La détoxication est un processus biochimique présent chez tous les organismes biologiques et qui leur permet d’assurer leur survie face aux xénobiotiques provenant de leur environnement. Les glutathion transférases (GST) représentent une large famille d’enzymes participant à la phase II de détoxication en conjuguant le glutathion au composé à éliminer. Par ailleurs, certaines GST ont un rôle non catalytique et assurent la séquestration ou le transport de molécules d’un compartiment cellulaire à un autre. Alors que l’activité catalytique des GST est étudiée depuis plusieurs décades, l’identification précise des molécules physiologiques ciblées par les GST reste un défi. Chez les organismes fongiques dégradeurs de bois, certaines classes de GST se sont multipliées au niveau génomique. Cette redondance serait le reflet de la diversité des molécules chimiques libérées lors de la dégradation du bois. Dans cette thèse, des approches biochimiques et structurales ont été employées pour caractériser onze isoformes de GST du basidiomycète Trametes versicolor. De plus, une approche utilisant des librairies de molécules a permis d’identifier une famille de ligands reconnus par ces GST : les polyphénols. Les modes d’interaction de ces ligands ont été décrits précisément à partir de la résolution de nombreuses structures cristallographiques. L’identification d’un flavonoïde à partir d’un extrait de bois de merisier (Prunus avium), arbre sur lequel croît T. versicolor, a été permise par une approche de cristallographie d’affinité. Ces données suggèrent que les GST d’organismes fongiques saprotrophes pourraient prendre en charge les polyphénols libérés lors de la décomposition du bois / The ubiquitous biochemical process that enables each organism to cope with xenobiotics from its environment and thus ensures its survival is called detoxification. Glutathione transferases (GSTs) form a large family of enzymes divided into several classes. These enzymes participate in the detoxification phase II by conjugating the tripeptide glutathione to the molecule to be eliminated. Moreover, some GSTs are involved in non-catalytic processes such as sequestration or transport of molecules from one cellular compartment to another. Studies dedicated to the catalytic activity of GSTs have been ongoing for decades, yet precise identification of molecules targeted by GSTs remains challenging. In wood-decaying organisms, some of the GST classes have expanded with an increase of the number of isoforms encoded at the genomic level. This redundancy would reflect the diversity of the small molecules released upon wood enzymatic degradation. Through this thesis work, biochemical and structural approaches were used in order to characterize eleven GST isoforms from the saprotrophic fungus Trametes versicolor. In addition, the use of libraries of molecules helped in identifying polyphenols as a family of ligands that bind these GSTs. The molecular interaction modes were described precisely based on the resolution of numerous crystal structures. The identification of a flavonoid from an extract of the wild-cherry tree (Prunus avium) on which T. versicolor grows, was enabled by using an affinity crystallography approach. These data suggest that fungal GSTs could interact with plant polyphenols released during wood degradation

