Made available in DSpace on 2016-08-17T15:00:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Raquel Silva Fonteles.pdf: 595737 bytes, checksum: 1cef131034266e95108a1695a3835c0b (MD5) Previous issue date: 2009-02-12 / In this study we examined, whether L. whitmani is susceptible to experimental infection by L. brasiliensis, causing Cutaneous and Mucocutaneous Leishmaniasis, and L. amazonensis, causing Diffuse Cutaneous Leishmaniasis. L. whitmani individuals were collected to establish a colony free from these parasites. Mice were experimentally infected with L. brasiliensis or L. amazonensis parasites. Female of this L. whitmani colony were permitted to feed on mice exhibiting clinical signs of the disease. Phlebotominae infected with parasites were detected by amplifying a Leishmania 120 bp specific kinetoblast DNA by means of PCR. The L. whitmani infection rate for Leishmania brasiliensis and Leishmania amazonensis was 65.2% and 47.4%, respectively and confirmed that the vector is susceptible to experimental L. brasiliensis and L. amazonensis infection. Comparison of the infection rates revealed statistically significant differences. The high L. whitmani infection rate together with epidemiological and entomological studies, verified that L. whitmani is responsible for L. brasiliensis infection. Remarkably, here we report for the first time that L. whitmani is vulnerable to experimental L. amazonensis infection and may be a vector of this pathogen and the distributor for Diffuse Cutaneous Leishmaniasis. / Este estudo teve como objetivo a análise da suscetibilidade experimental de Lutzomyia whitmani para infecção com Leishmania brasiliensis causadora da Leishmaniose Cutânea e Cutâneo-Mucosa e Leishmania amazonensis causadora da Leishmaniose Cutânea Difusa. Para isso, uma colônia de L. whitmani foi estabelecida com a finalidade de fornecer espécimes livres destes parasitas que foram submetidos à alimentação em camundongos experimentalmente infectados com L. brasiliensis e L. amazonensis. A infecção com parasita foi detectada a partir da amplificação por PCR de fragmentos de 120 pb de DNA cinetoplasto do gênero Leishmania sp. As taxas de infecção encontradas foram de 65,2% e 47,4% para L. brasiliensis e L. amazonensis, respectivamente, sendo, portanto, L. whitmani suscetível à infecção experimental por estas espécies de Leishmania. A comparação entre as taxas de infecção mostrou diferenças significativas. Assim, concluímos que a alta taxa de infecção desse vetor com L. brasiliensis associados à estudos epidemiológicos e entomológicos podem responsabilizá-lo pela transmissão da Leishmaniose Cutânea e Cutâneo-Mucosa. Notavelmente, pela primeira vez foi detectado que este flebotomíneo é suscetível à infecção experimental por L. amazonensis podendo ser um vetor para transmissão desse patógeno e dispersor da Leishmaniose Cutânea Difusa.

Made available in DSpace on 2016-08-19T17:47:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO WALMA FERNANDA MEIRELES SANTOS.pdf: 288787 bytes, checksum: 2e960028530403c4e90066e07ca8ceca (MD5) Previous issue date: 2011-10-31 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Maranhão is one of the states with the highest occurrence of American cutaneous leishmaniasis (ACL). Thus, it should be the focus of studies related to this disease. This study was conducted in Buriticupu-MA, a city with higher incidence of leishmaniasis in the State. This work aimed to study epidemiological aspects of ATL in Buriticupu the period 2005 to 2010. Data collection was performed at the Center for Studies in Tropical Medicine of the Pre-Amazon UFMA, Meteorology Laboratory of the Center Geoenvironmental UEMA, the Department of the Unified Health System - DATASUS and capture of sandflies in areas with reported cases ACL with the CDC light traps. It found the diagnosis of 281 autochthonous cases of ATL in Buriticupu, of which 238 patients were aged 10 years or more, predominantly in individuals 20 to 29 years. Regarding gender, 86 were female and 195 male. Virtually all cases were diagnosed with the cutaneous form, with the direct parasitological examination detected 228 cases and 53 IDRM. The overall detection was classified in high and very high levels, ranging from 20,0 to 135,0 cases per 100 000 inhabitants. The registration of cases had a higher concentration in the months July to December, ie during the dry season with low rainfall and high temperature. We captured 377 specimens of sandflies, predominantly the species L. whitmani. The ACL was largely distributed in Buriticupu the period 2005 to 2010, reaching rural areas and urban areas, especially in the main access roads to the city, BR 222, the corridor leading to the train station and the borders with neighboring municipalities. It is believed that the precariousness of the health infrastructure in the municipality can be detected by providing a favorable environment for the development of the vector, creating conditions for humans becoming infected in the vicinity of their homes. / O Maranhão é um dos estados com maior ocorrência de casos de Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). Desta forma, deve ser alvo de estudos relacionados a esta doença. O presente estudo foi realizado em Buriticupu-MA, município com maior incidência de casos de LTA no Estado. Este trabalho visou estudar aspectos epidemiológicos da LTA em Buriticupu no período de 2005 a 2010. A coleta de dados foi realizada no Núcleo de Estudos em Medicina Tropical da Pré-Amazônia da UFMA, Laboratório de Meteorologia do Núcleo Geoambiental da UEMA, no Departamento de Informática do Sistema Único de Saúde DATASUS e captura de flebotomíneos em áreas com registro de casos de LTA com armadilhas luminosas do tipo CDC. Constatou-se o diagnóstico de 281 casos autóctones de LTA em Buriticupu, dos quais 238 pacientes tinham idade igual ou maior de 10 anos, com predomínio nos indivíduos de 20 a 29 anos. Quanto ao sexo, 86 eram do sexo feminino e 195 do sexo masculino. Praticamente todos os casos foram diagnosticados com a forma cutânea, sendo que o exame parasitológico direto detectou 228 casos e a IDRM 53. O Coeficiente Geral de Detecção classificou-se nos níveis alto e muito alto, variando de 20,0 a 135,0 casos por 100 mil habitantes. O registro de casos teve maior concentração nos meses de julho a dezembro, ou seja, no período seco com baixa precipitação pluviométrica e alta temperatura. Foram capturados 377 espécimes de flebotomíneos, predominando a espécie L. whitmani. A LTA mostrou-se amplamente distribuída no município de Buriticupu no período de 2005 a 2010, atingindo áreas da zona rural e urbana, sobretudo nas principais vias de acesso ao município, a BR 222, o corredor de acesso a estação ferroviária e as fronteiras com os municípios vizinhos. Acredita-se que a precariedade da infra-estrutura sanitária detectada no município pode estar proporcionando um ambiente favorável para o desenvolvimento do vetor, criando condições para os seres humanos se infectarem no entorno de suas residências.

