Orientador: Edi Lúcia Sartorato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:38:26Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Svidnicki_MariaCarolinaCostaMelo_D.pdf: 3787463 bytes, checksum: 29bd7c40aa78f66813f8c5ccbd4806be (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: A perda da audição é uma doença sensorial comum, que pode ser causada por fatores genéticos ou ambientais. Os recentes avanços na biologia molecular têm permitido a determinação das causas genéticas da perda auditiva, e mais de 100 genes já foram relacionados com este fenótipo. Devido à elevada heterogeneidade genética envolvida, um grande número de pacientes permanece sem diagnóstico molecular, pois apenas um pequeno conjunto de genes é geralmente analisado. Isso indica a necessidade de novas estratégias metodológicas para o rastreamento simultâneo de mutações em múltiplos genes. Neste trabalho, um painel para genotipagem utilizando o sistema de espectrometria de massa iPLEX MassARRAY® (Sequenom Inc.), contendo 86 alterações em 17 genes, foi otimizado e testado, visando sua aplicação no diagnóstico molecular de indivíduos com perda auditiva. Inicialmente, um teste com indivíduos controles mostrou falha em 20% das alterações. Na tentativa de se obter uma maior taxa de genotipagem, os primers das alterações que falharam foram redesenhados e ressintetizados. Novos testes com 25 indivíduos controles mostraram um significativo aumento na taxa de genotipagem, e a especificidade e sensibilidade da técnica foram estimadas em mais de 95%. Após a otimização dos ensaios, um grupo de 180 indivíduos, com perda auditiva não-sindrômica com causa presumidamente genética, foi rastreado utilizando o painel desenvolvido, e a validação das mutações identificadas foi realizada por sequenciamento de DNA ou PCR seguido de análise de restrição enzimática. Alterações genéticas foram confirmadas em 31% dos indivíduos, sendo que em 20,6% dos casos analisados foi possível esclarecer a etiologia da perda auditiva. Alterações no gene GJB2 foram as mais prevalentes, porém outras mutações também foram identificadas nos genes SLC26A4, CDH23, MT-RNR1, MT-TS1, MYO15A e OTOF. A genotipagem de mutações usando o sistema iPLEX MassARRAY® mostrou melhor custo-benefício em comparação com as técnicas convencionais, e permitiu rastrear um conjunto mais abrangente de genes do que aqueles atualmente analisados. Portanto, o painel desenvolvido é viável para o rastreamento inicial de mutações envolvidas com a perda auditiva não-sindrômica e poderá auxiliar no diagnóstico dos pacientes afetados / Abstract: Hearing loss (HL) is a common sensorial disorder, which can be caused by genetic or environmental factors. Recent advances in molecular biology have allowed the determination of the genetic causes of HL, and more than 100 genes have been linked to the phenotype. Due to the extraordinary genetic heterogeneity involved in HL a large percentage of patients remain without any molecular diagnosis. This indicates the need for new methodological strategies for simultaneously screening for mutations in multiple genes. In this work, we optimized and tested a panel of 86 mutations in 17 different genes, screened using the mass spectrometry system, iPLEX MassARRAY® (Sequenom Inc.), in order to determine the molecular etiology of hearing loss. An initial genotyping of control subjects, showed failures in 20% of the selected alterations. In an attempt to achieve greater genotyping rates, the tests that failed were redesigned and new primers were synthesized. Further tests with 25 control subjects were then performed and showed significant increase in genotyping rate. The sensitivity and specificity of the technique showed average values above 95%. Additionally, a group of 180 individuals, with nonsyndromic hearing loss with presumably genetic causes, was tested using the developed panel, and the validation of the identified mutations was performed by DNA sequencing or PCR followed by restriction enzyme analysis. Genetic alterations were confirmed in 31% of patients, and in 20.6% of the individuals was possible to elucidate the etiology of HL. Mutations in the GJB2 gene were the most prevalent, but other mutations in the SLC26A4, CDH23, MT-RNR1, MYO15A, and OTOF genes were also identified. Genotyping of mutations using iPLEX MassARRAY® Spectrometry System proved to be faster and more cost-effective, compared to conventional techniques, and enabled the screening of a broader set of genes and mutations than those currently analyzed to establish the molecular etiology of hearing loss. Hence, the developed panel is feasible for the initial screening mutations involved in non-syndromic hearing loss and may aid in the diagnosis of affected patients / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutora em Genética e Biologia Molecular