Les hélicases à ARN de la famille DEAH/RHA sont impliquées dans la plupart des processus essentiels à la vie tels que l'épissage, la biogenèse des ribosomes, la réplication, la transcription ou encore la détection d’ARN viraux. Ces enzymes sont capables de catalyser la dissociation de duplexes d'ARN, la réorganisation de structures secondaires ou de remodeler des complexes ARN-protéines. L'hélicase DEAH/RHA Prp43 présente la particularité d'être bifonctionnelle. Prp43 est impliquée dans l'épissage des Pré-ARNm, où elle assure le recyclage du spliceosome et du lasso, mais aussi dans la biogenèse des ribosomes où elle est impliquée dans la maturation des deux sous-unités. Prp43 est activée et régulée par cinq partenaires protéiques : Ntr1, Gno1, Pfa1, RBM5 et GPATCH2. Ces partenaires protéiques présentent tous un domaine G-patch et sont capables de stimuler les activités hélicase et ATPase de Prp43. La structure cristallographique de Prp43 en complexe avec l'ADP a été résolue au laboratoire. Cette structure a mis en évidence un mode de fixation du nucléotide inédit chez les autres hélicases, notamment au niveau de la base qui s'empile entre la phénylalanine 357 (F357) du domaine RecA2 et l'arginine 159 (R159) du domaine RecA1. Les déterminants de l'activation de Prp43 par les protéines à domaine G-patch demeurent méconnus. Dans ce travail, nous avons cherché à déterminer quel était le rôle de l’empilement de la base dans l’activation de Prp43. Nous présentons ici plusieurs structures cristallographiques de Prp43 en complexe avec tous les nucléotides diphosphates(NDP) et les désoxynucléotides triphosphates (dNDP). Ces structures ont permis de conclure qu'il y avait des différences dans l’empilement de la base selon le (d)NDP considéré. Des dosages d'activité NTPase de Prp43 avec et sans son partenaire protéique Pfa1 montrent que lorsque la base ne s'empile pas avec la F357 et la R159, l'activité de l'enzyme n'est pas correctement régulée par son partenaire protéique. Les dosages d’activité enzymatique sur les mutants ponctuels F357A et R159A révèlent que le résidu F357 permet de moduler l’activité de Prp43. Tous ces résultats nous ont permis de mettre en évidence un modèle de la régulation de Prp43 par les protéines à domaines G-patch et d'expliquer l'importance du mode de fixation de la base à l'enzyme dans cette régulation. / RNA helicases from the DEAH/RHA family are involved in most of essential processes of life such as pre-mRNA splicing, ribosome biogenesis, replication, transcription or viral RNA sensing. These enzymes are able to catalyze RNA unwinding, secondary structures reorganization or RNA-protein complexes remodeling. The DEAH/RHA helicase Prp43 is remarkable because it is bifunctional, as it is involved both in pre-mRNA splicing, where it is responsible of spliceosome and lariat recycling and in the biogenesis of the two ribosomal subunits. Prp43 is activated by five protein partners: Ntr1, Gno1, Pfa1, RBM5 and GPATCH2. These protein partners all possess a G-patch domain and are able to stimulate helicase and ATPase activity of Prp43. The structure of Prp43 in complex with ADP has been solved by X-ray crystallography. The structure reveals that the nucleotide is bound to the enzyme in a novel mode that has never been observed in other known helicase structures. The specific feature of this binding mode is the base, stacked between phenylalanine (F357) from RecA2 domain and an arginine (R159) from RecA1 domain. Features of the activation of Prp43 by G-patch proteins are unclear. In this work, we investigated the role of base stacking in the activation of Prp43. We present several structures of Prp43 bound to all the nucleotide diphosphates (NDP) and deoxynucleotide diphosphates (dNTP). These results indicate that there are differences in stacking according to the (d)NDP bound to the enzyme. NTPase activity assays revealed that when stacking is weakened, Prp43 activity cannot be properly regulated by its protein partner Pfa1. Moreover, point mutations F357A and R159A show that stacking of F357 permits to modulate Prp43 activity. All these results allow us to propose a model of NTPase activity activation of Prp43 by G-patch proteins and to highlight the importance of base stacking in this regulation.

