O gênero Streptomyces constitui-se em um grupo diferenciado de procariotos fitopatogênicos, por serem morfologicamente similares aos fungos e produzirem diversos importantes metabólitos secundários. A sarna comum da batata é principal doença causada pelo gênero. O principal agente causal da doença, Streptomyces scabies, produz fitotoxinas denominadas concanamicinas, porém, não foi comprovada a importância da produção das mesmas na agressividade dos isolados de S. scabies. Dessa forma, neste trabalho procurouse avaliar a reação dos cultivares mais plantados no Brasil a isolados de S. scabies exibindo diferentes níveis de produção de concanamicinas. O nível de produção de concanamicinas A e B de dez isolados de Streptomyces spp. foi avaliado por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) e dois isolados (produtor de alto nível da toxina; baixo produtor) foram selecionados e utilizados na avaliação da resistência de seis cultivares de batata em casa de vegetação. Vasos contendo o substrato esterilizado receberam a suspensão de esporos bacterianos junto com os tubérculos sadios no momento do plantio e após quatro meses, a severidade da doença foi avaliada. Os resultados demonstraram aumento na agressividade do isolado produtor de elevadas quantidades de concanamicinas apenas sobre os cultivares Mondial, Monalisa e Asterix. Por sua vez, os resultados da avaliação do nível de resistência ao patógeno demonstraram que os cultivares Monalisa, Ágata, Asterix e Cupido são suscetíveis e os cultivares Atlantic e Mondial mostraram-se resistentes aos dois isolados de Streptomyces spp. avaliados. Por outro lado, a fitotoxina taxtomina A é a toxina mais frequentemente produzida pelas espécies fitopatogênicas de Streptomyces spp. O estudo do mecanismo de ação desta fitotoxina poderá auxiliar no entendimento de sua contribuição no desenvolvimento da doença. A taxtomina A é uma fitotoxina não específica e causa efeitos semelhantes em plantas de diferentes famílias botânicas. Desta forma, modificações citológicas, ultraestruturais e bioquímicas induzidas pela taxtomina A foram analisadas em plântulas de sorgo. Os tecidos foram tratados com taxtomina A e avaliados após sete dias do tratamento. Observou-se desorganização em todas as células dos tecidos tratados com a taxtomina A. A membrana plasmática das células do mesofilo foliar foi retraída e destacada da parede celular em diversos pontos. Entretanto, o plasmalema não pareceu rompido. O efeito sobre a permeabilidade seletiva da membrana plasmática também foi avaliado bioquimicamente, onde foi observado aumentos na saída de eletrólitos. Os cloroplastos apresentaram deformações na superfície e perda de turgidez. Estas deformações provavelmente contribuíram para a redução do teor de clorofilas A e B. As plântulas também apresentaram elevado acúmulo de fitoalexinas do tipo deoxiantocianidinas. Desta forma, conclui-se que a taxtomina A age principalmente sobre a membrana plasmática e organelas membranosas. Em contrapartida, o acúmulo de fitoalexinas evidencia que concentrações mínimas desta toxina podem ser exploradas como eliciador da resposta de defesa em plantas. / The genus Streptomyces is a different prokaryote phytopathogen group, being morphologically similar to fungi and able to produce several important secondary metabolites. The potato common scabies is the main plant disease caused by the members of the genus. The main causal agent of the plant disease, Streptomyces scabies, is able to produce the phytoxins concanamycins. However, the importance of these toxins in the aggressiveness of S. scabies strains was not proven. This research aimed to evaluate the reaction of main potato cultivars used in Brazil to Streptomyces spp. strains, exhibiting different levels of concanamycins production. The toxin production by several strains was quantified by high performance liquid chromatography (HPLC) and two strains (higher and lower producers) were chosen and used for resistance evaluation of six potato cultivars under greenhouse. Pots containing sterile substratum received a suspension of bacterial spores and the healthy seed tubers at the same time. After four months, the level of disease was evaluated and the results showed increasing in aggressiveness for the higher concanamycins producer only in the Mondial, Monalisa and Asterix cultivars. For the two strains, the cultivars Atlantic and Mondial were resistant and the cultivars Monalisa, Cupido, Ágata and Asterix were susceptible. On the other hand, the thaxtomin A is the main phytotoxin of plant pathogenic Streptomyces spp. Therefore, the study of the thaxtomin A action mechanism is important to explain its contribution to disease development. The thaxtomin A is not a specific toxin and causes similar effect in several plants of different botanical families. Thus, the cytological, ultrastructural and biochemical modifications induced by thaxtomin A were evaluated in sorghum seedlings. Leaf tissues of seedlings were treated with high levels of thaxtomin A and evaluated 7 days after treatment. Cytological disorganization was observed in all treated cells. The plasmma membrane of the cells of immature leaves was detached from the wall in several places. However, plasmmalema did not seem degraded. The chloroplasts had showed significant deformations in the surface and volume reduction. Theses changes in chloroplasts probably contributed for the reduction of chlorophylls A and B levels. The sorghum seedlings also showed high phytoalexin accumulation (deoxiantocianydins) in response to thaxtomin A treatment. Thus, the thaxtomin A acts mainly on plasmma membrane and membranous organelles, causing plasmolises, cell disorganization, deformations in chloroplasts and chlorophyll reduction in sorghum seedlings. Finally, the accumulation of phytoalexins in response to thaxtomin A treatment points out it potential to induce resistance in plants.