A definição de caso confirmado de leishmaniose visceral é baseada em aspectos clínicos, epidemiológicos e laboratoriais. As técnicas padrão-ouro para o diagnóstico laboratorial da leishmaniose visceral são as parasitológicas esfregaço e cultura de aspirado de medula óssea, que permitem a identificação do gênero Leishmania por visualização microscópica do parasito em lâmina, e os testes sorológicos, como o imunocromatográfico, que apresenta baixa sensibilidade em indivíduos imunodeprimidos. Em determinadas situações, como na coinfecção Leishmania/HIV, para o tratamento específico ou nos inquéritos epidemiológicos, faz-se necessária a identificação do agente etiológico da leishmaniose visceral, que comumente é a L. (L.) infantum. Desse modo, propusemos um algoritmo para o diagnóstico molecular da leishmaniose visceral, com o emprego da kDNA PCR (K20-K22 E RV1-RV2) do ITS1 PCR (LITSR e L5. 8S), tendo como referência os resultados obtidos nos exames parasitológicos e sorológicos, além de dados clínicos e epidemiológicos dos pacientes. Complementando nossa proposta, a realização da técnica de análise dos polimorfismos dos fragmentos da ITS1 PCR por RFLP, para identificação do agente etiológico, foi avaliada como alternativa à laboriosa técnica de eletroforese de isoenzimas, padrão-ouro para definição de espécies no diagnóstico das leishmanioses. As técnicas moleculares empregadas foram validadas em 82 amostras (ITS 1 PCR e kDNA PCR RV1-RV2) e 48 amostras (kDNA PCR K20-K22) de pacientes com leishmaniose visceral confirmada e em 30 amostras de pacientes saudáveis. Os ensaios obtiveram as seguintes sensibilidades: 97,5% (80/82) na ITS1 PCR, 98% (47/48) na kDNA PCR K20-K22, e 92,7% (76/82) na kDNA PCR RV1-RV2, e 100% de especificidade em todos os testes. Quando comparados os resultados obtidos nos testes moleculares ITS1 PCR, kDNA PCR K20-K22 e kDNA PCR RV1-RV2 ao padrão ouro observou-se uma concordância quase perfeita, com um índice kappa maior que 0,80, e um valor de p < 0,001. No que concerne à realização da ITS1 PCR RFLP nas 80 amostras positivas, 52,5% (42/80) demonstraram perfil semelhante ao de L. (L.) infantum. Três das amostras que não demonstraram perfil na RFLP da ITS1 PCR e na kDNA PCR K20-K22 obtiveram mais de 90% de identidade com a cepa de L. (L.) chagasi, mediante análise das amostras na técnica do sequenciamento. Concluímos o presente estudo com a proposta de um algoritmo de diagnóstico molecular da leishmaniose visceral, que deverá considerar a realização prévia do diagnóstico parasitológico e imunocromatográfico. E sugerimos, quando necessário, a realização da kDNA PCR K20-K22 e a kDNA PCR RV1-RV2 para a determinação do gênero e de subgênero da Leishmania, respectivamente. Por fim, que se complemente com a ITS1 PCR, seguida da ITS1 RFLP para a definição do agente etiológico da leishmaniose visceral. / The definition of visceral leishmaniasis case is based on clinical, epidemiological and laboratory aspects. The gold standard techniques for laboratory diagnosis of visceral leishmaniasis are parasitological, smear and culture of bone marrow aspirate, which allow the identification of Leishmania in microscopic visualization, and the serological tests, like the immunochromatographic, which presents low sensitivity in immunodepressed individuals. In certain situations, such as Leishmania/HIV co-infection, for specific treatment or in epidemiological surveys, it is necessary to identify the etiological agent of visceral leishmaniasis, commonly caused by L. (L.) infantum. In this way, an algorithm for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis by kDNA PCR (K20/K22 and RV1/RV2) and ITS1 PCR (LITSR e L5.8S) was proposed, using as the gold standard, the parasitological and serological results, as well as clinical and epidemiological data of patients. Complementing our proposal, the performance of the Restriction Fragment Length Polymorphism of the ITS1 (ITS1 PCR RFLP) to identify the etiological agent, was evaluated as an alternative to technical laboriously isoenzyme electrophoresis, the gold standard for defining species in the diagnosis of leishmaniasis. The molecular techniques were validated on 82 samples (ITS 1 kDNA PCR and PCR-RV1 RV2) and 48 samples (K20-K22 kDNA PCR) from patients with confirmed visceral leishmaniasis