O estudo de venenos de artrópodes é de grande interesse para melhorar os tratamentos contra envenenamentos e oferece uma ótima ferramenta para melhor compreensão dos sistemas nervoso e imunológico, coagulação sanguínea e respostas inflamatórias. As abelhas são um dos animais venenosos mais estudados e a elucidação do seu proteoma é de interesse na elucidação de reações tóxicas e alérgicas a ferroadas. O número de acidentes envolvendo estes insetos é crescente, tendo ultrapassado 20.000 notificações entre 2001 e 2006 em todo o país e, apesar disso, não há um tratamento específico para estas vítimas, nem mesmo uma identificação completa dos antígenos presentes nesse veneno. O perfil protéico descrito até então apresenta cerca de 40 proteínas. O objetivo deste trabalho foi identificar o perfil protéico do veneno de abelhas utilizando a união da abordagem proteômica e da cromatografia de afinidade. Identificar também as proteínas alergênicas deste veneno e algumas modificações pós-traducionais como fosforilação e glicosilação. Além disso, um soro antiveneno específico foi produzido e sua ação neutralizadora testada. O veneno de abelhas foi separado por cromatografia de afinidade utilizando o soro antiveneno imobilizado em coluna de Sepharose 4B. Para identificação das proteínas foram utilizadas técnicas de 2D-SDS-PAGE, MALDI TOF/TOF e nanoESI-LC/MS-MS. Ensaios de Western Blotting foram realizados para identificar as proteínas alergênicas e fosforiladas. A utilização da cromatografia de afinidade permitiu a identificação 2 de proteínas pouco abundantes. Foram identificadas 54 proteínas, dentre as quais 9 nunca haviam sido descritas neste veneno, como MRJP-2, alfaglicosidase, transferinas, proteases, quinases e um inibidor de protease. Após a identificação destas proteínas foi possível propor um provável mecanismo de ação deste veneno. Dentre as proteínas identificadas como alergênicas, a MRJP-8 foi identificada pela primeira vez, juntamente com fatores relacionados ao PDGF e VEGF. Os resultados dos ensaios de neutralização de atividades citotóxicas, hemolíticas e miotóxicas mostraram a eficiência do soro antiveneno produzido. Chegou-se a um volume de 5,7 mL de soro antiveneno necessários para neutralizar a ação tóxica provocada por 100 ferroadas de abelhas. Este valor está na mesma faixa de eficiência dos melhores antivenenos (ofídicos, aracnídicos e escorpionídicos) produzidos no Brasil e no mundo. O lote de soro antiveneno produzido mostrou resultados satisfatórios para ser utilizado nos testes clínicos / The aim of this work was to identify the protein profile of honeybee venom, and detect allergenic proteins and post-translational modifications. Furthermore specific antivenom was produced and potency tests were performed in order to check its power of neutralization of toxic activities of venom. They were identified 54 proteins, 9 that have never been reported before in this venom. After identification of these proteins it was possible to outline a feasible mechanism of action of venom. For the first time MRJP-8, transferrin, PDGF and VEGF factors were identified as allergenic. Results of neutralization of citotoxic, hemolytic and myotoxic activities showed the efficacy of antivenom that had satisfactory results to be tested in clinical assay

A Nattectina é uma toxina isolada do veneno de Thalassophryne nattereri que possui homologia com lectinas tipo C. Este estudo consistiu em avaliar a ação da Nattectina sobre as funções de macrófagos e a influência de citocinas Th1/Th2 nessa ativação. Nossos resultados mostram que a Nattectina induziu o aumento da expressão de moléculas coestimuladoras dependente da sinalização MAPK p38 e PI3K em macrófagos derivados da medula óssea, e também um aumento na capacidade endocítica e expressão de MHC de classe II dependentes da sinalização ERK1/2 e da ligação da Nattectina ao carboidrato. Verificamos ainda que alterações induzida pela Nattectina nos macrófagos são consistentes com a ativação clássica M1 dependente de IL-12 e IFN-<font face=\"Symbol\">g, e regulada negativamente por IL-4, IL-10 e IL-13. Por fim, verificamos uma ação coadjuvante da IL-4 com IFN-<font face=\"Symbol\">g na mobilização de SPMs (Small Peritoneal Macrophages) para cavidade peritoneal e na ativação de macrófagos. Dessa forma, a Nattectina pode ser considerada um importante agente imunomodulador capaz de modular as funções de macrófagos. / Nattectin is a toxin isolated from Thalassophryne nattereri fish venom that has homology with C-type lectin. This study was carried out to evaluate the action of Nattectin on macrophage functions and the influence of Th1/Th2 cytokines in this activation. Our results show that Nattectin induced the increased expression of costimulatory molecules dependent on MAPK p38 and PI3K signaling in bone marrow-derived macrophages, and also an increase in endocytic capacity and MHC class II expression dependent on ERK1/2 signaling and binding of Nattectin to carbohydrate. We also found that modifications induced by Nattectin in macrophages are consistent with classical (M1) activation of macrophages dependent on IL-12 and IFN-<font face=\"Symbol\">g cytokines, and negatively regulated by IL-4, IL-10 and IL-13. Finally, it was demonstrated an adjuvant role of IL-4 with IFN-<font face=\"Symbol\">g in mobilization of SPMs (Small Peritoneal Macrophages) to peritoneal cavity and also in macrophage activation. Thus, Nattectin can be considered an important immunomodulatory agent able to modulate macrophage functions.