A hipótese de que peptídeos gerados como produtos de proteólise intracelular poderiam modular cascatas de sinalização, foi originalmente proposto pelo nosso grupo. Um estudo realizado por Heimann et al. (2005) mostrou que camundongos geneticamente modificados e submetidos à dieta hiperlipídica, apresentavam uma diferença no conteúdo intracelular de peptídeos e uma melhora da resistência à insulina. Neste trabalho, investigamos o conteúdo peptídico intracelular do tecido adiposo de animais que desenvolveram obesidade e resistência à insulina, após serem submetidos à dieta cafeteria. Duas sequências peptídicas apresentaram 100% de aumento no tecido adiposo de animais submetidos à dieta cafeteria, em relação aos controles, tendo sido analisadas por ensaios de cinética enzimática, captação de glicose, western blot e cromatografia de afinidade. Os resultados obtidos corroboram os dados de Heimann et al. (2005) de que peptídeos intracelulares podem estar envolvidos na resistência à insulina, modulando o transporte de glicose no tecido adiposo. / The hypothesis that peptides generated as degradation products of intracellular proteolyses could modulate signaling pathways, was originally proposed by our group. A study by Heimann et al. (2005) showed that mice genetically modified and fed with high-fat diet, showed a difference in intracellular content of peptides and an improvement of insulin resistance. In this study, we investigated the intracellular peptide content from adipose tissue of animals that developed obesity and insulin resistance after being treated with the Western diet. Two peptide sequences showed 100% increase in adipose tissue of animals submitted to the Western diet compared to controls, and were analyzed by enzymatic assays, glucose uptake, western blot and affinity chromatography. Altogether, these results corroborate previous suggestions that intracellular peptides may be involved in insulin resistance, modulating glucose transport in adipose tissue.

A proteólise limitada de certas proteínas leva à liberação de peptídeos opióides endógenos. Vários relatos apontam que peptídeos derivados da hemoglobina como hemorfinas e hemopressinas têm efeito antinociceptivo, pela atividade de modulação de receptores acoplados a proteínas G. No presente estudo, um ensaio de captura do substrato (ECS) foi combinado com a marcação isotópica e LC-MS/MS para identificar e caracterizar um novo fragmento da hemoglobina que se liga à EP24.15. O peptídeo AGH, identificado neste trabalho, inibe respostas de hipernocicepção periféricas através de receptores opióides do tipo <font face=\"Symbol\">m . A persistência do peptídeo AGH no tecido nervoso perfundido sugere relevância fisiológica. Embora o AGH seja derivado de hemoglobina e tenha atividade opióide, falta-lhe a sequência chave das hemorfinas (YPWT), indicando que ele pode pertencer a uma nova classe de peptídeos derivados da hemoglobina. Adicionalmente, o AGH modula as interações entre as proteínas 14-3-3<font face=\"Symbol\">e e EP24.15 in vitro, podendo estar relacionado com a secreção não convencional da EP24.15. / Limited proteolysis of certain proteins leads to the release of endogenous opioid peptides. Several reports have shown that hemoglobin-derived peptides such as hemorphins and hemopressins have an antinociceptive effect by modulating GPCR activity. In the present study, a substrate capture assay (SCA) was combined with isotopic labeling and LC-MS/MS to identify and characterize a new bioactive hemoglobin fragment that binds to EP24.15. AGH, a new peptide identified in this work, inhibits peripheral hyperalgesic responses through <font face=\"Symbol\">m opioid receptors (MOR). The persistence of AGH peptide in perfused nervous tissue suggests its physiological relevance. Although AGH is derived from hemoglobin and it is a peptide with opioid activity, it lacks the key sequence of hemorphins (YPWT), indicating that it is part of a new class of peptides derived from hemoglobin. Additionally, the AGH modulates interactions between 14-3-3<font face=\"Symbol\">e and EP24.15 proteins in vitro and may be related to the unconventional EP24.15 secretion.