and 30 samples from healthy patients. The following sensitivities were presented by the molecular tests: 97.5% (80/82) for the ITS1 PCR, 98% (47/48) for kDNA PCR K20-K22 and 92.7% (76/82) for kDNA PCR-RV2 RV1, and 100% specificity for all tests. When comparing the results from molecular tests ITS1 PCR, kDNA PCR K20-K22 and kDNA PCR RV1-RV2 with the established gold standard, we see an almost perfect agreement with kappa index higher than 0.80, and p value <0.001 were obtained. As regard to ITS1 PCR RFLP, from 80 positive samples, 52.5% (42/80) showed a similar profile to that of L. (L.) infantum. Three of the samples that did not demonstrate RFLP profile in the ITS1 PCR and PCR kDNA K20-K22 obtained more than 90% of identity with strain L. (L.) chagasi, by analyzing the samples in sequencing. As our conclusion, an algorithm for the molecular diagnosis of visceral leishmaniasis must consider a previous performance of the parasitological and immunochromatographic diagnosis. When necessary kDNA PCR K20-K22 and kDNA RV1-RV2 PCR are suggested to determine the genus and the subgenus Leishmania, respectively. In addition, this molecular diagnosis can be complemented, with the ITS1 PCR, followed by RFLP ITS1, which can define the etiological agent of visceral leishmaniasis.

Dez cavalos adultos clinicamente saudáveis foram inoculados por via intranasal com a estirpe A4/72 do herpesvírus eqüino tipo 1 (HVE-1). Com o intuito de estudar o efeito da dose infectante na severidade da rinopneumonite, os animais foram distribuídos em dois grupos experimentais: (a) grupo I (106,6 DICT50) e (b) grupo II (5×106,6 DICT50). Nos primeiros dez dias após a inoculação viral, todos os cavalos apresentaram manifestações de infecção respiratória leve e restrita às vias aéreas anteriores. Poucos animais desenvolveram leucopenia sangüínea envolvendo linfócitos (n=4) e neutrófilos (n=2). Somente em um houve aumento na contagem dos neutrófilos no lavado broncoalveolar (LBA). Apesar de possuírem elevados títulos de anticorpos neutralizantes antes da inoculação, alguns cavalos apresentaram soroconversão após o desafio viral. Esse padrão de resposta humoral foi determinado pelo aumento da dose infectante. O HVE-1 não foi isolado a partir das secreções nasais de nenhum animal. Entretanto, o DNA viral foi detectado pela reação em cadeia pela polimerase (PCR) nas células mononucleares sangüíneas entre o terceiro e o oitavo dias pós-inoculação (d.p.i.) em todos os animais, indicando a ocorrência de viremia. Além disso, a prova de PCR detectou o vírus nas amostras de LBA a partir do nono d.p.i. no grupo II, demonstrando que a disseminação do HVE-1 pelo trato respiratório após o desafio viral foi dose-dependente. Com base nos resultados obtidos, foi possível concluir que a PCR é uma técnica com alta sensibilidade para o diagnóstico do HVE-1, capaz de detectar a presença do DNA viral mesmo quando não ocorre a constatação do agente pelos métodos tradicionais / Ten clinically healthy adult horses were inoculated intranasally with the A4/72 strain of equine herpesvirus 1 (EHV-1). The animals were divided into two experimental groups in order to study the influence of the infective dose in the severity of rhinopneumonitis: (a) group I (106,6 TCID50) and (b) group II (5×106,6 DICT50). In the first ten days after the inoculation, they showed signs of a mild, self-limiting upper respiratory tract infection. Very few animals developed transient blood leukopenia, involving lymphocytes (n=4) as well as neutrophils (n=2). Only one horse had an increase in the neutrophils count of the bronchoalveolar lavage (BAL) samples. In spite of the presence of neutralizing antibodies before the trial, seroconversion was observed in some horses. The pattern of antibody response was determined by the increase of the challenge exposure. The virus was not isolated from nasal swabs of any horse. However, the EHV-1 was detected through the polymerase chain reaction (PCR) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of all horses in the experiment within the third to the eighth day after the inoculation that illustrated the viremia. In addition, the PCR assay also detected the virus in BAL samples starting on the ninth day after the experimental infection of group II. For that reason, the dissemination of the EHV-1 throughout the respiratory tract after virus exposure was dose-dependent. Based on the results obtained from this study, it can be affirmed that the PCR is a highly effective technique in detecting the EHV-1. It may be used in circumstances where traditional methods are not efficient due to the fact that it provides an enhanced diagnostic procedure for underdiagnosed diseases

