Analysis of genetic relatedness is of great importance in forensic casework such as immigration and identification cases. The conventional methods for relationship testing are not sufficient in the most complicated cases, because more genetic markers are required to obtain results with satisfactory statistical security. This study demonstrates that microarrays, which can be used to genotype thousands of single nucleotide polymorphisms (SNPs), could be a promising solution to this problem. The microarray technique used in this study performed very well on blood samples and also worked well in combination with whole genome amplification, but did not generate any results when used on severely degraded materials. Markers suitable for relatedness analysis were selected from the microarray and were successfully tested on families with known genetic relations. Although a maximum of 64 autosomal markers were used, there is a great potential of selecting the hundreds or thousands of markers that may be required in some cases of relatedness investigation.

Vaginitis is a vaginal infection which affects many women all over the world. The disorder is characterized by an infection of the vaginal area which can cause problems like abnormal vaginal discharge, itching and redness. The two most common causes of vaginitis are bacterial vaginosis and Candida vaginitis. The prevalence of bacterial vaginosis in Sweden is around 10-20 % and approximately 75 % of all women will once in their lifetime suffer from vaginal yeast infection. The clinical symptoms of vaginal infections are not specific and the diagnosis methods of bacterial vaginosis and Candida vaginitis are subjective and depended on the acuity of the clinician. Due to the lack of standardized and objective diagnostic tools, misdiagnosis and consequently incorrect treatment may occur. As vaginal infections and symptoms impact greatly of women´s quality of life and vaginitis have been associated with serious public health consequences, it is essential to diagnose and treat the conditions correctly. Hence, there is a great need of better methods of diagnosing these conditions. The aim of this master thesis was to develop quantitative species-specific real-time PCR assays to use in diagnosing the two most common causes of vaginitis i.e. bacterial vaginosis and Candida vaginitis. Potential markers for bacterial vaginosis (Atopobium vaginae, BVAB2, Gardnerella vaginalis, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus gasseri, Lactobacillus jensenii, Lactobacillus iners, Megasphaera type 1, Megasphaera type 2, Mobiluncus curtisii, Mobiluncus mulieris and Leptotrichia/Sneathia species) and Candida vaginitis (Candida albicans, Candida glabrata, Candida parapsilosis and Candida tropicalis) were chosen. Primers and probes were designed and tested on reference strains and vaginal samples. Single- and multiplex PCR reactions were successfully optimized with the designed oligonucleotides. Furthermore, standard curves with excellent linearity were created and covered more than five orders of magnitude. These developed quantitative species-specific real-time PCR assays will, in a prospective medical validation, quantify 300 vaginal samples from women visiting the RFSU Clinic in Stockholm.