O estudo da biossíntese de isoprenóides em P. falciparum por meio da via 2C-metil-D-eritritol-4-fosfato (MEP) é apontado como possível alvo terapêutico, visto a via ser ausente em humanos. Foi descrito que nos estágios intraeritrocitários de P. falciparum a via essencial de biossíntese de isoprenóides é a via MEP. As vias do Chiquimato e MEP são precursoras da biossíntese de vitamina E e ambas já foram descritas em P. falciparum. É sugerido que a biossíntese de vitamina E possa ocorrer no parasita, representando um possível alvo para o desenvolvimento de novas drogas antimaláricas. Empregando marcações metabólicas com precursores radioativos, três diferentes métodos de RP-HPLC e análises por espectrometria de massas confirmamos a biossíntese de vitamina E nos três estágios intraeritrocíticos do parasita. O tratamento com ácido úsnico, mostrou inibição dessa biossíntese no estágio esquizonte e do crescimento do parasita. Demonstramos por meio de uma sonda fluorescente, ácido Parinárico, que a vitamina E atua como antioxidante lipofílico, protegendo a lipoperoxidação. Esses resultados não só contribuem para a compreensão da biologia de P. falciparum, mas também elucidam partes das vias MEP e do Chiquimato que podem servir como alvos terapêuticos. / The study of isoprenoid biosynthesis in Plasmodium falciparum by 2C-methyl-D-erythritol-4-phosphate pathway (MEP) it is presented as a therapeutic target once that it is absent in humans. It was found in intraerythrocytic stages of P. falciparum the biosynthesis of isoprenoids by the MEP pathway. The shikimate and MEP pathways are the precursors of biosynthesis of vitamin E and both pathways have already been described in P. falciparum. It is suggested that the biosynthesis of vitamin E might occur in the parasite, representing a possible target for developing new antimalarial drugs. Using metabolic labelling with radiolabelled precursors, three different methods of RP-HPLC and mass spectrometry analyses confirmed the biosynthesis of vitamin E in the three intraerythrocytic stages of parasite. The treatment with usnic acid showed an inhibition of this biosynthesis and of the growth of parasite. We demonstrated by means of a fluorescent probe, the acid Parinaric, that vitamin E acts as a lipophilic antioxidant protecting the membrane of lipoperoxidation. These findings not only contribute to the current understanding of P. falciparum biology but shed light on a pathway that could serve as a chemotherapeutic target.

Os artrópodes constituem o grupo mais diverso do Reino Animal, apresentando uma distribuição muito ampla nos ecossistemas e habitats. O fato de esses animais terem mudado muito pouco durante sua evolução e estarem bem adaptados aos ambientes inóspitos e com uma alta presença de microorganismos patogênicos, torna interessante a realização de estudos sobre o seu sistema imunológico. Parte importante deste sistema são os peptídeos antimicrobianos, que controlam a invasão dos diferentes patógenos. Estas moléculas não só podem fornecer informação sobre o sistema imune e o funcionamento deste, como também pode ajudar a buscar alternativas nas lutas contra as doenças infecciosas. Sendo assim, se torna interessante a purificação e a caracterização dos peptídeos antimicrobianos presentes nesses animais como também o conhecimento do funcionamento de seu sistema imune. Neste trabalho foram utilizadas duas espécies da ordem quilópoda: Scolopendra viridicornis e Otostigmus cavalcanti como modelo experimental. Foi avaliada a presença de moléculas bioativas na hemolinfa (plasma e hemócitos) e no extrato total do corpo, bem como a produção destas moléculas após o animal receber um estímulo ou injúria. Foi observada a presença de diferentes frações com atividade antimicrobiana na hemolinfa (plasma e hemócitos) e no extrato total de animais desafiados e não desafiados em Otostigmus cavalcanti, apresentando um aumento na atividade antimicrobiana nos animais do grupo estimulado. O que pode significar que algumas das moléculas antimicrobianas estão presentes constitutivamente no animal enquanto outras precisam de um estímulo para ser expressas. No plasma de S. viridicornis foram observadas diferentes frações com atividade antimicrobiana, observando-se atividade contra a bactéria Gram-negativa E coli e contra a levedura C. albicans. No entanto, nos