Made available in DSpace on 2016-08-19T17:47:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cristiane Costa de Carvalho.pdf: 1454881 bytes, checksum: 831238c6d9864b9fca7efc9ba6164541 (MD5) Previous issue date: 2007-09-25 / FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA E AO DESENVOLVIMENTO CIENTIFICO E TECNOLÓGICO DO MARANHÃO / The municipal district of Raposa located in the State of Maranhão, Brazil, is an endemic area of human and canine visceral leishmaniasis. Dogs are considered to be the principal Leishmania chagasi reservoir in this location. The objective of this study was to examine the relative levels of parasitic DNA in different tissues of infected dogs and their association with clinical signs of Leishmaniasis. We initiated this study by collecting blood samples from 233 distinct dogs that were analyzed by means of serological diagnosis. Of all examined dogs, 69 were positive in the anti-Leishmania ELISA. According to technical reasons only 27 of the Leishmania infected dogs could be recaptured and studied. The animals were classified according to their clinical signs in asymptomatics (10 animals), oligosymptomatics (8 animals) and polysymptomatics (9 animals) groups. A quantitative PCR method was developed and established in order to examine the parasitic load in blood, bone marrow, lymph node, spleen and skin. The parasite could be detected in lymph nodes of all animals analyzed (100%). The tissue with the highest parasitic load was lymph nodes followed by spleen, blood, bone marrow and skin. Comparing all analyzed tissues, the lymph nodes presented the highest levels of parasitic DNA, without exception, regardless their symptoms classification. Contrary to various other studies, we have detected the lowest parasitic DNA concentration in skin tissues. The quantitative PCR assay established in this study was sensitive, fast and inexpensive for qualitative and quantitative analyses of the Leishmania chagasi DNA. The canine lymph node is the most frequently infected tissue, with greater levels of parasitic DNA, and may be considered a target tissue for leishmaniasis monitoring in dogs. / O município de Raposa (Maranhão, Brasil) é uma área endêmica de leishmaniose visceral humana e canina. Neste município, cães são considerados o principal reservatório de Leishmania chagasi. O objetivo deste estudo foi investigar a concentração do DNA parasitário em diferentes tecidos de cães infectados e sua associação com sinais clínicos de leishmaniose. Iniciamos este estudo com a coleta de sangue de 233 cães para diagnóstico sorológico da infecção. Dentre todos os cães examinados, 69 apresentaram anticorpos anti-Leishmania no teste ELISA. Destes, apenas 27 puderam ser recapturados e estudados. Os animais foram classificados de acordo com avaliação clínica em assintomáticos (n=10); oligossintomáticos (n=8) e polissintomáticos (n=9). A técnica de PCR quantitativa foi desenvolvida e padronizada para avaliar a concentração de DNA parasitário em sangue, medula, linfonodo, baço e pele. O parasito foi detectado em todas as amostras de linfonodo analisadas (100%). O tecido com os maiores níveis de DNA parasitário foi o linfonodo, seguido pelo baço, sangue, medula e pele. Comparando-se os tecidos analisados, o linfonodo foi o tecido com as maiores cargas parasitárias, sem exceção, entre animais assintomáticos, oligossintomáticos e polissintomáticos. Contrariamente a outros estudos, detectamos baixos níveis de DNA parasitário em amostras de pele. A PCR quantitativa padronizada neste estudo foi um método sensível, rápido e econômico para detectar e determinar os níveis de DNA parasitário de Leishmania chagasi. Em cães, o linfonodo é o tecido mais acometido pelo parasito e com maiores níveis de DNA, podendo ser considerado o sítio ideal para o monitoramento da leishmaniose canina.

