania induzido por anfetamina, sendo porém separados em dois experimentos distintos: no primeiro experimento, além de avaliações comportamentais relacionadas à memória, marcadores do status oxidativo e análises moleculares foram feitas no hipocampo, sendo observado um prejuízo destes parâmetros no grupo suplementado com GVH, enquanto o grupo OP mostrou efeitos benéficos. No segundo experimento, além do comportamento locomotor, análises bioquímicas e moleculares foram feitas no córtex, quando novamente, a suplementação com GVH mostrou efeitos deletérios. No terceiro experimento avaliamos a influência da suplementação de gordura trans em animais de 1ª e 2ª geração sobre o mesmo modelo animal de mania e a resposta farmacológica ao carbonato de lítio (droga estabilizadora do humor), quando observamos que o lítio foi capaz de reverter todos efeitos induzidos pela ANF. Tomados em conjunto, os dados apresentados nesta tese sugerem que o consumo aumentado de alimentos industrializados, os quais são ricos em grodura trans, podem estar envolvidos no aumento da incidência de doenças neuropsiquiátricas. Contrariamente, uma alimentação balanceada, a qual inclui fontes de omega-3, reduz a suscetibilidade para o desenvolvimento de tais condições, em decorrência das possíveis alterações na composição fosfolipídica das membranas neurais.

Acute coronary syndrome (ACS) is characterized by the occurrence of a set of signs and symptoms that are related to myocardial ischemia. Unstable angina (UA) and acute myocardial infarction with ST segment elevation (AMI-SST) and without ST segment elevation (AMI-SSST) comprise this syndrome. It stands out among the diseases that affect the cardiovascular system due to its high prevalence and its impact on mortality in the general population. Its formation occurs due to rupture or erosion of atheromatous plaque, producing progressive tissue ischemia. This ischemia may progress to necrosis of the cardiomyocytes and changes could be detected by laboratory biomarkers. The gold standard biomarkers for the diagnosis of myocardial necrosis are the cardiac troponins I (cTnI) or T (cTnT), which have nearly absolute myocardial specificity and clinical sensitivity, reflecting microscopic areas of myocardial necrosis. However, markers used for the detection of myocardial ischemia during the pre-infarction are potentially the most interesting because they offer the opportunity for early intervention to prevent progression of the infarction. Thus, a biomarker to detect myocardial ischemia in the absence of necrosis would add substantially to the current clinical tools. The main objectives of this study were: (a) to evaluate the binding of albumin to nickel in patients with suspected ACS and develop a laboratory method based on this property capable of detecting cardiac ischemia, (b) develop a test protocol on the binding of albumin to nickel adapted to the automated Cobas Mira, (c) to investigate the diagnostic features of this method in the diagnosis of ACS, and (d) compare the test results of albumin binding to nickel with the albumin cobalt- binding to investigate whether the type of metal used in the test interferes with the diagnostic features of the method. Patients with myocardial ischemia showed a reduction in the capacity of binding albumin to nickel. A test, which was adapted for the automated Cobas Mira, was developed to detect this change. The binding test of albumin to nickel showed a potential role in excluding the diagnosis of AMI and was effective in the diagnosis of ACS because of its significant negative and positive predictive values, respectively. The test using nickel showed a slightly higher skill in the diagnosis of ACS than the test using cobalt. Thus, we could conclude that the type of metal (nickel or cobalt) influences the characteristics of the diagnostic test. / A síndrome coronariana aguda (SCA) caracteriza-se pela ocorrência de um conjunto de sinais e sintomas que estão relacionados à isquemia miocárdica. A angina instável (AI) e o infarto agudo do miocárdio com elevação do segmento ST (IAM-SST) e sem elevação do segmento ST (IAM-SSST) compõem esta síndrome. Destaca-se dentre as doenças que acometem o sistema cardiovascular devido a sua alta prevalência e seu impacto sobre a mortalidade na população em geral. Sua formação ocorre devido à ruptura ou erosão da placa ateromatosa, produzindo isquemia progressiva tecidual, sendo que esta isquemia pode progredir para necrose dos cardiomiócitos, podendo as alterações serem detectadas por biomarcadores laboratoriais. Os biomarcadores padrão-ouro para o diagnóstico de necrose miocárdica são as troponinas cardíacas I (cTnI) ou T (cTnT), que tem quase absolutas especificidade miocárdica e sensibilidade clínica, refletindo zonas microscópicas de necrose miocárdica. No entanto, marcadores utilizados para detecção da isquemia miocárdica na fase pré-infarto são potencialmente os mais interessantes, pois oferecem a oportunidade de intervenção precoce para impedir a progressão do infarto. Desta forma, um biomarcador que realmente detecte isquemia miocárdica na ausência de necrose acrescentaria substancialmente às atuais ferramentas clínicas. Os objetivos principais deste estudo foram: (a) avaliar a ligação da albumina ao níquel em pacientes com suspeita de SCA e desenvolver um método laboratorial baseado nesta propriedade capaz de detectar a isquemia cardíaca; (b) desenvolver um protocolo do teste de ligação da albumina ao níquel adaptado ao sistema automatizado Cobas Mira; (c) investigar as características diagnósticas deste método no diagnóstico da SCA; (d) comparar os resultados obtidos no teste de ligação da albumina ao níquel com o teste de ligação da albumina ao cobalto a fim de investigar se o tipo de metal utilizado no ensaio interfere nas características diagnósticas do método. Os pacientes com isquemia do miocárdio apresentaram uma redução na capacidade de ligação da albumina ao níquel, sendo desenvolvido um teste capaz de detectar essa alteração, o qual foi adaptado para o sistema automatizado Cobas Mira. O teste de ligação da albumina ao níquel apresentou um potencial papel na exclusão diagnóstica do IAM e foi eficaz no diagnóstico da SCA em virtude de seus significativos valores preditivos negativo e positivo, respectivamente. O ensaio utilizando o níquel demonstrou uma habilidade discretamente superior no diagnóstico da SCA, do que o ensaio que utiliza o cobalto, o que permite concluir que o tipo de metal (níquel ou cobalto) influencia nas características diagnósticas do ensaio.