Os objetivos desse estudo transversal foram avaliar a presença e a quantidade subgengival de Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola e Dialister pneumosintes, em indivíduos portadores de Gengivite associada apenas à placa bacteriana, Periodontite Crônica e Periodontite Agressiva, e correlacionar os resultados quantitativos com parâmetros clínicos periodontais (PCS e NCI). Dados clínicos e amostras de placa bacteriana subgengival foram coletados de um total de 176 indivíduos sendo, 67 indivíduos com Gengivite associada apenas à placa bacteriana (Grupo G), 71 com Periodontite Crônica (Grupo PC) e 38 com Periodontite Agressiva (Grupo PA). As amostras clínicas foram processadas pela PCR em tempo real através do uso de iniciadores e sondas específicos para regiões altamente conservadas do gene 16S rRNA de cada espécie bacteriana. Os resultados demonstraram a detecção dos cinco patógenos nos três grupos analisados, havendo associação significativa entre grupo e presença da bactéria para P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola e D. pneumosintes (p<0,01). A bactéria A. actinomycetemcomitans apresentou semelhantes freqüências de detecção nas condições periodontais analisadas (Grupo G, 100%; Grupo PC, 94,4%; Grupo PA, 92,1%), não havendo associação significativa entre grupo e presença dessa bactéria (p=0,09). As quantidades subgengivais de A. actinomycetemcomitans e de T. forsythia foram significativamente maiores no grupo PA (1,66x106 ± 5,39x106 e 1,96x106 ± 4,82x106, respectivamente), em relação aos grupos G (8,28x104 ± 1,76x105 e 3,86x105 ± 1,96x106, respectivamente) e PC (2,25x104 ± 3,11x104 e 3,59x105 ± 1,40x106, respectivamente), não havendo diferenças significativas entre os grupos para as cargas subgengivais das demais bactérias. A correlação obtida entre as cargas bacterianas subgengivais e os parâmetros clínicos, PCS e NCI, foi fraca ou muito fraca. / The aims of this cross-sectional study were to evaluate the presence and subgingival quantity of Aggregatibacter actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, Treponema denticola and Dialister pneumosintes, in individuals with Gingivitis associated with dental plaque only, Chronic Periodontitis and Aggressive Periodontitis, and correlate the quantitative results with periodontal clinical parameters (PD and CAL). Clinical data and subgingival plaque samples were collected from a total number of 176 individuals, among whom there were 67 individuals with Gingivitis associated with dental plaque only (Group G), 71 with Chronic Periodontitis (Group CP) and 38 with Aggressive Periodontitis (Group AP). The clinical samples were processed by real-time PCR with the use of specific primers and probes for regions of the highly conserved 16S rRNA gene of each bacterial species. The results demonstrated the detection of the five pathogens in the three analyzed groups, and there was significant association between the group and presence of the bacteria for P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola and D. pneumosintes (p<0.01). The bacterium A. actinomycetemcomitans presented similar frequencies of detection under the periodontal conditions analyzed (Group G, 100%; Group CP, 94.4%; Group AP, 92.1%), and there was no significant association between group and the presence of this bacterium (p=0.09). The subgingival quantities of A. actinomycetemcomitans and T. forsythia were significantly higher in the Group AP (1.66*106 ± 5.39*106 and 1.96*106 ± 4.82*106, respectively), in comparison with Groups G (8.28*104 ± 1.76*105 and 3.86*105 ± 1.96*106, respectively) and CP (2.25*104 ± 3.11*104 and 3.59*105 ± 1.40*106, respectively), there being no significant differences among the groups with regard to the subgingival loads of the other bacteria. The correlation obtained between the subgingival bacterial loads and the clinical parameters PD and CAL was weak or very weak.