Nós investigamos os efeitos da saliva de Lutzomyia longipalpis capturados no campo e colonizados em laboratório, na evolução da lesão e imunomodulação da infecção por Leishmania (Leishmania) amazonensis, uma espécie que é endêmica na América do Sul, onde causa Leishmaniose Cutânea, Leishmaniose Cutânea Disseminada Bordeline e Leishmaniose Cutânea Difusa Anérgica, com conseqüências graves aos pacientes. Com o intuito de comparar o efeito dos dois tipos de extrato de glândula salivar, camundongos C57BL/6 foram inoculados subcutaneamente no coxim plantar das patas traseiras e nas orelhas com 106 formas promastigotas de Leishmania (L.) amazonensis na presença de extrato de glândula salivar de vetores de captura e de colônia. O tamanho da lesão foi significantemente menor nos camundongos infectados com extrato de glândula salivar de vetores capturados, o que também determinou uma infiltração menos proeminente de macrófagos nas lesões e uma resposta Th2 mais branda quando comparada com aqueles inoculados com extrato de glândula salivar de vetores colonizados. Recentemente, foi mostradas diferenças nos compostos protéicos das glândulas salivares que poderiam parcialmente justificar a expressão da lesão. Portanto, nossos achados ressaltam que a extrato de glândula salivar de flebótomos provavelmente não desempenha um papel importante na exacerbação da infecção por Leishmania já que a transmissão natural do parasito ocorre através de vetores selvagens e não através de vetores colonizados em laboratório / We investigated the effects of Lutzomyia longipalpis saliva of vectors captured in the field and colonized in laboratory on the lesion evolution and immunomodulation of the infection by Leishmania (Leishmania) amazonensis, a species that is endemic in South America where it causes cutaneous leishmaniasis, borderline disseminated cutaneous leishmaniasis and anergic diffuse cutaneous leishmaniasis, with devastating consequences to the patients. In order to compare the effect of both salivas, C57BL/6 mice were inoculated subcutaneously into the hind footpads or into the ear dermis with 106 promastigotes in the presence of salivary gland homogenate from wildcaught and lab-colonized vectors. Lesion size was significantly lower in the mice infected with saliva from wild-caught sandflies that also determined a less prominent infiltration of macrophages in the lesions and a weaker Th2 response in comparison with those co-inoculated with colonized saliva. Recently, differences were shown in the protein compounds in the salivary glands that could partially account for the lesion size outcome. In conclusion, our findings highlight that phlebotomine saliva probably does not play an important role in the exacerbation of Leishmania infection as the natural parasite transmission occurs through wild and not laboratory colonized vectors.

Devido ao largo espectro de manifestações na leishmaniose visceral canina (LVC), o exame clínico não é capaz de confirmar o diagnóstico, já que muitos dos sinais clínicos não são exclusivos da LVC, tornando-se imprescindível o diagnóstico laboratorial para confirmação da infecção por L. (L.) infantum chagasi. A sorologia tem sido a primeira escolha para o diagnóstico da leishmaniose canina; porém, a diversidade de técnicas empregadas e de antígenos tem levado a resultados conflitantes. O emprego de formas promastigotas e amastigotas do parasito tem boa concordância no sorodiagnóstico de LVC pela Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI), porém o teste com amastigotas mostrou-se mais sensível sem perda da especificidade. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi avaliar o desempenho do ELISA no sorodiagnóstico da LVC empregando antígeno total bruto de formas amastigotas provenientes de cultura axênica (ELISA-AXE) e amastigotas purificadas de tecido de animal experimental cronicamente infectado (ELISA-AMA) comparando com o desempenho do ELISA feito com antígeno total bruto de formas promastigotas (ELISA-PRO) de L. (L.) infantum chagasi. Foram avaliados 115 soros de cães parasitologicamente positivos para a pesquisa de DNA de Leishmania por PCR, domiciliados a pelo menos 2 anos em municípios com alta transmissão de leishmaniose visceral, classificados em sintomáticos (n=67) e assintomáticos (n=48) de acordo com sinais clínicos e exames laboratoriais. Como controle, foram utilizados 81 soros de cães parasitologicamente negativos oriundos do município sem transmissão comprovada de leishmaniose visceral e 13 soros de cães com outras enfermidades. Os resultados não mostraram diferença significante em sensibilidade, especificidade, valores preditivos e acurácia entre os testes ELISA-AXE, ELISA-AMA e ELISA-PRO, com forte correlação e concordância entre os três antígenos testados. O ensaio de Western Blot mostrou reatividade para proteínas de diferentes pesos moleculares, entre 14 a 178kDa dependendo da fonte de antígeno. Os resultados mostraram desempenho semelhantes nos testes de ELISA com amastigotas axênicas, amastigotas purificadas e promastigotas como fonte de antígeno para sorologia da leishmaniose canina. A ampla e diversificada reatividade no Western Blot com poucas bandas altamente especificas sugere o emprego de quimeras de antígenos de diferentes pesos moleculares oriundos tanto de formas amastigotas como de formas promastigotas do parasito no diagnóstico da LVC / Due to the wide spectrum of manifestations in canine visceral leishmaniasis (CVL), clinical exam is not able to confirm the diagnosis, since many of the signs and symptoms are not exclusive of CVL, making it imperative that the laboratory diagnosis for infection confirmation by L. (L.) infantum chagasi. Since the direct search involves invasive material collection, time-consuming and expensive; the serology has been the first choice for diagnosis of canine leishmaniasis. However, the diversity of techniques employed and antigens have led to conflicting results in both diagnostic routine and applied research. Since the use of promastigotes and amastigotes of L. (L.) infantum chagasi have good agreement on serum diagnosis of CVL by reaction of Indirect Immunofluorescence (RIFI), despite