Orientador: L. A. Magalhães / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-19T01:56:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bastos_OthondeCarvalho_M.pdf: 3157673 bytes, checksum: d759eca7fcc66ef1c9008030b1ec3e94 (MD5) Previous issue date: 1975 / Resumo: Não informado / Abstract: Not informado / Mestrado / Mestre em Ciências Biológicas

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2012-08-21T16:31:44Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Renato Abdala.pdf: 2009448 bytes, checksum: 415669cc9e6a0622d6f58202d33f6488 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-08-21T16:31:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Renato Abdala.pdf: 2009448 bytes, checksum: 415669cc9e6a0622d6f58202d33f6488 (MD5) / CPqRR/FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico INCT-DT: Instituto Nacional de Ciência e tecnologia de Doenças Tropicais / Neste estudo foram avaliadas as principais alterações hematológicas e imunofenotípicas em pacientes portadores da fase crônica da esquistossomose (INF), subcategorizados por cargas parasitárias distintas, apresentando menos de 100 ovos por grama de fezes (<100) e mais de 100 ovos por grama de fezes (>100) e indivíduos negativos para ovos residentes (CA) ou não (CT) em áreas endêmicas para a doença. Amostras de fezes e sangue periférico foram coletadas para realização de exame parasitológico pelo método de Kato-Katz e hemograma, respectivamente. Logo após, foi realizado a avaliação do perfil imunofenotípico ex vivo dos leucócitos circulantes e a produção de citocinas em culturas de células mononucleares do sangue periférico, após estimulação antigênica in vitro por 12 horas na ausência ou presença de antígenos solúveis do ovo (SEA), do verme adulto (SWAP) e proteínas recombinantes (Sm22.6 e Sm29) do Schistosoma mansoni. Os resultados mostraram aumento no número absoluto de eosinófilos nos grupos INF e >100. Em relação ao perfil imunofenotípico, foi observado aumento da expressão dos receptores do Tipo Toll-2, CD80, CD86 e CD54 em monócitos dos grupos CA, INF, e >100 em relação ao grupo CT. Foi observado também aumento do receptor CD18 em linfócitos T CD4+ dos grupos CA e <100 em relação ao grupo CT, diminuição do CD18 no grupo >100 em relação ao grupo <100 e aumento da expressão do CD18 no grupo <100 em relação ao grupo CA. Em linfócitos T CD8+ foi observado aumento na expressão do receptor do tipo Toll-2 nos grupos INF, <100 e >100 em relação ao grupo CT, aumento do CD18 nos grupos <100 e CA em relação ao grupo CT e diminuição do CD18 no grupo >100 em relação ao grupo <100. Em linfócitos B, foi observado aumento da expressão do receptor CD80 e CD86 no grupo <100 em relação ao CT e aumento na expressão do CD86 no grupo CA em relação ao grupo CT. A análise após estimulação antigênica revelou, em monócitos, aumento da síntese de TGF-nos grupos INF e >100 estimulados com Sm22.6 e SEA em relação ao CA, redução na síntese de IL-10 e IL-12 no grupo INF em relação ao grupo CA estimulado com Sm22.6 e redução na síntese de IL-1nos grupos CAINF, <100 e >100estimulados com Sm22.6 e SEA em relação ao meio. Houve também, redução de expressão de IL-5 no grupo <100 em relação ao CA estimulado com Sm22.6, aumento na síntese de IFN- nos grupo INF e >100 estimulados com SEA em relação ao meio e aumento na síntese de F-e IL-10 nos grupo INF e >100 estimulados com Sm22.6 e SEAem relação ao grupo CA em linfócitos T CD4+. Além disso, houve aumento da síntese de IL-12 e TNF-no grupo INF em relação ao CA estimulado com SEA, redução de IL-8 no grupo >100 em relação ao grupo <100 estimulados com SEA, SWAP e Sm22.6 e redução de síntese de IL-5 no grupo INF estimulado com SWAP em relação ao CA em linfócitos T CD8+. Após a realização desse trabalho, pode-se concluir que indivíduos portadores da fase crônica e residentes em área endêmica para a doença apresentam forte expressão de moléculas co-estimuladoras, de adesão e de ativação celular em monócitos, linfócitos B, linfócitos T CD4+ e CD8+ do sangue periférico, sugerindo que estes indivíduos possuam intensa atividade das células envolvidas na resposta imune contra a infecção pelo S. mansoni. Além disso, de uma maneira geral, os indivíduos infectados apresentaram, após estimulação antigênica com antígenos recombinantes, redução na síntese de citocinas pró inflamatórias e aumento da síntese de citocinas reguladoras tanto para monócitos quanto para linfócitos. Isto mostra uma enorme capacidade que esses antígenos possuem em induzir uma modulação da resposta imune relacionada à resistência a infecção e a uma menor gravidade da doença. A categorização da população estudada, segundo intensidades de infecção distintas, definiu a contribuição dessa variável para os mecanismos de resistência e susceptibilidade durante a infecção esquistossomótica. / In this study, hematological and immunological features were determined in patients with chronic phase of schistosomiasis (INF), subcategorized by distinct parasitic loads in those with less than 100 eggs per gram of feces (<100) or more than 100 eggs per gram of feces (> 100). Non infected patients resident (CA) or not (CT) in endemic areas for the disease were evaluated as control groups. Stool samples and peripheral blood were collected to perform parasitological exams and hemogram, respectively. Afterwards, it was performed the immunophenotypic profile of circulating leukocytes and cytokine pattern in peripheral blood mononuclear cells cultures after antigenic stimulation in vitro at 12 hours in the absence or presence of soluble egg antigens (SEA), soluble worm antigen preparation (SWAP) and recombinant proteins of Schistosoma mansoni (Sm22.6 and Sm29 ). The results showed an increase in the absolute number of eosinophils in INF and >100 groups. It was also observed an increase in expression of TLR2, CD80, CD86 and CD54 on monocytes from CA, INF, and >100 groups as compared to CT group. It was still observed an increase in the CD18 receptor expression in T CD4+ lymphocytes from CA and <100 groups as compared to CT group. Decreased CD18 expression on >100 as compared to <100 group as well as increased expression of CD18 in <100 group as compared to CA group were also detected. Analyses of T CD8+ lymphocytes demonstrated an increase in the TLR2 expression from INF, <100 and >100 groups as compared to the CT group. Increased CD18 expression in <100 and CA groups as compared to CT group as well as decreased in CD18 expression from >100 as compared to <100 group were still revealed. In B lymphocytes, there was an increase in the both CD80 and CD86 expressions on <100 group as compared to CT group, and an increase in