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica encontrada em várias partes do mundo e tem a capacidade de produzir cristais durante a fase estacionária do crescimento. Esses cristais são toxinas compostas por proteínas ativas contra uma ampla variedade de fases imaturas de insetos. As toxinas do Bt têm sido usadas como bioinseticidas por décadas no controle de insetos das ordens Coleoptera, Lepidoptera e Diptera, e algumas toxinas já foram selecionadas como efetivas contra ácaros, nematoides e insetos sugadores de floema da ordem Hemiptera, como os afídeos. Recentemente, foi comprovada a patogenicidade de três isolados de Bt a outro inseto dessa ordem, o psilídeo Diaphorina citri. Esse psilídeo é vetor das bactérias Candidatus Liberibacter spp., agentes causais da principal doença dos citros: o Huanglongbing ou HLB. A descoberta da capacidade endofítica de Bt em plantas de diferentes espécies vegetais abriu perspectivas para novos estudos usando o Bt para controle de insetos sugadores, como a D. citri. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito patogênico de cada toxina Cry ou Cyt presente nestes três isolados através de isolados de Bt recombinantes expressando as toxinas individualmente. Foram montados bioensaios para confirmar a taxa de mortalidade causada por isolados de Bt contra ninfas de D. citri. Os bioensaios foram feitos usando cinco plantas de laranja doce (Citrus sinensis (L.) Osbeck) e dez ninfas de 3º ínstar de D. citri por planta, além dos controles (sem Bt). A mortalidade das ninfas foi avaliada diariamente durante cinco dias. Durante a avaliação, as ninfas mortas foram coletadas para o isolamento do Bt além da detecção do gene da toxina por PCR. No final do experimento, as folhas jovens onde as ninfas se alimentavam também foram avaliadas quanto à presença do Bt. Nossos resultados confirmaram que os isolados de Bt previamente identificados como patogênicos a D. citri causaram elevada mortalidade (em média 68-93%) em ninfas de 3º ínstar. Dentre os isolados recombinantes testados, um deles apresentou grande destaque, causando a mortalidade de 68-81% das ninfas em 48 horas e 83-93% em 120 horas. Esse isolado possui grande potencial de uso no controle biológico de D. citri através da produção de um bioinseticida ou produção de plantas de citros transgênicas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogenic bacterium found in several locations around the world and has the ability to produce crystals during the stationary phase of growth. These crystals are composed of protein toxins that are active against a wide variety of insect larvae. The Bt toxins have been used for decades as biopesticides to control insects of the orders Coleoptera, Lepidoptera, and Diptera. Some toxins have been selected as effective for mites, nematodes and phloem-sucking insects of the order Hemipera, such as aphids. The pathogenicity of strains of Bt to Diaphorina citri, an hemipteran known as Asian citrus psyllid, has been recently demonstrated. This psyllid is the vector of the bacteria Candidatus Liberibacter spp., the causal agents of the main disease of citrus: Huanglongbing or HLB. The discovery of the ability of Bt strains to endophytically colonize plants of different species has opened new perspectives for studies. The aim of this work was to evaluate the pathogenic effect of each Cry or Cyt toxin present in these three isolates through the use of recombinant Bt isolates expressing each toxin individually. A series of bioassays were done in order to confirm the mortality caused by Bt strains against nymphs of D. citri. Bioassays were performed in five seedlings of Citrus sinensis (L.) Osbeck (five replicates/ bioassay) and using ten D. citri 3rd instar nymphs to each assay plant. A suspension containing Bt spores was inoculated via drench in each seedling, and five seedlings were maintained as negative control (without Bt). Mortality was assessed daily for five days. During the bioassays, dead nymphs were collected for further Bt isolation and detection by PCR. At the end of the experiment, young leaves where nymphs feed were also collected to Bt isolation and detection. Our results confirmed that the previously identified Bt isolates pathogenic to D. citri cause high mortality to 3rd instar nymphs. Among the ten recombinant isolates tested, one of them stood out, causing 68-81 % and 83-93% mortality after 48 and 120 hours of inoculation, respectively. The isolation of Bt from dead nymphs and young leaves, and PCR performed with specific primers confirmed the presence of the Bt isolates in psyllids and plants, and their involvement in psyllid mortality. This recombinant Bt with the higher mortality rate found in our results has the potential to be used as a bioinsecticide to control D. citri and the toxin gene can be used to genetic engineering of citrus.

De uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno da cobra coral brasileira Micrurus corallinus foi isolada uma seqüência denominada NXH8. Esta seqüência de cDNA apresenta similaridade estrutural com a família de toxinas de serpentes em 'três dígitos' ricas em pontes dissulfeto. A subclasse melhor conhecida nesta família, são as alfa neurotoxinas. Uma outra seqüência distinta, denominada NXH1 e suas isoformas NXH3 e NXH7, foram isoladas anteriormente. Pertencem à mesma família de toxinas e estão presentes na mesma biblioteca. Alguns resultados da caracterização de NXH1, são utilizados neste estudo, em comparação com NXH8. Algumas características estruturais tornam a seqüência NXH8 diferente da classe usual das alfa neurotoxinas, vindo a constituir possivelmente uma nova subclasse da família. A proteína NXH8 foi expressa em diversos vetores de expressão em Escherichia coli. A proteína recombinante, expressa pelo vetor pRSET C - NXH8 foi utilizada para imunizar camundongos. O soro contra NXH8, assim como o soro anti - elapídico do Instituto Butantan, reconhece a toxina recombinante em ELISA e Western blot. O soro anti - NXH8 detecta apenas uma banda do veneno de M. corallinus em Western blot, mas apresenta reatividade cruzada com componentes do veneno de alguns elapídeos neotropicais e do velho mundo. Em contraste, dados anteriores demonstraram que o soro anti - NXH1 é específico para um componente único do veneno de M. corallinus. O veneno de M. corallinus tem alfa neurotoxinas que bloqueiam o receptor pós - sináptico nicotínico de acetilcolina nas membranas do músculo esquelético de ratos. O soro anti - NXH8 é capaz de impedir a ligação de componentes do veneno bruto a esses receptores. Já o soro contra NXH1 não apresenta a mesma capacidade inibitória. Isto indica que NXH8 tem afinidade pelo receptor nicotínico muscular de acetilcolina, ou que NXH8 compartilha de um epítopo neutralizante presente também nas alfa neurotoxinas do veneno da cobra coral M. corallinus. / A cDNA sequence encoding a putative new toxin, NXH8, was isolated from the cDNA library constructed from the venom gland of the Brazilian coral snake, Micrurus corallinus. This sequence shows a structural similarity with the snake toxin family known as 'three-fingered' toxins, a family of toxins with approximately 60 to 70 amino acids and usually 4 to 5 disulfide bonds. Irrespective of whether these proteins are functionally different, their amino acid sequences can be readily aligned, using 8 half-cystines as conserved elements, suggesting the presence of common structural features. The best known subclass of three-finger-type toxins are the curaremimetic toxins, also called alpha-neurotoxins, found in most venoms from Elapid and Sea snakes. Another toxin with a distinct sequence, known as NXH1 and its isoforms NXH3 and NXH7 had been previously isolated. They belong to the same family of toxins and were characterized from the same cDNA library. In the present study, a comparative biochemical, pharmacological and structural analyses of NXH1 and NXH8 were described. Few structural characteristics of NXH8 seem to indicate that it differs from the usual class of alpha – neurotoxins, belonging, possibly, to a new subclass of 'three-finger' toxins. The NXH8 protein was expressed in various E. coli expression vectors and the resulted recombinant toxin from pRSETC-NXH8 plasmid was used as a "toxoid" for mice immunization. The anti - NXH8 sera, as well as the anti – elapid sera from the Butantan Institute, recognized the recombinant toxin by both ELISA and Western blot assays. In contrast to the claim that anti - NXH1 sera is specific to one component of M. corallinus’s venom, the anti – NXH8 sera show cross reactivity to venom of some Neotropical and Old World elapids. The M. corallinus's venom contains alpha – toxins, which inhibit post-synaptic nicotinic acetylcholine receptor of neonatal rat skeletal muscle membrane. The anti - NXH8 serum was capable of blocking the binding of the components of the crude venom to these receptors. In contrast, the anti – NXH1 serum did not show this inhibitory effect. This indicates that either NXH8 presents affinity for muscular nicotinic acetylcholine receptor or it shares a neutralizing epitope also present in M. corallinus’s alpha – neurotoxins.