Les rétrovirus sont un enjeu de santé publique, aussi bien humaine qu'animale. La compréhension des déterminants structuraux sous-jacents à la fonction de leurs protéines constitue une étape essentielle dans le développement de stratégies antirétrovirales efficaces.Ce manuscrit porte sur l'étude des bases structurales des mécanismes moléculaires impliqués dans les fonctions clés des rétrovirus que sont i) la régulation de l'expression des protéines de rétrovirus complexes et ii) l'assemblage des particules virales, à travers l'étude de deux protéines rétrovirales d'intérêt thérapeutique : la protéine Tax du virus T-lymphotrope humain (HTLV) et la protéine de capside du virus de l'immunodéficience féline (FIV). L'étude structurale de ces deux protéines d'intérêt et la compréhension des mécanismes moléculaires nécessaires à leurs fonctions permettraient d'ouvrir la voie à la conception de nouvelles stratégies antirétrovirales.Malgré de nombreux tests d'expression et de purification, l'étude structurale de la protéine Tax du HTLV n'a pu être réalisée, en raison de son insolubité. Cependant, ce travail doctoral a permis de résoudre, pour la première fois, la structure cristallographique de la protéine de capside entière du FIV. Bien que cette dernière adopte un repliement similaire aux autres capsides rétrovirales dont la structure est connue, elle présente également des spécificités structurales dont les conséquences fonctionnelles seront discutées / Retroviruses are a major concern of public health in humans but also in animals. A better understanding of the structural determinants underlying the functions of retroviral proteins is a crucial step for the development of efficient antiretroviral therapies.This manuscript studies the structural basis of the molecular mechanisms implicated in key functions of retroviruses such as, i) the regulation of complex retroviruses protein expression and ii) the assembly of viral particles, through the study of two retroviral proteins of therapeutic interest: the human T-lymphotropic virus (HTLV) Tax protein and the feline immunodeficiency virus (FIV) capsid protein. The functional and structural studies of these two proteins and the understanding of the molecular mechanisms required for their functions will pave the way to the conception of new antiretroviral therapeutic strategies.Despite several expression and purification assays, no structural studies could be performed for the HLTV Tax protein. However, this study allowed the resolution of the first structure for the full-length FIV capsid protein by X-ray crystallography. Although the FIV capsid protein displays a standard a-helical topology like other retroviral CAs, it also harbors original features whose functional consequences will be discussed

L'émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques constitue un problème majeur de santé publique responsable d'un nombre croissant de décès, surtout dans les hôpitaux. La résistance aux aminoglycosides est principalement due à l'expression d'enzymes capables de les modifier, comme les aminoglycosides phosphotransférases (APH).Le premier volet de ce travail de thèse vise à mieux comprendre les bases moléculaires des interactions protéine-ligands et de la catalyse enzymatique d'une de ces enzymes, l'APH(2”)-IVa. La spécificité de substrats a été caractérisée en détails pour différents aminoglycosides par des méthodes thermodynamiques, de mesures cinétiques à l'état stationnaire et transitoire, par amarrage moléculaire et cristallographie aux rayons X. La seconde partie de cette étude consiste à développer et optimiser des inhibiteurs allostériques de ces enzymes capables de restaurer l'efficacité des aminoglycosides. Pour cela, une cavité, potentiellement impliquée dans la dynamique de l'APH(2”)-IVa, a été identifiée à partir de simulations de dynamique moléculaire. Celle-ci a servi de cible pour cribler, in silico, 12 000 composés issus de la banque de données Zinc. Ainsi, 14 composés ont été testés in vitro pour leur capacité à diminuer l'activité enzymatique d'APH. Parmi ces derniers, une molécule s'est révélée être un inhibiteur non-compétitif de l'APH(2”)-IVa. Une étude des relations structure-fonction a permis de déterminer les groupements les plus favorables à l'inhibition et d'identifier un composé plus efficace. L'utilisation de ces deux molécules permet de restaurer, par exemple, la sensibilité à la sisomicine d'une souche d'E. faecium exprimant cette enzyme. Cette étude fournit des bases au développement de thérapies combinant un aminoglycoside et un inhibiteur des enzymes d'inactivation constituant une stratégie pour lutter contre la résistance aux antibiotiques dans un contexte thérapeutique. / Emergence of multi-drug resistant bacteria leads to increasing fatal issues especially in hospitals. Resistance to aminoglycoside antibiotics is mainly due to the expression of modifying enzymes, such as aminoglycoside phosphotransferases (APH). The first aim of this project was to elucidate the molecular basis of protein-ligand interactions and catalysis of one of these enzymes, the APH(2”)-IVa. Promiscuity of aminoglycoside substrates has thus been characterized in details using thermodynamics, transient and steady state kinetics, molecular docking and X-ray crystallography techniques.The second part aimed to develop and optimize allosteric inhibitors of these enzymes able to counterbalance aminoglycoside resistance. For this purpose, a small cavity, potentially involved in APH dynamics, was identified from molecular dynamic simulations. This cavity was used as a target to virtually screen 12 000 compounds of the Zinc database. The efficiency of the 14 high-ranked molecules to inhibit APH was evaluated in vitro and lead to the identification of a non-competitive inhibitor of APH(2”)-IVa. Structure-activity relationships highlighted the most favourable substituents for APH inhibition and permitted to obtain a more potent compound. The two molecules were able to restore, for example, sisomicin susceptibility of an E. faecium strain, expressing this enzyme.This study provides a basis for the development of combined chemotherapies (antibiotic with enzyme inhibitor) which may overcome antibiotic resistance in a clinical context.