Os avanços tecnológicos vêm contribuindo cada vez mais nas áreas biológicas e científicas oferecendo ferramentas computacionais e sistemas específicos que em análise de dados in silico fornecem resultados rápidos e confiáveis. O presente projeto propõe o desenvolvimento de um portal na Internet para instalação e utilização de um banco de dados laboratoriais das principais serpentes brasileiras com seus respectivos venenos e antivenenos naturais, e a análise dos dados obtidos em ensaios farmacológicos, e bioquímicos. Utilizando a via de comunicação e interação mais simples atualmente, a Internet permite o compartilhamento de dados entre comunidades de pesquisadores, viabilizando recursos e tempo, além de permitir uma significante interação entre pesquisadores de todo o mundo, principalmente brasileira, na troca de informações e compartilhamento de dados. Dados elementares relacionados às serpentes foram armazenados no banco de dados, bem como as atividades tóxicas, farmacológicas e enzimáticas dos componentes dos venenos, e ainda, as aplicações biotecnológicas dos produtos que podem ser obtidos destes venenos, abrangendo ainda dados clínicos e valores estatísticos dos acidentes ofídicos. Aspectos bioquímicos dos ensaios realizados em laboratório permitiram a construção de uma ferramenta para análise comparativa de estruturas primárias de PLA2s, depositadas em bancos de dados internacionais. Além da interatividade entre pesquisadores, em Fóruns de Discussões, o sistema conta com listas dos principais artigos publicados em periódicos indexados, e devidamente atualizados periodicamente, com revisões bibliográficas. / Technological advances have been contributing, more and more, with biological and scientific areas, offering computational tools and specific systems which in silico data analysis supply reliable and fast results. The present project considers the development of an Internet portal for installation and use of laboratory data base for the main Brazilian serpents, with its respective venom and natural anti-venom, and the analysis of obtained data in pharmacological assays and biochemists. Using the easiest way of communication and interaction, the Internet allows sharing of data and information between communities of researchers around the world, especially for Brazilian researchers, making resources and time possible. Elementary data about serpents have been stored in the data base, as well as toxic, pharmacological and enzymatic activities of venom components, besides biotechnological applications of the products that can be obtained from these venom, enclosing clinical data and statistical values of ophidian accidents. Biochemists aspects of the assays carried through in laboratory allowed the construction of a comparative analysis tool for primary structures of PLA2s, deposited in international data bases. Beyond interactivity between researchers, in discussion forums, the system counts with lists of main articles published in indexed periodic, duly and constantly updated with bibliographical revisions.