the CD86 expression from CA group as compared to CT group. The analysis after antigenic stimulation revealed in monocytes increased TGF- synthesis from INF and >100 groups stimulated with SEA and Sm22.6 as compared to CA group, and decreased IL-10, IL-12 synthesis from INF group as compared to CA group, and decreased IL-1 syntheses from CA, INF, <100 and >100 groups estimualated with SEA and Sm22.6 as compared to absence of stimulation. There was also reduction in positivity for IL-5 from <100 group stimulated with Sm22.6 as compared to CA group and increase in the IFN- from INF and >100 groups stimulated with SEA as compared to absence of stimulation  increase in F- and IL-10 synthesis from INF and >100 groups stimulated with SEA and Sm22.6 as compared to absence of stimulation by T CD4+ lymphocytes besides of increased IL-12 and TNF- from INF group stimulated with SEA as compared to CA group decreased IL-8 syntheses from >100 group stimulated with SEA, SWAP and Sm22.6 as compared to <100 group and decreased IL-5 syntheses from INF group stimulated with SWAP as compared to CA group by T CD8+ lymphocytes. In conclusion, the individuals with chronic phase of schistosomiasis and residents in endemic areas for the disease have strong expression of co-stimulatory, adhesion and cell activation molecules in circulating monocytes, B cells and CD4+ and CD8+ T lymphocytes, suggesting that these individuals have intense cellular activity that might be involved in immune response against S. mansoni infection. Overall, infected individuals presented, after antigenic stimulation in vitro with recombinant specific antigens, reduced syntheses of pro-inflammatory cytokines apart of increased regulatory cytokine synthesis from both monocytes and lymphocytes revealing a great ability of these antigens to induce a modulation of immune response related to the resistance to infection as well as a lower disease severity. The subcategorization of the study population according to distinct intensity of infection better define the contribution of this parameter to resistance or susceptibility during Schistosoma mansoni infection.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T13:22:20Z No. of bitstreams: 1 Tese_SabrinaSidneyCampolinaCoelho2.pdf: 2260381 bytes, checksum: 200d7bbf614868ff45e6a877b2d5657b (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T13:22:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_SabrinaSidneyCampolinaCoelho2.pdf: 2260381 bytes, checksum: 200d7bbf614868ff45e6a877b2d5657b (MD5) / Approved for entry into archive by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2015-04-10T13:22:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_SabrinaSidneyCampolinaCoelho2.pdf: 2260381 bytes, checksum: 200d7bbf614868ff45e6a877b2d5657b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-10T13:22:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_SabrinaSidneyCampolinaCoelho2.pdf: 2260381 bytes, checksum: 200d7bbf614868ff45e6a877b2d5657b (MD5) Previous issue date: 2014 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil / No presente trabalho investigou-se a relação entre infecções por geohelmintos e S. mansoni e os fatores de risco para alergia em duas áreas endêmicas com diferentes prevalências de infecção e co-infecção. A intensidade das infecções, eosinofilia, fatores de risco para alergia, co infecção e os níveis de IgE anti-Der p 1 e anti-Ascaris antes e 2 anos (população 1) e 3 anos (população 2) após o tratamento com drogas anti-helmínticas foram avaliados. Observou-se que na população com baixa prevalência e intensidade de infecção (população 2) apresentou menor contagem de eosinófilos (>600/mm3) e maior contato com animais do que a população com alta prevalência e intensidade de parasitos (população 1). Após o tratamento a intensidade da infecção por S. mansoni diminuiu, mas não foram observadas mudanças nos indivíduos infectados por geohelmintos ou co-infectados. Na população 1, o tratamento anti-helmíntico aumentou os níveis de densidade óptica pelo método de ELISA de IgE anti-Der p1 e anti-Ascaris nos subgrupos que se tornaram negativos para infecção helmíntica independente da condição prévia ao tratamento. Diante disso, avaliou-se o index de reatividade de IgE anti-Der p1, e a razão (após/antes tratamento) foi significativamente maior em pacientes coinfectados antes do tratamento. Por outro lado, nenhuma associação entre o índex de reatividade de IgE anti-Der p1 e a intensidade foram observados. Conclui-se que o tratamento antihelmíntico de indivíduos de áreas endêmicas com alta prevalência para infecções por geohelmintos e S.mansoni aumenta os níveis de IgE anti-Der p1 e que há uma correlação direta entre os níveis de IgE anti-Der p1 com os níveis de IgE e anti- Ascaris, mostrando que altos níveis de IgE anti- Ascaris e não somente a infecção, é um fator de risco para o desenvolvimento de doenças alérgicas. / In this work were investigated the relationship between Hookworm/S. mansoni infections and allergy related risk factors in two endemic areas with distinct prevalence of infections and co-infection. The intensity of infections, eosinophilia, allergy risk factors, infections status and anti-Der p1 IgE levels before and two years (population 1) and three years (population 2) after anthelmintic treatment, were evaluated. It was observed that the population with lower prevalence and intensity of infection (population 2) had lower eosinophils counts (>600/mm3) and higher animal contact than the population with higher parasites intensity (population 1). After anthelmintic treatment the intensity of S. mansoni single infection decreased, but no changes were observed in Hookworm and co-infected individuals. The anthelmintic treatment also enhanced anti-Der p1 IgE optical density in ELISA on the subgroups that became negative for helminth infection regardless of their previous infection condition in population 1. Facing that, we evaluated the anti-Der p1 IgE reactivity index, and the ratio (after/before treatment) was significantly higher in patients coinfected before treatment. On the other hand, no association between anti-Der p1 IgE reactivity index and the intensity of infections were observed. In conclusion, effective anthelmintic therapy of subjects from endemic areas with high prevalence of Hookworm and S.mansoni infections enhances anti-Der p1 IgE levels and there is a relationship between the anti-Ascaris IgE levels and IgE anti- Der p1, showing that the first one, not only the infection, is a risk factor to allergic disorders development.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas / Conteúdo não liberado pelo autor.