Les interactions intermoléculaires au sein des êtres vivants sont complexes et permettent de véhiculer l’information nécessaire à la survie de l’organisme à un moment donné. Il arrive même que certains intervenants soient impliqués à différents stades d’un même processus. Parmi les très nombreux processus biologiques présents au sein des cellules, la biogénèse des centres fer-soufre apparaît être très complexe. Cette complexité est probablement reliée à la toxicité cellulaire du fer libre et du soufre libre. Ainsi les différentes étapes de la création des centres fer-soufre doivent être étroitement régulées. Des études récentes montrent que les protéines BolA et les glutarédoxines de classe II sont impliquées dans l’homéostasie du fer en intervenant seules ou de manière concertée. Cependant, la fonction réelle de ces protéines notamment aux différents stades de la biogénèse des centres fer-soufre reste encore que très peu connue. Afin de mieux comprendre la capacité des protéines BolA et glutarédoxines à jouer leur fonction biologique, nous avons étudié à travers ce travail de thèse la capacité des protéines BolA et glutarédoxines d’Arabidopsis thaliana, à former des homodimères et des hétérodimères. Pour ce faire, la cristallographie des rayons X, la résonance magnétique nucléaire et d’autres méthodes spectroscopiques ont été utilisées pour caractériser structuralement les différents états oligomériques de ces deux protéines / Intermolecular interactions in living cells are complex and help convey the information indispensable to the survival of the organism at a given time. It even happens that various stakeholders are involved at different stages of the same process. Among many biological processes present within living cells, the biogenesis of iron-sulfur clusters appears to be very complex. This complexity is probably related to cellular toxicity of both free iron and free sulfur. Thus the different stages of iron-sulfur clusters biosynthesis must be tightly regulated. Recent studies highlight that BolA proteins and class II glutaredoxins are involved in iron homeostasis probably by acting alone or in a concerted manner. However, the current function of these proteins in the various steps of the iron-sulfur clusters biogenesis is yet unidentified. To better understand how BolA proteins and glutaredoxins fulfill their biological function, we studied throughout this PhD work the ability of Arabidopsis thaliana proteins to form homodimers and heterodimers. To do this, X-ray crystallography, nuclear magnetic resonance and other spectroscopic methods were used to structurally characterize the different oligomeric states of these two proteins

La drosophile se défend contre les infections microbiennes par un ensemble de réponses immunitaires très efficaces comme la synthèse de peptides antimicrobiens. L’expression de ces peptides antimicrobiens est contrôlée par deux voies indépendantes : la voie Toll et la voie IMD. La voie IMD est activée par PGRP-LC, une protéine de la famille PGRP (Peptidoglycan Recognition Protein). PGRP-LF est un régulateur négatif spécifique de la voie IMD. Il a été proposé que cette protéinepourrait agir spécifiquement au niveau du récepteur PGRP-LC, en séquestrant le ligand peptidoglycane (PGN) et en empêchant son accès à PGRP-LC. Mon travail de thèse a été de résoudre la structure des deux domaines PGRP de PGRP-LF, LFz et LFw, dans le but de caractériser le mécanisme de régulation par cette protéine.J’ai exprimé le domaine LFz dans des cellules S2 et le domaine LFw dans des bactéries. J’ai résolu la structure cristallographique de LFz à la résolution de 1.72Å et celle de LFw à la résolution de 1.94Å. Les structures de LFz et LFw montrent qu’elles ne possèdent pas la crevasse de liaison classique des PGRP, et ne peuvent pas interagir avec le PGN. J’ai confirmé ces résultats structuraux par des étudesbiochimiques de liaison des ces domaines à du PGN insoluble. L’aspect de régulation par PGRP-LF, par une séquestration du PGN, n’est donc valide. J’ai cloné et exprimé dans des cellules S2 les protéines PGRP-LCx et PGRP-LCa (partenaire du complexe activateur de la voie IMD) dans le but d’étudier leur interaction avec PGRP-LF. J’ai mis en évidence, par des analyses de résonnance plasmonique de surface, une interaction entre PGRP-LF et PGRP-LCx en absence et en présence duPGN. Ces données nous permettent de proposer un modèle dans lequel PGRP-LF assure la régulation négative de la voie IMD par compétition avec PGRP-LCa pour la liaison au récepteur PGRP-LCx. / The fruit fly defends itself against microbial infections by a set of highly effective immune responses that involve the synthesis of antimicrobial peptides. The expression of these antimicrobial peptides is controlled by two independent pathways: the Toll pathway and the IMD pathway. The IMD pathwayis activated by PGRP-LC, a protein of the PGRP family (Peptidoglycan Recognition Protein). PGRPLF is a specific negative regulator of the IMD pathway. It has been proposed that this protein specifically acts at the receptor PGRP-LC, by sequestering peptidoglycan (PGN) and preventing its access to PGRP-LC. My thesis work aims to solve the structure of the two PGRP domains of PGRPLF, LFz and LFw, in order to characterize the mechanism of regulation by this protein. I have expressed the LFz domain in S2 cells and the LFw domain in bacteria. I have solved the crystalstructure of LFz at 1.72 Å resolution and that of LFw at 1.94Å resolution. Structures of LFz and LFw show they do not possess the classical binding cleft found in others PGRP, and cannot interact with the PGN. I have confirmed these structural results with biochemical studies of binding of these domains with insoluble PGN. The model of regulation by PGRP-LF, by a sequestration of PGN, is no longer valid. I have cloned and expressed in S2 cells PGRP-LCx and PGRP-LCa proteins (partners of theactivating complex of the IMD pathway) in order to elucidate whether there is direct interaction between PGRP LF and one of two isoforms of PGRP-LC. I have demonstrated, through Surface Plasmon Resonance analysis, an interaction between PGRP-LF and PGRP-LCx. Actually, PGRP-LF regulates negatively the IMD pathway by competing with PGRP-LCa to bind to the PGRP-LCx receptor.

Il est reconnu, depuis des années, que la flore intestinale par son équilibre complexe et dynamique joue un rôle essentiel dans la santé humaine. Une des stratégies les plus prometteuses pour la maintenir ou l’améliorer consiste à moduler le microbiome par l’utilisation de bactéries probiotiques ou de sucres prébiotiques. C’est dans ce contexte que s’inscrivent les études structurales et fonctionnelles d’α glucosidases bactériennes développées dans cette thèse. Ces enzymes hydrolysant les liaisons α-(1,4) glucosidiques sont classées, selon la base de données CAZy, dans les familles de glycoside hydrolases (GH) 4, 13, 31, 63, 97 et 122. Ces travaux de thèse, centrés sur trois α-glucosidases issues de Lactobacillus bulgaricus (11842aglu, GH31), Lactococcus lactis (1403aglu, GH13) et Shewanella sp. ANA-3 (SHWaglu, GH97), exposent la mise au point de leurs protocoles de surexpression et de purification. Ils présentent également des études bioinformatiques de 11842aglu et de 1403aglu, ainsi qu’une caractérisation enzymatique préliminaire de cette dernière. Une analyse structurale et fonctionnelle approfondie de SHWaglu a aussi été réalisée. La résolution, par cristallographie aux rayons X, des structures de SHWaglu seule, en complexe avec différents ligands et de mutants, a participé à enrichir les connaissances, jusqu’à présent peu étendues, sur les enzymes de la famille GH97. Ainsi, un motif structural conservé au sein de cette famille a notamment été mis en évidence. Par ailleurs, ces informations structurales combinées aux études enzymatiques ont permis de révéler des déterminants moléculaires de l’activité de cette α-glucosidase et, par conséquent, d’établir les relations structure-fonction-activité de cette enzyme. Ainsi, l’ensemble des données obtenues, couplé à des études d’ingénierie protéique, contribue à ouvrir de nouvelles perspectives industrielles, notamment en suggérant d’optimiser ou de conférer des activités enzymatiques modifiées dans certaines cibles de choix afin de leur faire synthétiser des sucres de type prébiotiques / It is now generally accepted that the gut flora with its complex and dynamic nature plays a vital role in human health. One of the most promising strategies for maintaining or improving health is to modulate the microbiome by the use of