the amastigote test proved more sensitive without loss of specificity. The main objective of this study was to evaluate and compare the performance of ELISA in the CVL using crude total antigen of axenic amastigote and promastigote culture, and purified amastigote from experimental chronically infected animal tissue of L. (L.) infantum chagasi. One hundred and fifty-five sera from dogs residing on areas with high disease incidence were evaluated by PCR and diagnosed positive for Leishmania, these were used as positive control on the present study. The animals were examined clinically and in accordance with the characteristic clinical signs of visceral leishmaniasis and laboratory tests, then were classified into 2 groups: symptomatic (n=67) and asymptomatic (n=48) animals. As negative control, eighty-one sera were used from dogs parasitologically negative by PCR in real time from the municipality without proven transmission of visceral leishmaniasis. The results showed no significant difference in sensitivity, specificity, predictive values and accuracy between ELISA-AXE, ELISA-AMA and ELISA-PRO, with strong correlation and concordance between the three antigens tested. The Western Blot assay showed reactivity for proteins of different molecular weights ranging from 14 to 178kDa depending on the antigen source. The results showed similar performance in the ELISA tests with axenic amastigotes, purified amastigotes and promastigotes as source of antigen for serology of canine leishmaniasis. The broad and diverse reactivity in Western Blot with few highly specific bands suggests the use of antigen chimeras of different molecular weights derived from both amastigote and promastigote forms of the parasite in the diagnosis of LVC

O cão (Canis familiaris) é o principal reservatório de Leishmania (Leishmania) infantum. Sua alta competência em transmitir o parasito para o inseto vetor contribui para a manutenção do ciclo e aumento do risco para os humanos em áreas endêmicas. O amplo espectro de manifestações clínicas da leishmaniose visceral canina (LVC) torna seu diagnóstico bastante complexo, já que essas manifestações podem se sobrepor àquelas causadas por outros agentes infecciosos. Fator agravante é que a infecção, na maior parte das vezes, tem caráter subclínico, podendo passar despercebida. Diante disto, um diagnóstico confiável se faz necessário para confirmar uma suspeita clínica ou infecção inaparente. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem contribuído em muito para o aumento da sensibilidade do diagnóstico, e seu uso mostra que a prevalência da infecção canina por L. (L.) infantum em áreas endêmicas pode ser bem maior do que a apontada pela sorologia. É sabido que um dos fatores limitantes do emprego de uma técnica diagnóstica em larga escala refere-se à coleta do material clínico que, idealmente, deve ser simples, rápida e indolor. Assim, entende-se que a associação da PCR com amostras não invasivas, de fácil coleta, poderia representar uma contribuição importante para o diagnóstico da LVC. Dessa forma, a proposta do presente projeto foi investigar o valor do swab oral (SO) na detecção de L. (L.) infantum em cães oriundos de áreas onde ocorre transmissão do parasito, através do uso da PCR em tempo real, considerada a mais sensível dentre as técnicas moleculares. Para tanto, comparamos sua positividade com a encontrada em outra amostra não invasiva (swab conjuntival= SC), pouco invasiva (sangue periférico= SG) e invasiva (aspirado de linfonodo=LN) e com a sorologia, considerando grupos clínicos, carga parasitária, índice de concordância entre os resultados, e a combinação dos resultados das diferentes amostras e a sorologia com aqueles obtidos no SO. Noventa e dois cães com comprovada infecção participaram do estudo. Os animais foram classificados em sintomáticos (n=63) e assintomáticos (n=29), de acordo com o exame físico e provas laboratoriais. No presente estudo a positividade do SO (67,4%) foi equivalente a do SC (68,5 %), maior do que a encontrada no SG (52,2%), e menor quando comparada ao LN (84,8%). Considerando os grupos clínicos, o SO foi positivo em 81 % dos cães sintomáticos e em 37,9 % dos assintomáticos. A positividade encontrada no SC também foi maior no grupo sintomático em relação ao assintomático (82,5 % x 37,9 %), assim como no LN (93,7 % x 65,5 %), mas não no SG (62,1 % x 47,6 %) e na sorologia (77,8 % x 79,3 %). Salienta-se que o SO foi positivo em 35 % dos cães com sorologia negativa (n=20), o SC em 35%, o SG em 40 %, o LN em 70 %, e OS+CS em 60% deles. A concordância dos resultados do SO foi moderada em relação à conjuntiva (k= 0,3) e fraca em relação às demais amostras e a sorologia (0.2 < k < 0.3). A carga parasitária do SO, por sua vez, não se diferiu da conjuntival, ambas foram maiores do que a encontrada no SG, e o LN apresentou a maior carga, mostrando uma clara correlação da intensidade do parasitismo com os índices de positividade obtidos. O LN mostrou o maior parasitismo entre as amostras analisadas. A combinação dos resultados do SO e SC atingiram 84 % de positividade nos 92 cães estudados, 92,1 % no grupo sintomático e 65,5 % no assintomático. Em suma, o presente estudo mostrou a presença do DNA de L. (L.) infantum no swab oral de cães infectados através da PCR em tempo real, revelando seu potencial uso no diagnóstico da LVC em cães com suspeita clínica dada a sua alta positividade nos animais com sintomatologia, equivalente à encontrada na amostra invasiva, o aspirado de linfonodo. Em oposição, encontrou-se baixa positividade nos cães assintomáticos, mas seu uso combinado com outra amostra não invasiva, a conjuntiva, atingiu patamares satisfatórios. O fato do SO ter sido positivo em parte dos animais soronegativos aponta vantagem adicional do seu uso na investigação de infecção por L. (L.) infantum em inquéritos epidemiológicos ou mesmo na rotina clínica. Por fim, os nossos resultados mostraram que a combinação de testes e amostras é necessária para a identificação de cães infectados por L. (L.) infantum, e que a PCR com o swab oral, especialmente associado ao swab conjuntival, pode contribuir de forma significativa