Sedan andra världskriget har en rad tekniker utvecklats som drastiskt förändrat såväl människors omvärld och livsvillkor som det offentliga samtalet. Gentekniken utgör ett belysande exempel, inte minst genom tillämpningen inom livsmedelsproduktionen. Utvecklingen av den genförändrade maten har dock inte gått obemärkt förbi utan har kommit att bli ett kontroversiellt ämne, kanske ett av de mest framskjutande i den offentliga diskussionen på senare tid. I mitten av det offentliga samtalet kring ett ämne som på samma gång som det är tekniskt komplicerat och forskningsberoende berör oss alla i vår vardag befinner sig medierna. Då deras roll är så central är det av intresse att analysera och kritiskt granska just medias framställning av frågan och se denna som ett utsnitt av en större diskurs på området. Det övergripande syftet med studien har därför varit att analysera och kritiskt granska hur frågan om den genförändrade maten framställs och kommuniceras i Sveriges största morgontidning Dagens Nyheter (DN) i vår närtid, närmare bestämt från och med januari 2000 till och med april 2004. Intentionen har varit att på så vis synliggöra och problematisera den diskurs på området som DN medverkar till att producera och reproducera. Med utgångspunkt i diskursanalys som teori och metod har 57 artiklar publicerade i DN analyserats. Genom analysen har det framkommit att frågan om den genförändrade maten i många avseenden kan ses som ett uttryck för det risksamhälle vi i dag lever i. Detta karaktäriseras bl a av att vi nu till skillnad från tidigare står inför risker, eller snarare faror, som är resultatet av mänskliga beslut och därmed kan ses som självförvållade. Produktionen av varor och värden går hand i hand med produktionen av risker. Eftersom vi uppenbarligen kan välja om vi vill producera denna nytta och dessa risker är det kanske inte så konstigt att det uppstår meningsskiljaktigheter kring hur vi skall handla. Detta är också vad som sker inom det studerade utsnittet av diskursen för genförändrad mat. Den bild som framträder i Dagens Nyheter är nämligen polariserad. Dessutom är förhållandet mellan olika aktörer och synsätt ojämlikt. Det är i huvudsak två perspektiv på genförändrad mat som diskursen formuleras kring och som ställs mot varandra: förhoppningar och hotbilder. Förhoppningarna, mestadels representerade av forskarna, ledarskribenterna och företagens språkrör, får i Dagens Nyheters framställning större plats än hotbilderna vilka i sin tur representeras av allmänheten, miljöorganisationerna och konsumentföreningarna. Medan de förra ofta får personifiera vetenskapen och förnuftet får de senare stå för de etiska ställningstagandena vilka stundtals mer eller mindre likställs med desinformation. Etik ställs med andra ord mot vetenskap och allmänhet mot forskare vilket aktualiserar för samhället grundläggande frågor om demokrati och teknokrati. Analysen har också visat att missuppfattningar lätt uppstår mellan aktörer på de olika sidorna om konfliktlinjen då dessa stundtals grundar sin argumentation på skilda värden utan att själva inse detta. Medan de som intar en mer restriktiv inställning till den genförändrade maten grundar sin pessimism på såväl osäkerhet och risk som på etiska värden tycks aktörerna som ser positivt på gentekniken endast uppfatta att motståndet beror på de eventuella riskerna gentekniken kan föra med sig och missar därmed helt den del av de negativt inställda aktörerna som grundar argumenten på etik. Missförstånd som detta bådar för att beslut kommer att bygga på felaktiga förutsättningar och att det därför också kan bli svårt att komma fram till en gemensam handlingsväg när det gäller frågan om den genförändrade maten. Det finns dock vissa starka gemensamma värden som står stadigt trots att det annars råder turbulens inom diskursens ramar. Det handlar om människans rätt till valfrihet, att det som är naturligt är gott samt vikten av tillit och genomskinlighet i en tillvaro som genom sin komplexitet blir alltmer oöverskådlig.

Framsteg inom genteknik har givit upphov till tanken om en förestående förändring av vår rättviseuppfattning, däribland vilken roll hälsa, intelligens och fantasi kan ha i en distributiv rättviseteori. Denna uppsats syftar till att tydliggöra John Rawls förhållningssätt till dessa nyttigheter, vilken i samtida forskning ofta beskrivs som en exkludering, med hänvisning till att de inte innefattas i Rawls rättviseuppfattning. Medan den gängse uppfattningen beskriver denna exkludering som ett resultat av bristande kontroll, vilket genteknik anses kunna förändra, visar denna uppsats genom en beskrivande idéanalys att frågan är mer problematisk än vad som vanligen framförs. Bland annat dras slutsatsen att Rawls exkludering i viktiga avseenden inte är ett resultat av bristande kontroll, utan att den snarare bör betraktas som ett medvetet val. Detta påverkar inte bara vår syn på Rawls rättviseteori, utan även synen på vilka implikationer genteknik i själva verket har på vår rättviseuppfattning.

De senaste årens forskning har tydligt visat på elevers svårigheter att utveckla begreppsförståelse inom ämnesområdet genetik. I denna studie har jag valt att intervjua lärare i några svenska gymnasieskolor för att undersöka om de identifierar samma problem med genetikundervisningen som finns dokumenterade i forskningslitteraturen samt hur de arbetar för att eleverna skall nå uppsatta kunskapsmål. De intervjuade lärarna bekräftar samtliga av de huvudproblem som forskningslitteraturen utpekar. Eleverna har svårt att utveckla begreppsförståelse inom den grundläggande genetiken. Detta leder bland annat till en mycket begränsad förmåga att, på basis av genetisk kunskap, ta ställning i frågor som rör gentekniska metoders tillämpningar. Avslutningsvis diskuteras möjligheterna att använda formativ utvärdering och att arbeta med autentiska problem för hjälpa och motivera eleverna.