probiotics and prebiotics as food supplements. The structure/function/activity relationship studies of bacterial α-glucosidases described in this thesis have been performed within this context. These α-(1,4)-glucosidic bond hydrolyzing enzymes are classified, according to the CAZy database, into glycoside hydrolases families (GH) 4, 13, 31, 63, 97 and 122. This thesis work, has focused on three α-glucosidases from Lactobacillus bulgaricus (11842aglu, GH31), Lactococcus lactis (1403aglu, GH13) and Shewanella sp. ANA-3 (SHWaglu, GH97), and the development of their overexpression and purification protocols. It also presents a bioinformatics studies of 11842aglu and 1403aglu, as well as preliminary enzymatic characterization of the latter. As for SHWaglu, detailed structural and functional studies have been carried out. The crystal structures of SHWaglu in its native state, in complex with different ligands as well as site directed mutants have contributed to increase our knowledge on enzymes from the GH97 family which to date remains relatively limited. Notably, a conserved structural motif in this family has been identified. Overall, the structural- and enzymatic studies and analyses have revealed molecular-and structural determinants governing the activity and broad substrate specificity of this α-glucosidase which is adapted to cold temperatures. Apart from the insight gained from a fundamental research point of view, data described within this work, coupled with protein engineering studies may contribute to open up new industrial perspectives, in particular by suggesting optimized or altered enzyme activities in some attractive enzyme targets with the aim of synthesizing prebiotic compounds

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / La détermination des structures tertiaires des protéines par rayons X a pour but de nous apporter des connaissances détaillées sur leur repliement et de comprendre la relation entre leur structure et leur fonction. Nous allons montrer par la présente étude comment la cristallographie jumelée à la mutagenèse dirigée peut être utilisée dans la détermination et la compréhension du mécanisme enzymatique de l'aldolase du muscle de lapin. Les différentes mutations générées visent des acides aminés qui sont, dans la plupart des cas, situés dans le site actif et qui sont impliqués dans la catalyse enzymatique. Certains mutants de l'aldolase du muscle sont analysés par des méthodes cristallographiques, cinétiques, enzymatiques et d'échanges isotopiques. L'enzymologie nous a permis de déterminer les paramètres cinétiques de ces mutants, afin d'établir leur rôle dans la réaction enzymatique. L'étude structurale permet d'avoir une vision directe des types d'interactions au sein d'une enzyme. L'interprétation des données structurales associée aux données cinétiques permet d'analyser avec pertinence la fonction des résidus impliqués dans le mécanisme catalytique de l'aldolase du muscle de lapin. Dans le but de connaître l'implication de certains résidus dans le mécanisme catalytique, nous nous sommes focalisés sur l'étude structurale de plusieurs mutants. Les principaux intérêts de ce travail consistent à connaître si la perte d'activité est directement liée à la mutation ou à un changement global de la structure engendrée par celle-ci, à déterminer la structure mutante formant un complexe avec le substrat ou le produit de la réaction catalytique ainsi qu'a connaître le lien entre l'affinité pour le substrat et un acide aminé bien spécifique. La réponse à toutes ces questions nous a amenés à la résolution des structures cristallographiques de certains mutants. La cristallographie qui donne une vision directe des interactions entre les acides aminés est un puissant outil qui nous renseigne sur la nature et le mode d'action des résidus. Les résultats structuraux nous ont permis de tirer plusieurs conclusions sur la relation structure/fonction de cette enzyme et de déterminer la nature et le rôle des résidus impliqués dans la catalyse, ainsi que ceux impliqués dans sa conformation. Ces méthodes nous ont également permis de proposer un nouveau modèle du mécanisme enzymatique. Nous discuterons aussi des problèmes liés à la cristallisation des protéines et les méthodes récentes appliquées pour les contourner.