O Programa Nacional de Controle e Erradicação de Brucelose e Tuberculose (PNCEBT) proposto pelo MAPA (Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento) adotou como medida central à vacinação com a B19 de todas as fêmeas das espécies bovina e bubalina, entre três e oito meses de idade. Embora a B19 seja capaz de conferir 65 a 70 % de proteção contra a maioria dos níveis de exposição de fêmeas bovinas, se utilizada na dose correta e na idade recomendada, o período de excreção e seu efeito sobre animais comunicantes e suscetíveis, incluindo o homem ainda são pouco conhecidos e por se tratar de uma vacina viva e virulenta deve-se atentar para o papel zoonótico no manejo dos animais excretores. O presente estudo avaliou a excreção da estirpe B19 pelo leite e urina, de 14 fêmeas bovinas de diferentes faixas etárias, que foram imunizadas dos três aos oito meses de idade, provenientes de um rebanho de exploração leiteira, empregando-se o diagnóstico bacteriológico e PCR, correlacionando-os com as fases hormonais de um ciclo reprodutivo completo. Todas as amostras positivas na PCR para Brucella spp. foram confirmadas como sendo da estirpe vacinal B19, sendo sua excreção predominantemente no momento do cio aos 150 dias de gestação e no pós-parto imediato (30 dias), ou seja, independentemente da fase hormonal. A persistência e excreção de B19 foi observada em fêmeas bovinas de até nove anos de idade. / The National Program of Brucellosis and Tuberculosis Control and Eradication (PNCEBT) designed by MAPA (Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento) adapted as the central of vaccination by law with B19 the of all females of bovine and bubaline species, between three and eight months of age. However the B19 should be capable of verifying 65 - 70% of protection against a large number of levels of exposition of bovines if utilized in the correct dose and age recommended the period of excretion and your effect about communicant animals and bound to included men but are still not well known and for the subject of biovaccines of a high infectious should be watchful for the role of zoonotic in the handling of animals that?s eliminate these vaccines. This studies evaluated the excretion of B19 strain in milk and urine of 14 bovine females the different ages that was immunized at three and eight months of age originated from heads of milky exploration, based on the bacteriologic tests and polymerize chain reaction (PCR) diagnoses correlated with hormonal fases of complete reproductive cycle. All of positive samples in PCR for Brucella spp. was confirmed for B19 strain being its excretion predominantly at moment of cio about 150 pregnant days and the pos parturition (30 days) or else independently the hormonal fase. The persistence and excretion of B19 was observed in bovine females until nine years old.

A cosmomicina D é um policetídeo aromático da família das antraciclinas com propriedades antitumorais e antimicrobianas produzida por Streptomyces olindensis. A elucidação de genes responsáveis pela síntese desta molécula foi abordada neste trabalho com as técnicas de LDGW-PCR e PCR que permitiram amplificar fragmentos gênicos envolvidos na formação da aglicona. O cluster gênico completo foi caracterizado numa região de 43,1 kb produto do seqüenciamento do genoma, onde se agruparam funcionalmente 40 ORFs em varias categorias: síntese de aglicona, reguladores, glicosiltransferases, deoxiaçúcares, resistência e com função desconhecida. Visando obter mutantes nulos para os genes cosS e cosY foram construidos os plasmídeos pCCSII e pCCYII onde a transformação da cepa selvagem com pCCSII resulto na cepa mutante SoDS, deficiente em produção de cosmomicina. As analises dos produtos obtidos da expressão de ambos os genes mostrou um efeito na redução de cosmomicina e supressão de intermediários do complexo antitumoral. / Cosmomycin D produced by Streptomyces olindensis is an aromatic polyketide of the anthracycline family with antitumor and antimicrobial properties. The amplification of genes responsible for the molecule synthesis were approached in this study by LDGW-PCR and PCR techniques, the obtained fragments showed high similarities with genes involved in aglycon core assembly. The complete gene cluster was characterized in a genome region of 43.1 kb product of genome sequencing, containing 40 ORFs grouped functionally into different categories: aglycon synthesis, regulators, glycosyltransferases, deoxisugars, resistance and unknown function. In order to obtain null mutants for cosS and cosY genes, the plasmids pCCSII pCCYII were constructed, the transformation of the wild strain with pCCSII result in SoDS mutant, deficient in production of cosmomycin. The analyses of the obtained products from the expression of both genes showed an effect in reducing cosmomycin levels and suppression of various intermediates in the antitumor complex.

A técnica de PCR, utilizando-se \"primers\" desenhados a partir do gene que codifica uma proteína imunogênica de 31 KDa de Brucella abortus, foi empregada na detecção de Brucella spp. em 300 amostras de produtos lácteos clandestinos apreendidas em municípios dos Estados de São Paulo (SP) e de Minas Gerais (MG). Foram analisadas 49 amostras de queijo minas frescal e 18 de queijo meia-cura provenientes de MG, e 92 amostras de queijo minas frescal, 33 amostras de queijo meia-cura e 108 amostras de leite cru provenientes de SP. O isolamento bacteriano foi tomado como referência, porém não se isolou Brucella spp. de nenhuma das amostras cujos cultivos mostraram-se contaminados com outros gêneros bacterianos. Pela PCR foi observado que 37 amostras de queijo foram positivas: 29/141 (20,56 %) das amostras de queijo minas frescal e 8/51 (15,68%) das amostras de queijo meia-cura. Todas as amostras positivas na PCR para Brucella spp. foram confirmadas como sendo da espécie Brucella abortus pela técnica de PCR utilizando-se \"primers\" espécie-específicos. Foi instituída a reação de hemi-nested PCR para a diferenciação da cepa em B19 ou campo tomando-se como base a deleção genética de 702 pb existente na cepa vacinal B19. A padronização da técnica permitiu que todas as cepas de Brucella spp. fossem diferenciadas, revelando que 30 (81,08%) amostras eram B19 e 7 (18,92%) eram cepas de Brucella abortus de campo. A concordância estimada entre as técnicas de PCR e do cultivo microbiológico através do indicador Kappa foi considerada baixa (K = 0) devido ao não isolamento do microrganismo. / A PCR assay using primers designed based on the gene that encodes a 31 KDa immunogenic protein from Brucella abortus was used in the detection of Brucella spp. in 300 samples of illegal dairy products obtained in cities of the states of São Paulo (SP) and Minas Gerais (MG), Brazil. A total of 49 samples of minas frescal cheese and 18 samples of meia-cura cheese from MG were analyzed, besides 92 samples of minas frescal cheese, 33 samples of meia-cura cheese and 108 samples of raw milk from SP. Although bacterial isolation was used as reference, Brucella spp. was not isolated from any samples in which culture was contaminated by other genera of bacteria. PCR showed that 37 samples were positive for Brucella spp.: 29/141 (20,56 %) of the minas frescal cheese samples and 8/51 (15,68%) of the meia-cura cheese samples. All positive samples for Brucella spp. were confirmed as Brucella abortus by PCR using species-specific primers. Hemi-nested PCR was used for the differentiation between B19 and field strains, based on the genetic deletion of 702 pb in the vaccinal strain. Standardization of the technique enabled the differentiation of all Brucella spp. strains, showing that 30 of them (81,08%) were B19 and 7 (18,92%) of them were Brucella abortus field strains. Estimated agreement between PCR and microbiological culture as determined by Kappa indicator was considered to be poor (K = 0) due to the absence of isolation of the microorganism.

A partir de isolados de campo de P. falciparum de pacientes sintomáticos e assintomáticos de uma mesma área endêmica brasileira, clonamos fragmentos de genes surf e dos genes das proteínas do merozoíto AMA1 e das famílias MSP e EBL. Expressamos todas as sequências diferentes encontradas fusionadas a GST. Por ELISA, testamos a positividade para IgG dos plasmas das mesmas amostras de sangue e identificamos as subclasses de IgG nos plasmas mais reativos e a duração da resposta de IgG em um subgrupo de plasmas. A odds ratio conferida pela resposta humoral contra MSP5, MSP9 e SURFIN 13.1 mostrou 9x menos chances para os dois primeiros e 3,5x menos chances para o terceiro para a presença de sintomas, através da análise de tabelas de contingência. A odds ratio conferida pela resposta humoral mais intensa a MSP5 e EBA175 aponta respectivamente, 9,4x e 5,7x mais chances de desenvolvimento do perfil assintomático, por regressão logística. Paralelamente, verificamos por RT-qPCR que pode ocorrer switching transcricional e talvez exclusão alélica na expressão de genes surf. / Using field P. falciparum isolates present in the blood of symptomatic and asymptomatic patients from the same endemic Brazilian area, we cloned and expressed all different sequences of surf genes and those encoding merozoite antigens AMA1, MSP1-10 and members of the EBL protein family as GST fusion peptides. We identified plasmas positive for specific IgG and their subclasses in the most reactive plasmas and the longevity of the response in a lot of plasmas by ELISA. The odds ratio conferred by antibodies against MSP5, MSP9 and SURFIN 13.1 pointed to 9x fewer chances of the first two and 3,5x fewer chances of the last for presence of malaria symptoms by cross tab analysis. The odds ratio conferred by the higher quantity of antibodies against MSP5 and EBA175 pointed to 9,4x and 5,7x higher chances for development of an asymptomatic profile by logistic regression. In parallel, transcription analysis of surf genes in the P. falciparum strain 3D7 verified by RT-qPCR pointed to a mechanism reminiscent of allelic exclusion.