The purpose of this thesis is to analyse Sweden’s first GMO-legislation which was implemented in 1994. The legislation was created because of Swedens commitment to the EES-agreement, but also because of the necessity for GMO-legislation. The analysis is based on Ulrich Beck’s theory which stipulates that highly developed societies are no longer industrial societies but instead have become risk societies, which also has a connection to and is strongly influenced by the precautionary principle. In a risk society the logic of risk production dominates the logic of wealth production and the regulations and actions of governments correlate to this perspective. The questions the analysis seeks to answer are how the actors involved in the making of Sweden’s first comprehensive GMO-legislation has considered, judged and finally chosen to handle the potential risks associated with gene technology. The results show that Sweden had a distinctive focus on risk, which also had a strong connection to ethics, which in the end was about how big of a risk could be accepted based on the moral resonsibility for the environment. In some parts Sweden took the restrictions further than required for by the EES-agreement based on the risk approach. The legislation can be characterized as being surrounded by an epistemological problem, due the lack of definitive knowledge about GMOs at the time. These results also support the view found by earlier research, when it comes to how Sweden has handled the issues surrounding GMOs during an early stage. / Uppsatsens syfte är att utifrån ett riskperspektiv analysera Sveriges första heltäckande GMO-lagstiftning vilken antogs 1994. Lagstiftningen skapades som ett resultat av Sveriges åtaganden via EES-avtalet, men också utifrån nödvändigheten av att skapa en heltäckande GMO-lag. Undersökningen bygger på Ulrich Becks teori om att välutvecklade samhällen har gått från att vara industrisamhällen till att bli risksamhällen. I risksamhället dominerar riskproduktionens logik över rikedomsproduktionens logik där regeringars och myndigheters agerande styrs utifrån detta perspektiv. Frågor som undersökningen söker svar på är hur de aktörer som var inblandade i skapandet av Sveriges första heltäckande GMO-lag resonerat kring, bedömt och slutligen hanterat de risker som ansågs finnas med gentekniken. Resultatet visar att Sverige hade ett uttalat fokus på risker som i förlängningen går tillbaka till etiska frågor, där vilka risker som kunde accepteras utifrån det moraliska ansvaret för miljön stod i centrum. I vissa delar så införde Sverige en striktare lagstiftning än vad EES-avtalet krävde utifrån ett riskperspektiv. Lagstiftningen kan sägas ha karaktäriserats av ett epistemologiskt problem, vilket var en följd av den okunskap som förelåg vid tidpunkten. Detta stödjer också den tidigare forskningens uppfattningar kring hur Sverige hanterat frågan med GMO på ett tidigt stadium.

Med genteknik är det möjligt att ändra gensammansättningen i våra livsmedel och applikationen har väckt stort intresse, inte minst bland allmänheten. Genmodifierade (GM) livsmedel har varit föremål för diskussion sedan 1970-talet. Syftet med denna uppsats är att studera olika uppfattningar och representationer om genmodifierade livsmedel. Enligt teorin om sociala representationer har representationer dubbla funktioner. Den ena är att konventionalisera objekt och den andra innebär att representationerna intar en förutbestämd form. För att analysera uppfattningar och representationer har jag använt mig av en tematisk innehållsanalys samt en analys av kommunikativa strategier av samtal i fyra fokusgrupper. Analysen av fokusgruppsdatan visar att diskussionerna cirkulerar kring tre teman: risker, möjligheter och mervärden med genmodifierade livsmedel. De risker som associeras med GM livsmedel diskuteras främst utifrån begreppsparet naturligt/antropogent och utgår ofta från ett grundläggande antagande om att naturen har ett positivt värde. De möjligheter som associeras med GM livsmedel diskuteras utifrån begreppsparet Nord/Syd och utgår ofta från antagandet att GM livsmedel först och främst gör nytta i utvecklingsländer. Antagandet om naturens positiva värde samt uppfattningen om GM livsmedlens frånvaro av fördelar för konsumenter i industrialiserade länder resulterar i att deltagarna inte ser några eller få konsumentfördelar med GM livsmedel. Representationerna kring GM livsmedel kan genom ett gemensamt meningsskapande ses både ha en konventionaliserande funktion där GM livsmedel förankras och förstås samt en preskriptiv funktion där representationerna leder till ett visst sätt att tänka.