para o diagnóstico da infecção canina, seja ela sintomática ou assintomática / Dog (Canis familiaris) is the major reservoir of Leishmania (L.) infantum. Its high competence for transmitting the parasite to the vector contributes to the maintenance of the cycle and for increasing risk to humans in endemic areas. The wide spectrum of clinical manifestations of canine visceral leishmaniasis (CVL) makes the diagnosis quite complex, since the symptoms can overlap those caused by other infectious agents. Of note, the infection is mostly subclinical, making the diagnosis even more difficult. Therefore, an accurate diagnosis is necessary to confirm a clinical suspicion or the silent infection. The polymerase chain reaction (PCR) has greatly contributed for increasing the diagnostic sensitivity, and its use shows that L. (L.) infantum canine infection in endemic areas may be much higher than that pointed by serology. It is known that one limiting factor of using a diagnostic method in large scale refers to the collection of clinical samples which should be ideally simple, quick, and painless. Thus, it is understood that the association of PCR with non-invasive samples could represent an important contribution to the diagnosis of CVL. Therefore, the purpose of this study was to investigate the value of the oral swab (OS) in detecting L. (L.) infantum in dogs from areas of parasite transmission through the use of real-time PCR that is considered the most sensitive among the molecular techniques. To this end, we compared the OS positivity with that found in other non-invasive (conjunctival swab = CS), minimally invasive (blood = BL) and invasive (lymph node aspirate = LN) samples and serology, considering clinical groups, parasite load, agreement among results, and the combination of results from different samples and serology with those obtained with OS. Ninety-two dogs with proven infection were selected for this present study. The animals were divided into symptomatic (n = 63) and asymptomatic (n = 29) dogs, according to the physical examination and laboratory tests. Here, the positivity in OS (67.4%) was equivalent to the CS (68.5%), higher than that found in BL (52.2%), and lower when compared to LN (84.8%). Regarding clinical groups, OS was positive in 81% of the symptomatic dogs and in 37.9% of asymptomatic ones. The positivity in CS was also higher in the symptomatic compared to the asymptomatic group (82.5% x 37.9%) and in LN (93.7% x 65.5%), but not in BL (62.1% x 47.6%) and serology (77.8% x 79.3%). Noteworthy, the OS was positive in 35% of dogs with negative serology (n = 20), CS in 35%, BL in 40% and LN in 70%. Moderate agreement was found between OS results and CS results (k = 0.3) and weak in comparison to other samples and serology (0.2 < k < 0.3). The parasite load was equivalent between OS and CS, both were higher than that found in BL, and LN presented the highest burden, showing that parasitism intensity and the positivity rates are correlated. The combination of OS and CS results reached 84% positivity in 92 dogs studied, 92.1% for symptomatic dogs and 65.5% for asymptomatic ones. In summary, the present study showed the presence of L. (L.) infantum DNA in oral swab of infected dogs by real-time PCR, revealing its potential use for diagnosing CVL in animals with clinical suspicion due to its high positivity in dogs with symptoms, equivalent to that found in invasive sample, the lymph node aspirate. In contrast, low positivity was found in asymptomatic dogs, but the combined use with other non-invasive sample, the conjunctiva, reached satisfactory levels. OS positivity found in part of the seronegative animals points additional advantage of using OS in the investigation of L. (L.) infantum infection in epidemiological surveys or in clinical practice. Finally, our findings pointed that combination of tests and samples is required for identifying dogs infected with L. (L.) infantum, and that the PCR with oral swab, especially associated with the conjunctival swab, can contribute for diagnosing both asymptomatic and symptomatic dogs

Na América Central, em países como Honduras, El Salvador, Nicarágua e Costa Rica, tem sido descrito lesões cutâneas não ulceradas, designadas como leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica (LCNU) causadas por Leishmania (L.) infantum chagasi. Em Honduras, leishmaniose visceral e leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica são produzidas pelo mesmo agente etiológico, Leishmania (L.) infantum chagasi e ocorrem na mesma área geográfica. A LCNU é a forma clínica mais comum, afetando principalmente crianças maiores de 5 anos e adultos jovens. A lesão é definida como uma pápula, nódulo indolor, não ulcerativo, eritematoso ou da cor da pele, na presença ou ausência de halo hipopigmentado. Tendo em vista que existe uma lacuna no conhecimento do padrão de resposta imunológica tecidual da leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica, este trabalho visou avaliar a resposta imunológica inflamatória e regulatória in situ das lesões de pele. Foram utilizadas 20 biópsias de pele, com diagnóstico parasitológico confirmado por raspado de lesão corado por Giemsa e observado em microscópio ótico. O estudo histopatológico foi avaliado em cortes histológicos corados com hematoxilina e eosina (HE) e o padrão da resposta imune inflamatória e regulatória por meio da reação de imuno-histoquímica utilizando marcadores para linfócito T (CD4 e CD8), T regulatório (FoxP3), e antígenos intracelulares como: IL-17, TGF-beta, IL-10, IL-6 e IFN-y. As alterações histopatológicas mais significativas foram observadas na derme e caracterizadas por um infiltrado inflamatório linfohistiocitário de intensidade variável e associado à formação de granulomas epitelioides. Já as alterações histopatológicas identificadas na epiderme mostraram-se mais leves e correspondem a leve adelgaçamento, leve acantose e exocitose focal linfohistiocitária. Em 55% dos casos, o parasitismo mostrou-se discreto. A análise imuno-histoquímica das lesões cutâneas dos pacientes com LCNU mostrou no infiltrado inflamatório a presença de todos os marcadores