hemocitos, diferentes frações apresentaram atividade somente contra a bactéria Gram-positiva M. luteus. Na porção hidrofóbica do extrato total do corpo de S. viridicornis também foram observadas diferentes frações com atividade antimicrobiana. No material eluído em 5% de ACN, por análise de ESI-MS de uma fração com atividade contra M. luteus foram observadas duas moléculas com massa molecular baixa (848,49 e 861,94 Da). Ainda no extrato total da fração hidrofóbica foram observadas duas moléculas que se apresentaram puras. A primeira destas mostrou uma massa molecular de 1,7 kDa mas ainda não foi caracterizada. Enquanto a segunda evidenciou um peptídeo de 925,4658 Da e cuja estrutura primaria apresentou um composto de 8 resíduos de aminoácidos (RYPAVGYT). Esta molécula foi nomeada Lacraina. Entretanto na porção hidrofílica do extrato total de S. viridicornis e de Otostigmus cavalcanti foram observadas frações de baixa massa molecular com atividade antiparasítica contra Leishmania amazonensis e Trypanosoma brucei e antibacteriana contra E. coli e M. luteus. Também nesta fração foi observada uma molécula semelhante à Gomesina um peptídeo antimicrobiano da aranha caranguejeira Acanthoscurria gomesiana. A análise e caracterização desta molécula ainda esta em progresso. / Arthropods constitute the most diverse group in the Animal Kingdom, representing a very wide distribution in different ecosystems and habitats. The fact that these animals have changed very little during their evolution and that theyre well adapted to harsh environments with a high presence of pathogenic microorganisms, makes it interesting to conduct studies on their immune system. An important part of these systems are antimicrobial peptides that control the invasion of various pathogens. These molecules not only provide us with information on their immune system and its functioning, but can also help us find alternatives in the struggle against infectious diseases. Therefore, the purification and characterization of antimicrobial peptides present in these animals becomes important, as well as gaining knowledge on how their immune systems work. In this work two specimens of the Chilopoda order, Scolopendra viridicornis and Otostigmus cavalcanti, were used as an experimental model for the characterization of bioactive molecules present in the hemolymph and total body extract as well as the production of these molecules after stimulating or injuring the animal. The presence of different fractions with antimicrobial activity in the hemolymph (plasma and hemocytes) and the total body extract of defied and not defied animals in Otostigmus cavalcanti was observed. Presenting an increase in the antimicrobial activity in the stimulated group of animals, this could mean that some of the antimicrobial molecules are constitutively present in the animal, while others need to be induced to be expressed. In the plasma of S. viridicornis different fractions with antimicrobial activity and with activity against the Gram-negative bacteria E coli and against the C. albicans yeast were observed. Notwithstanding, in the hemocytes, there are different fractions that presented activity only against the Gram-positive M. luteus bacteria. In the hydrophobic portion of the total extract of the S. viridicorniss body, different fractions with anti-microbial activity were also observed. In the 5% ACN eluted material, by an ESI-MS analysis of a fraction with activity against M. luteus two molecules with low molecular mass (848.49 and 861.94 Da) were present and two pure molecules were observed in the total extract of the hydrophobic fraction. The first one presented a molecular mass of 1.7 kDa that remains to be characterized. The second one was a 925.4658 Da peptide, whose primary structure presented a compound of 8 amino acid residues (RYPAVGYT). This molecule was named Lacrain. However, in the hydrophilic portion of the total extract of S. viridicornis and O. cavalcanti low molecular mass fractions with antiparasitic activity against Leishmania amazonensis and Trypanosoma brucei as well as antibacterial activity against E. coli and M. luteus were observed. Also in this fraction a molecule similar to Gomesin, an antimicrobial peptide from the spider Acanthoscurria gomesiana. was present. The analysis and characterization of this molecule is still in progress.