Made available in DSpace on 2014-08-20T13:32:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_elizandra_schoenardie.pdf: 268602 bytes, checksum: 08408f44b3e993faf7cf221741aa401e (MD5) Previous issue date: 2005-06-24 / The Visceral Larva Migrans (VLM) is a zoonotic disease caused by the helminth Toxocara cannis. The precocious diagnosis of this disease in humans is very important to determinate the evolution of the clinical case and the patient's treatment. The goal of the first experiment was determinate the presence of antibodies anti-T. cannis in children from Pelotas through the Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) front to the antigen TES, as well as to define the pattern of bands recognized by the positive serums in ELISA through the "Western blotting . For this experiment 427 serums from children, with ages between one to eleven yeas old was tested, those serums was adsorved with AgSoAl and determinate that 50,6% was positive for antibodies anti-TES, showing a significant association among the positive children for antibodies anti-TES and the contact with dogs and cats. This association was also observed in the children's different age groups, but not regarding the gender of the same ones. To perform the Western Blotting , 70 serums witch give a positive result in the Indirect ELISA was been used, all serums recognize glicoproteic bands in the range between 30 and 120 kDa. Was observed a diminution in the crusade reaction with AgSoAl when the adsorved and not adsorved serums with this antigen has been test in the Western blotting , where a band of 30 kDa demonstrate to be an important glicoprotein to specific diagnosis of VLM. In the second experiment, 25 mice BALB/c were inoculated with approximately 1000 eggs containing the larvae L3. Each fifteen days blood collection was made through the reto orbital plexus until the 105 days after de animals infection. The serums was tested in the Indirect ELISA using the Antigen TES and urea 6M in order to discriminate recent and late infection, through the percentile of avidity of the IgG in the different days after the infection. A low percentile of avidity was observed to the 15 days after inoculation (between 7,25 and 27,5%). After 60 days of infection, all the animals presented avidity between 31,4 and 58%. This result suggests that in mice BALB/c, to the 60 days after infection the chronic phase of VLM is already established. / A Larva Migrans Visceral (LMV) é uma doença zoonótica que possui como principal agente etiológico o helminto Toxocara canis. O diagnóstico precoce da doença no homem é importante para estudos de evolução clínica e tratamento do paciente e os inquéritos epidemiológicos para determinar a freqüência da infecção em uma população. Por isso, o primeiro experimento teve como objetivo, determinar a presença de anticorpos anti-T. canis em crianças da região de Pelotas através de Enzyme linked immnosorbent assay (ELISA) com o antígeno de excreção e secreção de larvas de Toxocara canis (TES), bem como definir, através de Western blotting , o padrão de bandas do TES reconhecidas pelos soros positivos ao ELISA. Foram ensaiados no ELISA Indireto 427 soros de crianças de um a 12 anos de idade adsorvidos com antígeno somático de Ascaris lumbricoides e determinado que 50,6% apresentaram anticorpos anti-TES, ocorrendo uma associação significativa entre as crianças positivas e o contato com cães e gatos. Esta associação também foi observada em diferentes faixas etárias das crianças, mas não com relação ao sexo das mesmas. Setenta soros positivos no ELISA foram ensaiados no Western blotting e todos reconheceram frações proteicas entre 30 e 120 kDa. Uma diminuição da reação cruzada com o AgSoAl foi observada quando soros adsorvidos com este antígeno foram testados no Western blotting , sendo que uma fração antigênica de 30 kDa apresentou-se como uma proteína importante para o diagnóstico específico da LMV. No segundo experimento, 25 camundongos BALB/c foram inoculados com aproximadamente 1000 ovos contendo a larva infectante (L3). Colheitas quinzenais de sangue foram realizadas através do plexo retro orbital até os 105 dias pós-infecção dos animais. Os soros foram ensaiados no ELISA Indireto utilizando o antígeno TES e a uréia 6M a fim de discriminar infecção recente e tardia, através do percentual de avidez da IgG nos diferentes dias após a infecção. Um baixo percentual de avidez, característico da infecção aguda, foi observado aos 15 dias pós-inoculação (entre 7,3 e 27,5%). Após 60 dias de infecção, todos os animais apresentaram avidez entre 31,4 e 58%. Através destes resultados, sugere-se que em camundongos BALB/c, aos 60 dias pós-infecção a fase crônica da LMV já está estabelecida.