Affinity proteins are invaluable tools in biotechnological and medical applications. This thesis is about combinatorial protein engineering principles for the generation of novel affinity proteins to purify mouse immunoglobulin, detect a potential cancer marker protein or inhibit a cell proliferation pathway. In a first study, ribosome display was for the first time applied to the selection of so-called affibody molecules, including the design of a ribosome display gene cassette, initial test enrichment experiments and the selection of binders against murine IgG1. One of the selected binders (ZMAB25) showed a highly selective binding profile to murine IgG1, which was exploited in the recovery of two different mouse monoclonal IgG1 antibodies from a bovine immunoglobulin-containing background. Ribosome display was further applied to the selection of affibody molecules binding to SATB1, a suggested marker protein for metastasizing adenocarcinoma. The study also included the selection of VHH antibody fragments from a naïve gene repertoire displayed on phage. Binders from both classes of protein scaffolds could be isolated that selectively recognized SATB1 but not its close homologue SATB2, and were used to detect endogenous SATB1 in Jurkat cells by immunofluorescence microscopy. The well-established phage display technology was used to select affibody molecules binding to H-Ras and Raf-1, both involved in the mitogen-activated protein kinase (MAPK) pathway and playing a central role in the control of cell proliferation, survival and differentiation. An isolated affibody molecule denoted ZRAF322 was found to selectively bind to Raf-1 and inhibit the interaction between H-Ras and Raf-1 in vitro. In a continued effort, ribosome display was applied to the affinity maturation of the ZRAF322 variant in a novel approach, based on repetitive cycles of diversification by error-prone PCR of the entire affibody gene and ribosome display selection, mimicking the principles of natural evolution. The method involved a monitoring of the progress of evolution and variants of ZRAF322 with 13- to 26-fold improved affinities were obtained, that contained different combinations of single or double amino acid substitutions in either previously randomized or framework positions. Implications of the substitutions for binder stability and selectivity were also investigated, showing that a higher affinity could be associated with a lower thermal melting point and that affinity-improved variants showed uncompromised binding selectivity to the hRaf-1 target. / QC 20110506

DNA is the code for all life. Via intermediary RNA the information encoded by the genome is relayed to proteins executing the various functions in a cell. Together, this repertoire of inherently linked biological macromolecules determines all characteristics and features of a cell. Technological advancements during the last decades have enabled the pursuit of novel types of studies and the investigation of the cell and its constituents at a progressively higher level of detail. This has shed light on numerous cellular processes and on the underpinnings of several diseases. For the majority of studies focusing on nucleic acids, an amplification step has to be implemented before an analysis, scoring or interrogation method translates the amplified material into relevant biological information. This information can, for instance, be the genotype of particular SNPs or STRs, or the abundance level of a set of interesting transcripts. As such, amplification plays a significant role in nucleic acid assays. Over the years, a number of techniques – most notably PCR – has been devised to meet this amplification need, specifically or randomly multiplying desired regions. However, many of the approaches do not scale up easily rendering comprehensive studies cumbersome, time-consuming and necessitating large quantities of material.Trinucleotide threading (TnT) – forming the red thread throughout this thesis – is a multiplex amplification method, enabling simultaneous targeted amplification of several nucleic acid regions in a specific manner. TnT begins with a controlled linear DNA thread formation, each type of thread corresponding to a segment of interest, by a gap-fill reaction using a restricted trinucleotide set. The whole collection of created threads is subsequently subjected to an exponential PCR amplification employing a single primer pair. The generated material can thereafter be analyzed with a multitude of readout and detection platforms depending on the issue or characteristic under consideration.TnT offers a high level of specificity by harnessing the inherent specificities of a polymerase and a ligase acting on a nucleotide set encompassing three out of the four nucleotide types. Accordingly, several erroneous events have to occur in order to produce artifacts. This necessitates override of a number of control points.The studies constituting this thesis demonstrate integration of the TnT amplification strategy in assays for analysis of various aspects of DNA and RNA. TnT was adapted for expression profiling of intermediately-sized gene sets using both conventional DNA microarrays and massively parallel second generation 454 sequencing for readout. TnT, in conjunction with 454 sequencing, was also employed for allelotyping, defined as determination of allele frequencies in a cohort. In this study, 147 SNPs were simultaneously assayed in a pool comprising genomic DNA of 462 individuals. Finally, TnT was recruited for parallel amplification of STR loci with detection relying on capillary gel electrophoresis. In all investigations, the material generated with TnT was of sufficient quality and quantity to produce reliable and accurate biological information.Taken together, TnT represents a viable multiplex amplification technique permitting parallel amplification of genomic segments, for instance harboring polymorphisms, or of expressed genes. In addition to these, this versatile amplification module can be implemented in assays targeting a range of other features of genomes and transcriptomes. / QC 20100819