O uso da metabolômica ambiental tem sido usada para avaliar a interação dos organismos com o ambiente. Apesar do alto impacto que os metais têm no ambiente, essa abordagem analítica ainda está em seu início, em especial para as macroalgas. Como membro do primeiro nível trófico da cadeia alimentar marinha, fornecendo nutrientes e microelementos para os níveis superiores, as macroalgas são um alvo apropriado tanto para o desenvolvimento de ensaios toxicológicos quanto como bioindicador de degradação do ambiente marinho. Também por causa da sua posição na cadeia alimentar, essas macrófitas são consideradas o principal vetor para a magnificação desses elementos tóxicos. Os efeitos tóxicos dos metais sobre o ambiente aquático são documentados e bem conhecidos, mas relacionam principalmente ao desbalanço do potencial redox intracelular e, assim, o estresse oxidativo em organismos vivos. Com o objetivo de compreender a relação das macroalgas com o metal essencial Cu2+ e o metal não essencial Cd2+, a macroalga vermelha Gracilaria domingensis foi selecionada. Após 48h de exposição aos metais em águas do mar sintética e natural, as amostras foram extraídas e analisadas em cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. Em seguida, os dados foram pré-processados e pré-tratados para serem utilizados nas análises estatísticas multivariadas (AEM) de PCA e OPLS-DA. A G. domingensis exposta aos metais em água do mar sintética não foram significativamente influenciadas, como indicado pela MVA e pela análise de vias. Apesar disso, alterações significativas foram observadas na exposição aos metais em água do mar natural. Os principais resultados para o Cu2+ foram a interação do metabolismo de glicina, serina e treonina com o metabolismo de glioxilato e dicarboxilato. Foi sugerido que a macroalga poderia estar alterando o modo de adquirir carbono para uma via não fotossintetizante, uma vez que essa via está prejudicada na exposição ao metal. Também, o metabolismo de fenilalanina foi impactado por essa exposição, uma vez que é uma via fundamental para sintetizar compostos fenólicos antioxidantes. Por outro lado, apesar de oito vias terem sido identificadas como significativamente alteradas na exposição ao Cd2+, somente o metabolismo de arginina e prolina parece ter sido significativamente influenciado com o objetivo de produzir prolina, um aminoácido reconhecido por suas propriedades antioxidantes e protetoras em organismos estressados por metais. Em conclusão, os metais essenciais e não essenciais parecem ter mecanismos diferentes na tentativa de promover o combate aos danos gerados pela exposição aos metais. / The environmental metabolomics approach has been used to evaluate the interaction of organisms with their environment. Besides the high impact metals have on the environment, this method of analysis is still in its infancy, in special for macroalgae. As members of the first trophic level in the marine food chain, providing nutrients and microelements to upper levels, macroalgae are appropriate target organisms both for the development of toxicological assays and as a bioindicator of marine degradation. Also, because of their marine food chain position, these macrophytes are considered the main vectors to magnify these toxic elements. The toxic effects of metals on the aquatic environment are documented and well known, but regards mainly to the unbalance of intracellular redox potential and, therefore, oxidative stress in living organisms. In order to understand the relationship of macroalgae with the essential metal Cu2+ and the non-essential metal Cd2+, the red macroalga Gracilaria domingensis was chosen. After 48h of metal exposure in synthetic and natural seawater, the samples were extracted and analysed in gas chromatograph coupled to mass spectrometry. Afterward, the data were preprocessed and pretreated for the multivariative analysis (MVA) with PCA and OPLS-DA statistics. G. domingensis exposed to metals in synthetic seawater were not significantly affected, as indicated by MVA and pathway analysis. Though, significant changes were observed on exposure to metals in natural seawater. The main results for Cu2+ were the interlay of glycine, serine and threonine metabolism with glyoxylate and dicarboxylate metabolism. It was suggested that the macroalga could be shifting the metabolism to acquire carbon from a non-photosynthetic pathway, since it is injured on metal exposure. Also, phenylalanine metabolism was impacted by this metal exposure, since it is a pivotal source of phenolic antioxidant compounds. On the other hand, besides eigth pathways were identified as significantly changed on Cd2+ exposure, only arginine and proline metabolism seemed to be significantly affected, in order to produce proline, known for its antioxidative and protective properties in metal stressed organims. In conclusion, essential and non essential metals seem to have distinct mechanism to mitigate the damaged caused by metal exposure.