A proteína recombinante B13 contém repetições seriadas de 12 aminoácidos e corresponde a uma região do antígeno imunodominante de 140-116 KDa encontrado na superfície da forma tripomastigota de T. cruzi (cepa Y). A proteína B13 apresenta elevada sensibilidade e especificidade no diagnóstico sorológico da Doença de Chagas. A análise da distribuição de subclasses de IgG anti-B13 em soros de pacientes chagásicos cardiopatas (SCC) e de assintomáticos (SCI) mostrou o mesmo padrão: IgG1&#187;IgG3>IgG2>IgG4. No entanto, a média de reatividade a B13 foi maior no grupo SCC do que no grupo SCI. Dados anteriores de nosso grupo indicam que a resposta de célula Ta B13 é restrita ao grupo HLA de classe II (HLA- DQA1*0501, DRB1*0101 and DRB5*0101 - denominado grupo HLA+). Por outro lado, dados da literatura sugerem que antígenos repetitivos de protozoários são antígenos T-independentes. Analisamos por ELISA a reatividade a B13 em soros de pacientes HLA+ e HLA- (portadores de outros alelos). Os resultados obtidos indicam que a média de reatividade a B13 é semelhante nos dois grupos de soros, sugerindo que no grupo HLA- a resposta de anticorpos anti-B13 pode ser T-independente. Utilizando peptídeos sintéticos derivados da seqüência de B13 concluímos que o epitopo imunodominante está contido na seqüência FGQAAAGDK. Visando mapear o epitopo responsável pela resposta anti-B13 e analisar uma possível correlação entre estrutura e atividade antigênica, três peptídeos sintéticos contendo o centro do epitopo AAAGDK (pB13 - GDKPSLFGQAAAGDKPSPLF; S4 -FGQAAAGDK e S5 -QAAAGDKPS) foram analisados quanto à sua capacidade de inibir a reatividade de soros de chagásicos à proteína recombinante B13. Os resultados mostram haver uma hierarquia na atividade antigênica inibitória dos peptídeos (pB13>S4>S5), que poderia estar relacionada com a capacidade distinta dos peptídeos em assumir uma estrutura secundária ordenada. As propriedades estruturais dos peptídeos foram analisadas por DC e RNM e indicam que os peptídeos apresentam uma hierarquia pB13>S4>S5 quanto à capacidade de adquirir uma conformação em hélice. Dados anteriores indicam que soros de pacientes chagásicos da América Central e do Sul apresentam diferenças na mediana de reatividade à proteína B13 em testes de ELISA: por ex. Argentina MD=1.79; Brasil MD=1.51; Honduras MD=0.91. Investigamos alguns parâmetros sorológicos que pudessem explicar as diferenças observadas. Soros de 224 indivíduos chagásicos da Argentina, Brasil, Bolívia, Colômbia, El Salvador, Honduras e Venezuela foram analisados com relação à subclasse de IgG responsável pelo reconhecimento de B13. Os dados mostram igual distribuição das subclasses com a seguinte ordem decrescente de reatividade: IgG1&#187;IgG3>IgG2>IgG4. Também concluímos que os soros em questão reconhecem o mesmo epitopo imunodominante da proteína B13. Uma alternativa para explicar variações na resposta imune do hospedeiro a B13 seria a heterogeneidade molecular do antígeno correspondente a B13 nas cepas de T. cruzi. Primeiramente investigamos a massa molecular deste antígeno em sete cepas do parasita derivadas de diferentes regiões geográficas em ensaios de Western blot com soro anti-proteína recombinante B13. Observamos que a massa molecular deste antígeno varia de 100 a 190 KDa e que em várias cepas o soro anti-B13 reage com dois polipeptídeos. Com base nestes resultados investigamos a organização deste gene de cópia única no genoma das cepas. Concluímos que este gene está localizado em uma banda cromossômica única que apresenta variação de tamanho entre as cepas (1,25 a 0,9 Mpb). Análise por Southern blot indicou que o gene B13 apresenta arranjo diferente no genoma das cepas. Investigamos também o tamanho da região que contém as repetições seriadas no gene B13. A partir de dados da seqüência deste gene da cepa CA-1 desenhamos um par de oligonucleotídeos que flanqueiam esta região. DNA genômico de 23 cepas foi submetido a PCR com este par de iniciadores, detectando-se produtos de amplificações com tamanho variando de 2,1 a 3,5 Kb em 11 cepas. Após seqüenciamento da região a 3\' das repetições seriadas do gene B13 da cepa Y, foi desenhado um segundo par de oligonucleotídeos iniciadores. Amplificação foi obtida em quatro cepas adicionais. Em 73% das cepas houve amplificação de um único fragmento enquanto nas demais dois produtos foram obtidos. Os dois produtos podem corresponder a diferenças no tamanho da região das repetições dos dois alelos do gene B13. Também analisamos a seqüência de nucleotídeos de 83 unidades repetitivas em cinco cepas de T. cruzi. Concluiu-se que o epitopo imunodominante (FGQAAAGDK) é altamente conservado nas unidades das cepas embora algumas variações de aminoácidos foram observadas em algumas unidades. Tomados em conjunto os dados indicam haver polimorfismo do gene de B13 em cepas de T. cruzi quanto a: (a) grande variação no número de unidades repetitivas (de 58 a 97 unidades); (b) baixa variação na seqüência que flanqueia a região repetitiva; (c) certa variação na seqüência codificadora de aminoácidos da região imunodominante. Como conseqüência destas observações, sugere-se que as diferenças observadas no número de unidades repetitivas e na estrutura de algumas destas repetições no antígeno B13 de cepas de T. cruzi podem ter implicações na indução da resposta humoral e celular do hospedeiro e poderiam explicar, em conjunto com diferenças genéticas do indivíduo, a variação da resposta imune a B13 observada em soros de pacientes chagásicos. Que seja de nosso conhecimento este é o primeiro estudo que analisa a estrutura geral de um gene de antígeno