utilizados neste estudo, em especial de linfócitos T CD8+ e CD4+, e das citocinas inflamatórias IFN-y e IL-6. A participação de células FoxP3+, TGF-beta+ e IL-10+ foi discreta, assim como das células IL-17+. Os dados mostram uma participação maior da resposta inflamatória na leishmaniose cutânea não ulcerada ou atípica, capaz de controlar o parasitismo e consequentemente a evolução do tamanho da lesão; porém, embora mais discreta, a resposta imune regulatória pode ser responsável para manter um balanço na resposta imune celular evitando danos teciduais e levando a baixa persistência parasitária no tecido, necessária para a manutenção de uma imunidade protetora e duradoura / Honduras: evaluation of the inflammatory and regulatory immune response in situ in skin lesions [dissertation]. São Paulo: \"Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo\"; 2017. In Central America, in countries such as Honduras, El Salvador, Nicaragua and Costa Rica, non-ulcerated skin lesions, designated as non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis (NUCL) caused by Leishmania (L.) infantum chagasi, has been reported. In Honduras, visceral leishmaniasis and non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis are caused by the same etiologic agent, Leishmania (L.) infantum chagasi and occur in the same geographical area. NUCL is the most common clinical form, affecting mainly children older than 5 years and young adults. The lesion is defined as a papule, painless nodule, non-ulcerative, erythematous or skin color, in the presence or absence of hypopigmented halo. Considering that, there is a gap in the knowledge of the tissue immune response pattern of non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis, this study aimed to evaluate the in situ inflammatory and regulatory immune response of skin lesions. Twenty skin biopsies with a confirmed parasitological diagnosis by scraping of lesion stained by Giemsa and observed under an optical microscope were used. The histopathological study was evaluated in histological sections stained with hematoxylin and eosin (HE) and the inflammatory and regulatory immune response through the immunohistochemistry reaction using T lymphocyte (CD4 and CD8), regulatory T (FoxP3) markers, and intracellular antigens such as IL-17, TGF-beta, IL-10, IL-6 and IFN-y. The most significant histopathological changes were observed in the dermis, and they were characterized by a lymphohistiocytic inflammatory infiltrate of variable intensity and associated to the formation of epithelioid granulomas. On the other hand, the histopathological changes identified in the epidermis were lighter and correspond to mild thinning, mild acanthosis and focal lymphohistiocytic exocytosis. In 55% of the cases, the parasitism was discreet. The immunohistochemistry analysis of the cutaneous lesions of patients with NUCL showed in the inflammatory infiltrate the presence of all the markers used in this study, especially CD8+ and CD4+ T lymphocytes, and the inflammatory cytokines IFN-y and IL-6. The participation of FoxP3+, TGF-beta+ and IL-10+ cells was discrete, as well as IL-17+ cells. The data show a higher participation of the inflammatory response in non-ulcerated or atypical cutaneous leishmaniasis, able to control the tissue parasitism and consequently the evolution of the lesion size; however, although discreet, the regulatory immune response may be responsible for maintaining a balance in the cellular immune response avoiding tissue damage and leading to low tissue parasitic persistence necessary for the maintenance of a protective and lasting immunity

A leishmaniose tegumentar americana (LTA) apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas e imunopatológicas resultante da interação entre as diferentes espécies de Leishmania e os mecanismos de resposta imune do hospedeiro. Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) amazonensis são as espécies de maior potencial patogênico para o homem e de importância médica no Brasil. As células TCD4, quando ativadas por antígenos via MHC II podem se diferenciar em linhagens de células efetoras como Th1, Th2, Th17 e células T reguladoras (Treg). IL-23 é indispensável para as funções efetoras e manutenção de células Th17. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de Foxp3, IL-17 e IL-23 em lesões cutâneas de pacientes com diferentes formas clínicas da LTA. Biópsias parafinadas de 44 pacientes foram submetidas à imunoistoquímica, sendo 6 casos de leishmaniose cutânea anérgica difusa (LCADIDRM-) e leishmaniose cutânea disseminada borderline (LCDBIDRM-), ambas causadas por L.(L) amazonensis e 16 casos de leishmaniose cutânea localizada (LCLIDRM+) também causada por L.(L.) amazonensis; 9 casos de LCLIDRM+, 2 casos de LCDBIDRM- e 5 casos de leishmaniose cutâneo-mucosa (LCMIDRM+), todos causados por L.(V.) braziliensis. A densidade de células Tregs Foxp3+ no espectro clínico da LTA mostrou um aumento progressivo partindo das formas centrais LCL causadas por L.(V.) braziliensis (170mm2) e L.(L) amazonensis (140mm2) para as formas polares, LCADIDRM- (289mm2) e LCDBIDRM- (183mm2) causada por L.(L) amazonensis, LCDBIDRM- (189mm2) e LCMIDRM+, causadas por L.(V.) braziliensis (158mm2). A comparação entre as densidades de células IL-17+ nas diferentes formas clínicas da LTA mostrou um perfil semelhante também com um aumento progressivo da expressão de IL-17 partindo das formas centrais LCLIDRM+ causadas por L.(V.) braziliensis (232mm2) e L.(L) amazonensis (197mm2) em direção as formas polares, LCADIDRM- (470mm2) e LCDBIDRM- (340mm2) causada por L.(L.) amazonensis, LCDBIDRM- (431mm2) e LCMIDRM+ (372mm2) causada por L.(V.) braziliensis. A densidade de células IL-23+ mostrou perfil similar ao de IL-17 como no espectro de doença causada por L. (V.) braziliensis ou L. (L.) amazonensis: LCADIDRM- (687mm2), LCDBIDRM- (518mm2) e LCLIDRM+ (348mm2) por L.