Les amylosaccharases sont des α-transglucosylases catalysant naturellement la synthèse exclusive d’α-1,4-glucanes à partir du saccharose. Ces enzymes produisent également des composés secondaires et, en particulier, des isomères du saccharose tels que le turanose et le tréhalulose.L’objectif de cette thèse a consisté à utiliser un panel de techniques biophysiques et biochimiques afin d’étudier les amylosaccharases de Deinococcus geothermalis (ASDg) et Neisseria polysaccharea (ASNp) afin de comprendre les relations unissant la structure, la flexibilité et la fonction de ces enzymes.La première étude rapporte la caractérisation structurale et biophysique de l’amylosaccharase la plus thermostable connue à ce jour, l’amylosaccharase de Deinococcus geothermalis. La structure tridimensionnelle révèle une organisation dimérique en solution, jamais rapportée pour une amylosaccharase. Grâce à l’analyse de l’interface dimérique et à des travaux d’analyse de séquences, une séquence signature de dimérisation a été identifiée. En rigidifiant la structure de l’ASDg, la structure quaternaire contribue à l’augmentation de la stabilité thermique de la protéine. La spécificité de production des isomères du saccharose par les amylosaccharases a été étudiée. Les résultats décrivent, pour la première fois, les structures de l’ASDg et de l’ASNp en complexe avec le turanose. Dans l’ASNp, les résidus clefs forcent le résidu fructosyle à adopter une conformation linéaire positionnant idéalement le O3’ pour sa glucosylation expliquant la formation préférentielle de turanose par l’enzyme. Ces résidus sont absents ou placés différemment dans l’ASDg. En conséquence, l’ASDg lie principalement les formes furanoses du fructose avec un faible réseau d’interactions. La topologie du sous-site +1 permet donc différents modes de liaison du fructose en accord avec la capacité de l’ASDg à produire une plus grande quantité de tréhalulose par rapport à l’ASNp.Dans la seconde étude, des techniques de mutagenèse à saturation et combinatoire ciblées sur les acides aminés voisins du site actif ont été utilisées pour modifier la spécificité d'accepteur de l’ASNp. Le criblage de trois bibliothèques semi-rationnelles représentant un total de 20 000 variants a permis d’isoler trois doubles mutants montrant une amélioration spectaculaire de spécificité à la fois vis-à-vis du saccharose, le substrat donneur et de l’accepteur α-allyl-N-acetyl-2-désoxy-α-D-glucopyranoside par rapport au type sauvage de l’ASNp. De tels niveaux d'amélioration d'activité n'ont jamais été signalés auparavant pour cette classe d’enzymes actives sur les sucres. L’analyse par cristallographie des rayons X de la structure des meilleures enzymes mutantes suivie par des simulations de dynamique moléculaire ont montré une rigidité locale du sous-site -1 couplée à une flexibilité des boucles impliquées dans la topologie du site actif. Ces faits pourraient être à l’origine des performances catalytiques accrues de ces enzymes mutantes. L'étude démontre l'importance, lors de la conception des bibliothèques de variants, de tenir compte de la conformation locale des résidus catalytiques ainsi que de la dynamique des protéines au cours du processus catalytique / Amylosucrases are sucrose-utilizing α-transglucosylases that naturally catalyze the synthesis of α-glucans, exclusively linked through α-1,4 linkages. Side-products and in particular sucrose isomers such as turanose and trehalulose are also produced by these enzymes.The objective of this thesis concerned the application of biophysical and biochemical techniques to study amylosucrases from Deinococcus geothermalis (DgAS) and Neisseria polysaccharea (NpAS) in order to investigate relationships between structure, flexibility and function of these enzymes.In the first study, we report the first structural and biophysical characterization of the most thermostable amylosucrase identified so far, the amylosucrase from Deinoccocus geothermalis. The 3D-structure revealed a homodimeric quaternary organization, never reported before for other amylosucrases. A sequence signature of dimerization was identified from the analysis of the dimer interface and sequence alignments. By rigidifying DgAS structure, the quaternary organization is likely to participate in the enhanced