Determina el efecto antiespasmódico y toxicidad aguda del extracto acuoso de las hojas. Se usa como materiales las hojas del Solanum americanum Muller, ratones y cobayos del Instituto Nacional de Salud y productos químicos reconocidos. Se realiza una marcha fitoquímica, para identificar los metabolitos secundarios. Los métodos; determinación del efecto antiespasmódico del extracto acuoso se realiza sobre el íleon de cobayo en órgano aislado; la motilidad gastrointestinal y determinación de toxicidad aguda en ratones albinos. Para la evaluación estadística se usa el programa SPSS V20, ANOVA, con pos hoc Tukey y Dunnett con una p< 0,05 y la prueba de hipótesis se evalúa con la Prueba T de student. En el tamizaje fitoquímico se detecta presencia de taninos, alcaloides, aminoácidos, flavonoides y saponinas. En el método de órgano aislado en el íleon de cobayo se observa una relajación del 40 % en dosis efectivas en presencia de acetilcolina e histamina y una inhibición de 60 % en motilidad gastrointestinal dependiente de dosis, siendo la dosis de 500 mg/kg, semejante al control positivo de atropina. Los ratones sobrevivieron a la dosis administrada en la DL50. Se concluye que el extracto acuoso de las hojas del Solanum americanum Muller posee efecto antiespasmódico en cobayos y no presenta toxicidad aguda en ratones. / Tesis

O estudo das florações de cianobactérias potencialmente tóxicas é de fundamental importância, principalmente se tratando de um reservatório de grande valor econômico e social, devido a seus usos múltiplos e localização próxima a grandes centros urbanos como é o reservatório de Salto Grande (Americana - SP). Assim, este trabalho visou fornecer subsídios para formulação de prognóstico da ocorrência de cianobactérias e produção de toxinas em ambientes aquáticos com elevado grau de eutrofização. Para isto, a pesquisa foi desenvolvida em três escalas: em macrocosmo (represa), foi determinada a variação da ocorrência das espécies de cianobactérias e das demais classes fitoplanctônicas, e analisado o potencial tóxico das amostras coletadas nos meses chuvosos (janeiro, fevereiro e março/98) e de estiagem (junho, julho, agosto e setembro/98) em duas estações de coleta no reservatório de Salto Grande; em mesocosmo (tanques), verificou-se, durante o período de seca, as variações na ocorrência das classes fitoplanctônicas e das espécies de cianobatérias e produção de toxinas, em função da manipulação da razão N/P através da dosagem de nitrogênio e fósforo na água; em microcosmo (garrafões de vidro, em laboratório), foi testado o efeito da redução de fósforo e conseqüente aumento da razão N/P sobre o crescimento e produção de toxinas em culturas de cepas de Microcystis aeruginosa (Kützing) Kützing, isoladas a partir de amostras de florações desta espécie no reservatório de Salto Grande, durante os meses chuvosos e os secos. No ambiente foi detectada a presença de microcistinas na água de todos os dias de coleta, exceto em 25/02/99. Em geral, as concentrações estiveram abaixo do limite de aceitabilidade (1 &#956g.L-1), com exceção da estação 2 nos dias 27/01/99 (39,53 &#956g.L-1) e 22/03/99 (3,98 &#956g.L-1). Nos experimentos em mesocosmos notou-se um aumento da densidade fitoplanctônica) nas 3 condições distintas. Na condição controle (sem manipulação), ocorreu um sensível aumento da porcentagem de contribuição das cianobactérias e diminuição dos demais grupos ao longo dos 11 dias. Na condição de razão N/P baixa, houve um pequeno aumento na porcentagem de contribuição das cianobactérias e clorofíceas, uma diminuição das criptofíceas e os demais grupos não apresentaram grandes alterações. Sob razões N/P alta, as cianobactérias tiveram um aumento, as clorofíceas mantiveram-se constantes e as criptofíceas diminuíram em relação às porcentagens iniciais. As condições dos tanques mantidos com razão N/P baixa foram mais favoráveis às clorofíceas. As cianobactérias apresentaram um aumento de biomassa nas condições dos tanques mantidos com razão N/P alta. Em microcosmos, a fase exponencial teve início no oitavo dia de cultivo em todos os testes. Ao completar aproximadamente 18 dias de experimento, notou-se uma diminuição no rendimento das culturas em meio ASM-1 com redução de fósforo. Em todas as escalas estudadas constatou-se que a concentração de microcistina esteve relacionada a fatores favoráveis ao desenvolvimento das espécies tóxicas. Entretanto, os fatores determinantes para o crescimento de cianobactérias tóxicas, apresentaram diferentes papéis em casa escala estudada. No macrocosmo, a estabilidade da coluna d\'água foi fundamental para o estabelecimento de maiores densidades de espécies tóxicas. Nos mesocosmos, o enriquecimento foi responsável pelo aumento da densidade de espécies tóxicas. Nos microcosmos, a disponibilidade de fósforo esteve diretamente relacionada à taxa de crescimento de Microcystis aeruginosa e conseqüentemente, ao aumento da concentração de microcistina. / The study of the bloom of potential toxic cyanobacteria is of paramount significance, mainly when a reservoir endowed with great social and economical values due to both its multiple uses and its nearness to big urban centres - such as the Salto Grande reservoir, located near the city of Americana in the inland of the State of São Paulo, Brazil - is concerned. Based on such actuality, this work was aimed at supplying resources to devise forecasting the occurrence of cyanobacteria as well as the production of toxins in aquatic environments in which high eutrophication levels are observed. Towards this target, the research was carried out in the three steps that follow. In macrocosmic level (reservoir), the variations of the occurrence of both the cyanobacteria species and the remaining phytoplankton classes were found out, and then the toxic potentiality of the samples collected during the rainy season (January, February and March 1998) and the dry season (June, July, August and September 1998) in two sampling stations at the Salto Grande reservoir was analysed. In mesocosrnic scale (tanks), the variations in the occurrences of the classes of phytoplankton and of the cyanobacteria species - as well as the variations in production of toxins as a function of the ratio N/P that was dealt with by means of dosing nitrogen and phosphorus in