(L.) amazonensis, LCLIDRM+ (457mm2), LCDBIDRM- (609mm2) e LCMIDRM+ (568mm2) L. (V.) braziliensis. Diante dos nossos achados, observa-se que as células Foxp3+, IL-17+ e IL-23+ desempenham um papel importante na imunopatogênese das diferentes formas clínicas da LTA causadas por L. (V.) braziliensis ou L. (L.) amazonensis, caracterizada por uma resposta imune polarizada de diferente expressão patológica / The American cutaneous leishmaniasis (ACL) presents a wide spectrum of clinical and immunopathological manifestations resulting from the interaction between the different species of Leishmania and the mechanisms of the host immune response. Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) amazonensis are the species with the largest pathogenic potential for humans and medical importance in Brazil. The CD4+ T cells can be differentiated into effector cell lines as Th1, Th2, Th17 and regulatory T cells (Treg). IL-23 is essential for effector functions and maintenance of Th17 cells, that produces IL-17. The aim of this study was to evaluate the expression of Foxp3, IL-17 and IL-23 in cutaneous lesions of patients with different clinical forms of ACL. Paraffin embedded biopsies from 44 patients were submitted to immunohistochemistry, there were 6 cases of anergic diffuse cutaneous leishmaniasis (ADCLDTH-) and borderline disseminated cutaneous leishmaniasis (BDCLDTH-) both caused by L. (L.) amazonensis 16 cases of cutaneous leishmaniasis (LCLDTH+) caused by L. (L.) amazonensis, 9 cases of LCLDTH+, 2 cases of BDCLDTH- and 5 cases of mucocutaneous leishmaniasis (MCLDTH+) all caused by L. (V.) braziliensis. The density of Treg Foxp3+ cells in the clinical spectrum of ACL showed a progressive increase starting from the central forms LCLDTH+ caused by L. (V.) braziliensis (170mm2) and L. (L) amazonensis (140mm2) towards the polar forms ADCLDTH- (289mm2). The intermediate clinical forms BDCLDTH- (183mm2) caused by L. (L) amazonensis and BDCLDTH-(189mm2) by L. (V.) braziliensis as well as, MCLDTH+(158mm2) did not present any significant differences. The comparison between the densities of IL-17+ cells in different clinical forms of ACL showed progressive increasing starting from the central forms LCLDTH+ caused by L. (V.) braziliensis (232mm2) and L. (L) amazonensis (197mm2) towards the polar forms, ADCLDTH-(470mm2) and BDCLDTH-(340mm2) caused by L. (L.) amazonensis BDCLDTH- (431mm2) and MCLDTH+ (372mm2) caused by L. (V.) braziliensis. The density of IL-23+ cells showed a similar profile to that of IL-17 at the disease spectrum caused by L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis: ADCLDTH-(687mm2) BDCLDTH-(518mm2) and LCLDTH+ (348mm2) by L. (L.) amazonensis; LCLDTH+ (457mm2) LCDBDTH-(609mm2) and MCLDTH+ (568mm2) L. (V.) braziliensis. In view of our findings, we notice that the Foxp3+, IL-17+ and IL-23+ cells play an important role in the immunopathogenesis of different clinical forms of ACL caused by L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis, characterized by an immune polarized response with different pathological expression

A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) representa um sério problema de saúde pública. No Brasil muitas espécies são reconhecidas como patogênicas para o homem, portanto o diagnóstico diferencial é necessário para compreender o perfil epimemiológico da LTA em áreas endêmicas. Com o objetivo de identificar espécies de Leishmania utilizando ferramentas moleculares, cinquenta e três biópsias de pele de pacientes com LTA, fixadas em formalina e incluídas em parafina dos Estados do Pará (N=33) e Maranhão (20) foram submetidos a diferentes protocolos da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para a identificação dos agentes causadores. Biopsias foram desparafinizadas e o DNA foi extraído usando o protocolo de fenol-clorofórmio, quantificado e submetido a reações de PCR, com base na sequência de nucleotídeos codificadora do RNA que compõe a subunidade menor do ribossomo (SSUrDNA) e da enzima Glicose 6-Fosfato Desidrogenase (G6PD). O alvo G6PD foi utilizado tanto em reações de PCR convencional (cPCR), como de PCR quantitativo (qPCR). As reações de cPCR e Nested PCR SSUrDNA apresentaram resultado positivo para o gênero Leishmania em 40 (83,3%) das amostras submetidas. Vinte e sete desses produtos de PCR foram sequenciados, sendo 17 identificados como L.(L.) amazonensis e 10 como L.(Viannia) sp. A cPCR G6PD identificou 9 amostras como L.(V.) braziliensis , sendo 7 do Maranhão (36%) e 2 do Pará (6%). O DNA de L.(Viannia) sp. foi quantificado em quatro amostras do Maranhão através da reação de qPCR G6PD, mesmo esse alvo sendo de cópia única. Esses resultados indicam que sequências especificas de Leishmania sp. presentes em múltiplas cópias devem ser escolhidas para a aplicação de cPCR em DNA provindo de amostras parafinadas,uma vez que é freqüente casos de LTA com baixo parasitismo e consequentemente, pequenas concentrações de DNA. E ainda a cPCR SSUrDNA pode ser um bom alvo para estudos diagnósticos e epidemiológicos.A qPCR G6PD permitiu a detecção, identificação e quantificação de L. (Viannia) sp. em uma única etapa de amplificação em quatro amostras que presentaram resultados positivos somente na Nested ou Semi-Nested PCR, demonstrando uma maior sensibilidade oferecida pela q PCR / American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) presents a serious problem of public healthy. In Brazil many species are recognized as pathogenic to humans, therefore differential diagnostic is necessary to understand the epidemiological profile of ACL in endemic areas. Fifty-three paraffinembedded skin biopsies of ACL patients from Pará (N=33) and Maranhão (20) States, were submitted to different protocols of polymerase chain reaction (PCR) for identification of their causative agents. Biopsies were deparaffinized and DNA were extracted using phenol-chloroform, quantified and submitted to PCR reaction, using small subunit coding sequence (SSUrDNA) and enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). The target of G6PD was used both in conventional PCR reactions (cPCR) and quantitative PCR (qPCR). The reactions of cPCR and Nested PCR SSUrDNA showed positive result for the genus Leishmania in 40 (83.3%) of the samples. Twenty-seven positive samples were submitted to sequencing and 10 were identified as L. (Viannia) sp. and 17 as L. (L.) amazonensis. The G6PD PCR identified 9 samples as L. (V.) braziliensis, 2 from Pará (6%) and 7 from Maranhão (35%).Four samples were quantified in G6PD qPCR, even this is a single copy. These results indicate that specific sequences from Leishmania sp. present in multiple copies should be chosen in relation to those from unique copies in paraffin-embedded tissues, once is frequent cases of ACL with low parasitism, consequently small DNA concentrations and that SSUrDNA can be a good target to diagnostic and epidemiologic studies of ACL. The qPCR allowed the detection and identification of L. (Viannia) sp. in a single round of amplification in four samples that when showed positive results only in the Nested or Semi Nested cPCR suggesting a higher sensitivity offered by qPCR