que apresenta domínios repetitivos em cepas de T. cruzi. / The recombinant protein B13 contains 12 amino acid tandem repeats and corresponds to the immunodominant region of the 140/116 KDa surface antigen of T. cruzi trypomastigotes of the Y strain. B13 protein shows high sensitivity and specificity in the serological diagnosis of Chagas disease. The analysis of anti-B13 IgG subclass distribution in sera of chronic chagas disease cardiopathy patients (CCC) and asymptomatic patients (ASY) showed the same pattern: IgG1&#187;IgG3>IgG2>IgG4. However, the mean of reactivity to B13 was higher in the CCC group as compared with ASY. Previous data from our laboratory indicate that T cell response to B13 protein is MHC class II-restricted (HLADQA1*0501, DRB1*0101 and DRB5*0101 - named as group HLA+). On the other hand, data from the literature suggest that repetitive antigens from protozoa are T-independent antigens. Reactivity to B13 was analyzed by ELISA in sera of patients HLA+ and HLA-(presenting the other alleles). Similar mean ODs values were obtained for the two groups of sera suggesting that at least in the HLA- group the humoral response to B13 could be T-independent. Competitive ELISA employing synthetic peptides derived from B13 sequence allowed concluding that the immunodominant epitope is included in the FGQAAAGDK sequence. To define the minimum epitope responsible for the anti-B13 response and to analyze a possible correlation between structural features and antigenic activity three synthetic peptides bearing the core (AAAGDK) of the immunodominant epitope (pB13 -GDKPSLFGQAAAGDKPSPLF; S4 -FGQAAAGDK e S5 -QAAAGDKPS) were assayed regarding their ability to inhibit chagasic sera reactivity to B13. A hierarchy in the inhibitory antigenic activity was observed (pB13>S4>S5), that could reflect the distinct capacity of the polypeptides to assume an ordered secondary structure. This feature was investigated by CD and NMR. Data are suggestive that the three peptides have the some hierarchy regarding their capacity to acquire a helical conformation (pB13>S4>S5). Previous analyses of chagasic sera from nine countries of Central and South America showed variations in the mean O.D. values of B13-ELISA according to the country (eg Argentina, MD=1.79; Brazil, MD=1.51; Honduras, MD=0.91). We investigated some serological parameters that could explain the observed variation. 224 chagasic sera from Argentina, Brazil, Bolívia, Colombia, EI Salvador, Honduras and Venezuela were investigated concerning the IgG subclass reactive to B13. Data indicate that all the sera displayed the some subclass distribution: IgG1&#187;IgG3>IgG2>IgG4. It was also concluded that the some immunodominant epitope of B13 protein was recognized by the sera. As an alternative to explain variations in the host immune response to B13 we investigated the molecular heterogeneity of the native B13 antigen in different T. cruzi strains. Firstly we analyzed the molecular mass of this antigen in seven stocks derived from different hosts and geographic regions. Western blot experiments employing anti-recombinant protein B13 serum showed variations in the molecular mass of B13 antigen ranging from 100 to 190 KDa. In most of the stocks, anti-B13 serum reacted with two polypeptides. Based on these results we investigated the organization of the B13 single copy gene in the genome of the strains. It was concluded that the gene is localized in a single chromosomal band presenting size variation among the strains (1,25 to 0,9 Mbp). Southern blot analysis indicated that B13 gene has different genomic arrangement. We have also investigated the size of the region that contains the tandem repeats. Based on the sequence of a B13-homologous gene of the CA-1 strain we designed a pair of oligonucleotide primers flanking the repetitive region. Genomic DNA of 23 parasite strains was submitted to PCR with these primers. Amplification products ranging from 2.1 to 3.5 Kb were observed in 11 stocks. After sequencing of a region located at the 3\' end of the repetitive portion of B13 gene of the Y strain, a second pair of primers was designed. PCR amplification was obtained in four additional strains. Most of stocks (73%) originated only one amplified band while two products were detected in the remaining strains. The two products could derive from the independent amplification of the repetitive regions of the two alleles of B13 gene. We have also analyzed the nucleotide sequence of 83 repetitive units of f ive T. cruzi strains. It is concluded that the immunodominant epitope (FGQAAAGDK) is highly conserved among the units and the various parasite strains, although few amino acid variations were detected in some units. Taken together these data indicate polymorphism of B13 gene among T. cruzi strains regarding: (a) high degree of heterogeneity in the number of repetitive units (it is estimated that this number varies form 58 to 97 units); (b) discrete sequence variation upstream and downstream of the repetitive region; (c) minor variations in the codified amino acid of some repetitive units. Differences in the number of repetitive immunodominant units and in the structure of some of these repeats may have implications on the induction of humoral and cellular responses of the host to B13 antigen. These parameters in conjunction with genetic characteristics of the individuais could explain the variation of reactivity to B13 observed in sera of chagasic patients. To our knowledge this is the first report that describes the general structure of an antigen gene bearing repetitive domains in T. cruzi strains.