No Brasil, a espécie Tityus serrulatus (Ts) é a responsável pela maioria dos acidentes de envenenamento com escorpiões, bem como pela maior incidência de acidentes ocasionados por animais peçonhentos. Isso ocorre devido ao fato desta espécie possuir somente fêmeas, realizando uma reprodução assexuada (partenogênese), facilitando assim sua proliferação. Atualmente, existem 16 diferentes toxinas descritas provenientes da peçonha de Ts, sendo a Ts1 a mais abundante na peçonha solúvel. Dentre estas toxinas, as neurotoxinas com ação em canais para sódio e potássio são as que despertam maior interesse da comunidade científica, devido aos seus efeitos no envenenamento e especificidades por canais iônicos. As neurotoxinas com ação em canais para potássio são compostas por uma alfa-hélice e três fitas-beta antiparalelas, e são constituídas por 23-43 resíduos de aminoácidos. Essas estão classificadas em quatro famílias (?-, ?-, g- e k-KTx). A família ?-KTx é a de maior relevância e está dividida em 21 subfamílias. Estas toxinas com alta especificidade para diferentes subtipos de canais para sódio e potássio são de extrema importância, pois podem ser utilizadas como ferramentas terapêuticas específicas para células-alvo. Até o momento, nosso grupo realizava o isolamento dessas toxinas utilizando como primeira etapa de purificação a cromatografia da peçonha em coluna de CM-Celulose-52, segundo protocolo descrito por Arantes e colaboradores (1989). O presente trabalho padronizou um novo método de fracionamento inicial da peçonha utilizando a mesma coluna, porém incorporando o uso de CLAE (Cromatografia Liquida de Alta Eficiência), onde foi possível observar um perfil cromatográfico semelhante ao anterior (XIII Frações), porém com maior reprodutibilidade e praticidade. Algumas frações do método anteriormente descrito foram subdivididas em duas (VIA-VIB, VIIIA-VIIIB, IXA-IXB e XIA-XIB), demonstrando que o novo procedimento também apresenta melhor resolução dos componentes da peçonha. Utilizando o novo método, foram purificadas as toxinas Ts6 e Ts7. Os efeitos dessas toxinas foram avaliados em 14 diferentes tipos de canais para potássio (Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.4, Kv1.5, Kv1.6, Kv2.1, Kv3.1, Kv4.3, Kv7.1, Kv7.2, Kv7.4, hERG e Shaker), expressos em células de oócitos de Xenopus laevis, através da técnica de voltage-clamp com dois microeletrodos. A toxina Ts6 (1?M) demonstrou ter ação em 11 tipos de canais (Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.5, Kv1.6, Kv4.3, Kv7.1, Kv7.2, Kv7.4, hERG e Shaker), porém nos canais Kv1.2, Kv1.3 e Shaker sua ação bloqueadora foi mais intensa. Através de experimentos de dose-resposta foi possível comprovar tal seletividade, demonstrando que a toxina Ts6 atua em quantidades extremamente baixas em ambos os canais (IC50 Kv1.2 = 6,19 ± 0,35 nM /IC50 Kv1.3 = 0,55 ± 0,20 nM). A toxina Ts7 (1?M) demonstrou ter ação em 11 tipos de canais para K+ (Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.4 Kv1.5, Kv1.6, Kv2.1, Kv3.1, Kv7.1, hERG e Shaker), porém a ação de bloqueio em vários subtipos de canais não apresentou diferenças significativas, mostrando baixa seletividade entre os canais analisados. Este trabalho foi de Resumo ii extrema importância por melhorar a reprodutibilidade, praticidade e resolução do método de fracionamento da peçonha de Ts, bem como por fornecer uma avaliação eletrofisiológica criteriosa das toxinas Ts6 e Ts7 em diferentes subtipos de canais para potássio. O presente estudo demonstra a potencial aplicação da toxina Ts6, seletiva para canais Kv 1.3, para o tratamento de doenças autoimunes. Além disso, indica o uso das toxinas Ts6 e Ts7 como ferramentas para o estudo de características estruturais e funcionais de canais para potássio. / In Brazil, Tityus serrulatus (Ts) species is the responsible for the most scorpion accidents and also for the major incidence of accidents caused by venomous animals. About 16 different toxins of Ts venom have been listed so far, being Ts1 the major one. Among these toxins, the neurotoxins with action on sodium and potassium channels are the most interest in the scientific community, due to their effect in the envenomation and ion channel specificity. The neurotoxins with action on potassium channels are composed of an ?-helix and three ?-strands formed by 23-43 amino acid residues. They are classified into four families (?-, ?-, g- and ?- KTx). The ?