Orientador: Carlos Arturo Levi D'Ancona / Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T10:56:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_RuiterSilva_D.pdf: 2813399 bytes, checksum: a60122cb9b6dd6b69a465a84a16f289e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Introdução: O tratamento da incontinência urinária é aspecto importante no processo de reabilitação de pacientes portadores de lesão medular (LM). Objetivos: Os objetivos desse estudo foram avaliar o impacto na qualidade de vida (QV) e nos parâmetros urodinâmicos de pacientes portadores de LM tratados com injeção intradetrusora de onabotulinumtoxina ou uso oral de oxibutinina. Pacientes e Métodos: Sessenta e oito pacientes portadores de LM e hiperatividade detrusora neurogênica foram randomizados em dois grupos. Grupo I (n=34) receberam 15 mg/dia de cloridrato de oxibutinina por via oral e grupo II (n=34) foram tratados com injeção intradetrusora de 300U de onabotulinumtoxina em 30 pontos da parede vesical com preservação do trígono. Parâmetros urodinâmicos como capacidade cistométrica máxima (CCM), pressão detrusora máxima (Pdetmax) e complacência foram avaliados juntamente com escores de QV obtidos pelo questionário Qualiveen. As avaliações foram feitas antes da randomização dos pacientes, quatro, 12 e 24 semanas após inicio do tratamento. O nível de significância adotado foi de 5%. Resultados: Sete pacientes não completaram o estudo. Dos 61 pacientes, 49 pertenciam ao sexo masculino (80,3%) com idade média de 31,84 (DP ± 8,73) anos no grupo I e 33,54 (DP ± 11,86) anos no grupo II, p=0,839. Após 24 semanas, o aumento médio da CCM no grupo I foi de 126,24 (DP ± 62,22) ml e de 289,25 (DP ± 134,52) ml no grupo II, p<0,001. A Pdetmax apresentou redução média de 21,09 (DP ± 19,95) cm H2O no grupo I e de 48,75 (DP ± 29,34) cm H2O no grupo II, p<0,001. A complacência vesical apresentou aumento médio de 6,85 (DP ± 5,13) ml/cm H2O no grupo I e de 25,82 (DP ± 24,00) ml/cm H2O no grupo II, p=0,006. O número de perdas urinárias em 24h apresentou diminuição média de 2,34 (DP ± 1,89) episódios no grupo I e de 7,55 (DP ± 3,52) episódios no grupo II, p<0,001. Os escores do impacto específico dos problemas urinários do questionário Qualiveen apresentaram redução média de 0,26 (DP ± 0,33) no grupo I e de 1,48 (DP ± 0,70) no grupo II, p<0,001. Os escores do índice de qualidade de vida apresentaram aumento médio de 0,12 (DP ± 0,26) no grupo I e de 0,63 (DP ± 0,45) no grupo II, p<0,001. Conclusão: A injeção intradetrusora de onabotulinumtoxina e a administração oral de oxibutinina promoveram melhora significativa nos parâmetros urodinâmicos e na qualidade de vida de pacientes portadores de hiperatividade detrusora devido a LM. Porém, a comparação dos dois tratamentos demonstrou que a onabotulinumtoxina apresentou resposta significativamente melhor quando comparada à oxibutinina / Abstract: Introduction: The treatment of urinary incontinence is an important issue in the rehabilitation of patients with spinal cord injury (SCI). Objectives: The goals of this study were to evaluate the impact on Quality of Life (QoL) and urodynamic parameters on patients with SCI who were treated with intradetrusor injections of onabotulinumtoxinA or oral oxybutynin. Patients and Methods: Sixty-eight patients with SCI and neurogenic detrusor overactivity were randomized into two groups. Patients in Group I (n=34) received 15 mg/day oxybutynin orally, and patients in Group II (n=34) were treated with intradetrusor injections of 300U onabotulinumtoxinA into 30 different segments of the urinary bladder wall, sparing of the trigone. Urodynamic parameters such as maximum cystometric capacity (MCC), maximum detrusor pressure (Pdetmax) and bladder compliance were evaluated, and QoL scores were obtained by applying the Qualiveen questionnaire. Evaluations were performed prior to randomisation and at 4, 12 and 24 weeks of treatment. The significance level was set at 5%. Results: Seven patients did not complete the study. Of the 61 patients, 49 (80.3%) were male. The mean age of patients was 31.84 (SD ± 8.73) years old in group I and 33.54 (SD ± 11.86) years old in group II (p=0.839). After 24 weeks, the mean increase in MCC in group I was 126.24 (SD ± 62.22) mL compared to 289.25 (SD ± 134.52) mL in group II (p<0.001). We determined a mean decrease of 21.09 (SD ± 19.95) cm H2O in Pdetmax in group I compared to 48.75 (SD ± 29.34) cm H2O in group II (p<0.001). Furthermore, the mean increase in bladder compliance was 6.85 (SD ± 5.13) mL/cm H2O in group I compared to 25.82 (SD ± 24.00) mL/cm H2O in group II (p=0.006). A mean decrease in 24-hour urine leakage of 2.34 (SD ± 1.89) episodes occurred in group I, with a mean decrease of 7.55 (SD ± 3.52) episodes in group II (p<0.001). Scores in the Qualiveen questionnaire that focused on the specific impact of urinary dysfunction were decreased by a mean of -0.26 (SD ± 0.33) in group I and -1.48 (SD ± 0.70) in group II (p<0.001). Importantly, the Qualiveen scores related to the QoL index increased by a mean of 0.12 (SD ± 0.26) in group I and 0.63 (SD ± 0.45) in group II (p<0.001). Conclusions: Both intradetrusor injections of onabotulinumtoxinA and oral administration of oxybutynin resulted in a significant improvement in urodynamic parameters and QoL in patients with detrusor overactivity due to SCI. However, a comparison of the two treatments showed a significantly improved response with onabotulinumtoxin. A compared to oxybutynin / Doutorado / Cirurgia / Doutor em Cirurgia