A transformação plastidial oferece uma série de vantagens em relação à transformação nuclear, como: altos níveis de expressão de proteínas, capacidade de expressar múltiplos transgenes em operons e contenção gênica pela ausência de transmissão pelo pólen. Devido ao alto número de cópias do genoma plastidial por cloroplasto e ao alto número de cloroplastos por células vegetais, são necessários ciclos de regeneração sob condições seletivas para obter transformantes homoplásmicos. A análise de homoplasmia é realizada pela metodologia de Southern blot ou pelo teste de herança do transgene pela germinação de sementes em meio seletivo. O Southern blot é trabalhoso, demorado e para maior sensibilidade envolve o uso de radioisótopos, enquanto o teste de germinação é realizado somente após a produção de sementes necessitando de um ciclo de reprodução da planta. Assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um método rápido, sensível e eficaz para determinar o grau de homoplasmia de plantas transplastômicas, baseado na técnica de PCR em tempo real. Folhas de fumo foram transformadas com vetores compostos pelos genes 9 dessaturase (pMR1), 15 dessaturase (pMR3), -3 elongase (pMR5) e 12/3 dessaturase (pMR10), todos contendo o gene de seleção aadA. No total, 44 plantas foram obtidas, sendo 21 plantas positivas para a inserção do transgene. O grau de homoplasmia foi determinado pela proporção entre o número de cópias do transgene e o número de cópias do gene endógeno. Inicialmente, misturas de DNA de plantas transplastômicas homoplásmicas (pMR1 e pMR3) com DNA de planta tipo selvagem foram preparadas para simular diferentes graus de homoplasmia. DNA da planta transplastômica ou do plasmídeo foi diluído em série para construção das curvaspadrão, com a quantidade dos genes sendo estimada por meio da plotagem nessas curvas. Os índices de homoplasmia detectados na PCR em tempo real foram compatíveis com os resultados do teste de germinação com valores abaixo de 1 para plantas heteroplásmicas, 1 para a planta homoplásmica e 0 para as plantas sem a inserção do transgene. Os resultados das análises de amostras coletadas após o primeiro ciclo de regeneração mostraram que 13 das 21 plantas já se apresentavam em estado homoplásmico não sendo necessários mais ciclos de regeneração. A PCR em tempo real mostrou ser um método eficiente para análise do grau de homoplasmia de plantas transplastômicas. / Plastid transformation offers several advantages in relation to nuclear transformation, such as high-level of protein expression, the feasibility of expressing multiple transgenes in operons and gene containment through the lack of pollen transmission. Due to the high copy number of plastidial genome in chloroplasts and the high number of chloroplasts per plant cells, regeneration cycles under selective conditions are necessary to obtain homoplasmic transformants. Homoplasmy analysis is performed by Southern blot methodology or transgene inheritance test through seed germination in selective medium. Southern blot is laborious, time consuming and for more sensitivity it would require the use of radioisotopes, while germination test can be performed only after seed production which require a plant reproduction cycle. The objective of this study was to develop a fast, sensitive and effective method to determine the homoplasmy degree of transplastomic plants, based on real-time PCR. Tobacco leaves were transformed with vectors containing the 9 desaturase (pMR1), 15 desaturase (pMR3), -3 elongase (pMR5) and 12/3 desaturase (pMR10) each one with the aadA selection gene. In total, 44 plants were obtained, of which 21 were positive for the insertion of the transgene. The homoplasmy degree was determined by the proportion between the number of transgene copies and the number of endogenous gene copies. Initially, mixtures of homoplastomic plants DNA (pMR1 and pMR3) with wild-type plant DNA were prepared to simulate different degrees of homoplasmy. Transplastomic plant DNA or plasmid DNA was diluted to construct the standard curves and the gene amount was detected by plotting in this curves. The homoplasmy rate detected in real-time PCR were consistent with the results of germination test with values below 1 for heteroplasmic plants, 1 for homoplasmic plants and 0 for plants without the transgene insertion. The results obtained from the samples collected after the first regeneration cycle showed that 13 of the 21 plants were already in a homoplasmic state and did not require more cycles of regeneration. The real-time PCR proved to be an effective method for analyzing the homoplasmy degree of transplastomic plants.

O milho (Zea mays) é um cereal amplamente cultivado no Brasil e no mundo. Sua produtividade pode ser afetada por diversos fatores incluindo a colonização fúngica. Em Fitopatologia, grãos afetados por fungos são denominados grãos ardidos e os gêneros mais encontrados em milho são Stenocarpella e Fusarium. Espécies de Fusarium podem causar podridões nas espigas e também podem produzir fumonisinas, toxina esta tóxica para animais e humanos e associadas ao desenvolvimento de diversas doenças. O presente trabalho teve como objetivo analisar a incidência de Fusarium ssp. com potencial toxigênico em amostras de grãos ardidos através da identificação da presença do gene fum5, responsável pela produção de fumonisinas pelo fungo, bem como quantificar os níveis de fumonisinas encontrados nessas amostras e comparação com os resultados obtidos de grãos assintomáticos. Um total de 100 amostras dos anos de 2006 e 2007 provenientes das principais regiões produtoras do Brasil foram submetidas à três análises. A primeira avaliou a incidência de Fusarium spp. nos grãos através do método do papel de filtro com congelamento e em 100% das amostras foi encontrado o fungo em níveis que variaram de 34 a 91%. A segunda análise utilizou a PCR para confirmação do gênero, identificação de espécies (F. verticillioides, F. proliferatum e F. subglutinans) e identificação da presença do gene fum5. A PCR confirmou 93% dos isolados como pertencentes ao gênero Fusarium. Os isolados negativos passaram por análise morfológica e todos foram confirmados. As PCRs para espécies identificaram 82% dos isolados como F. verticillioides, 3% como F. subglutinans e nenhum como F. proliferatum. A PCR para potencial toxigênico foi positiva para 81% dos isolados. A terceira análise consistiu na quantificação de fumonisinas (B1, B2 e B3 na proporção 5:3:1) através do método de ELISA e os níveis variaram de 4,4 a mais de 90 µg/g. Grãos assintomáticos da segunda safra de 2007 foram analisados separadamente para comparação. Em 100% das amostras houve incidência de Fusarium spp, variando de 74 a 87%. A PCR para confirmação do gênero foi positiva para 87% dos isolados e os demais passaram por análise morfológica e então confirmados. As PCRs para identificação de espécies mostrou 60% dos isolados como sendo F. verticillioides, 3% como F. subglutinans e nenhum como F. proliferatum. A maior concentração de fumonisinas nos grãos assintomáticos foi de 2,1 µg/g e em 53% das amostras não foram detectadas fumonisinas. Os resultados mostraram que há uma alta incidência de Fusarium spp. em grãos ardidos e assintomáticos. Grãos ardidos e assintomáticos têm Fusarium spp. com potencial toxigênico mas os níveis de fumonisinas encontrados nos grãos assintomáticos foram muito baixos em comparação com os encontrados nos grãos ardidos mostrando que, em condições adversas, esse fungo deixa de ser endofítico e passa a ser patogênico, podendo causar doenças na planta e produzir toxinas. Pelo fato das fumonisinas estarem concentradas nos grãos ardidos, a redução dessas toxinas da dieta deve ser baseada na eliminação dos mesmos através do controle do beneficiamento. / Maize is a cereal widely cultivated in Brazil and worldwide. Its productivity can be affected by numerous factors including fungal colonization. In pathological terms, affected grains by fungi are denominated rot grains and the two most prevalent genera found in maize are Stenocarpella and Fusarium. Species of Fusarium can cause rotting in the stalks and also produce fumonisins, which are toxic both for animals and humans since their occurrence is associated to many diseases. The present work aimed to analyse the incidence of Fusarium ssp. with toxigenic potential in rot grains samples through the identification of the presence of the gene fum5, responsible for the production of fumonisins, as well as to quantify the levels of fumonisins found in these samples and compare with the results obtained in asymptomatic grains. A total of 100 samples from the 2006 and 2007 harvests were collected from the main producing regions of Brazil and were submitted to three analyses. The first evaluated the incidence of Fusarium ssp. in the grains through the method of filter paper and freezing, which revealed incidences that varied from 34 to 91%. The second analysis used specific primers and PCR to confirm the genus and species (F. verticillioides, F. proliferatum and F. subglutinans) and to detect the presence of the fum5 gene. The results indicated that 93% of the isolates belonged to the genus Fusarium. The PCR - negative isolates were confirmed as Fusarium after morphological analysis. Eigthy two percent of the isolates were classified as F. verticillioides, 3% as F. subglutinans and none as F. proliferatum using speciesspecific PCR. The fum5 gene was detected in eighty one percent of the isolates. The third analysis consisted in the quantification of the fumonisins (B1, B2 e B3 in the proportion of 5:3:1) through the ELISA method and the levels varied from 4,4 to more than 90 µg/g. Asymptomatic grains from the second cropping season of 2007 were analyzed separately for comparison purposes. The incidence of Fusarium spp. in these varied from 74 to 87%. The PCR for confirmation of the genus was positive for 87% of the isolates. The PCRs for species identification showed 60% of the isolated as being F. verticillioides, 3% as F. subglutinans and none as F. proliferatum. The greater concentration of fumonisins in the asymptomatic grains was of 2,1 µg/g and in 53% of the samples fumonisins were not detected. Rot and asymptomatic grains presented Fusarium spp. with toxigenic potential but the levels of fumonisins found in the asymptomatic grains were much lower compared with rot grains, showing that, in adverse conditions, this fungus changes from endophytic to pathogenic, being able to parasitize the plant and to produce toxins. The fact that fumonisins levels are much higher in rot grains, a simple measure to reduce the levels of these toxins in the animal diet would be to eliminate them during processing.

O patótipo de Escherichia coli diarreiogênica denominado E. coli enteroagregativa (EAEC) é caracterizado pela expressão do padrão de adesão agregativo (AA) em células epiteliais cultivadas. Amostras de EAEC são classificadas como típicas ou atípicas, dependendo da presença ou não do gene aggR, respectivamente. O padrão AA no teste de adesão em células epiteliais é o diagnóstico padrão para a classificação de EAEC. Técnicas moleculares, como a PCR multiplex, são alternativas a esse teste. No presente estudo foi desenvolvida uma PCR multiplex para o diagnóstico molecular de EAEC típica e atípica, baseada na detecção dos genes aatA, aggR, aaiA e aaiG. A partir de colônias isoladas de E. coli de origem fecal o teste apresentou sensibilidade de 94,8%, especificidade de 94,7%, valor preditivo de teste positivo de 74,3% e valor preditivo de teste negativo de 99,1%. O teste desenvolvido mostrou-se uma alternativa diagnóstica sensível e específica para EAEC e permite um acréscimo significativo na detecção de EAEC atípica. / The diarrheagenic Escherichia coli pathotype known as enteroaggregative E. coli (EAEC) is characterized by the expression of the aggregative adherence pattern (AA) on cultured epithelial cells. EAEC strains are classified as typical or atypical, depending on the presence or absence of the aggR gene, respectively. The AA pattern in the adherence assay with epithelial cells is the gold standard diagnostic for EAEC. Molecular techniques, such as multiplex PCR, are alternatives to this test. In the present study we developed a multiplex PCR for the molecular diagnostic of typical and atypical EAEC, based on the detection of aatA, aggR, aaiA and aaiG genes. The test presented 96.5% of sensitivity, 94.8% of specificity, 74.3% of positive predictive value and 99.1% of negative predictive value, when tested in isolated colonies of E. coli from feces. The test developed is a sensitive and specific diagnostic alternative for EAEC and allows a significant increase in atypical EAEC detection.