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Introduction: Has been observed the global spread of different variants of P. aeruginosa that is often associated with increased virulence or the emergence of new antimicrobial resistance genotypes. There are few studies describing the association of the Type III Secretion System (TTSS) with antibiotic resistance and outcome of patients with pneumonia and bacteremia. Objectives: Determine the relation among resistance to carbapenems and fluoroquinolones and the Type III Secretion System (TTSS) effector genotype and its association with the poor prognostic in patients with ventilator-associated pneumonia (VAP) and bacteremia, identify mutations in the Quinolone Resistance Determining Regions (QRDRs), Metallo-&#946;-Lactamase genes (M&#946;L), virulence genes (algD, lasB e toxA) and clonal spread of isolates producing M&#946;L. Material and Methods: A retrospective cohort was conducted to determine the risk factors for 30-day mortality in patients with the first episode of bacteremia (157 patients) and VAP (60 patients) caused by P. aeruginosa. Genes blaIMP, blaVIM, blaSIM, blaGIM and blaSPM, TTSS genes (exoT, exoS, exoY, exoU ) and virulence genes (lasB, algD, toxA) were detected by PCR; the sequencing was conducted for QRDR genes (gyrA e parC) on fluoroquinolone-resistant strains and the Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) for molecular typing of positive strains for the M&#946;L genes Results: The multivariate analysis showed that predictors independently associated with death in patients with bacteremia were inappropriate therapy and cancer. Carbapenem resistance was more frequent among strains of VAP (53.3%), however with the detection of M&#946;L genes in one isolate (blaIMP), unlike blood, where the frequency of these genes was 16.1%, being 10.7% blaSPM genotype and 5.4% blaVIM genotype. The exoS gene was found in all blood and lung isolates and the exoU gene only in 9.4%. Substitution of threonine to isoleucine at position 83 in gyrA was the most frequent mutation among fluoroquinolone-resistant strains. It was detected a mutation at position 91 in parC gene (Glu91Lys) associated with mutation in gyrA (Thre83Ile) in a strain of extensively drug-resistant P. aeruginosa, exoT+exoS+exoU+ genotype, isolate from lung, not described in Brazil yet. Among the strains that harboring the TTSS virulence genes it was observed high resistance to gentamicin (93.7%) and low for amikacin (37.5%). The evaluation of the clonal relationship between isolates producing blaSPM, blaVIM and blaIMP genes showed similarity (more than 80%) among the blaSPM strains, which was not observed for those producing blaVIM gene. Conclusions: Our results confirm previous findings regarding the spread of blaSPM clone, with indirect evidence of its cross-spread in our hospital and polyclonal those containing the blaVIM gene. Inappropriate therapy is significant factor for poor prognosis among patients with bacteremia caused by multidrug-resistant P. aeruginosa , independent of the virulence TTSS genotype associated. / Introdução: Vem sendo observado a disseminação global de diferentes variantes de P. aeruginosa que está frequentemente associada a maior virulência ou a emergência de novos genótipos de resistência aos antimicrobianos. Há poucos estudos descrevendo a associação do Sistema de Secreção Tipo III (TTSS) com resistência aos antibióticos e evolução dos pacientes com pneumonia e bacteremia. Objetivos: Determinar a relação entre resistência a fluorquinolonas e carbapenêmicos e a virulência de Pseudomonas aeruginosa pelo Sistema de Secreção Tipo III e sua associação com pior prognóstico em pacientes com Pneumonia Associada a Ventilação Mecânica (PAV) e bacteremia, identificar mutações na Região Determinante de Resistência as Quinolonas (QRDR), genes para Metalo-&#946;-Lactamase (M&#946;L), genes de virulência (algD, lasB e toxA) e disseminação clonal das amostras produtoras de M&#946;L. Material e Métodos: Foi realizada uma coorte retrospectiva para determinar os fatores de risco para mortalidade em 30 dias em pacientes com primeiro episódio de bacteremia (157 pacientes) e PAV (60 pacientes) por P. aeruginosa. Os genes blaIMP, blaVIM, blaSIM, blaGIM e blaSPM, os genes do TTSS (exoT, exoS, exoY, exoU ) e os genes de virulência (lasB, algD, toxA) foram detectados por PCR; o sequenciamento foi realizado para os genes do QRDR (gyrA e parC) nas cepas resistentes a fluorquinolonas e o Pulsed-Field Gel Electrophoresis (PFGE) para tipagem molecular das amostras positivas para o gene produtor de M&#946;L. Resultados: A análise multivariada mostrou que os preditores independentemente associados com mortalidade nos pacientes com bacteremia foram terapia antimicrobiana inapropriada e câncer. A resistência aos carbapenêmicos foi maior entre as amostras de PAV (53,3%), porém com a detecção dos genes que codificam M&#946;L em apenas um isolado (blaIMP), ao contrário do sangue, onde a frequência desses genes foi de 16,1%, sendo 10,7% blaSPM e 5,4% blaVIM. O gene exoS foi encontrado em todas as amostras avaliadas de sangue e pulmão e o gene exoU em apenas 9,4% das mesmas. A substituição de uma treonina por isoleucina na posição 83 no gene gyrA foi a mais frequente entre as cepas resistentes a fluorquinolonas. Foi detectada uma mutação na posição 91 no gene parC (Glu91Lys) associada com a mutação em gyrA (Thre83Ile) em uma amostra de P. aeruginosa ,isolada do pulmão, extensivamente resistente, do genótipo exoT+exoS+exoU+ , ainda não descrita no Brasil. Entre as amostras que carreavam os genes de virulência TTSS observou-se alta resistência a gentamicina (93,7%) e baixa para amicacina (37,5%). A avaliação da relação clonal entre as amostras contendo os genes blaSPM, blaVIM e blaIMP , apresentou alta similaridade (maior que 80%), naquelas contendo blaSPM, o que não foi observado para as amostras contendo o gene blaVIM. Conclusões: Nossos resultados confirmam achados prévios com relação a disseminação do clone blaSPM, com evidências indiretas da sua disseminação cruzada no nosso hospital e policlonal daquelas contendo o gene blaVIM. A terapia inapropriada é fator significativo para pior prognóstico entre os pacientes com bacteremia por P. aeruginosa multirresistente, independente do genótipo de virulência TTSS associado. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Human strongyloidiasis is an important intestinal parasitic infection worldwide, 50% of infected individuals are asymptomatic, however it can cause hyper infection and dissemination in immunocompromised hosts leading to death. Early detection of the disease prevents the development of hyper infection and dissemination syndromes, so the use of an efficient diagnostic tool has great importance to identify and control this parasitic disease. Due to the lack of efficiency in parasitological and serological tests currently available to detect human strongyloidiasis it is necessary to improve immunodiagnostic tests using recombinant and synthetic antigens once there are limitations to obtain and use homologous antigens produced from the parasite. The aim of this study was to select using phage display technology Strongyloides stercoralis mimetic peptides ligands to immunoglobulin G from patients with strongyloidiasis. The PhDTM-C7C library was used in the selection process and the DNA of the selected clones was extracted, sequenced and analyzed using bioinformatics tools. ELISA tests were done by using five distinct phage clones, which presented significant similarity with proteins from S. stercoralis, and the two synthetic peptides corresponding to the sequences displayed on two phage clones. Binding specificity of each phage clone to the pool of sera from patients with strongyloidiasis was analyzed by competitive ELISA. Sensitivity, specificity, diagnostic efficiency, area under curve and likelihood ratio were calculated for each antigen. All phage clones presented high diagnostic potential achieving area under curves higher than 0.8, the C9 clone presented reasonable sensitivity (87.5%), specificity (80%) and diagnostic efficiency (82.5%).Synthetic peptides C10 and D3 showed superior diagnostic performance, with areas under the curve greater than 0.9 and excellent sensitivity (95%, 95%), specificity (86.3%, 92.5%) and diagnostic efficiency (89 2%, 93.3%) respectively. It was concluded that the selected peptides by Phage display can mimic S. stercoralis epitopes and represent promising alternative to the currently available antigens for human strongyloidiasis diagnosis. / Estrongiloidiase humana é uma importante parasitose intestinal em todo mundo, 50% das pessoas infectadas são assintomáticas, entretanto pode haver hiperinfecção e disseminação em pacientes imunocomprometidos, levando à morte. A detecção precoce da doença previne o desenvolvimento das síndromes de hiperinfecção e disseminação, assim, o uso de uma ferramenta diagnóstica eficiente é de grande importância para identificar e controlar esta parasitose. Devido à falta de eficiência nos testes parasitológicos e sorológicos disponíveis atualmente para detectar estrongiloidiase humana é necessário aprimorar os testes imunodiagnósticos utilizando antígenos recombinantes e sintéticos, uma vez que há limitações para obter e utilizar antígenos homólogos, produzidos a partir do parasito. O objetivo deste trabalho foi selecionar por Phage display peptídeos miméticos a Strongyloides stercoralis ligantes a imunoglobulinas G de pacientes com estrongiloidiase. Uma biblioteca PhDTM-C7C foi utilizada no processo de seleção e o DNA dos clones selecionados foi extraído, sequenciado e analisado por ferramentas de bioinformática. Os testes ELISA foram feitos utilizando cinco clones de fagos distintos, os quais tiveram similaridades significantes com proteínas de S. stercoralis, e dois peptídeos sintéticos correspondentes às sequências expressas por dois clones selecionados. A especificidade de ligação de cada clone de fago ao pool de soros de pacientes com estrongiloidiase foi analisada por ELISA de competição. Sensibilidade, especificidade, eficiência diagnóstica, áreas sob a curva e razão de verossimilhança foram calculados para cada antígeno. Todos os clones de fagos analisados apresentaram alto potencial diagnóstico alcançando área sob a curva maiores que 0,8, se destacando o clone C9 com razoável sensibilidade (87,5%), especificidade (80%) e eficiência de diagnóstica (82,5%). Os peptídeos sintéticos C10 e D3 apresentaram desempenho diagnóstico superior, com áreas sob a curva maiores que 0,9 e excelente sensibilidade (95%, 95%), especificidade (86,3%, 92,5%) e eficiência de diagnóstica (89,2%, 93,3%) respectivamente. Concluiu-se que os peptídeos selecionados por Phage display podem mimetizar epitopos de S. stercoralis e representam alternativa promissora aos antígenos atualmente disponíveis para utilização no diagnóstico da estrongiloidiase humana. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

A imunidade inata mostra-se importante na defesa do hospedeiro contra a infecção por fungos, e dentro desse contexto macrófagos e neutrófilos (PMN) desempenham papel central na Paracoccidioidomicose. O tratamento desta doença inclui o uso de antifúngicos que, além do prolongado tempo de administração, podem ter diversos efeitos colaterais, sendo necessário pesquisa de tratamentos mais eficientes ou adjuvantes. A laserterapia de baixa potência (LLLT) vem sendo utlizada como tratamento adjuvante para muitas enfermidades, e já foi demonstrado seu efeito modulador em células imunes. Neste trabalho avaliamos os efeitos da LLLT (λ= 780 nm e 50 mW) aplicadas in vivo e em dias alternado em dois pontos das patas traseiras de camundongos Swiss inoculados pela via “air pouch” subcutânea com P. brasiliensis cepa 18 (Pb18) ou com Zymosan. Grupos de animais que não sofreram irradiação foram utilizados