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-09-02T14:22:40Z No. of bitstreams: 1 patriciadealmeidamachado.pdf: 2264339 bytes, checksum: daac1876462208aa982df4724ffcd524 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-09-06T14:17:16Z (GMT) No. of bitstreams: 1 patriciadealmeidamachado.pdf: 2264339 bytes, checksum: daac1876462208aa982df4724ffcd524 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-06T14:17:16Z (GMT). No. of bitstreams: 1 patriciadealmeidamachado.pdf: 2264339 bytes, checksum: daac1876462208aa982df4724ffcd524 (MD5) Previous issue date: 2013-02-26 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O objetivo deste trabalho foi avaliar a atividade leishmanicida de análogos de alcalóides marinhos e bioisósteros do resveratrol em L. amazonensis. Foram testados 12 análogos de alcalóides marinhos 3-alquil piridinas e 7 biosósteros do resveratrol, sendo 4 complexados a ouro, em formas promastigotas de L. amazonensis e em macrófagos peritoneais. Em ambos os casos, a viabilidade celular foi avaliada pelo método colorimétrico do MTT. Os compostos que apresentaram significante atividade antipromastigota e foram seletivos para o parasito, em comparação com a célula hospedeira, foram testados em amastigotas intracelulares de L. amazonensis, cujo efeito dos compostos foi avaliado pela contagem das formas intracelulares. Além disso, foi coletado o sobrenadante para a dosagem de óxido nítrico (NO), através do método de Griess. A maioria dos compostos testados apresentou efeito antipromastigota, destacando os compostos 4 e 5 do grupo dos análogos de alcalóides marinhos, com CI50 de 1,07 e 1,09 µM, respectivamente. Em relação à série dos bioisósteros do resveratrol, destacam-se aqueles complexados a ouro, sendo o composto 17 o mais ativo (CI50 de 5,18 µM). Todos os compostos que foram testados em amastigotas apresentaram atividade, destacando-se, o composto 10 (CI50 = 0,27 µM), dentre os análogos de alcalóides marinhos, e o composto 19, da série dos bioisósteros do resveratrol complexados a ouro (CI50 = 5,77 µM). A maioria dos análogos de alcalóides marinhos mostrou significante toxicidade em macrófagos peritoneais, enquanto somente dois bioisósteros do resveratrol complexados a ouro foram tóxicos para a célula hospedeira. No entanto, todos os compostos testados em amastigotas apresentaram significante seletividade pelo parasito em seu estágio intracelular. Com relação à especificidade das moléculas, os análogos marinhos foram específicos para amastigotas, sugerindo que o alvo desses compostos é exclusivo desse estágio, já a maioria dos bioisósteros do resveratrol complexados a ouro mostraram efeito semelhante em formas promastigotas e amastigotas de L. amazonensis, sugerindo alvos comuns desses compostos nos dois estágios do parasito. Nenhum dos compostos testados induziu significante produção de NO por macrófagos infectados com L. amazonensis, sugerindo que essa molécula não está diretamente relacionada ao efeito antiparasitário. Em resumo, o trabalho mostrou que os compostos testados possuem significativo potencial leishmanicida e abrem perspectivas para estudos em modelos in vivo, bem como estudo do mecanismo de ação. / The aim of this study was to evaluate the leishmanicidal activity of marine alkaloid analogues and bioisosteres of resveratrol in L. amazonensis. We tested 12 3alkylpyridine marine alkaloid analogues of and 7 bioisosteres of resveratrol, 4 complexed to gold, in promastigotes of L. amazonensis and in peritoneal macrophages. In both cases, the viability of the cells was checked using the MTT colorimetric method. Compounds with significant antipromastigote activity and selectivity by the parasite, when compared to the host cell, were tested on intracellular amastigotes of L. amazonensis, which effect of the compounds was determined by counting the number of intracellular parasites. Supernatant was also collected for measure of the nitric oxide (NO), by the Griess method. Most compounds showed antipromastigote effect, especially compounds 4 and 5 of the marine alkaloid analogues, with IC50 of 1.07 and 1.09 µM, respectively. Regarding the bioisosteres of resveratrol, the gold complex 17 was the most active (IC50 of 5.18 µM). All compounds tested in amastigotes exhibited activity, including the compound 10 (IC50 = 0.27 µM), among marine alkaloid analogues, and the compound 19, among gold complexes with bioisosteres of resveratrol (IC50 = 5.77 µM). Most marine alkaloid analogues showed significant toxicity in peritoneal macrophages, while only two bioisosteres of resveratrol complexed to gold were toxic to host cell. However, all compounds tested in amastigotes showed significant selectivity for intracellular parasite. Regarding the specificity of the molecules, marine analogues were specific to amastigote forms, suggesting that the target of these compounds is unique to this stage, while most of bioisosteres of resveratrol complexed to gold showed similar effect on promastigotes and amastigotes of L. amazonensis, suggesting common targets of these compounds in both stages of the parasite. None of compounds induced significant NO production by L. amazonensis-infected macrophages, suggesting that this molecule is not directly related with the antiparasitic effect. In summary, the study showed that the compounds have significant potential leishmanicidal and encourages in vivo studies, as well as the action mechanism.