A análise do perfil metabólico de frutos em amadurecimento pode prover informações a respeito de quais as vias metabólicas são ativadas e inativadas durante o processo. Tais informações podem auxiliar na identificação de genes expressos nessa fase do ciclo de vida do fruto, ampliando o conhecimento sobre os mecanismos envolvidos no amadurecimento. Usando esta abordagem, este trabalho tem por objetivo identificar mudanças significativas nos níveis de metabólitos da banana durante o amadurecimento induzido pelo etileno. Para tal utilizou-se a cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas para a análise em função do poder de resolução da técnica. Utilizando a biblioteca de espectros de massa NIST 98 foi possível identificar 70 substâncias na fração polar e 40 substâncias na fração apoiar incluindo aminoácidos, açúcares, ácidos orgânicos, lipídeos entre outros. A análise de perfil metabólico revelou importantes variações nos níveis metabólicos de açúcares e ácidos orgânicos, provavelmente devido ao aumento na taxa respiratória do fruto. A maltose e o mio-inositol foram os metabólitos escolhidos para uma análise mais detalhada, que evidenciou a influência de outros metabólitos independentes do etileno na regulação dos eventos da degradação do amido. / The analysis of the metabolic profile of fruits can provide information regarding which metabolic ways are activated and inactivated during the ripening. Such information may help the identification of expressed genes in this process extending the knowledge on the involved mechanisms of ripening. Using this approach, the aim of this work was identify significant changes in the levels of metabolites of the banana during the ripening induced by ethylene. In this way it was used gas chromatography connected the mass spectrometry for these analysis, due to the high resolution of this technique. Using the NIST 98 library of mass spectra it was possible to identify about 70 substances in the polar fraction and 40 substances in the apolar fraction, including amino acids, sugars, organic acid, lipids, and others. The analysis of metabolic profile revealed important variations in the metabolic levels of organic acid sugars and, probably due to an increase in the respiratory rate of the fruit. A detailed analysis was conducted with maltose and myo-inosytol and revealed the influence of other metabolites which independed of ethylene, in the regulation of starch degradation.

A ribonucleoproteína heterogênea nuclear K (hnRNP K) é uma proteína envolvida em processos de expressão gênica e tem sido proposta como ligante de RNAs mensageiros mitocondriais. Apesar de ser considerada um marcador de pior prognóstico no câncer de cabeça e pescoço, o papel da hnRNP K nesta doença ainda é pouco conhecido. O objetivo deste trabalho foi estudar o envolvimento da hnRNP K na mitocôndria com ênfase na bioenergética e na identificação de novos potenciais ligantes de hnRNP K. As linhagens celulares utilizadas foram de carcinoma de cabeça e pescoço (HN13 e CAL 27) com silenciamento de RNA para hnRNP K e células HEK293 com super-expressão de hnRNP K. O efeito do acúmulo celular da hnRNP K na cadeia transportadora de elétrons mitocondrial foi avaliado por meio da atividade dos complexos mitocondriais I, II e V em células HN13. A redução do nível de hnRNP K usando RNA de interferência promoveu uma diminuição da atividade dos complexos nas células HN13, indicando o envolvimento da proteína na eficiência do transporte de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial. Células HEK293 com super-expressão da hnRNP K (HEK293/hnRNP K) e as linhagens HN13 e CAL 27 com silenciamento e redução estável de hnRNP K foram utilizadas para determinar o papel de hnRNP K no potencial de membrana mitocondrial, níveis de ATP, produção de lactato e consumo de oxigênio. Células HEK293/hnRNP K comparadas ao controle apresentaram maior nível de ATP, menor potencial de membrana mitocondrial, menor consumo de oxigênio e maior produção de lactato. As células HN13 com redução da hnRNP K apresentaram níveis mais baixos de ATP, com menor liberação de lactato para o meio extracelular e maior consumo de oxigênio. Esses resultados sugerem que o acúmulo da proteína hnRNP K tem ação importante na mitocôndria por alterar o metabolismo bioenergético celular de fosforilação oxidativa para glicólise anaeróbica. A estratégia de co-imunoprecipitação usando anticorpos para hnRNP K, digestão de proteínas com tripsina e cromatografia líquida