como controle. Após 10 dias da infecção nós obtivemos uma população de PMN altamente pura, que posteriormente foram mantidos em cultura na presença de Pb18 para ensaios de produção de proteínas, avaliação da atividade mitocondrial, produção de metabólitos do oxigênio e quantificação de fungos viáveis por ensaios de UFC. Os resultados mostraram que os PMN de animais que sofreram irradiação, independente do estímulo in vivo para sua obtenção, apresentaram maior produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), atividade mitocondrial elevada e maior atividade fungicida. Com relação à produção de proteínas, os PMN de animais que não sofreram irradiação in vivo apresentaram crescimento constante na produção, enquanto que nos PMN de animais que sofreram irradiação essa produção diminuiu com o tempo de incubação. Podemos concluir que a LLLT rende aos PMN maior atividade metabólica, o que resulta em maior atividade fungicida contra o Pb18, provavelmente devido à maior produção de ERO independente do estímulo utilizado para sua obtenção. / Innate immunity is an important component of host defense against by fungi, and into this context macrophages and neutrophils (PMN) play a central role in paracoccidioidomycosis. The treatment of this disease includes the use of antifungals that, which in addition to the prolonged administration time needed may have many side effects, so research for more efficient drugs or adjuvant treatments is needed. Low level laser therapy (LLLT) has been used as adjuvant treatment for many ailments, and its modulating effect on immune cells has already been demonstrated. In this work, we evaluated the effects of LLLT (λ= 780 nm e 50 mW) applied “in vivo” in alternate days at two points of hind paws of Swiss mice inoculated in the subcutaneous air pouch with the virulent P. brasiliensis Pb18 isolated or with Zymosan. Unirradiated animals were used as controls. After 10 days of infection we obtained a highly pure population of PMN, which subsequently were maintained in culture in presence of Pb18 for trials to protein production, evaluation of mitochondrial activity, production of reactive oxygen species (ROS) and quantification of viable fungi. The results showed that PMN from irradiated animals, regardless of the “in vivo” stimulus for their obtention, presented higher production of ROS, elevated mitochondrial activity and increased fungicidal capacity. Regarding the production of proteins, PMN from unirradiated animals showed increased production, while the treated group decreased gradually this production with the time of incubation. We conclude that LLLT renders PMN more active metabolically, resulting in higher fungicidal activity against Pb18, probably due to increased production of ROS, independently of the stimulus used to obtain it.

A paracoccidioidomicose (PCM) é caracterizada como uma micose profunda e que acomete, principalmente, indivíduos do sexo masculino e de regiões agrícolas. A infecção ocorre através da inalação de propágulos fúngicos presentes no ambiente, atingindo inicialmente os pulmões e podendo se disseminar para outros órgãos. O diagnóstico precoce da doença previne a formação de sequelas e garante que o trabalhador dê continuidade a sua atividade de vida diária. Os testes de intradermorreação, imunodifusão dupla e ELISA são os mais utilizados no diagnóstico da PCM, no entanto, podem apresentar reatividade cruzada com outras doenças, como Histoplasmose, Candidíase e Criptococose. Em ensaios de Dot Blot com gp43 purificada, foi comprovada a eficiência deste teste para o sorodiagnóstico da PCM em pacientes durante terapia antimicótica, apresentando alta sensibilidade e especificidade. Portanto, objetiva-se com este trabalho utilizar a técnica do ensaio de Dot Blot com a glicoproteína de 43 KDa como um método de diagnóstico para a PCM infecção em indivíduos expostos ao Paracoccidioides brasiliensis na área rural de Alfenas. A prevalência de positividade nos testes Dot Blot, ELISA e IDR foi 57,57% 56,71% 68,83% respectivamente. A proporção de positivos no teste de Dot Blot foi maior no gênero masculino. A maioria dos indivíduos positivos situa-se na faixa etária acima dos 30 anos. Os resultados mostram uma maior concordância entre o teste Dot Blot e ELISA. Devido à dificuldade na padronização no teste Dot Blot e a uma melhor reprodutibilidade e rapidez do teste de ELISA, os resultados sugerem que o teste de ELISA seja mais adequado para levantamento da prevalência da PCM em áreas rurais. / The paracoccidioidomycosis (PCM) is characterized as a deep mycosis and that affects mainly males and agricultural regions. Infection occurs by inhalation of fungal propagules in the environment, initially reaching the lungs and may spread to other organs. Early diagnosis of the disease prevents the formation of sequels and ensures that the worker gives continuity to their activities of daily living. The intradermal tests, immunodiffusion and ELISA are the most used in the diagnosis of PCM, however, may show cross-reactivity with other diseases such as histoplasmosis, candidiasis and cryptococcosis. Therefore, the objective of this study was to use the technique of Dot Blot assay glycoprotein of 43 kDa as a diagnostic method for PCM infection in individuals exposed to P. brasiliensis in rural Alfenas. Different variables were tested in the standardization of Dot Blot assay using sera samples from patient’s positive and negative individuals. The prevalence of positivity in Dot Blot, ELISA and IDR tests was 57.57%, 56.71% and 68.83% respectively. Seropositivity in the Dot Blot test was higher in males. Most positive individuals lie in the age group above 30 years. The results show a better agreement between the Dot Blot and ELISA. Due to the difficulty in standardizing the Dot blot test a better reproducibility and speed of ELISA, the results suggest that ELISA is more suitable for survey of the prevalence of PCM in rural areas.