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The aim of this study was to obtain new fish anesthetic and sedative drugs from Brazilian medicinal plants: Ocimum gratissimum (OG), Ocimum americanum (OA) e Hyptis mutabilis (HM). Essential oils from these plants were obtained by hydrodestilation and analysed by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The chirality of one constituent of OA oil was also determined. Isolation process from essential oil of OA and HM was conduced and the isolated compounds were analyzed by spectroscopic methods. To determine the point at which anesthesia was induced and the length of the recovery period, juvenile silver catfish (Rhamdia quelen) were placed in aquaria containing essential oil or isolated compounds. The mechanism of action of the essential oil of OG and (-)-globulol was evaluated through association with diazepam (150 μM) and reversion with flumazenil (5μM). The evaluation of tolerance development was performed to OG oil using re-exposure after 30 days or at week intervals. The effects of OA oil (300 and 500 mg L-1) exposure on stress parameters (plasma cortisol, glucose and sodium levels) after handling were also assayed. The major compounds of the essential oils were eugenol (73.6%) in OG, 1,8-cineol (21% in the leaf) and linalool (20.2% in the leaf; 46.6% in the inflorescence) in OA, globulol (26.6% in the leaf) and germacrene D (15% in the inflorescence) in HM. Anesthetic effects were detected to all samples in silver catfish in concentration ranges of 30-300 mg L-1 of OG, 200- 500 mg L-1 of OA and 344 mg L-1 of HM. Fractionation of the essential oil of HM furnished (+)-1-terpinen-4-ol and (-)-globulol, which demonstrated sedative effect at 10 mg L-1. Anesthesia was obtained with 83-190 mg L-1 of (-)-globulol, but animals showed loss of mucus during induction and mortality at these concentrations. Benzodiazepinic-like action on receptor GABAA was detected to the essential oil of OG, as well as tolerance development. The same pattern could not be observed to (-)-globulol. The R-(-)-linalool detected in essential oil of OA demonstrated higher anesthetic effect in silver catfish in relation to the S- (+)-form isolated from the essential oil of Lippia alba, which was the only active against Aeromonas hydrophila in vitro. Regarding to the stress parameters, previous exposure to the essential oil of OA was able to prevent handling-induced stress. / Este trabalho visou obter anestésicos e sedativos para peixes a partir de plantas medicinais brasileiras, nomeadamente Ocimum gratissimum (OG), Ocimum americanum (OA) e Hyptis mutabilis (HM). Os óleos essenciais destas espécies foram obtidos por hidrodestilação e analisados por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). A quiralidade de um dos componentes do óleo de OA também foi determinada. Os óleos de OA e HM foram submetidos ao processo de isolamento de seus constituintes, os quais foram caracterizados por métodos espectroscópicos. A determinação do tempo de indução aos estágios de anestesia e de recuperação foi realizada em jundiás juvenis (Rhamdia quelen) por meio de banhos contendo os óleos essenciais ou constituintes isolados. Para o óleo de OG e o (-)-globulol também foram avaliados o mecanismo de ação via sítio benzodiazepínico do receptor gabaérgico por meio de associação com diazepam (150 μM) e reversão com flumazenil (5μM). O desenvolvimento de tolerância foi avaliado para o óleo de OG através de re-exposição sucessiva após 30 dias ou com intervalos semanais. Os efeitos da exposição ao óleo de OA (300 e 500 mg L-1) em parâmetros de estresse (níveis plasmáticos de cortisol, glicose e sódio) após manuseio também foram testados. Os constituintes majoritários dos óleos essenciais corresponderam ao eugenol (73,6%) em OG, 1,8-cineol (21% nas folhas) e linalol (20,2% nas folhas e 46,6% nas inflorescências) em OA, globulol (26,6% nas folhas) e germacreno D (15% nas inflorescências) em HM. Todos os óleos apresentaram atividade anestésica em jundiás juvenis em concentrações entre 30-300 mg L-1 de OG, 200-500 mg L-1 de OA e 344 mg L-1 de HM. O fracionamento do óleo essencial de HM forneceu os compostos (+)-1-terpinen-4-ol e (-)-globulol, os quais demonstraram ação sedativa em 10 mg L-1. (-)-Globulol foi capaz de induzir anestesia entre 83-190 mg L-1, contudo perda de muco e mortalidade foram observados nos peixes expostos. Ação similar aos benzodiazepínicos no receptor GABA foi detectada para o óleo de OG, inclusive no que se refere ao desenvolvimento de tolerância. Para o (-)-globulol o mesmo não pode ser observado. A avaliação da quiralidade do linalol presente no óleo de OA demonstrou a presença do isômero R-(-), o qual demonstrou maior efeito anestésico que o S-(+)-linalol isolado do óleo de Lippia alba em jundiás. Os isômeros também apresentaram diferenças em relação à ação bactericida frente a Aeromonas hydrophila, sendo apenas o S-(+)-linalol ativo. Em relação aos efeitos sobre parâmetros de estresse, a exposição prévia ao óleo essencial de OA preveniu o estresse induzido pelo manuseio.