Machupovirus är ett virus som kan orsaka hemorragisk feber hos människor. Efter utvärdering av bindning mellan designade proteiner och virala glykoproteiner skulle proteinerna potentiellt kunna användas vid framtagning av ett proteinbasserat läkemedel mot hemorragisk feber. Syftet med studien var att efter riktad evolution och framrening av optimerade varianter av proteinet AP01 undersöka inbindningen till virala glykoproteiner mellan designade AP01 proteiner och transferrinreceptorn med hjälp av flödescytometrisk undersökning. Den fysiologiska nivån av järn i kroppen upprätthålls av transferrin (Tf) och transferrinreceptorn (TfR), ett transmembranprotein bestående av tre domäner. TfR apikala domän används av glykoprotein 1 (MGP1) och Plasmodium vivax för att ta sig in i celler genom receptormedierad endocytos. Med rekombinant genteknik kan rekombinanta plasmider skapas där en gen av intresse ligeras in i en plasmid med hjälp av DNA-ligas. I studien skapades rekombinanta plasmider pET29b+/AP01 S2.1, S2.2, S2.3, S3.3, S3.4 och S3.6 som transformerades till E. coli. Erhållna resultat från sekvensering visade att samtliga sex AP01-gener hade ligerats i vektorn men sekvensering av rekombinanta plasmider visade att endast pET29b+/AP01 S2.1, S2.2, S2.3 och S3.6 hade nukleotidsekvens utan mutationer. Proteinuttryck inducerades innan proteiner renades fram med immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC). Den uppskattade molekylvikten hos de framrenade proteinerna var 18 kDa som bestämdes med sodium dodecyl sulfate – polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE) vilket överrenstämde med den teoretiska molekylvikten. Flödescytometri användes för att undersöka inbindningsförmågan mellan de uttryckta proteinerna och glykoprotein 1 (MGP1). Interaktionsbindningen mellan de designade proteinerna och MGP1 är bättre än interaktionen mellan originalgen AP01 och MGP1. De designade proteinerna visar på en svag effekt i den utförda ”competition assay” som gjorts vilket kan förklaras med en ej optimal struktur hos de designade proteinerna eller närvaro av BSA. / Machupovirus is a virus that can cause hemorragic fever in humans. After evaluating the binding between designed proteins and viral glycoproteins, the proteins could potentially be used in the development of a protein-based drug for hemorrhagic fever. The aim of the study was to investigate the binding to viral glycoproteins between designed AP01 proteins and the transferrin receptor after directed evolution and purification of optimized variants of the AP01 protein by means of flow cytometric examination. The physiological level of iron in the body is maintained by transferrin (Tf) and the transferrin receptor (TfR), a transmembrane protein consisting of three domains. The apical domain of TfR is used by glycoprotein 1 (MGP1) and Plasmodium vivax to enter cells through receptor mediated endocytosis. With recombinant DNA technology, recombinant plasmids can be created where a gene of interest is ligated into a plasmid using DNA ligase. In this study, recombinant plasmids pET29b+/AP01 S2.1, S2.2, S2.3, S3.3, S3.4 and S3.6 were created and transformed into E. coli. Sequencing results showed that all six AP01 genes had been ligated into the vector but sequencing of recombinant plasmids showed that only endast pET29b+/AP01 S2.1, S2.2, S2.3 and S3.6 had nucleotid sequence without mutations. Protein expression was induced before proteins were purified by immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC). The estimated molecular weight of the purified proteins was 18 kDa as determined by sodium dodecyl sulfate – polyacrylamid gel electrophoresis (SDS-PAGE) which was consistent with the theoretical molecular weight. Flow cytometry was used to examine the binding ability between the expressed proteins and glycoprotein 1 (MGP1). The interaction binding between the designed proteins and MGP1 is better than the interaction between the original gene AP01 and MGP1. The designed proteins show a weak effect in the “competition assay” preformed, wich can be explained by a non-optimal structure how the designed proteins or the presence of BSA.