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-27T12:45:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carregari_VictorCorasolla_D.pdf: 3134117 bytes, checksum: 3177d146a01c9214975aac2e9aebd929 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os venenos de serpentes são uma mistura complexa de moléculas funcionais sendo em sua maior parte proteínas. Para a perpetuação da espécie, e sendo selecionadas a partir do processo de seleção natural, as serpentes apresentam uma alta variabilidade de mutações gênicas responsáveis por expressar proteínas e componentes dos venenos ocorrendo um processo denominado de microevolução, com isso criou diversas toxinas com uma alta complexidade funcional e uma alta similaridade estrutural. Essas toxinas são responsáveis por uma grande variedade de efeitos farmacológicos que geram alterações fisiológicas e com isso imobilizando a presa (neurotoxicidade e miotoxicidade) impedindo a fuga do local de ataque, tendo componentes nos venenos que também iniciam a digestão da presa facilitando a alimentação da serpente. Estas toxinas têm sido utilizadas como ferramentas moleculares para uma melhor compreensão de processos fisiológicos. Através da identificação de modificações químicas em aminoácidos específicos e sequenciamento de "de novo" através de espectrometria de massas de PLA2s isoladas a partir do veneno de serpentes, foi possível correlacionar estrutura e função destas enzimas e elucidar certos mecanismos de ações farmacológicas específicas. As modificações químicas através dos reagentes p-BPB e AA da Bbil-TX foram identificadas e confirmadas por espectrometria de massas, apresentando um alto grau de eficiência e especificidade dos reagentes por aminoácidos específicos (lisina para o AA e histidina para o p-BPB). Após três etapas de purificação de uma nova PLA2 K49 isolada do veneno de Bothriopsis taeniata, denominada Btt-TX, esta foi submetida a duas diferentes enzimas de clivagem (tripsina e Lys-C) e os peptídeos gerados aplicados a um sistema de LC MS/MS aplicando-se diferentes métodos de fragmentação dos peptídeos digeridos como CID/HCD/ETD, com isso foi possível obter uma variedade de padrões complementares dos peptídeos fragmentados, sendo feito o sequenciamento "de novo" automático através da sobreposição dos peptídeos gerados pela combinação destas diferentes metodologias, permitindo obter 100% de cobertura da sequencia de aminoácidos. Nossos estudos de relação entre estrutura e função demonstraram que a região C-terminal e a presença de resíduos de aminoácidos altamente hidrofóbicos assim como a presença das lisinas são responsáveis pela ancoragem e penetração da membrana, promovendo assim o efeito miotóxico, independendo da atividade catalítica. A perda da região consenso do N-terminal da Btt-TX comprova a importância desta região na ancoragem com as membranas celulares e aumentando a interação com aminoácidos destas PLA2s, permitindo uma aproximação das lisinas com a membrana plasmática das células musculares aumentando a eficiência da penetração dos aminoácidos hidrofóbicos presentes na região C-Terminal / Abstract: The snake venoms are a complex mixture of functional molecules and in the most part of proteins. For the preservation of the species and suffering a natural selection process, the snakes show high genic variability responsible for the protein expressions and compounds present in the venom, occurring an microevolution process, in this way several toxins with a high functional complexity and structural similarity was created. These toxins are responsible for various pharmacological effects that produces many physiological disturbs (neurotoxicity and myotoxicity) which immobilize the prey keeping near from the local of the attack and having some venom components that start the digestion of the prey. Toxins are often used as a molecular tool to get a better comprehension of physiological process. Through identification of chemical modifications in specific amino acids and make a "de novo" sequence by mass spectrometry on isolated PLA2s from snake venom correlating function and structure of these enzymes trying to elucidate some specific pharmacological actions. All the chemical modification at the Bbil-TX by the reagents p-BPB and AA was identified and proved by mass spectrometry, showing a high level of efficacy and specificity of the reagents from specific amino acids (lysine for the AA and histidine for the p-BPB). After the purification of a new PLA2 K49 isolated from the Bothriopsis taeniata snake venom, called Btt-TX, submitting it to two different cleavage enzymes (trypsin and Lyc-C) and the generated peptides injected to an LC MS/MS system. Applying different fragmentation mode, such as, CID/HCD/ETD, it was possible obtain a variety of additional and complementary patterns of fragmented peptides. With the obtained data we did the "de novo" automatic sequence through the overlapping of the generated peptides from all the fragmentation methods, allowing to have 100%. Nossos estudos de relação entre estrutura e função demonstraram que a região C-terminal e a presença de resíduos de aminoácidos altamente hidrofóbicos assim como a presença das lisinas são responsáveis pela ancoragem e penetração da membrana, promovendo assim o efeito miotóxico, independendo da atividade catalítica. A perda da região consenso do N-terminal da Btt-TX comprova a importância desta região na ancoragem com as membranas celulares e aumentando a interação com aminoácidos destas PLA2s, permitindo uma aproximação das lisinas com a membrana plasmática das células musculares aumentando a eficiência da penetração dos aminoácidos hidrofóbicos presentes na região C-Terminal. Our structure/function studies showed that the C-terminal region and the presence of the highly hydrophobic amino acid residues as well as the lisines presence are responsible for the anchorage and disrupt membrane, promoting the myotoxic effetc. The N-terminal loss in the Btt-TX, prove the importance of this region in anchoring with the cell membrane and increasing interaction with amino acids of these PLA2s, allowing a better interaction with the lisines increasing the penetration efficiency of the hydrophobic amino acids on C-terminal region / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Análise proteômica das glândulas de veneno e acessória durante o ciclo de produção de veneno e a influência da inervação noradrenérgica na síntese de proteínas foi verificada. Nossos dados mostram que a síntese de proteínas envolvidas no processo de síntese e secreção de proteínas está aumentada nos estágios ativados da glândula de veneno e que a estimulação da inervação noradrenérgica regula a síntese de algumas proteínas importantes para estes processos. Mostramos pela primeira vez, a presença de várias toxinas no estágio quiescente da glândula e que a produção e secreção de toxinas ocorrem de maneira não sincronizada. Na glândula acessória verificamos uma modulação na síntese de algumas proteínas da glândula após a extração de veneno. Mostramos também a presença de várias toxinas e de inibidores de enzimas do veneno nesta glândula. A composição proteômica das glândulas do aparelho glandular de veneno de serpente contribuirá para um melhor conhecimento dos mecanismos de produção e secreção de veneno e para os estudos das toxinas e suas diversidades. / Proteomic analysis of venom gland and accessory gland during venom production cycle and the influence of noradrenergic innervation on protein synthesis of venom gland were verified. Our data show that the synthesis of proteins involved in the process of synthesis and secretion of proteins is increased in activated stages of venom gland and the sympathetic outflow regulates the synthesis of some proteins that is important to this process. For the first time we showed that many toxins are present in quiescent stage of venom gland and the production and secretion of toxins is not synchronized. Regarding the accessory gland, we verify that the syntheses of some protein of gland were regulated after venom extraction. We also showed the presence of some toxins of the venom and enzyme inhibitors in this gland. The proteomic composition of snake venom gland apparatus will contribute to better understand the mechanisms involved in venom gland activation and consequently, venom production. These data will also contribute to the studies on snake toxins and their diversities.

A jararagina, isolada do veneno de Bothrops jararaca, possui efeito pró-inflamatório caracterizado por edema, liberação de citocinas e migração celular. Neste estudo, demonstramos o aumento na expressão gênica da quimiocina IL-8, moléculas de adesão (E-Selectina, V-CAM-1, I-CAM-1), CD-69, Angiopoetina-2 e MMP-10 em HUVECs estimuladas com jararagina. Também investigamos o efeito da jararagina na expressão protéica de moléculas de adesão e da quimiocina IL-8. A molécula de adesão PECAM-1 foi expressa na superfície das HUVECs em todos os tratamentos e intervalos de tempo analisados. Entretanto não observamos aumento da expressão de E-selectina e VCAM-1 após estímulo com a jararagina. A jararagina também não induziu a liberação de IL-8. Nossos resultados sugerem que a jararagina se liga nas células endoteliais, mas o receptor celular envolvido neste efeito ainda não está claro. Este trabalho contribui com a literatura na medida em que elucida a participação de importantes genes dentro do contexto inflamatório desencadeado pela jararagina em células endoteliais. / Jararhagin, from Bothrops jararaca venom, causes a local reaction manifested by edema, cytokine release and inflammatory cells recruitment. In this study we evaluated by real time PCR the expression of 9 genes involved in inflammatory response, triggered by jararhagin in HUVECs. Our results showed a significant increase in the gene expression of chemokine IL-8, adhesion molecules (E-selectin, V-CAM-1, I-CAM-1), CD-69, angiopoietin-2 and MMP-10. We also investigated the effect of jararhagin on expression of adhesion molecules in the surface of HUVECs by flow cytometry. We did not observe increased expression of E-selectin and VCAM-1 molecules on the surface of HUVECs compared with control. Jararhagin did not increase the release of soluble chemokine IL-8 in HUVECs supernatant. Our results suggest that jararhagin binds to endothelial cells, but the cellular receptor involved in this effect remains unclear. This work contributes to the literature highlighting the participation of important genes within the inflammatory context triggered by jararhagin on endothelial cells.