acoplada a espectrômetria de massa foi usada para encontrar novos potenciais ligantes de hnRNP K. A análise dos dados com o software SEPro identificou 57 proteínas candidatas a ligantes da hnRNP K. Três proteínas foram validadas por co-IP e Western blotting: o fator de transcrição mitocondrial PTCD3, YB1 e PSF. Propomos que a hnRNP K apresenta função na energética mitocondrial, e provavelmente, a sua interação com PTCD3 participa desta função. / Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K (hnRNP K) is a protein involved in gene expression processes, which has been proposed to bind mitochondrial mRNAs. Despite it to be considered a prognostic marker in cancer, the hnRNPK role in this disease is unknown. We addressed the involvement of hnRNP K in mitochondria with emphasis on bioenergetics and identification of new potential ligands of hnRNP K. The cell lines used were from head and neck squamous cell carcinoma (HN13 and CAL 27) with RNA silencing for hnRNP K , and HEK293 cells with overexpression of hnRNP K. The effects of cellular accumulation of hnRNP K in mitochondrial electron chain carriers were assessed by the activity of mitochondrial complexes I, II and V in HN13 cells. Reduced levels of hnRNP K using RNA interference promoted a decrease in the activity of the complexes in HN13 cells, indicating the involvement of the protein in the efficiency of the electron transport in mitochondrial respiratory chain. HEK293 cells with overexpression of hnRNP K (HEK293/hnRNP K) and HN13 and CAL 27 cells with silencing and stable reduction of hnRNP K were used to determine the role of hnRNP K in mitochondrial membrane potential, ATP levels, lactate production and oxygen consumption. HEK293/hnRNP K, compared to control cells, showed higher levels of ATP, reduced mitochondrial membrane potential, lower oxygen consumption and higher production of lactate. HN13 cells with reduced hnRNP K had lower ATP levels, with lower release of lactate to the extracellular medium and higher oxygen consumption. These results suggest that accumulation of hnRNP K protein plays a role in mitochondria by changing the cellular energetic metabolism from oxidative phosphorylation to glycolysis. The strategy of co-immunoprecipitation using antibodies for hnRNP K, protein digestion with trypsin, and liquid chromatography, coupled to mass spectrometer, were used to search for new potential ligands of hnRNP K. Data analysis with software SEPro identified 57 candidate proteins binding to hnRNP K. Three proteins were validated by co-IP and Western blotting: the mitochondrial transcription factor PTCD3, YB1, and PSF. We propose that hnRNP K plays a role in the mitochondrial energetics, and probably its interaction with PTCD3 participates in this function.

Orientador: Cezinande de Meira / Resumo: O presente estudo teve como objetivo descrever o perfil proteico do embrião equino e do fluido uterino durante a fase inicial do reconhecimento materno da gestação. Foram utilizadas 10 éguas, sem anormalidades uterinas, de 5 a 8 anos de idade. O acompanhamento folicular diário foi realizado até a detecção de um folículo (35 mm) para indução da ovulação, o dia seguinte realizava a inseminação artificial e posteriormente o D0 sendo o dia da ovulação da égua. O líquido uterino foi colhido, usando tampão vaginal comercial de humanos nos dias 7 (D7), 10 (D10) e 12 (D12) de gestação. Nos mesmos períodos, após a retirada do tampão vaginal, os embriões foram colhidos por fluxo retrógrado utilizando-se tampão fosfato-salina pH 7,2. O processamento do líquido uterino foi de centrifugação e dos embriões foram sonicação e centrifugação para proteômica. A concentração de proteína total foi determinada e uma alíquota (50 µg) foi digerida “in solution” com tripsina, seguida da análise por espectrometria de massas. Após a análise estatística multivariada, foram identificadas 171 proteínas, sendo 29 no embrião e 142 no líquido uterino. Foram encontradas 15 proteínas mais abundantes nos embriões, sendo 10 no D10 e 5 no D12. Já no líquido uterino, 6 proteínas foram mais abundantes no D7, 3 no D10 e 6 no D12. As principais funções moleculares foram atividade catalítica e de ligação e os processos biológicos mais significativos foram o processo celular e metabólico. Este estudo descreveu proteína... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to describe the protein profile of the equine embryo and uterine fluid, during the maternal recognition of pregnancy. Ten mares from 5 to 8 years of age, without uterine abnormalities were used. Daily follicular monitoring was performed until the detection of the preovulatory follicle (35 mm) to induce ovulation, the next day performed artificial insemination and then D0 was the mare's ovulation day. The uterine fluid was collected using commercial human vaginal tampon at 7 (D7), 10 (D10) and 12 (D12) of the gestation. In the same moments, after withdraw vaginal tampon, the embryos were collected by retrograde flushing using phosphate-saline buffer pH 7.2. The processing of the uterine fluid was centrifugation and the embryos were sonicated and centrifuged for proteomics. The total protein concentration was determined and an aliquot (50 µg) was digested “in solution” with trypsin, followed by analysis by mass spectrometry. After data analysis by multivariate statistical, 171 proteins were identified, 29 in the embryo and 142 in the uterine fluid. Fifteen abudant proteins were found in the embryos, 10 proteins in the D10 and 5 in the D12. In the uterine fluid, 6 proteins were more abundant in the D7, 3 in the D10 and 6 in the D12. The main molecular functions were catalytic and binding activity and the most significant biological processes were the cellular and metabolic processes. This study described proteins that were abundants in the uterine fluid... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Robson Francisco Carvalho / Resumo: Adenocarcinoma ductal do pâncreas (PDAC) é extremamente agressivo, possui prognóstico desfavorável e não existem biomarcadores satisfatório para a doença ou identificação de indivíduos com alto risco de morbidade e mortalidade. A complexidade celular e molecular do câncer de pâncreas leva a inconsistências nas validações clínicas de muitas proteínas que foram avaliadas como biomarcadores prognósticos da doença. O secretoma tumoral desempenha um papel crucial na proliferação e metástase de células PDAC, bem como na resistência a tratamentos terapêuticos, que juntos contribuem para um pior resultado clínico. Assim, a enorme quantidade de dados proteômicos do câncer de pâncreas que foram gerados a partir de diferentes tipos de amostras e técnicas de espectrometria de massa pode ser integrada para a seleção de proteínas secretadas compartilhadas relevantes para o diagnóstico e prognóstico da doença. O objetivo do presente estudo foi realizar uma meta-análise combinando dados do proteoma do câncer de pâncreas e secretome publicamente para identificar novos potenciais biomarcadores de doenças. Realizamos uma meta-análise integrando dados de espectrometria de massa obtidos de duas revisões sistemáticas da literatura sobre câncer de pâncreas, que selecionaram independentemente 20 estudos do secretoma e 35 do proteoma. Em seguida, realizamos análises de predição de proteínas secretadas usando sete ferramentas ou bancos de dados “in silico”, que identificaram 39 proteínas compartilhada... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is extremely aggressive, has an unfavorable prognosis and there are no satisfactory biomarkers for the disease or identification of individuals at high risk of morbidity and mortality. The cellular and molecular complexity of pancreatic cancer leads to inconsistences in clinical validations of many proteins that have been evaluated as prognostic biomarkers of the disease. Tumor secretome plays a crucial role in PDAC cell proliferation and metastasis, as well as in resistance to therapeutic treatments, which together contribute to a worse clinical outcome. Thus, the massive amount of proteomic data from pancreatic cancer that have been generated from different studies can be integrated into the selection of shared secreted proteins relevant to the prognosis of the disease. The aim of the present study was to perform a metaanalysis combining pancreatic cancer proteome and secretome publicly data to identify new potential disease biomarkers. We performed a meta-analysis integrating mass spectrometry data obtained from two systematic reviews of the pancreatic cancer literature, which independently selected 20 studies of the secretome and 35 of the proteome. Next, we performed prediction analyses of secreted proteins using seven “in silico” tools or databases, which identified 39 proteins shared between the secretome and the proteome data. Notably, the expression of 31 genes of these proteins was upregulated in pancreatic adenocarcinoma samp... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor