Este trabalho investigou, pela primeira vez, a influência do CH na modulação do metabolismo e proliferação de fibroblastos dérmicos humanos (FDHs) derivados de áreas fotoprotegida e fotoexposta, cultivados em modelo de monocamada. Além disto, foram investigados os efeitos da suplementação com CH na secreção de colágeno tipo I, em modelo de cultura 3D de equivalente dérmico, derivado de matriz produzida exclusivamente por FDHs. O tratamento com CH não influenciou a proliferação celular dos fibroblastos derivados de ambas as áreas, porém modulou expressivamente o metabolismo dos FDHs cultivados em monocamada, elevando o conteúdo de pró-colágeno I e colágeno I e diminuindo a atividade de metaloproteinases de matriz (MMP) 1 e 2. Concentrações menores de CH foram suficientes para estimular as células de área fotoexposta, sugerindo efeitos mais pronunciados do CH nestas células. Este estudo é uma contribuição importante para compreensão dos efeitos biológicos do CH nas células da pele e viabilidade do seu uso como ingrediente funcional de suplementos alimentares. / This study investigated, for the first time, the influence of CH on the extracellular matrix metabolism and proliferation of human dermal fibroblasts (HDFs) derived from sun-protected and sun-exposed body sites, cultured in monolayer in vitro model. Moreover, CH effects on the secretion of type I collagen were investigated in dermal equivalent 3D model derived from dermal matrix produced exclusively by HDFs. CH treatment did not affect cellular proliferation of either cell cultures, but notably modulated cell metabolism in monolayer model, increasing the content of procollagen I and collagen I and decreasing metalloproteinase activity (MMP) 1 and 2. These effects were confirmed in the human dermal equivalent model. Lower concentrations of CH were enough to stimulate sun-exposed-derived HDFs, suggesting more pronounced effect in these cells. This study presents an important contribution to understanding the biological effects of CH in skin cells and viability of its use as a functional ingredient in food supplements.

INTRODUÇÃO: Embora os corticosteróides sejam considerados tratamento padrão-ouro na asma, pacientes com asma grave não são totalmente controlados com este tratamento. Estudos prévios com inibidores da Rho quinase sugeriram uma influência benéfica destas drogas na asma, atuando como uma possível alternativa anti-inflamatória. No entanto, não há estudos anteriores avaliando os efeitos destes inibidores, associados ou não com corticosteróides, na modulação da mecânica do sistema respiratório e oscilatória do tecido pulmonar distal, assim como nas alterações histopatológicas, em modelo animal de inflamação pulmonar crônica. OBJETIVOS: Avaliar se o tratamento com o inibidor específico da Rho (Y- 27632), associado ou não com a dexametasona modula a resposta de mecânica pulmonar, inflamatória, de remodelamento da matriz extracelular e ativação do estresse oxidativo em cobaias com inflamação alérgica crônica. MÉTODOS: As cobaias receberam sete inalações de ovoalbumina (1-5mg/ml; grupo OVA) durante 4 semanas. A partir da quinta inalação, os animais do grupo da Rho quinase receberam inalação de Y-27632 (1mM) (grupo OVA-RHO) e ou dexametasona (2 mg.kg-1) associada ou não a Y-27632 (grupos OVA-C ou grupos ORC), 10 minutos antes de cada inalação com OVA. Setenta e duas horas depois da sétima inalação, os animais foram anestesiados, exsanguinados, o óxido nítrico exalado foi coletado e a mecânica do sistema respiratório (Ers e Rrs) e oscilatória do tecido pulmonar distal (Et e Rt) foram realizadas em condições basais e após desafio com OVA (0,1%). Após, as fatias de pulmão foram removidas e submetidas à avaliação histopatológica. RESULTADOS: Houve um aumento no óxido nítrico exalado, nas respostas máximas de Ers, Rrs, Rt e Et após desafio antigênico, nos eosinófilos, nas células positivas para IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-?, iNOS, MMP-9, TIMP-1,TGF- ß, NF?B e no conteúdo do 8-iso-PGF2?, no conteúdo de fibras elásticas, colágenas e de actina em vias aéreas e no parênquima pulmonar distal do grupo OVA comparado ao controle (P<0,05). Nos grupos OVA-RHO, OVA-C e ORC houve uma diminuição em todos os parâmetros comparados ao grupo OVA (P<0,05). A associação do Y-27632 com o tratamento com corticosteróide (grupo ORC) potencializou a atenuação do conteúdo de colágeno e IFN-? na parede das vias aéreas e IL-2, IFN-?, 8-iso-PGF2? e NF-?B no parênquima distal comparado aos grupos OVA-RHO e OVA-C (P<0,05). No grupo ORC houve uma redução nas células positivas para TIMP-1 e eosinófilos no septo alveolar comparado ao grupo OVA-C (P<0,05). CONCLUSÕES: A inibição da Rho quinase ou o tratamento com corticosteróides contribuíram para o controle da resposta de mecânica pulmonar, da resposta eosinofílica e linfocitária Th1 e Th2, do remodelamento da matriz extracelular e da ativação do estresse oxidativo nas vias aéreas e parênquima distal neste modelo animal. A associação do inibidor da Rho quinase com o corticosteróide potencializou o controle de parte da resposta de remodelamento e de inflamação nas vias aéreas e parênquima. A inibição da Rho quinase associada ou não a corticosteróides pode ser considerada uma ferramenta farmacológica futura para o tratamento de doenças pulmonares crônicas / INTRODUCTION: Although corticosteroids are considered gold standard of asthma treatment, patients with serious asthma are not totally controlled with this treatment. Previous studies with Rho-kinase inhibitors suggested a beneficial influence of these drugs on asthma, being a possible anti-inflammatory alternative. However, there are no previous studies evaluating in an animal model of chronic pulmonary inflammation the effects of such inhibitors, combined or not with corticosteroids, on the mechanics modulation of the respiratory system and oscillation of distal pulmonary tissue, as well as on histopathological alterations. OBJECTIVES: To evaluate whether treatment with the specific Rho inhibitor (Y-27632), combined or not with dexamethasone, modulates the responses of pulmonary mechanics, inflammation, extracellular matrix remodeling, and oxidative stress activation in guinea pigs with chronic allergic inflammation. METHODS: Guinea pigs received seven ovalbumin inhalations (1-5mg/ml; OVA group) during 4 weeks. After the fifth inhalation, the animals of the Rho-kinase group received inhalation of Y-27632 (1mM) (OVA-RHO group) and/or dexamethasone (2 mg.kg-1), combined or not with Y-27632 (OVA-C groups or ORC groups), 10 minutes before each inhalation with OVA. Seventy-two hours following the seventh inhalation, the animals were anesthetized, exsanguinated, the exhaled nitric oxide was collected, and mechanics of the respiratory system (Ers and Rrs) and oscillation of the distal lung tissue (Et e Rt) were performed in basal conditions and after challenge with OVA (0.1%). Afterwards, lung slices were removed and submitted to histopathological evaluation. RESULTS: There was an increase of exhaled nitric oxide, maximum responses of Ers, Rrs, Et and Rt after antigen challenge, eosinophil counts, cells positive for IL-2, IL-4, IL-5, IL-13, IFN-?, iNOS, MMP-9, TIMP-1,TGF-ß, NF?B, and in the content of 8-iso-PGF2?, elastic fibers, collagen fibers and actin in the airways in distal lung parenchyma of the OVA group, compared to the control (P<0.05). In the OVA-RHO, OVA-C and ORC groups there was a decrease in all parameters, when compared to the OVA group (P<0.05). The treatment combining Y-27632 with corticosteroid (ORC group) maximized the attenuation of the content of collagen and IFN-y in the airways walls, and of IL-2, IFN-?, 8-iso-PGF2? and NF-?B in distal parenchyma, when compared to the OVA-RHO and OVA-C groups (P<0.05). In the ORC group, there was a reduction of cells positive for TIMP-1 and eosinophils in the alveolar septum, compared to the OVA-C group (P<0.05). CONCLUSIONS: Rho kinase or treatment with corticosteroids contributed to the control of the pulmonary mechanics response, Th1 and Th2 lymphocyte and eosinophil responses, extracellular matrix remodeling, and activation of the oxidative stress in the airways and distal parenchyma of this animal model. The combined treatment with Rho kinase and corticosteroid maximized the control of part of the remodeling response and inflammation of the airways and parenchyma. Rho-kinase inhibition combined or not with corticosteroids can be considered a future pharmacological tool for treatment of chronic pulmonary diseases

A remodelação do epitélio e do mesênquima subjacente tem um papel crucial na patogênese da fibrose pulmonar experimental. A iniciação, gravidade e distribuição de fibrose varia entre os diferentes agentes químicos. Estudos recentes indicaram que o envolvimento epitelial, a expressão de proteínas reguladoras do epitélio, ativação endotelial, estresse do retículo endoplasmático, a ativação de fibroblastos e acumulação de diferentes tipos de colágeno, pode ser específica em lesão causadas por diferentes agentes químicos. Neste estudo, comparou-se a fibrose pulmonar induzida por bleomicina (BLM) e hidroxitolueno butilado (BHT). Envolvimento epitelial, proteínas reguladoras, ativação endotelial e de fibroblastos foram quantitativamente avaliados pela densidade de células alveolares, expressão de telomerase, endotelina-1 (ET-1), fator de crescimento vascular (VEGF), fator de transformação do crescimento beta (TGF-beta) e do fator de crescimento de fibroblastos básico (bFGF). Estresse celular em células epiteliais alveolares do tipo 2 (AEC II) e fibroblastos, eventualmente, responsáveis pela gênese da fibrose pulmonar, foram investigados por microscopia eletrônica. Os colágenos do tipo I (Col I), III (Col III) e V (Col V) foram caracterizados e quantificados por imunofluorescência. A quantidade de colágeno pulmonar e alterações histológicas fibróticas foram significativamente aumentadas nos grupos BLM e BHT em relação aos controles, com diferença significativa entre a resposta fibrótica precoce e tardia. A densidade AEC II, a expressão da telomerase, ET-1, VEGF, TGF-beta e bFGF foram significativamente maiores nos grupos BLM e BHT do que em pulmões dos grupos controles, com diferença significativa entre a fase precoce e tardia da resposta fibrótica. Mitocôndrias anormais e estresse do retículo endoplasmático em AEC II e fibroblastos foram encontrados em ambos os grupos fibróticos. Aumento no acumulo de fibras de Col I, III e V, foram encontradas no interstício pulmonar após instilação de BLM e BHT. A expressão gênica de TGF-beta1 e alfa actina de músculo liso (alfa-SMA) foi significativamente maior em ambos modelos de fibrose pulmonar. Ativação de Smad3 (Mothers against decapentaplegic homolog 3) associada à expressão de IL-beta1 (Interleucina-1 beta), Lox (lisil-oxidase) e o fator de transcrição Sp1 (Specificity protein 1) foi associada com a ativação do gene alfa-SMA. Em conclusão, os nossos resultados tornam-se relevantes pois demonstram que, independentemente do insulto inicial, há uma convergência no perfil de sinalização, onde fica evidente que a lesão epitélio/endotelial está envolvida num amplo e contínuo processo de reparação com consequente final fibrótico. Um elemento chave no reparo e remodelamento tecidual ou fibrose é a resposta mesenquimal que fornece componentes essenciais de MEC necessários para a infraestrutura da cura e por outro lado para a fibrose progressiva crônica / Epithelial and underlying mesenchyme remodeling have a critical role in the pathogenesis of experimental pulmonary fibrosis. The initiation, distribution and severity of fibrosis varies among different chemical agents. Recent studies have indicated that epithelial involvement, expression of epithelial regulatory proteins, endothelium activation, endoplasmic reticulum stress, fibroblast activation and accumulation of different types of collagen may be specific in various chemical agents of injury. In this study, bleomycin (BLM) and Butylated hydroxytoluene (BHT)-induced pulmonary fibrosis in mice were compared. Epithelial involvement, regulatory proteins, endothelium and fibroblast activation were quantitatively evaluated by alveolar cells density, telomerase, endothelin-1 (ET-1), Vascular endothelial growth factor (VEGF), Transforming growth factor beta (TGF-beta) and basic fibroblast growth factor (bFGF) expression. Cellular stress in type 2 alveolar epithelial cells (AEC II) and fibroblasts, eventually responsible by generating lung fibrosis, were investigated by electron microscopy. We characterized and quantified collagen type I (Col I), III (Col III) and V (Col V) by immunofluorescence. Lung collagen content and fibrotic histological changes were significantly increased in BLM and BHT models compared to control with significant difference between early and late fibrotic response. AEC II density, telomerase expression, ET-1, VEGF, TGF-beta and bFGF were significantly higher than control lungs with significant difference between early and late BLM and BHT fibrotic response. Abnormal mitochondria and endoplasmic reticulum in AEC II and fibroblasts was found in both groups of chemical agents. Increased of Col I, Col III and V fibers accumulation was found in the lung interstitium after BLM and BHT instillation. The expression of TGF-beta1 and alfa smooth muscle actin (alfa-SMA) gene was significantly increased in both model of pulmonary fibrosis. Activated Smad3 (Mothers against decapentaplegic homolog 3) associated to the IL-beta1 (Interleukin-1 beta), Lox (Lysyl oxidase) and the transcription factor Sp1 (Specificity protein 1) was associated to the activation of alfa-SMA gene. In conclusion, our results become relevant because they demonstrate that, regardless of the initial insult, there is a convergence in the signaling profile, where it is clear that the epithelial/endothelial injury is involved in a broad and continuous repair process with consequent fibrotic end. A key component in tissue repair and remodeling, or fibrosis is the mesenchymal response which provides essential components of extracellular matrix infrastructure needed to cure and secondly for chronic progressive fibrosis

O câncer de mama é o tipo de câncer mais comumente detectado em mulheres de todo o mundo. Na maioria das pacientes, a causa de morte se deve, principalmente, à doença metastática que pode se desenvolver a partir do tumor primário. O processo metastático envolve uma complexa cascata de eventos, incluindo a quebra organizada dos componentes da matriz extracelular por metaloproteinases de matriz (MMPs). A atividade das MMPs é precisamente regulada por inibidores específicos, os inibidores teciduais das MMPs (TIMPs). Dado seu papel na progressão tumoral, níveis elevados de MMPs têm sido associados com prognóstico desfavorável para pacientes com câncer. Por outro lado, sendo os TIMPs proteínas multifuncionais, níveis elevados de TlMP-1 e de TIMP-2 correlacionam com agressividade do tumor e prognóstico ruim em diferentes tipos de câncer, incluindo o câncer de mama. O gene supressor de metástase RECK codifica uma glicoproteína de membrana capaz de inibir a invasão e a metástase tumoral através da regulação negativa da atividade de MMPs envolvidas em carcinogênese: MMP-2, MMP-9 e MMP-14 (MT1-MMP). A fim de analisar o papel das MMPs e de seus inibidores (TIMPs e RECK) na progressão tumoral do câncer de mama, o perfil de expressão destes genes foi detectado, através de ensaios de Real-Time PCR, em um painel de cinco linhagens celulares de carcinoma de mama humano com diferentes potenciais invasivos e metastáticos e em 72 amostras teciduais de tumores primários de mama e 30 amostras teciduais de borda normal adjacente ao tumor. O perfil de expressão protéica de RECK foi avaliado em 236 amostras de tumores primários de mama através de ensaios de Tissue Microarray. Além disso, a atividade proteolítica das MMPs foi detectada em ensaios de Zimografia. Os resultados obtidos indicam que a progressão do câncer de mama humano está relacionada com um aumento dos níveis de expressão das MMPs e de seus inibidores específicos. O aumento dos níveis de expressão dos TIMPs parece estar relacionado ao seu papel como proteína multifuncional que pode estar funcionando de maneira a promover, mais do que suprimir, a progressão tumoral. Níveis elevados da expressão protéica de RECK estão associados com pior prognóstico. No entanto, para pacientes em estádios clínicos avançados, altos níveis de expressão de RECK podem estar correlacionados com melhor prognóstico, dependendo do balanço MMP/inibidor. Os níveis de expressão das MMPs apresentaram correlação positiva em relação aos níveis de expressão de seus inibidores específicos, sugerindo a existência de fatores e vias de sinalização comuns envolvidas na regulação coordenada destes genes. Além disso, a síntese do inibidor pode estar relacionada a uma resposta celular ao aumento da expressão e atividade de proteases. O balanço transcricional enzima/inibidor favorece a enzima nas amostras tumorais e, de modo contrário, o inibidor específico nas amostras de borda normal, sugerindo o balanço como o principal fator na determinação da degradação da MEC em processos invasivos e metastáticos. Os resultados obtidos podem contribuir para um melhor entendimento da complexidade dos mecanismos envolvidos na metástase do câncer de mama. / Breast cancer is among the most common tumors affecting women. Like most solid tumors, metastatic disease rather than the primary tumor itself is responsible for death. The metastatic process involves a complex cascade of events, including the organized breakdown of the extracellular matrix by matrix metalloproteinases (MMPs). The activity of these proteases is tightly regulated by specific inhibitors, known as tissue inhibitors of MMPs (TIMPs). Consistent with their role in tumor progression, high levels of a number of MMPs have been shown to correlate with poor prognosis in human cancers. On the other hand, TIMPs are multifunctional molecules with high levels of TIMP-1 and TIMP-2 having been shown to predict adverse prognosis and correlate with tumor aggressiveness in several different human cancers, including breast cancer. The RECK metastasis suppressor gene encodes a membrane-associated MMP regulator protein that is able to suppress tumor invasion and metastasis by negatively regulating MMPs involved in carcinogenesis, namely: MMP-2, MMP-9 and MMP-14 (MT1-MMP). In order to analyse the role of these genes in breast cancer progression, the expression levels of MMPs and theirs inhibitors were detected by Real Time PCR in a panel of five human breast cancer cell lines displaying different degrees of invasiveness and metastatic potential and in 72 primary breast cancer and 30 adjacent normal tissue specimens. The RECK protein expression profile was also examined in 236 primary breast cancer tissue specimens by Tissue Microarray technology. The proteolytic activity of MMPs was examined by Zymography. The results suggest that high expression levels of MMPs and their inhibitors are correlated with breast cancer progression. High levels of TIMP transcript may be involved in tumor-promoting activity as a result of their multifunctional role. Increased levels of the RECK protein are correlated with poor prognosis for the patient. However, high levels of RECK would be expected to confer a favorable prognosis to patients with advanced disease. The expression levels of MMPs significantly correlated with the levels of TIMPs and may be explained by coordinate correlation of these molecules or, alternatively, the synthesis of an inhibitor may be a cellular reaction to the presence of the protease. The enzyme/inhibitor balance at the transcriptional level favors the enzyme in tumor tissue and the inhibitor in adjacent normal tissue. It is probably the parameter that will determine the matrix degradation at invasion and metastatic process. Our results are likely to contribute for better understanding of the complex mechanisms involved in breast cancer metastasis.

La medicina regenerativa és una disciplina que ha guanyat reconeixement en les últimes dècades pel fet que moltes malalties no són tractables amb fàrmacs convencionals. Molts grups de recerca i empreses inverteixen temps i diners en la producció de nous paradigmes per curar malalties com el Parkinson, l'artrosi o la regeneració de medul·la espinal. Aquestes propostes es basen en l'ús de teixits biomimètics per reparar òrgans danyats. En aquesta tesi es presenta un nou model experimental per estudiar la formació d'os i cartílag i eventualment la reparació d'aquests teixits. Hem utilitzat Fibroblasts Embriònics de Ratolí (MEFs) combinats amb diferents materials biomimètics per estudiar os i cartílag in vitro i in vivo. Aquests MEFs es van cultivar in vitro i in vivo en RAD16-I, un pèptid auto-ensamblable amb estructura similar a matrius extracel·lulars genèriques, amb l'objectiu d'estudiar l'evolució dels fibroblasts en aquestes dues condicions. També s'han recobert superficialment micropartícules de hidroxiapatita obtenint càrregues inorgàniques similars a l'os i biològicament actives per a utilitzar-les com a substituts d'os o cartílag. Amb la idea de millorar els recobriments superficials, hem desenvolupat una plataforma que permet dur a terme proves combinatòries amb factors de creixement i altres compostos biològicament actius. Cultius in vitro de MEFs han mostrat que quan fibroblasts embrionaris primaris de ratolí es cultiven en RAD16-I, estableixen una xarxa intercel·lular que causa una contracció cel·lular organitzada, proliferació i migració cel·lulars i culmina amb la formació d'una estructura bilateral i simètrica amb un eix central distingible. Durant aquest procés morfològic, augmenta l'expressió d'un grup de gens mesodèrmics (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2). L'expressió de brachyury està localitzada primer en l'eix de simetria central i després s'extén als dos costats de l'estructura. Per acabar, la formació espontània d'un teixit similar al del cartílag acompanya l'expressió de Sox9 i Runx2.L'estudi in vivo de MEFs es va fer gràcies a la tècnica de presa d'imatges no invasiva basada en bioluminiscència (BLI) que ha desenvolupat en el grup de recerca del dr. Jerónimo Blanco. Aquests experiments han mostrat que el RAD16-I és una matriu molt permissiva per a la supervivència i proliferació cel·lulars in vivo. A més, sembla que les pobres propietats mecàniques que té el RAD16-I no li suposen cap desavantatge en termes de creixement cel·lular in vivo. Finalment, hem desenvolupat diferents tipus de micropartícules de hidroxiapatita (HA) no recobertes, i recobertes mitjançant polimerització assistida per plasma. Els recobriments permeten afinar les propietats de la HA i produir partícules que satisfacin les necessitats de diferents aplicacions mèdiques en reparació d'os i cartílag. També hem desenvolupat un mètode per produir plataformes basades en plaques de 96 pous que permetin fer proves combinatòries amb compostos biològicament actius per vàries aplicacions en medicina regenerativa. En conclusió, hem aportat noves idees i eines que permetran trobar teixits regeneratius basats en l'ús de fibroblasts i materials biomimètics. / La medicina regenerativa es una disciplina que ha ganado reconocimiento en las últimas décadas porque muchas enfermedades no son tratables con fármacos convencionales. Muchos grupos de investigación y empresas invierten tiempo y dinero en la producción de nuevos paradigmas para curar enfermedades como el Parkinson, la artrosis o la regeneración de médula espinal. Estas propuestas se basan en el uso de tejidos biomiméticos para reparar órganos dañados. En esta tesis se presenta un nuevo modelo experimental para estudiar la formación de hueso y cartílago y tal vez la reparación de estos tejidos. Hemos utilizado Fibroblastos Embrionarios de Ratón (MEFs) combinados con diferentes materiales biomiméticos para estudiar hueso y cartílago in vitro e in vivo. Estos MEFs se cultivaron in vitro e in vivo en RAD16-I, un péptido auto-ensamblable con estructura similar a matrices extracelulares genéricas, con el objetivo de estudiar la evolución de los fibroblastos en estas dos condiciones. También se han recubierto superficialmente micropartículas de hidroxiapatita obteniendo cargas inorgánicas similares al hueso y biológicamente activas para utilizarlas como sustitutos de hueso o cartílago. Con la idea de mejorar los recubrimientos superficiales, hemos desarrollado una plataforma que permite llevar a cabo pruebas combinatorias con factores de crecimiento y otros compuestos biológicamente activos. Cultivos in vitro de MEFs han mostrado que cuando fibroblastos embrionarios primarios de ratón se cultivan en RAD16-I, establecen una red intercelular que causa una contracción celular organizada, proliferación y migración celulares y culmina con la formación de una estructura bilateral y simétrica con un eje central distinguible. Durante este proceso morfológico, aumenta la expresión de un grupo de genes mesodérmicos (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2). La expresión de brachyury está localizada primero en el eje de simetría central y después se extiende a los dos lados de la estructura. Para terminar, la formación espontánea de un tejido similar al del cartílago acompaña a la expresión de Sox9 y Runx2.El estudio in vivo de MEFs se hizo gracias a la técnica de toma de imágenes no invasiva basada en bioluminiscencia (BLI) que han desarrollado en el grupo de investigación del dr. Jerónimo Blanco. Estos experimentos han mostrado que el RAD16-I es una matriz muy permisiva para a la supervivencia y proliferación celulares in vivo. Además, parece que las pobres propiedades mecánicas que tiene el RAD16-I no le suponen ninguna desventaja en términos de crecimiento celular in vivo. Finalmente, hemos desarrollado diferentes tipos de micropartículas de hidroxiapatita (HA) no recubiertas, y recubiertas mediante polimerización asistida por plasma. Los recubrimientos permiten afinar las propiedades de la HA y producir partículas que satisfagan las necesidades de diferentes aplicaciones médicas en reparación de hueso y cartílago. También hemos desarrollado un método para producir plataformas basadas en placas de 96 pozos que permitan hacer pruebas combinatorias con compuestos biológicamente activos para varias aplicaciones en medicina regenerativa. En conclusión, hemos aportado nuevas ideas y herramientas que permitirán hallar tejidos regenerativos basados en el uso de fibroblastos y materiales biomiméticos. / Regenerative medicine is a discipline that has gained recognition in the last decades because many diseases are not treatable with traditional drugs. Many research groups and companies invest time and money in the production of new paradigms to cure conditions such as Parkinson's, arthrosis or spinal cord injuries. These approaches are based in the use of biomimetic tissues to replace damaged organs. In this work we present a new experimental model to study the formation of bone and cartilage and eventually to repair these tissues. We have used Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs) combined with different biomimetic materials to study bone and cartilage formation in vitro and in vivo. MEFs have been cultured in vitro and in vivo in RAD16-I, a synthetic self-assembling peptide with structure similar to generic extracellular matrix milieu, to study the evolution of these fibroblasts in both conditions. Also, hydroxyapatite microparticles have been surface coated to produce biologically active bone-like inorganic charges for use in cartilage or bone substitutes. In order to improve the particles' coatings, we have developed a platform that allows us to perform combinatorial testing of growth factors and other biologically active compounds. In vitro cultures of MEFs has shown that when primary mouse embryonic fibroblasts are cultured in a soft nanofiber scaffold, they establish a cellular network that causes an organized cell contraction, proliferation, and migration that ends in the formation of a symmetrically bilateral structure with a distinct central axis. A subset of mesodermal genes (brachyury, Sox9, Sox5, Sox6, Runx2) is upregulated during this morphogenetic process. The expression of brachyury was localized first at the central axis, extending then to both sides of the structure. The spontaneous formation of cartilage-like tissue mainly at the paraxial zone followed the expression of Sox9 and Runx2.In vivo study of MEFs was facilitated by a non-invasive bioluminescence imaging (BLI) technique to detect luciferase-expressing cells, developed by Dr. Blanco's research group. These experiments showed that RAD16-I is a very permissive scaffold for cell survival and proliferation in vivo. Furthermore, it seems that the poor mechanical properties of RAD16-I are no disadvantage in terms of cell growth in vivo.Finally, we have developed different types of coated and uncoated hydroxyapatite (HA) microparticles by plasma polymerization. The coatings permit to tune the properties of HA and produce particles that suit the needs of different medical applications in bone and cartilage repair. Moreover, we have developed a method to produce platforms based on 96-well plates that allow the combinatorial testing of biologically active compounds for various applications in regenerative medicine. In conclusion, we have supplied new insights and tools that will enhance the finding of new regenerative tissues based on fibroblasts and biomimetic materials.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O diagnóstico da hanseníase neural pura baseia-se em dados clínicos e laboratoriais do paciente, incluindo a histopatologia de espécimes de biópsia de nervo e detecção de DNA de Mycobacterium leprae (M. leprae) pelo PCR. Como o exame histopatológico e a técnica PCR podem não ser suficientes para confirmar o diagnóstico, a imunomarcação de lipoarabinomanana (LAM) e/ou Glicolipídio fenólico 1 (PGL1) - componentes de parede celular de M. leprae foi utilizada na primeira etapa deste estudo, na tentativa de detectar qualquer presença vestigial do M. leprae em amostras de nervo sem bacilos. Além disso, sabe-se que a lesão do nervo na hanseníase pode diretamente ser induzida pelo M. leprae nos estágios iniciais da infecção, no entanto, os mecanismos imunomediados adicionam severidade ao comprometimento da função neural em períodos sintomáticos da doença. Este estudo investigou também a expressão imuno-histoquímica de marcadores envolvidos nos mecanismos de patogenicidade do dano ao nervo na hanseníase. Os imunomarcadores selecionados foram: quimiocinas CXCL10, CCL2, CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, e metaloproteinases 2 e 9. O estudo foi desenvolvido em espécimes de biópsias congeladas de nervo coletados de pacientes com HNP (n=23 / 6 BAAR+ e 17 BAAR - PCR +) e pacientes diagnosticados com outras neuropatias (n=5) utilizados como controle. Todas as amostras foram criosseccionadas e submetidas à imunoperoxidase. Os resultados iniciais demonstraram que as 6 amostras de nervos BAAR+ são LAM+/PGL1+. Já entre as 17 amostras de nervos BAAR-, 8 são LAM+ e/ou PGL1+. Nas 17 amostras de nervos BAAR-PCR+, apenas 7 tiveram resultados LAM+ e/ou PGL1+. A detecção de imunorreatividade para LAM e PGL1 nas amostras de nervo do grupo HNP contribuiu para a maior eficiência diagnóstica na ausência recursos a diagnósticos moleculares. Os resultados da segunda parte deste estudo mostraram que foram encontradas imunoreatividade para CXCL10, CCL2, MMP2 e MMP9 nos nervos da hanseníase, mas não em amostras de nervos com outras neuropatias. Além disso, essa imunomarcação foi encontrada predominantemente em células de Schwann e em macrófagos da população celular inflamatória nos nervos HNP. Os outros marcadores de ativação imunológica foram encontrados em leucócitos (linfócitos T e macrófagos) do infiltrado inflamatório encontrados nos nervos. A expressão de todos os marcadores, exceto CXCL10, apresentou associação com a fibrose, no entanto, apenas a CCL2, independentemente dos outros imunomarcadores, estava associada a esse excessivo depósito de matriz extracelular. Nenhuma diferença na frequência da imunomarcação foi detectada entre os subgrupos BAAR+ e BAAR-, exceção feita apenas às células CD68+ e HLA-DR+, que apresentaram discreta diferença entre os grupos BAAR + e BAAR- com granuloma epitelioide. A expressão de MMP9 associada com fibrose é consistente com os resultados anteriores do grupo de pesquisa. Estes resultados indicam que as quimiocinas CCL2 e CXCL10 não são determinantes para o estabelecimento das lesões com ou sem bacilos nos em nervo em estágios avançados da doença, entretanto, a CCL2 está associada com o recrutamento de macrófagos e com o desenvolvimento da fibrose do nervo na lesão neural da hanseníase. / The diagnosis of pure neural leprosy (PNL) is based on clinical and laboratory data, including the histopathology of nerve biopsy specimens and detection of M. leprae DNA by polymerase chain reaction (PCR). Given that histopathological examination and PCR methods may not be sufficient to confirm diagnosis, immunolabeling of lipoarabinomanan (LAM) and/or phenolic glycolipid 1 (PGL1) M. leprae wall components were utilized in the first step of this investigation in an attempt to detect any vestigial presence of M. leprae in AFB- nerve samples. Furthermore, its well known that nerve damage in leprosy can be directly induced by Mycobacterium leprae in the early stages of infection; however, immunomediated mechanisms add gravity to the impairment of neural function in symptomatic periods of the disease. Therefore, this study also investigated the immunohistochemical expression of immunomarkers involved in the pathogenic mechanisms of leprosy nerve damage. These markers selected were CXCL10, CCL2 chemokines and CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, metalloproteinases 2 and 9 in nerve biopsy specimens collected from leprosy (23) and nonleprosy patients (5) suffering peripheral neuropathy. Twenty-three PNL nerve samples (6 AFB+ and 17 AFB-PCR+) were cryosectioned and submitted to LAM and PGL1 immunohistochemical staining by immunoperoxidase; 5 nonleprosy nerve samples were used as controls. The 6 AFB-positive samples showed LAM/PGL1 immunoreactivity. Among the 17 AFB- samples, only 8 revealed LAM and/or PGL1 immunoreactivity. In 17 AFB-PCR+ patients, just 7 had LAM and/or PGL1-positive nerve results. In the PNL cases, the detection of immunolabeled LAM and PGL1 in the nerve samples would have contributed to enhanced diagnostic efficiency in the absence of molecular diagnostic facilities. The results of the second part of this study showed that CXCL10-, CCL2-, MMP2- and MMP9-immunoreactivities were found in the leprosy nerves but not in nonleprosy samples. Immunolabeling was predominantly found in recruited macrophages and Schwann cells composing the inflammatory cellular population in the leprosy-affected nerves. The immunohistochemical expression of all the markers, but CXCL10, was associated with fibrosis; however, only CCL2 was, independently from the other markers, associated with this excessive deposit of extracellular matrix. No difference in the frequency of the immunolabeling was detected between the AFB+ and AFB- leprosy subgroups of nerves, exception made to some statistical tendency to difference in regard to CD68+ and HLA-DR+ cells in the AFB- nerves exhibiting epithelioid granuloma. MMP9 expression associated with fibrosis is consistent with previous results of this research group. The findings conveys the idea that CCL2 and CXCL10 chemokines at least in advanced stages of leprosy nerve lesions are not determinant for the establishment of AFB+ or AFB- leprosy lesions, however, CCL2 is associated with macrophage recruitment and fibrosis.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas (CTHs) e células-tronco mesenquimais. A regeneração do fígado após a hepatectomia é um processo complexo que requer a proliferação de todas as células hepáticas. Fatores de crescimento, citocinas e componentes da matriz extracelular são elementos-chave nesse processo. As lamininas são uma família de proteínas de matriz extracelular, com funções adesivas e quimiotáticas pelo recrutamento de integrinas e outros receptores de superfície celular. No fígado normal, a laminina é expressa nas veias porta e centrolobular. O objetivo desse estudo foi investigar a expressão de laminina durante a regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial e após o transplante de células mononucleares de medula óssea. As células mononucleares de medula óssea foram obtidas dos fêmures e tíbias de ratos, isoladas, marcadas com DAPI e injetadas pela veia porta em ratos recém-hepatectomizados. Os fígados foram coletados 15 minutos, 1 dia e 3 dias após a hepatectomia e o transplante de células de medula óssea e congelados. Os cortes foram imunomarcados com anticorpos primários anti-CD34 e anti-laminina de rato e observados em microscópio confocal de varredura a laser. Os resultados mostraram que 15 minutos após a hepatectomia parcial, as células-tronco hematopoiéticas CD34+ transplantadas foram encontradas em contato com a laminina localizada nas veias porta e centrolobular, indicando que a laminina poderia participar na adesão inicial das células-tronco a esses vasos logo após o seu transplante. Além disso, 1 e 3 dias após a hepatectomia, as células mononucleares de medula óssea transplantadas foram observadas nos sinusóides hepáticos expressando laminina. Esses resultados sugerem que a laminina pode ser um componente da matriz extracelular importante para a adesão e enxerto de células de medula óssea no fígado após uma lesão. Nós também analisamos a expressão de osteopontina (OPN) em células de medula óssea e CTHs. Os resultados por microscopia confocal demonstraram que a maioria das células mononucleares de medula óssea recém-isoladas expressa quantidades variáveis de OPN. Além disso, algumas CTHs CD34+ também expressam OPN. Após 1 e 4 dias de cultura, observamos uma diminuição de células expressando CD34, e um aumento na expressão de OPN pelas células mononucleares de medula óssea. / The adult bone marrow retains two populations of stem cells with emerging importance for the treatment of diverse liver diseases: hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stem cells. Liver regeneration after partial hepatectomy is a complex process that requires the proliferation of all hepatic cells. Growth factors, cytokines and extracellular matrix molecules are key elements in this process. Laminins are a family of heterotrimeric extracellular matrix proteins with adhesive and chemotactic functions, through recruitment of integrins and other cell surface receptors. In the normal liver, laminin is expressed in portal and centrolobular veins. The aim of this study was to investigate laminin expression during liver regeneration induced by partial hepatectomy and after bone marrow mononuclear cells transplantation. Rat bone marrow mononuclear cells were obtained from tibias and femurs, isolated, stained with DAPI and injected in immediately hepatectomyzed rats via portal vein. Livers were collected 15 minutes, 1 day and 3 days after hepatectomy and bone marrow cells transplantation and frozen. Liver sections were immunolabeled with mouse anti-rat CD34 and rabbit anti-rat laminin primary antibodies and observed under a Laser Scanning Confocal Microscope. Results showed that 15 minutes after partial hepatectomy, transplanted CD34+ HSCs were found in contact with laminin, which was localized principally in portal and centrolobular veins of rat livers, indicating that laminin could participate in stem cell initial attachment to these vessels soon after their transplantation. Furthermore, 1 and 3 days after hepatectomy, transplanted bone marrow mononuclear cells were found in the hepatic sinusoids expressing laminin. These results suggest that laminin could be an important extracellular matrix component for bone marrow cell adhesion and grafting in the injured liver. We also analyzed osteopontin (OPN) expression in bone marrow mononuclear cells and HSCs. Results by confocal microscopy showed that the most freshly isolated bone marrow mononuclear cells express variable amounts of OPN. Furthermore, some CD34+ HSCs also expressed OPN. After 1 and 4 days in culture, we observed a decrease in CD34+ cells, and an increase in OPN expression in bone marrow mononuclear cells.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A medula óssea adulta possui duas populações de células-tronco importantes no tratamento de diversas doenças hepáticas: células-tronco hematopoiéticas (CTHs) e células-tronco mesenquimais. A regeneração do fígado após a hepatectomia é um processo complexo que requer a proliferação de todas as células hepáticas. Fatores de crescimento, citocinas e componentes da matriz extracelular são elementos-chave nesse processo. As lamininas são uma família de proteínas de matriz extracelular, com funções adesivas e quimiotáticas pelo recrutamento de integrinas e outros receptores de superfície celular. No fígado normal, a laminina é expressa nas veias porta e centrolobular. O objetivo desse estudo foi investigar a expressão de laminina durante a regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial e após o transplante de células mononucleares de medula óssea. As células mononucleares de medula óssea foram obtidas dos fêmures e tíbias de ratos, isoladas, marcadas com DAPI e injetadas pela veia porta em ratos recém-hepatectomizados. Os fígados foram coletados 15 minutos, 1 dia e 3 dias após a hepatectomia e o transplante de células de medula óssea e congelados. Os cortes foram imunomarcados com anticorpos primários anti-CD34 e anti-laminina de rato e observados em microscópio confocal de varredura a laser. Os resultados mostraram que 15 minutos após a hepatectomia parcial, as células-tronco hematopoiéticas CD34+ transplantadas foram encontradas em contato com a laminina localizada nas veias porta e centrolobular, indicando que a laminina poderia participar na adesão inicial das células-tronco a esses vasos logo após o seu transplante. Além disso, 1 e 3 dias após a hepatectomia, as células mononucleares de medula óssea transplantadas foram observadas nos sinusóides hepáticos expressando laminina. Esses resultados sugerem que a laminina pode ser um componente da matriz extracelular importante para a adesão e enxerto de células de medula óssea no fígado após uma lesão. Nós também analisamos a expressão de osteopontina (OPN) em células de medula óssea e CTHs. Os resultados por microscopia confocal demonstraram que a maioria das células mononucleares de medula óssea recém-isoladas expressa quantidades variáveis de OPN. Além disso, algumas CTHs CD34+ também expressam OPN. Após 1 e 4 dias de cultura, observamos uma diminuição de células expressando CD34, e um aumento na expressão de OPN pelas células mononucleares de medula óssea. / The adult bone marrow retains two populations of stem cells with emerging importance for the treatment of diverse liver diseases: hematopoietic stem cells (HSCs) and mesenchymal stem cells. Liver regeneration after partial hepatectomy is a complex process that requires the proliferation of all hepatic cells. Growth factors, cytokines and extracellular matrix molecules are key elements in this process. Laminins are a family of heterotrimeric extracellular matrix proteins with adhesive and chemotactic functions, through recruitment of integrins and other cell surface receptors. In the normal liver, laminin is expressed in portal and centrolobular veins. The aim of this study was to investigate laminin expression during liver regeneration induced by partial hepatectomy and after bone marrow mononuclear cells transplantation. Rat bone marrow mononuclear cells were obtained from tibias and femurs, isolated, stained with DAPI and injected in immediately hepatectomyzed rats via portal vein. Livers were collected 15 minutes, 1 day and 3 days after hepatectomy and bone marrow cells transplantation and frozen. Liver sections were immunolabeled with mouse anti-rat CD34 and rabbit anti-rat laminin primary antibodies and observed under a Laser Scanning Confocal Microscope. Results showed that 15 minutes after partial hepatectomy, transplanted CD34+ HSCs were found in contact with laminin, which was localized principally in portal and centrolobular veins of rat livers, indicating that laminin could participate in stem cell initial attachment to these vessels soon after their transplantation. Furthermore, 1 and 3 days after hepatectomy, transplanted bone marrow mononuclear cells were found in the hepatic sinusoids expressing laminin. These results suggest that laminin could be an important extracellular matrix component for bone marrow cell adhesion and grafting in the injured liver. We also analyzed osteopontin (OPN) expression in bone marrow mononuclear cells and HSCs. Results by confocal microscopy showed that the most freshly isolated bone marrow mononuclear cells express variable amounts of OPN. Furthermore, some CD34+ HSCs also expressed OPN. After 1 and 4 days in culture, we observed a decrease in CD34+ cells, and an increase in OPN expression in bone marrow mononuclear cells.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O diagnóstico da hanseníase neural pura baseia-se em dados clínicos e laboratoriais do paciente, incluindo a histopatologia de espécimes de biópsia de nervo e detecção de DNA de Mycobacterium leprae (M. leprae) pelo PCR. Como o exame histopatológico e a técnica PCR podem não ser suficientes para confirmar o diagnóstico, a imunomarcação de lipoarabinomanana (LAM) e/ou Glicolipídio fenólico 1 (PGL1) - componentes de parede celular de M. leprae foi utilizada na primeira etapa deste estudo, na tentativa de detectar qualquer presença vestigial do M. leprae em amostras de nervo sem bacilos. Além disso, sabe-se que a lesão do nervo na hanseníase pode diretamente ser induzida pelo M. leprae nos estágios iniciais da infecção, no entanto, os mecanismos imunomediados adicionam severidade ao comprometimento da função neural em períodos sintomáticos da doença. Este estudo investigou também a expressão imuno-histoquímica de marcadores envolvidos nos mecanismos de patogenicidade do dano ao nervo na hanseníase. Os imunomarcadores selecionados foram: quimiocinas CXCL10, CCL2, CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, e metaloproteinases 2 e 9. O estudo foi desenvolvido em espécimes de biópsias congeladas de nervo coletados de pacientes com HNP (n=23 / 6 BAAR+ e 17 BAAR - PCR +) e pacientes diagnosticados com outras neuropatias (n=5) utilizados como controle. Todas as amostras foram criosseccionadas e submetidas à imunoperoxidase. Os resultados iniciais demonstraram que as 6 amostras de nervos BAAR+ são LAM+/PGL1+. Já entre as 17 amostras de nervos BAAR-, 8 são LAM+ e/ou PGL1+. Nas 17 amostras de nervos BAAR-PCR+, apenas 7 tiveram resultados LAM+ e/ou PGL1+. A detecção de imunorreatividade para LAM e PGL1 nas amostras de nervo do grupo HNP contribuiu para a maior eficiência diagnóstica na ausência recursos a diagnósticos moleculares. Os resultados da segunda parte deste estudo mostraram que foram encontradas imunoreatividade para CXCL10, CCL2, MMP2 e MMP9 nos nervos da hanseníase, mas não em amostras de nervos com outras neuropatias. Além disso, essa imunomarcação foi encontrada predominantemente em células de Schwann e em macrófagos da população celular inflamatória nos nervos HNP. Os outros marcadores de ativação imunológica foram encontrados em leucócitos (linfócitos T e macrófagos) do infiltrado inflamatório encontrados nos nervos. A expressão de todos os marcadores, exceto CXCL10, apresentou associação com a fibrose, no entanto, apenas a CCL2, independentemente dos outros imunomarcadores, estava associada a esse excessivo depósito de matriz extracelular. Nenhuma diferença na frequência da imunomarcação foi detectada entre os subgrupos BAAR+ e BAAR-, exceção feita apenas às células CD68+ e HLA-DR+, que apresentaram discreta diferença entre os grupos BAAR + e BAAR- com granuloma epitelioide. A expressão de MMP9 associada com fibrose é consistente com os resultados anteriores do grupo de pesquisa. Estes resultados indicam que as quimiocinas CCL2 e CXCL10 não são determinantes para o estabelecimento das lesões com ou sem bacilos nos em nervo em estágios avançados da doença, entretanto, a CCL2 está associada com o recrutamento de macrófagos e com o desenvolvimento da fibrose do nervo na lesão neural da hanseníase. / The diagnosis of pure neural leprosy (PNL) is based on clinical and laboratory data, including the histopathology of nerve biopsy specimens and detection of M. leprae DNA by polymerase chain reaction (PCR). Given that histopathological examination and PCR methods may not be sufficient to confirm diagnosis, immunolabeling of lipoarabinomanan (LAM) and/or phenolic glycolipid 1 (PGL1) M. leprae wall components were utilized in the first step of this investigation in an attempt to detect any vestigial presence of M. leprae in AFB- nerve samples. Furthermore, its well known that nerve damage in leprosy can be directly induced by Mycobacterium leprae in the early stages of infection; however, immunomediated mechanisms add gravity to the impairment of neural function in symptomatic periods of the disease. Therefore, this study also investigated the immunohistochemical expression of immunomarkers involved in the pathogenic mechanisms of leprosy nerve damage. These markers selected were CXCL10, CCL2 chemokines and CD3, CD4, CD8, CD45RA, CD45RO, CD68, HLA-DR, metalloproteinases 2 and 9 in nerve biopsy specimens collected from leprosy (23) and nonleprosy patients (5) suffering peripheral neuropathy. Twenty-three PNL nerve samples (6 AFB+ and 17 AFB-PCR+) were cryosectioned and submitted to LAM and PGL1 immunohistochemical staining by immunoperoxidase; 5 nonleprosy nerve samples were used as controls. The 6 AFB-positive samples showed LAM/PGL1 immunoreactivity. Among the 17 AFB- samples, only 8 revealed LAM and/or PGL1 immunoreactivity. In 17 AFB-PCR+ patients, just 7 had LAM and/or PGL1-positive nerve results. In the PNL cases, the detection of immunolabeled LAM and PGL1 in the nerve samples would have contributed to enhanced diagnostic efficiency in the absence of molecular diagnostic facilities. The results of the second part of this study showed that CXCL10-, CCL2-, MMP2- and MMP9-immunoreactivities were found in the leprosy nerves but not in nonleprosy samples. Immunolabeling was predominantly found in recruited macrophages and Schwann cells composing the inflammatory cellular population in the leprosy-affected nerves. The immunohistochemical expression of all the markers, but CXCL10, was associated with fibrosis; however, only CCL2 was, independently from the other markers, associated with this excessive deposit of extracellular matrix. No difference in the frequency of the immunolabeling was detected between the AFB+ and AFB- leprosy subgroups of nerves, exception made to some statistical tendency to difference in regard to CD68+ and HLA-DR+ cells in the AFB- nerves exhibiting epithelioid granuloma. MMP9 expression associated with fibrosis is consistent with previous results of this research group. The findings conveys the idea that CCL2 and CXCL10 chemokines at least in advanced stages of leprosy nerve lesions are not determinant for the establishment of AFB+ or AFB- leprosy lesions, however, CCL2 is associated with macrophage recruitment and fibrosis.

INTRODUÇÃO: A endomiocardiofibrose (EMF) é uma doença típica de países tropicais, na qual ocorre a deposição de uma capa fibrosa na região endomiocárdica com graves consequências clínicas. A patogenia da EMF ainda não foi elucidada, mas uma das principais hipóteses etiológicas sugere que a EMF seja consequência de um processo inflamatório crônico com envolvimento de respostas imunes Th2 pós-infestação helmíntica, mediada por eosinófilos nas fases iniciais da doença. Neste estudo avaliamos o perfil da resposta imune e inflamatória, assim como o perfil de proteínas expressas no endomiocárdio afetado, para compreender melhor os mecanismos envolvidos na patogênese da EMF. MÉTODOS: Foram coletadas amostras de plasma e soro de pacientes com diagnóstico de EMF e de indivíduos saudáveis, para dosagens de 6 citocinas plasmáticas do perfil Th1/Th2, Proteína C Reativa ultrassensível (PCRus), IgE total e IgE específico contra aero-alérgenos prevalentes e alérgenos de helmintos. A análise proteômica do endomiocárdio afetado de quatro pacientes com EMF submetidos à ressecção cirúrgica da fibrose, levou à identificação por espectrometria de massas, de proteínas separadas previamente por gel 1D e 2D. Análises in silico de vias funcionais e redes ligando as proteínas identificadas também foram realizadas. Eosinofilia em sangue periférico, assim como dados clínicos e ecocardiográficos, foram avaliados retrospectivamente. RESULTADOS: Foram selecionados 27 pacientes em estágio avançado da EMF, portadores de disfunção diastólica e/ou valvar. Todas as amostras de plasma analisadas apresentaram níveis detectáveis de pelo menos uma das citocinas avaliadas. As citocinas IL-6, TNF-?, IL-10 e IL-4 foram detectadas em pelo menos 74% das amostras, sendo que os níveis de IL-6, TNF-? e IL-10 se apresentaram significantemente elevados em comparação com os detectados nos indivíduos saudáveis. Foi observada correlação positiva entre os níveis de todas as citocinas avaliadas. Apenas 33% dos pacientes apresentaram algum episódio isolado de eosinofilia periférica ao longo do tempo, sendo que 11% apresentaram hipereosinofilia. Os níveis de IgE total foram semelhantes aos observados na população controle. A análise proteômica permitiu identificar 140 proteínas distintas no tecido endomiocárdico, das quais 18 eram provenientes da matriz extracelular. As análises in silico indicaram IL-6 e TNF-? como dois dos principais indutores da expressão das proteínas identificadas e a principal via canônica envolvida nas proteínas identificadas foi a: \"Resposta de Fase Aguda\". Coincidentemente, os níveis de PCRus encontraram-se significativamente aumentados nos portadores de EMF. CONCLUSÕES: Elevados níveis de citocinas pró e anti-inflamatórias e de PCRus sugerem a presença de perfil inflamatório misto (Th1/Th2) nas fases avançadas da patogênese da EMF. A pouca expressão da eosinofilia descarta sua participação ativa na patogênese da fase avançada da doença, mas não é possível excluir sua participação nas fases iniciais. Nossos dados permitem levantar a hipótese que os níveis elevados de citocinas inflamatórias modulem a expressão de proteínas- incluindo as de fase aguda- no tecido endomiocárdico de pacientes portadores de EMF / INTRODUCTION: Endomyocardial fibrosis (EMF) is a typical disease in tropical countries, characterized by the fibrous deposition in the endomyocardium, with severe clinical manifestations. EMF pathogenesis is still unclear, but one of the major hypothesis suggests that EMF could be a consequence of a chronic inflammatory process with possible involvement of a Th2 immune responses after helminthiasis, mediated by eosinophils, which could contribute to pathogenesis in the early stages of the disease. In this study, we evaluated the inflammatory response profile and the protein expression profile of the affected endomyocardium, to understand the mechanisms involved in this pathogenesis. METHODS: Plasma and serum samples were collected from the 27 patients diagnosed with advanced stage EMFand from healthy controls, to mensured plasma levels of 6 cytokines belonging to the Th1/Th2 cytokine profiles, ultrasensitive C Reactive Protein (CRP), total and allergen-specific serum IgE against prevalent and helminthic allergens. Proteomic analysis of tissue samples obtained from 4 EMF patients submitted to surgical resection of affected endomyocardial tissue allowed the identification of proteins by mass spectrometry, after separation by 1D and 2D electroforesis. In silico analysis of functional pathways and networks connecting the proteins identified in the EMF cardiac tissue was also performed. Blood peripheral eosinophilia, clinical and echocardiography data were evaluated retrospectively. RESULTS: All EMF patients displayed detectable plasma levels of at least one of the cytokines tested. We found that TNF-?, IL-6, IL-4 and IL-10 were each detected in at least 74% of tested sera, and plasma levels of IL10, IL6 and TNF-? were significantly higher than controls. Plasma levels of such cytokines positively correlated with each other. Only 33% of the patients presented any episode of blood eosinophilia along time, and 11% of these patients presented hypereosinophilia. Total IgE levels were similar to those from healthy subjects. Proteomic analysis allowed the identification of 140 distinct proteins from the resected endomiocardium of the EMF patients, 18 of which belonging to the extracellular matrix. In silico analysis indicated IL-6 and TNF-? as two of the major gene expression inducers of the identified proteins in our analysis, and the Acute Phase Response was identified as the major canonical pathway involved with the identified set of proteins. Similarly, CRP levels were significantly increased in the EMF patients. CONCLUSIONS: Increased levels of an inflammatory/anti-inflammatory circulating cytokines (Th1/Th2), along with increased CRP levels, suggested the presence of a mixed inflammatory profile in EMF advanced stage. The number of EMF patients with blood eosinophilia does not support the active participation of eosinophils in pathogenesis of advanced EMF. However, it is not possible to exclude the participation in the pathogenesis early stages. Our data support the hypothesis that the increased levels of inflammatory cytokines modulate protein expression -including proteins of the acute phase response - in the endomyocardial tissue of EMF patients