Echinometra lucunter, o ouriço-do-mar responsável por 50% dos acidentes por animais marinhos, causa inflamação e dor quando os espinhos entram na pele, efeitos atribuídos ao trauma mecânico, além de acidentes por ingestão de ovas. O líquido celômico e o extrato aquoso de espinhos foram fracionados e purificados até a obtenção de moléculas puras, que foram testadas em modelos de inflamação. Foram feitas análises histológicas do espinho e de atividade enzimática do extrato de espinho. Foi isolada uma molécula do espinho e um peptídeo do líquido celômico, que causaram inflamação e dor. Foi verificada atividade enzimática de catepsina B/X. Foi observada uma estrutura histológica organizada no espinho, com células entre a porção calcificada, algumas contendo grânulos eletrodensos com conteúdo protéico, típicas secretoras. Conclui-se que o espinho e o líquido celômico de E. lucunter possuem toxinas inflamatórias, que participam do envenenamento e o espinho tem células secretoras de toxinas. A catepsina pode auxiliar no mecanismo de reparação do espinho, quando quebrado. / Echinometra lucunter, the sea urchin responsible for 50% of marine animals accidents, cause inflammation and pain by the spine penetration, effects attributed to the mechanical trauma. Accidents were reported after the ingestion of raw. The celomic fluid and spines were fractionated and purified, procedure repeated until pure molecules were obtained, tested for inflammation models. Histological analyses and enzymatic assays were performed. A molecule from spines and a peptide from the celomic fluid caused inflammatory effects. Moreover, a cathepsin B/X activity could be identified in the spines. An organized histological structure in the spine was observed, with cells embedded in a calcified matrix, as well as granulous cells displaying proteic contents, typical of secretory cells. It was possible to conclude that the spine and the celomic fluid of E. lucunter do contain inflammatory toxins that prolong the spine puncturing event itself, and the spine possesses a toxin secretory structure. The cathepsin would be present in a mechanism of tissue remodeling.

Escherichia coli produtoras de toxina de Shiga (STEC) são consideradas importantes patógenos de origem alimentar que apresentam o trato intestinal de ruminantes domésticos, principalmente bovinos, seu reservatório natural. Esses microrganismos estão associados a doenças severas em humanos, tais como colíte hemorrágica (CH) e síndrome urêmica hemolítica (SHU). Este trabalho teve como objetivos avaliar a ocorrência de STEC em diferentes fontes, ambientais ou não, da criação e abate de bovinos confinados. Além disso, detectar a presença dos genes stx1, stx2, ehxA e eaeA; identificar cepas O157:H7 através da pesquisa do gene uidA; evidenciar a capacidade de produção de Stx e de Eh; identificar variantes de stx e de eaeA; e determinar os sorotipos e a diversidade genética das cepas de STEC. A avaliação da presença dos genes (stx1, stx2, ehxA, eaeA e uidA) e da produção de Eh foi utilizada como triagem para a seleção de cepas possivelmente patogênicas, sendo que do total de 628 isolados avaliados, foram selecionadas 50 cepas STEC e 12 consideradas como EPEC atípicas. Das STEC, 76% foram isolados provenientes de amostras de fezes, enquanto 18% foram de amostras de carcaças e 6% de amostras de água da baia. Seis cepas isoladas de fezes e 1 de carcaça foram sorotipificadas como O157:H7, todas positivas para a presença do gene uidA. Além do sorogrupo O157, nenhum outro, dentre os principais causadores de surtos e casos esporádicos de CH e SHU, foi detectado. Das 30 cepas que apresentaram resultado positivo no ensaio de citotoxicidade em células Vero, 96,7% apresentaram gene para a produção de Stx. Em 17 das STEC foi possível identificar o tipo de Stx produzida, através de ensaio imunocromatográfico, sendo que todas apresentaram os genes correspondentes à toxina identificada, com exceção de uma cepa de carcaça que foi positiva para a produção de ambas as toxinas, mas apresentando apenas o gene stx2. Através da análise por PFGE, observou-se a disseminação e permanência de cepas STEC entre os animais. Dentre as 50 cepas STEC, 28% foram positivas para a variante Stx2d ativável e das 21 cepas eaeApositivas apenas em 8 foram detectadas variantes desse gene, sendo 7 positivas para eae-&#947; e a outra cepa positiva para eae-&#946;). Através dos resultados obtidos, podemos dizer que a pesquisa do gene uidA pode ser considerada uma ótima ferramenta na triagem de isolados do sorotipo O157:H7. Por outro lado, o gene ehxA e a produção de Eh não se mostraram como bons marcadores para pesquisa de cepas Stx positivas. Houve uma ampla diversidade de sqrotipos/sorogrupos entre as cepas STEC típicas. É importante salientar que, neste estudo, STEC O157:H7 foi detectada pela primeira vez no Brasil em amostra de carcaça de bovino criado em confinamento. A detecção de cepas STEC em amostras de fezes e principalmente em amostras de carcaças de bovinos demonstra um potencial risco à saúde pública, uma vez que tais cepas podem contaminar e chegar viáveis ao produto final. / Shiga toxin (Stx)-producing Escherichia coli (STEC) are considered important foodborne pathogens that have the intestinal tract of ruminants, in particular cattle, as reservoir. These microorganisms are associated with severe human diseases as hemorrhagic colitis (HC) and hemolytic-uremic syndrome (HUS). The aims of this research were to evaluate the occurrence of STEC from different