thermal stability of the protein. Amylosucrase specificity with respect to sucrose isomer formation (turanose or trehalulose) was also investigated. We report the first structures of the DgAS and NpAS in complex with turanose. In NpAS, key residues were found to force the fructosyl moiety to bind in an open state with the O3' ideally positioned to explain the preferential formation of turanose by NpAS. Such residues are either not present or not similarly placed in DgAS. As a consequence, DgAS binds the furanose tautomers of fructose through a weak network of interactions to enable turanose formation. Such topology at subsite +1 is likely favoring other possible fructose binding modes in agreement with the higher amount of trehalulose formed by DgAS.In the second study, iterative saturation mutagenesis and combinatorial active site saturation focused on vicinal amino acids were used to alter the acceptor specificity of NpAS and sort out improved variants. From the screening of three semi-rational sub-libraries accounting in total for 20,000 variants, we report here the isolation of three double-mutants displaying a spectacular specificity enhancement towards both sucrose, the donor substrate, and the α-ally-N-acetyl-2-deoxy-α-D-glucopyranoside acceptor compared to wild-type N. polysaccharea amylosucrase. Such levels of activity improvement have never been reported before for this class of carbohydrate-active enzymes. X-ray structural analysis of the best performing enzymes followed by Molecular Dynamics simulations showed both local rigidity of the -1 subsite and flexibility of loops involved in active site topology which both account for the enhanced catalytic performances of the mutants. The study well illustrates the importance when designing enzyme libraries of taking into account the local conformation of catalytic residues as well as protein dynamics during the catalytic process

Depuis sa découverte il y a plus de 30 ans, le Virus de l’Immunodéficience Humaine est à l’origine d’une importante mortalité dans le monde. De par la difficulté de tester l’efficacité de formulations thérapeutiques et/ou vaccinales directement chez l’homme, des études d’infections modèles du VIH, comme celle du Virus de l’Immunodéficience Féline (FIV), ont été entreprises ces dernières années. Au-delà de son intérêt vétérinaire, l’étude du FIV représente un avantage important pour trouver un moyen de contrôler les infections par les lentivirus tel que le VIH. Elle peut permettre de développer et surtout de tester l’efficacité des vaccins et/ou thérapies spécifiques chez le chat, dont le SIDA mime les symptômes et les modifications hématologiques rencontrés chez l’homme. Ce manuscrit s’est intéressé à l’étude structurale de deux familles de protéines virales de ces virus, les protéines lentivirales précoces (protéine Tat du VIH) et tardives (domaines Capside CA et Matrice MA de Gag du FIV). L’étude structurale de ces protéines et leur compréhension fonctionnelle au sein de l’hôte pourront à l’avenir ouvrir de nouvelles voies thérapeutiques et/ou vaccinales contre les lentivirus, palliant ainsi les problèmes existants de résistances virales / Since its discovery 30 years ago, the Human Immunodeficiency Virus is the cause of an important mortality worldwide. Because of the difficulty to test the efficiency of therapeutical and/or vaccinal formulations directly in humans, studies of models of HIV infections, such as the Feline Immunodeficiency Virus (FIV), have been performed in recent years. In addition to its veterinary interest, the study of FIV is an important issue to find a way to control infections by lentiviruses such as HIV. It can help to develop and test the efficiency of specific therapies and/or vaccines for cats, where AIDS mimics the symptoms and hematologic changes observed in humans. This manuscript describes the structural study of two types of viral proteins of these viruses, early lentiviral proteins (HIV Tat protein) and late lentiviral proteins (CA capsid and MA Matrix domains of FIV Gag). The structural study of these proteins and their functional understanding into the host will open new therapeutic and/or vaccine strategies against these lentiviruses in the future, in order to overcome the existing problems of viral resistance