The methylmalonic acidemia is an inborn error of metabolism (IEM) characterized by methylmalonic acid (MMA) accumulation in body fluids and tissues, causing neurological dysfunction, mitochondrial failure, oxidative stress and neuroinflammation. Although neurological evidence demonstrate that infection and/or inflammation mediators facilitate metabolic crises in patients, the involvement of neuroinflammatory processes in the neuropathology of this organic acidemia is not yet established. In this experimental study, a single intracerebroventricular dose of MMA (MMA 2.5μmol /g, 12 hs after birth; at dose that raise its concentration in blood and in the brain from affected) was administered to mice pups at postnatal day 0 (P0) to induce an acute, transient rise of MMA levels in the central nervous system (CNS). In the following days (21st 33th or 40th 52th ) animal behavior was assessed in the radial maze test and elevated plus maze. It was measured tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), DCFH, Ache activity and caspase levels in the cerebral cortex, striatum and hipoccampus from mice with 21 e 40 days of life. Behavioral tests showed that animals injected with MMA have a reduction in the working memory test, but no in the reference test. The animals did not exhibit anxiety-like behaviors. Furthermore, MMA increased levels of TNF-α, AchE activity and activation of caspases 1, 3 and 8 in the cerebral cortex, hippocampus and striatum of mice with 21 and 40 days of life. The overall results indicate that a simple administration of MMA increased pro-inflammatory markers in the structure studied, increased apoptotic markers, and coincide with the behavioral changes found in young mice. This leads to speculate that, through mechanisms not yet elucidated, the transient metabolic insult with MMA may cause a neuroinflammatory processes during critical periods of development, contributing to the progression of cognitive impairment in patients with methylmalonic acidemia. / A acidemia metilmalônica (AM) é um erro inato do metabolismo (IEM) caracterizado pelo acúmulo do ácido metilmalônico (MMA) nos fluidos corporais e tecidos, causando disfunção mitocondrial, estresse oxidativo e neuroinflamação, resultando principalmente em disfunções neurológicas. Embora, estudos sugerem que a infecção ou mediadores da inflamação facilitem as crises metabólicas nos pacientes afetados, o envolvimento de processos neuroinflamatórios na patologia dessas acidemia orgânica ainda não foi estabelecido. Neste estudo, uma dose única intracerebroventricular de MMA (MMA 2.5μmol/g; dose encontrada no cérebro e fluidos corporais de pacientes afetados) foi administrada a filhotes de camundongos logo após o nascimento (P0). Além disso, o peso dos animais foi aferido até o dia dos testes comportamentais. A partir do 21° até 33° ou 40º até 52° dias de vida, os animais foram avaliados em tarefas comportamentais como o teste de labirinto radial e em cruz elevado. Os níveis de fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α), DCFH, atividade da acetilcolinesterase (AchE) e os níveis de caspases foram determinados no córtex cerebral, estriado e hipocampo de camundongos com 21 e 40 dias de vida. Os testes do labirinto radial mostrou que os animais injetados com o MMA apresentaram um pior desempenho no teste de memória de trabalho, mas não no teste de memória de referência com 21 e 40 dias de vida. Os animais não apresentaram comportamento de ansiedade. Além disso, o MMA aumentou os níveis de TNF- α, a atividade AchE e a ativação das caspases 1, 3 e 8 no córtex cerebral, hipocampo e estriado dos camundongos com 21 e 40 dias de vida. Entretanto, a administração de MMA não causou alterações histológicas nas estruturas analisadas. Dessa forma, os resultados sugerem que uma administração única de MMA aumentou os níveis de mediadores pró-inflamatórios e a expressão de marcadores apoptóticos. Esses eventos podem estar associados com as mudanças comportamentais encontradas nos camundongos jovens. Assim, pode-se sugerir que, devido a mecanismos ainda não totalmente esclarecidos, o acúmulo de MMA durante períodos críticos de desenvolvimento pode causar processos neuroinflamatórios, que contribuem para a progressão da piora de memória nos pacientes com acidemia metilmalônica.