the water - were observed during the dry season. In microcosmic level (glass bottles \"in lab\"), the effect of reducing phosphorus (and consequently increasing the ratio N/P) on the growth and the production of toxins in cultures of Microcystis aeruginosa (Kützing) Kützing strains - isolated from bloom samples of this species at the Salto Grande reservoir, during the wet and the dry seasons - was tested. At the environment, the presence of rnicrocystin in the water of all the samples, with the exception of the 25th of February 1999, was detected. Apart from the station 2 during January 2th 1999 (39.53 µg.L-1) and March 2th 1999 (3.98 µg.L-1), the concentrations stayed below the limit of acceptability (1 µg.L-1). At the experiments in mesocosmic scale, in 3 different conditions, increasing in phytoplankton density was observed. At the control condition (without manipulation), both reasonable augmentation of the percentage of the cyanobacteria contribution and diminishment of the other groups during the 11 days were detected. Under the condition of low N/P ratio, a slight rise of the percentage of the cyanobacteria and chlorophycea contribution and a decrease of the cryptophycea were observed; the other groups did not present much change. Under the condition of high N/P ratio, it was seen that the cyanobacteria increased, the chlorophycea remained unaffected and the cryptophycea decreased in comparison to the initial percentages. The conditions ofthe tanks that had been maintained at low N/P ratio favoured more the chlorophycea. The cyanobacteria presented biomass augmentation under the conditions of the tanks that had been maintained with high N/P ratio. For every test at the microcosmic level, the exponential stage had begun at the 8th development day. After being experimented for nearly 18 days, yield decrease of the cultures at the environment ASM-1 with phosphorus reduction was observed. In every scale that had been studied, it was noted that the microcystin concentration is related to unfavourable factors as far as the development of the toxic species is concerned. However, the determining causes for the growth of toxic cyanobacteria played different roles in each scale studied. At the macrocosmic level, enrichment was the responsible for increasing the density of the toxic species. At the microcosmic level, phosphorus availability had been directly related to Microcystis aeruginosa growth rate and, therefore, to the increase of microcystin concentration.

O envenenamento por aranhas Loxosceles pode resultar dois tipos de manifestações clínicas: o loxoscelismo cutâneo e o sistêmico. Hemólise, agregação plaquetária, inflamação persistente, falência renal e morte podem ser observados em pacientes com manifestações sistêmicas. Apesar da pouca incidência de vítimas com falência renal, esta é a principal causa de óbito, ocorrendo principalmente em crianças. O principal fator do veneno da aranha Loxosceles, responsável pelas manifestações locais e sistêmicas, é a esfingomielinase D. O presente estudo teve como objetivo investigar a ação tóxica do veneno de L. intermedia e das SMases D sobre células renais humanas, o possível envolvimento de metaloproteases endógenas e do sistema complemento neste processo. Os resultados obtidos mostram que tanto o veneno, como a SMase D, foram capazes de provocar morte celular, a qual foi relacionada a ativação de metaloproteases de matriz extracelular, MMP-2 e MMP-9 e, ainda, por ação lítica do complemento, após clivagem do MCP, por ação de metaloproteases da família das adamlisinas. A remoção de MCP permitiu ativação do Complemento, como determinado pelo aumento da deposição de C3 e C4 e da morte celular. Também foi observado um aumento na deposição do fator H e da properdina, mas não de C4bp após a tratamento das células com veneno/ SMase D. Diminuição na expressão das moléculas de superfície MHC-I, <font face=\"Symbol\">b2 microglobulina, EPCR e EGFR foi observada e está relacionada com a ativação de metaloproteases da família das adamlisinas. A expressão de outros reguladores do complemento, como DAF e CD59, não foi afetada pelo tratamento. Em conjunto, tais resultados mostram que o veneno e a SMase D induzem aumento na expressão/ativação de metaloproteases endógenas, operantes nos eventos de morte celular por apoptose e necrose, os quais podem ter um papel relevante para os danos renais presentes no loxoscelismo sistêmico humano. / Envenomation by Loxosceles spider can result two forms of clinical manifestations: cutaneous and systemic loxoscelism. Haemolysis, platelet aggregation, inflammation persistent, renal failure and death can be observed in patients with systemic manifestations. Despite the low incidence of renal failure victims, this is the main cause of death, occurring mainly in children. The sphingomyelinase D is the main factor in Loxosceles spider venom responsible for local and systemic manifestations This study aimed to investigate the toxicity of the L. intermedia venom and SMase D on human kidney cells and the possible involvement of endogenous metalloproteinases and complement this process. Results showed that venom and SMase D were able to cause cell death, which was related to activation of extracellular matrix metalloproteases, MMP-2 and MMP-9 and also by lytic action of complement, after MCP cleavage by the action of the family of metalloproteases adamlisins. The removal of MCP, by action of the venom/ SMase D, allowes activation of complement, as determined by increases deposition of C3 and C4 and cell death. There was also an increases in deposition of properdin and factor H, but not C4bp, after treatment of cells with venom/ SMase D. decreased expression of surface molecules MHC-I, <font face=\"Symbol\">b2 microglobulin, EPCR and EGFR was observed after incubation of the renal cells with venom or SMase D and is related to activation of metalloproteinases family adamlisins. The expression of others complement regulators such as DAF and CD59 was not affected by treatment. Together, theses results show that the venom and SMase D induce increased expression/ activation of endogenous metalloproteases, operating in the event of cell death by apoptosis and necrosis, which may have an important role for the kidney injury loxoscelism in the human system.

Dos peixes peçonhentos encontrados no Brasil os bagres destacam-se pelo número de acidentes provocados. O objetivo deste trabalho foi caracterizar os componentes tóxicos presentes na peçonha e no muco. Obtivemos uma média protéica de 3,1 mg/mL (peçonha) e 1,4 mg/mL (muco). O perfil eletroforético da peçonha e do muco possui poucas bandas protéicas. O fracionamento isolou 11 frações para peçonha e 13 frações para o muco. Com relação às atividades biológicas avaliadas, as frações peptídicas induziram danos teciduais ao passo que as frações protéicas induziram processo inflamatório. Isolamos duas frações com atividade antimicrobiana para cada secreção. Isolamos uma toxina de 65,1 kDa que apresenta homologia com Wap65 e análise por microscopia intravital revelou que esta proteína causa aumento dos leucócitos rolantes assim como a presença de leucócitos aderidos ao endotélio. Nossos resultados indicam uma diferença entre os componentes protéicos e peptídicos do muco e da peçonha. Finalmente, conseguimos isolar e caracterizar a proteína Wap65 da peçonha deste peixe. / Of the venomous fish found in Brazil, catfish noteworthy for the number of accidents they cause. The objective of this study was to characterize the toxic compounds present in the venom and mucus. We obtained an average protein intake of 3,1 mg / mL (venom) and 1,4 mg / mL (mucus). The electrophoretic profile of venom and mucus has a few protein bands. Fractionation isolated 11 fractions to the venom and 13 fractions to the mucus. With respect to biological activities evaluated, the peptide fractions induced tissue damage while the protein fractions induced inflammation. We isolated two fractions with antimicrobial activity for each sample. We isolated a toxin of 65,1 kDa which shows homology with Wap65 and intravital microscopy analysis revealed that this protein causes an increase in leukocyte rolling as well as the presence of leukocytes adhered to the endothelium. Our results indicate a difference between the peptide and protein components of mucus and venom. Finally, we isolate and characterize the protein Wap65 from the venom of this fish.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2016-05-17T20:42:43Z No. of bitstreams: 1 Gabriela Gomes Cardoso Rodrigues.pdf: 623885 bytes, checksum: 3da3d1230fd77beffc9c12f00be889bb (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-17T20:42:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gabriela Gomes Cardoso Rodrigues.pdf: 623885 bytes, checksum: 3da3d1230fd77beffc9c12f00be889bb (MD5) Previous issue date: 2015-02-04 / Chronic kidney disease (CKD) is characterized by progressive and irreversible loss of renal function and often progresses with a muscular weakness, whose set of signs and symptoms is generally referred to as uremic myopathy. Possible risk factors for the uremic myopathy are the uremic toxins. Among uremic toxins, indoxyl sulfate (IS) is a derivative of tryptophan metabolism by intestinal bacteria. Because skeletal muscle tissue undergo constant remodeling due differentiation of myoblasts in myotubes, it is possible that uremic toxins have a deleterious effect to influence this process, exacerbating the uremic myopathy. Low level laser therapy (LLLT) is regarded as a growth promoter feature widely used in the treatment of chronic diseases and has shown positive effects on the modulation of skeletal muscle repair process and also in the process of inflammation. However, in the context of CKD, the LLLT has not yet been explored. The aim of this study was to evaluate the effects of the IS on cell viability and on oxidative stress on cellular differentiation in cultured C2C12 myoblasts. In addition, to verify the action of the LLLT as a protective alternative to the cells. The C2C12 myoblasts were cultured in DMEM culture medium containing 10% fetal bovine serum and were induced to differentiation process by adding 2% horse serum. Three different IS concentrations were used to mimic the plasma concentrations of normal individual, CKD patients with moderate uremia and CKD patients with advanced uremia (0.6 mg/l and 53 mg/l and 236 mg/l, respectively), at different times of incubation (24 h, 48 h and 72 h). Subsequently, the cells were subjected to treatment with LLLT GaAlAs 780 nm (output power 10 mW, 20 seconds application time and energy density of 0.5 J / cm2). In terms of analysis, we used MTT method to assess the viability of the cells, flow cytometry to assess the viability/cell death and oxidative stress, nitrite dosing to evaluate nitric oxide production and real-time PCR to analyze IL-6, myogenin and MyoD expression (inflammation and cell differentiation markers). The results demonstrate that the IS at the maximum concentration was toxic to C2C12 cells, because it significantly decreased cell viability by MTT and by flow cytometry and by increasing the percentage of necrosis. This effect was present throughout the three incubation periods. With respect to oxidative stress, was not any conclusion, probably by the time the samples, but do not rule out the possibility of IS induce this type of stress. Although the IS has induced death to C2C12 cells, the remaining had no change in cell differentiation markers. Treatment with BPL the IS sensitized cells, reducing cell viability. We conclude that the IS acts directly on C2C12 myoblasts with toxic effect and may be the one factor responsible for uremic myopathy. Treatment with LLLT was not effective in protecting the cells. / A doença renal crônica (DRC) é caracterizada pela perda progressiva e irreversível da função renal e que frequentemente cursa com um quadro de fraqueza muscular, cujo conjunto de sinais e sintomas é globalmente designado como miopatia urêmica. Possíveis fatores predisponentes para a miopatia urêmica são as toxinas urêmicas. Dentre as toxinas urêmicas, o indoxil sulfato (IS) é uma derivada do metabolismo do triptofano presente em bactérias intestinais. Devido ao fato do tecido muscular esquelético sofrer constante remodelação graças à diferenciação de mioblastos em miotubos, é possível que toxinas urêmicas tenham um efeito deletério por influenciar este processo, agravando a miopatia urêmica. A terapia a laser de baixa potência (LBP) é considerada como um recurso bioestimulante amplamente utilizado no tratamento de doenças crônicas e tem demonstrado efeitos positivos sobre a modulação do processo de reparo muscular esquelético e também no processo da inflamação. Entretanto, no contexto de DRC, o LBP não foi ainda explorado. O objetivo do presente estudo foi avaliar dos efeitos do IS sobre a viabilidade celular, sobre o estresse oxidativo e sobre a diferenciação celular em cultura de mioblastos C2C12. Além disso, verificar a ação do LBP como forma de proteção às células. Os mioblastos C2C12 foram cultivados em meio de cultura de DMEM, contendo 10% de soro fetal bovino e foram induzidos ao processo de diferenciação por meio da adição de 2% soro de cavalo. Três diferentes concentrações de IS foram usadas para mimetizar as concentrações plasmáticas de indivíduo normal, paciente DRC com uremia moderada e paciente DRC com uremia avançada (0,6 mg/l; 53 mg/l e 236 mg/l, respectivamente), em diferentes períodos de incubação (24 h, 48 h e 72 h). Posteriormente, as células foram submetidas ao tratamento com laser de baixa potência AsGaAl 780 nm (potência de saída de 10 mW, tempo de aplicação de 20 segundos e densidade de energia de 0,5 J/cm2). Como análise, foi utilizado o método MTT para acessar a viabilidade das células, citometria de fluxo para avaliar a viabilidade/mortalidade das células, bem como o estresse oxidativo, dosagem de nitrito para avaliar a produção de óxido nítrico e PCR em tempo real para analisar a expressão de IL-6, miogenina e MyoD (marcadores de inflamação e diferenciação celular). Os resultados demonstram que o IS na concentração máxima foi tóxico para as células C2C12, pois diminuiu significativamente a viabilidade das células, tanto por MTT como por citometria de fluxo, aumentando a porcentagem de necrose. Este efeito foi presente nos três períodos de incubação. Com relação ao estresse oxidativo, não foi possível nenhuma conclusão, provavelmente pelo tempo das amostras , porém não descartamos a possibilidade do IS induzir este tipo de estresse. Embora o IS tenha induzido morte às células C2C12, as remanescentes não tiveram alteração dos marcadores de diferenciação celular. O tratamento com LBP sensibilizou as células ao IS, diminuindo a viabilidade das células. Concluímos que o IS age diretamente sobre mioblastos C2C12 com efeito tóxico, podendo ser um dos responsáveis pela miopatia urêmica. O tratamento com LBP não foi eficiente na indução de proteção às células.

As cianobactérias apresentam distribuição variada e podem ocorrer desde as regiões frias do ártico até os trópicos, em corpos dágua doce e no ambiente marinho. Algumas espécies de cianobactérias produzem compostos com conhecida toxidade, podendo causar efeitos deletérios em seres humanos e animais. Entre estes compostos estão os com atividade neurotóxica devido aos mais variados mecanismos de ação. O objetivo geral deste projeto é a obtenção por via sintética de algumas neurotoxinas e variantes, entre elas a &#946;-N-metil-L-alanina (L-BMAA), anatoxina-a e anatoxina-a(s), bem como algumas aplicações. Para a L-BMAA, foi buscada a determinação de rotas sintéticas viáveis para a obtenção deste aminoácido modificado sob a forma racêmica e enantiomericamente pura, além de um possível produto cíclico que pode ser gerado naturalmente a partir da L-BMAA. Algumas rotas estratégicas foram determinadas com êxito para a síntese destes compostos. Entre as aplicações dos produtos obtidos podem ser citados: (i) a determinação de um método analítico para a determinação deste aminoácido por RMN de 1H; (ii) um método analítico por LC-MS utilizando D3-L-BMAA como padrão interno e (iii) a indicação de um possível mecanismo de neurotoxidade ligado a neurodegeneração via um intermediário produzido naturalmente do equilíbrio entre L-BMAA e íons bicarbonato. Duas rotas sintéticas estratégicas foram traçadas para a anatoxina-a. Na primeira, que não foi bem sucedida, partiu-se de um biciclo já formado e em sua etapa chave deveria ocorrer à expansão de um anel tropânico que conduziria ao biciclo 1:2:4. Na segunda, tentou-se a síntese a partir de uma molécula extremamente simples, o 1,5- ciclooctadieno, e após cinco passos reacionais obteve-se a síntese total da anatoxina-a sob a forma racêmica. A etapa mais importante para essa rota foi a ciclização utilizando-se paládio divalente. Entre as possíveis aplicações dos produtos obtidos sugere-se: (i) o desenvolvimento de um método analítico por LC-MS utilizando D3-anatoxina-a como padrão interno e (ii) ensaios biológicos com os análogos para se determinar potencial agonista, antagonista ou agonista parcial de receptores nicotínicos para esses compostos. A anatoxina-a(s) apresentou um grande desafio para a sua síntese total. Por se tratar de um organofosforado com uma parte alquílica heterocíclica, buscou-se primeiramente a sua síntese parcial. Assim, foi possivel a síntese da guanidina cíclica sob a forma racêmica e quiral, além da obtenção de alguns compostos análogos inéditos. Para a síntese da N-hidroxiguanidina cíclica traçou-se duas diferentes rotas, uma enantioseletiva, partindo do aminoácido asparagina, e outra racêmica, com a utilização de álcool benzílico como material de partida. No entanto, apesar da produção de intermediários e análogos, não foi possível a obtenção do produto final. Entre as aplicações dos produtos sintéticos obtidos estão: (i) o desenvolvimento e validação de um método analítico para a quantificação indireta de anatoxina-a(s) utilizando a N-hidroxiguanidina cíclica como padrão e (ii) a utilização destes intermediários sintéticos em ensaios para se determinar os mecanismos de ação tóxicos, especialmente como inibidores de colinesterases. / Cyanobacteria are aquatic and photosynthetic organisms that can be present in cold areas, such as the Arctic, as well as in tropical waters, in both marine and freshwater environment. They are important species for aquatic life and terrestrial ecosystems since they are on the base of the food web. However, some cyanobacterial species can produce toxic secondary metabolites that have deleterious effects for animals and human. These toxic metabolites are also called cyanotoxins and show different mechanisms of action ranging from hepatotoxic to neurotoxic effects. The aim of this study is the organic synthesis of some common neurotoxins, including some analogues, such as &#946;-N-methyl-L-alanine (L-BMAA), anatoxin-a and anatoxin-a(s). Moreover, focus was given for some possible application of these compounds, especially as analytical standards for water monitoring. Some synthetic routes were carried out in order to produce L-BMAA in both racemic and enantiomerically pure forms. Also, it was synthesized a possible cyclic analogue that may be formed in vivo from L-BMAA. The racemate and the pure L-BMAA were successfully obtained. Some possible application of these compounds were suggested: (i) the development of an analytical method based on 1H NMR analyses for the determination of L-BMAA in environmental and biological samples; (ii) the development of an analytical method based on LC-MS for the determination of L-BMAA, using D3-L-BMAA as an internal standard, in different matrices and (iii) the indication of a cyclic derivative formed in vivo that can be involved in the neurotoxicity of L-BMAA. Two strategies were planned in order to produce anatoxin-a. The first one was not successful and was started by using the bicyclic precursor. The crucial step was the expansion of tropanic ring to produce the 1:2:4 byciclic anatoxin-a precursor. The second strategy was initiated with the 1,5 cyclicoctadiene and after five reaction steps anatoxin-a was finally synthesized in its racemic form. The most important step for this route was the use of palladium. Similar applications were suggested for anatoxin-a: (i) the development of an analytical method based on LC-MS for the determination of anatoxin-a using D3-anatoxin-a as an internal standard in different matrices and (ii) the screening of anatoxin-a and analogues in bioassays based on nicotinic receptors in order to determine their agonistic and antagonistic mechanism of action. The total synthesis of anatoxin-a(s) is still a challenge. This cyanotoxin is a natural organophosphate with an alkylic heterocyclic chain. Therefore, the first step was the production of the cyclic guanidine in both racemic and enantiomerically pure forms. Some cyclic guanidine derivatives were prepared via asparagine and/or benzilic alcohol. However, anatoxin-a(s) was not achieved. The use of the cyclic guanidine can be recommended for: (i) the development of an analytical method based on LC-MS for the indirect determination of anatoxin-a(s) using its alkylic chain as a standard after sample alkalinization and (ii) the screening of anatoxin-a(s) derivatives in cholinesterase assays to determine their toxicity and mechanisms of action.

O gênero Streptomyces constitui-se em um grupo diferenciado de procariotos fitopatogênicos, por serem morfologicamente similares aos fungos e produzirem diversos importantes metabólitos secundários. A sarna comum da batata é principal doença causada pelo gênero. O principal agente causal da doença, Streptomyces scabies, produz fitotoxinas denominadas concanamicinas, porém, não foi comprovada a importância da produção das mesmas na agressividade dos isolados de S. scabies. Dessa forma, neste trabalho procurouse avaliar a reação dos cultivares mais plantados no Brasil a isolados de S. scabies exibindo diferentes níveis de produção de concanamicinas. O nível de produção de concanamicinas A e B de dez isolados de Streptomyces spp. foi avaliado por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e dois isolados (produtor de alto nível da toxina; baixo produtor) foram selecionados e utilizados na avaliação da resistência de seis cultivares de batata em casa de vegetação. Vasos contendo o substrato esterilizado receberam a suspensão de esporos bacterianos junto com os tubérculos sadios no momento do plantio e após quatro meses, a severidade da doença foi avaliada. Os resultados demonstraram aumento na agressividade do isolado produtor de elevadas quantidades de concanamicinas apenas sobre os cultivares Mondial, Monalisa e Asterix. Por sua vez, os resultados da avaliação do nível de resistência ao patógeno demonstraram que os cultivares Monalisa, Ágata, Asterix e Cupido são suscetíveis e os cultivares Atlantic e Mondial mostraram-se resistentes aos dois isolados de Streptomyces spp. avaliados. Por outro lado, a fitotoxina taxtomina A é a toxina mais frequentemente produzida pelas espécies fitopatogênicas de Streptomyces spp. O estudo do mecanismo de ação desta fitotoxina poderá auxiliar no entendimento de sua contribuição no desenvolvimento da doença. A taxtomina A é uma fitotoxina não específica e causa efeitos semelhantes em plantas de diferentes famílias botânicas. Desta forma, modificações citológicas, ultraestruturais e bioquímicas induzidas pela taxtomina A foram analisadas em plântulas de sorgo. Os tecidos foram tratados com taxtomina A e avaliados após sete dias do tratamento. Observou-se desorganização em todas as células dos tecidos tratados com a taxtomina A. A membrana plasmática das células do mesofilo foliar foi retraída e destacada da parede celular em diversos pontos. Entretanto, o plasmalema não pareceu rompido. O efeito sobre a permeabilidade seletiva da membrana plasmática também foi avaliado bioquimicamente, onde foi observado aumentos na saída de eletrólitos. Os cloroplastos apresentaram deformações na superfície e perda de turgidez. Estas deformações provavelmente contribuíram para a redução do teor de clorofilas A e B. As plântulas também apresentaram elevado acúmulo de fitoalexinas do tipo deoxiantocianidinas. Desta forma, conclui-se que a taxtomina A age principalmente sobre a membrana plasmática e organelas membranosas. Em contrapartida, o acúmulo de fitoalexinas evidencia que concentrações mínimas desta toxina podem ser exploradas como eliciador da resposta de defesa em plantas. / The genus Streptomyces is a different prokaryote phytopathogen group, being morphologically similar to fungi and able to produce several important secondary metabolites. The potato common scabies is the main plant disease caused by the members of the genus. The main causal agent of the plant disease, Streptomyces scabies, is able to produce the phytoxins concanamycins. However, the importance of these toxins in the aggressiveness of S. scabies strains was not proven. This research aimed to evaluate the reaction of main potato cultivars used in Brazil to Streptomyces spp. strains, exhibiting different levels of concanamycins production. The toxin production by several strains was quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) and two strains (higher and lower producers) were chosen and used for resistance evaluation of six potato cultivars under greenhouse. Pots containing sterile substratum received a suspension of bacterial spores and the healthy seed tubers at the same time. After four months, the level of disease was evaluated and the results showed increasing in aggressiveness for the higher concanamycins producer only in the Mondial, Monalisa and Asterix cultivars. For the two strains, the cultivars Atlantic and Mondial were resistant and the cultivars Monalisa, Cupido, Ágata and Asterix were susceptible. On the other hand, the thaxtomin A is the main phytotoxin of plant pathogenic Streptomyces spp. Therefore, the study of the thaxtomin A action mechanism is important to explain its contribution to disease development. The thaxtomin A is not a specific toxin and causes similar effect in several plants of different botanical families. Thus, the cytological, ultrastructural and biochemical modifications induced by thaxtomin A were evaluated in sorghum seedlings. Leaf tissues of seedlings were treated with high levels of thaxtomin A and evaluated 7 days after treatment. Cytological disorganization was observed in all treated cells. The plasmma membrane of the cells of immature leaves was detached from the wall in several places. However, plasmmalema did not seem degraded. The chloroplasts had showed significant deformations in the surface and volume reduction. Theses changes in chloroplasts probably contributed for the reduction of chlorophylls A and B levels. The sorghum seedlings also showed high phytoalexin accumulation (deoxiantocianydins) in response to thaxtomin A treatment. Thus, the thaxtomin A acts mainly on plasmma membrane and membranous organelles, causing plasmolises, cell disorganization, deformations in chloroplasts and chlorophyll reduction in sorghum seedlings. Finally, the accumulation of phytoalexins in response to thaxtomin A treatment points out it potential to induce resistance in plants.

Echinometra lucunter, o ouriço-do-mar responsável por 50% dos acidentes por animais marinhos, causa inflamação e dor quando os espinhos entram na pele, efeitos atribuídos ao trauma mecânico, além de acidentes por ingestão de ovas. O líquido celômico e o extrato aquoso de espinhos foram fracionados e purificados até a obtenção de moléculas puras, que foram testadas em modelos de inflamação. Foram feitas análises histológicas do espinho e de atividade enzimática do extrato de espinho. Foi isolada uma molécula do espinho e um peptídeo do líquido celômico, que causaram inflamação e dor. Foi verificada atividade enzimática de catepsina B/X. Foi observada uma estrutura histológica organizada no espinho, com células entre a porção calcificada, algumas contendo grânulos eletrodensos com conteúdo protéico, típicas secretoras. Conclui-se que o espinho e o líquido celômico de E. lucunter possuem toxinas inflamatórias, que participam do envenenamento e o espinho tem células secretoras de toxinas. A catepsina pode auxiliar no mecanismo de reparação do espinho, quando quebrado. / Echinometra lucunter, the sea urchin responsible for 50% of marine animals accidents, cause inflammation and pain by the spine penetration, effects attributed to the mechanical trauma. Accidents were reported after the ingestion of raw. The celomic fluid and spines were fractionated and purified, procedure repeated until pure molecules were obtained, tested for inflammation models. Histological analyses and enzymatic assays were performed. A molecule from spines and a peptide from the celomic fluid caused inflammatory effects. Moreover, a cathepsin B/X activity could be identified in the spines. An organized histological structure in the spine was observed, with cells embedded in a calcified matrix, as well as granulous cells displaying proteic contents, typical of secretory cells. It was possible to conclude that the spine and the celomic fluid of E. lucunter do contain inflammatory toxins that prolong the spine puncturing event itself, and the spine possesses a toxin secretory structure. The cathepsin would be present in a mechanism of tissue remodeling.

O estudo de venenos de artrópodes é de grande interesse para melhorar os tratamentos contra envenenamentos e oferece uma ótima ferramenta para melhor compreensão dos sistemas nervoso e imunológico, coagulação sanguínea e respostas inflamatórias. As abelhas são um dos animais venenosos mais estudados e a elucidação do seu proteoma é de interesse na elucidação de reações tóxicas e alérgicas a ferroadas. O número de acidentes envolvendo estes insetos é crescente, tendo ultrapassado 20.000 notificações entre 2001 e 2006 em todo o país e, apesar disso, não há um tratamento específico para estas vítimas, nem mesmo uma identificação completa dos antígenos presentes nesse veneno. O perfil protéico descrito até então apresenta cerca de 40 proteínas. O objetivo deste trabalho foi identificar o perfil protéico do veneno de abelhas utilizando a união da abordagem proteômica e da cromatografia de afinidade. Identificar também as proteínas alergênicas deste veneno e algumas modificações pós-traducionais como fosforilação e glicosilação. Além disso, um soro antiveneno específico foi produzido e sua ação neutralizadora testada. O veneno de abelhas foi separado por cromatografia de afinidade utilizando o soro antiveneno imobilizado em coluna de Sepharose 4B. Para identificação das proteínas foram utilizadas técnicas de 2D-SDS-PAGE, MALDI TOF/TOF e nanoESI-LC/MS-MS. Ensaios de Western Blotting foram realizados para identificar as proteínas alergênicas e fosforiladas. A utilização da cromatografia de afinidade permitiu a identificação 2 de proteínas pouco abundantes. Foram identificadas 54 proteínas, dentre as quais 9 nunca haviam sido descritas neste veneno, como MRJP-2, alfaglicosidase, transferinas, proteases, quinases e um inibidor de protease. Após a identificação destas proteínas foi possível propor um provável mecanismo de ação deste veneno. Dentre as proteínas identificadas como alergênicas, a MRJP-8 foi identificada pela primeira vez, juntamente com fatores relacionados ao PDGF e VEGF. Os resultados dos ensaios de neutralização de atividades citotóxicas, hemolíticas e miotóxicas mostraram a eficiência do soro antiveneno produzido. Chegou-se a um volume de 5,7 mL de soro antiveneno necessários para neutralizar a ação tóxica provocada por 100 ferroadas de abelhas. Este valor está na mesma faixa de eficiência dos melhores antivenenos (ofídicos, aracnídicos e escorpionídicos) produzidos no Brasil e no mundo. O lote de soro antiveneno produzido mostrou resultados satisfatórios para ser utilizado nos testes clínicos / The aim of this work was to identify the protein profile of honeybee venom, and detect allergenic proteins and post-translational modifications. Furthermore specific antivenom was produced and potency tests were performed in order to check its power of neutralization of toxic activities of venom. They were identified 54 proteins, 9 that have never been reported before in this venom. After identification of these proteins it was possible to outline a feasible mechanism of action of venom. For the first time MRJP-8, transferrin, PDGF and VEGF factors were identified as allergenic. Results of neutralization of citotoxic, hemolytic and myotoxic activities showed the efficacy of antivenom that had satisfactory results to be tested in clinical assay

De uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno da cobra coral brasileira Micrurus corallinus foi isolada uma seqüência denominada NXH8. Esta seqüência de cDNA apresenta similaridade estrutural com a família de toxinas de serpentes em 'três dígitos' ricas em pontes dissulfeto. A subclasse melhor conhecida nesta família, são as alfa neurotoxinas. Uma outra seqüência distinta, denominada NXH1 e suas isoformas NXH3 e NXH7, foram isoladas anteriormente. Pertencem à mesma família de toxinas e estão presentes na mesma biblioteca. Alguns resultados da caracterização de NXH1, são utilizados neste estudo, em comparação com NXH8. Algumas características estruturais tornam a seqüência NXH8 diferente da classe usual das alfa neurotoxinas, vindo a constituir possivelmente uma nova subclasse da família. A proteína NXH8 foi expressa em diversos vetores de expressão em Escherichia coli. A proteína recombinante, expressa pelo vetor pRSET C - NXH8 foi utilizada para imunizar camundongos. O soro contra NXH8, assim como o soro anti - elapídico do Instituto Butantan, reconhece a toxina recombinante em ELISA e Western blot. O soro anti - NXH8 detecta apenas uma banda do veneno de M. corallinus em Western blot, mas apresenta reatividade cruzada com componentes do veneno de alguns elapídeos neotropicais e do velho mundo. Em contraste, dados anteriores demonstraram que o soro anti - NXH1 é específico para um componente único do veneno de M. corallinus. O veneno de M. corallinus tem alfa neurotoxinas que bloqueiam o receptor pós - sináptico nicotínico de acetilcolina nas membranas do músculo esquelético de ratos. O soro anti - NXH8 é capaz de impedir a ligação de componentes do veneno bruto a esses receptores. Já o soro contra NXH1 não apresenta a mesma capacidade inibitória. Isto indica que NXH8 tem afinidade pelo receptor nicotínico muscular de acetilcolina, ou que NXH8 compartilha de um epítopo neutralizante presente também nas alfa neurotoxinas do veneno da cobra coral M. corallinus. / A cDNA sequence encoding a putative new toxin, NXH8, was isolated from the cDNA library constructed from the venom gland of the Brazilian coral snake, Micrurus corallinus. This sequence shows a structural similarity with the snake toxin family known as 'three-fingered' toxins, a family of toxins with approximately 60 to 70 amino acids and usually 4 to 5 disulfide bonds. Irrespective of whether these proteins are functionally different, their amino acid sequences can be readily aligned, using 8 half-cystines as conserved elements, suggesting the presence of common structural features. The best known subclass of three-finger-type toxins are the curaremimetic toxins, also called alpha-neurotoxins, found in most venoms from Elapid and Sea snakes. Another toxin with a distinct sequence, known as NXH1 and its isoforms NXH3 and NXH7 had been previously isolated. They belong to the same family of toxins and were characterized from the same cDNA library. In the present study, a comparative biochemical, pharmacological and structural analyses of NXH1 and NXH8 were described. Few structural characteristics of NXH8 seem to indicate that it differs from the usual class of alpha – neurotoxins, belonging, possibly, to a new subclass of 'three-finger' toxins. The NXH8 protein was expressed in various E. coli expression vectors and the resulted recombinant toxin from pRSETC-NXH8 plasmid was used as a "toxoid" for mice immunization. The anti - NXH8 sera, as well as the anti – elapid sera from the Butantan Institute, recognized the recombinant toxin by both ELISA and Western blot assays. In contrast to the claim that anti - NXH1 sera is specific to one component of M. corallinus’s venom, the anti – NXH8 sera show cross reactivity to venom of some Neotropical and Old World elapids. The M. corallinus's venom contains alpha – toxins, which inhibit post-synaptic nicotinic acetylcholine receptor of neonatal rat skeletal muscle membrane. The anti - NXH8 serum was capable of blocking the binding of the components of the crude venom to these receptors. In contrast, the anti – NXH1 serum did not show this inhibitory effect. This indicates that either NXH8 presents affinity for muscular nicotinic acetylcholine receptor or it shares a neutralizing epitope also present in M. corallinus’s alpha – neurotoxins.