sources during the feedlot cattle breeding and slaughtering; detecting the presence of stx1, stx2, ehxA and eaeA genes; identifying O157:H7 strains through uidA; evidencing Stx and Eh production capacity; identifying stx and eaeA variants and determining STEC strains serotypes and genetic diversity. The potentially pathogenic strains were screened by detection of stx1, stx2, ehxA, eaeA and uidA, and Eh production, amongst 628 isolates studied. Fifty isolates were identified as STEC and 12 others as atypical EPEC. Among the STEC isolates, 76% were from feces, 18% from carcasses and 6% from water samples. Six strains isolated from feces and one from carcass were serotyped as O157:H7, ali being positive for the uidA. No other serogroup linked to outbreaks or sporadic cases of HC and HUS were found. From the 30 strains that showed cytotoxic effect on Vero cells, the great majority (96.7%) was positive for stx. Using an immunochromatographic assay, it was possible to identify the type of Stx produced by 17 out of the 50 STEC strains. All but one of these strains harbored the gene correspondent to the identified toxin. The other strain, even though producing both toxins, presented only stx2. It was possible to determine by PFGE the dissemination and persistence of STEC strains among the animals. 14/50 (28%) STEC strains were positive for the variant Stx2d activatable. Amongst 21 eaeA-positive strains, the variants of this gene were detected only in eight, being seven positive for eae-&#947; and the other eae-&#946;. The results showed that uidA gene can be considered an excellent tool for screening O157:H7 strains. On the other hand, ehxA and Eh production, could not be considered as good markers for Stx-positive strains detection. A great diversity of serotypes/serogroups was observed among typical STEC strains. It is important to notice that this is the first report of O157:H7 strains in carcasses trom feedlot cattle in Brazil. The detection of STEC strain in fecal samples and in carcasses trom feedlot cattle evidences the potential public health risk, once these strains can contaminate the final product.

O setor agropecuário responde atualmente por cerca de 9,2% do Produto interno bruto (PIB) brasileiro, sendo que a cana-de-açúcar ocupa cerca de 9% da área cultivada, fato que lhe confere especial relevância com relação ao desenvolvimento nacional. Os dois produtos mais importantes desta cultura são o açúcar e o álcool etílico produzido por fermentação com leveduras. Durante o processo de fermentação alcoólica, o fermento sofre inúmeras reciclagens e interferências externas advindas do caldo, do ambiente e de outras fontes, tornando-se vulnerável à contaminação por outros microrganismos e mesmo leveduras indesejáveis. Métodos de monitoramento microbiológico que possibilitem a discriminação das linhagens de forma rápida e inequívoca, além de baratos, são altamente desejáveis. A utilização de meios diferenciais e seletivos, métodos bioquímicos e análise molecular tem se mostrado eficientes, porém são demorados e dispendiosos. A reação ‘killer’ é um fenômeno descoberto há 40 anos em S. cerevisiae, e resultados satisfatórios já foram obtidos na caracterização de leveduras, considerando-se o perfil de sensibilidade ‘killer’. O padrão de sensibilidade às toxinas killer foi utilizado nesse projeto em leveduras industriais (isoladas de processo fermentativo para produção de etanol). Os dados gerados com os testes de sensibilidade às toxinas Killer geraram polimorfismos entre as linhagens, mesmo em nível intra-específico, validando a metodologia na biotipagem das leveduras. As informações obtidas subsidiam o desenvolvimento de uma metodologia de biotipagem aplicável para o monitoramento microbiológico na indústria sucro-alcooleira, com a seleção de nove leveduras killer contra as quais as leveduras industriais apresentaram um perfil característico de sensibilidade, dependendo do grupo ao qual pertencem (S. cerevisiae ou não Saccharomyces). Finalmente, vale citar que os testes foram corroborados pelos resultados obtidos com a taxonomia clássica e pelos métodos de biologia molecular com reações de PCR (Polymerase Chain Reaction) e RAPD (Random Amplified Polimorphism DNA). / Agriculture is an important sector in the economy of Brazil. The sugar cane occupies 9% of the cultivated area in this country. The most important products from the sugar cane industry are sugar and alcohol, the latest produced by fermentative process by yeasts. During the fermentation the yeast population changes due to the interferences coming from the sugar cane juice or other sources, turning the process susceptible to undesirable contaminations. In this way, fast, reliable and cheap methods for microbiological monitoring can be helpful. Selective culture media, biochemical tests and molecular analyses have been used but they are time-consuming or expensive. The killer phenomenon discovered initially in Saccharomyces cerevisiae have shown interesting results to yeast biotyping. The sensibility pattern to different killer toxins was used to make a “fingerprinting” and successfully separate different strains of yeasts. This method was corroborated by classical taxonomy and molecular biology results (PCR and RAPD-PCR). The results obtained gives support to development of a methodology useful on fermenting microbiologic monitoring with the selection of nine strains of killers yeasts with highly discrimination between industrial bakker yeasts and contaminants of the fermentation process.