-KTx family is the most relevant and is divided into 21 subfamilies. These toxins with high specificity for different subtypes of sodium and potassium channels are very important, because they can be used as therapeutic tools to specific target cells. Until now, the fractionation of these toxins was done using a CM-Cellulose-52 column, according to the protocol of Arantes and co-workers (1989). The present work standardized a new method of isolation using the same column, but incorporated the use of HPLC (High Performance Liquid Chromatography), in which was observed a chromatographic profile such as the previous one (XIII Fractions), however with high resolution and more practical. Some fraction of the previous method were divided in two subfractions (VIA-VIB, VIIIA-VIIIB, IXA-IXB e XIA-XIB), showing that the new method also present high resolution. Using the new method, it was isolated the Ts6 and Ts7 toxin. The effects of these toxins were evaluated in 14 different types of potassium channels (Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.4, Kv1.5, Kv1.6, Kv2.1, Kv3.1, Kv4.3, Kv7.1, Kv7.2, Kv7.4, hERG and Shaker), which were expressed in Xenopus laevis oocytes using the voltage-clamp technique with twomicroelectrodes. The Ts6 toxin (1?M) shows to act on 11 types of potassium channels (Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.5, Kv1.6, Kv4.3, Kv7.1, Kv7.2, Kv7.4, hERG and Shaker), but the blocking of Kv1.2 and Kv1.3 was significantly more intense. Using dose-response experiments, it was possible to confirm this selectivity, in which Ts6 demonstrates to act in both channels in extremely low quantities (IC50 Kv1.2 = 6,19 ± 0,35 nM /IC50 Kv1.3 = 0,55 ± 0,20 nM). The Ts7 toxin (1?M) shows to act on 11 types of potassium channels (Kv1.1, Kv1.2, Kv1.3, Kv1.5, Kv1.6, Kv4.3, Kv7.1, Kv7.2, Kv7.4, hERG and Shaker), but the blocking action on multiple subtypes channels showed no significant differences, showing low selectivity among the channels analyzed. This work was important to improve and facilitate the method of fractionation of Ts venom, as well as evaluate the electrophysiology properties of the toxins Ts6 and Ts7 of interacting with different types of potassium channels. These studies will be essential for future applications of these toxins as drugs to treat channelpathies or as tools to study potassium channels structurally and functionally.

INTRODUÇÃO: O aracnídeo Phoneutria nigriventer, também conhecido por aranha-armadeira, possui um veneno complexo, contendo vários peptídeos que ativam canais iônicos nas células. Dentre estes, só dois neuropeptídeos, Tx2-5 e Tx2-6, destacam-se por relaxar o músculo liso trabecular do corpo cavernoso, induzindo ereção peniana em camundongos e ratos. Este efeito tem sido associado à produção de oxido nítrico pela ativação de óxido nítrico sintases. No entanto, faltam estudos mais amplos para determinar o papel de Tx2-6 na indução da ereção. OBJETIVOS: Identificar os genes diferencialmente expressos no tecido erétil de camundongos após indução da ereção pela Tx2-6 utilizando microarranjos de oligonucleotídeos. Validação dos resultados obtidos nos microarranjos por PCR quantitativa e imuno-histoquímica. MATERIAIS E MÉTODOS: Camundongos machos e adultos da linhagem Swiss foram divididos em dois grupos: controle (n=10), inoculados pela via intracavernosa com 20 l de solução salina; e tratado (n=10), os quais receberam 0,006gg/animal do peptídeo Tx2-6 diluído em 20 l de salina pela via intracavernosa. Uma hora após o início da ereção no grupo tratado todos os animais foram sacrificados e retirou-se o pênis. Este último foi dividido em dois fragmentos, uma parte do material foi congelada em nitrogênio líquido e mantida a 80°C até a extração do RNA para os experimentos de microarranjos e PCR quantitativa; outra parte foi utilizada para avaliação imuno-histoquímica. RESULTADOS: No grupo tratado a ereção foi observada 30-45 minutos após aplicação de Tx2-6 e mantida durante 120 minutos. Os camundongos de grupo controle não apresentaram nenhum indício de ereção. Nos experimentos de microarranjos, onde foram analisados 34.000 genes representando o genoma total do camundongo, identificou-se 3.803 (12,3%) genes com expressão diferencial de pelo menos ±1,5 vez entre os grupos (1.823 genes superexpressos e 1.980 genes subexpressos no grupo tratado comparado ao controle). Os genes ednrb, sparc, fn1, sstr2, pdgfr foram selecionados para validação dos microarranjos por PCR quantitativa e confirmaram a superexpressão em relação aos controles. As proteínas Fn1, Sstr2 e Pdgfr resultaram aumentadas no grupo tratado após avaliação imuno-histoquímica. CONCLUSÕES: A inoculação de Tx2-6 pela via intracavernosa alterou o perfil de expressão gênica no tecido erétil de camundongos. O número de genes superexpressos foi similar ao de genes subexpressos. Serão necessários outros estudos para entender melhor as vias moleculares que Tx2-6 afeta na indução da ereção peniana. / INTRODUCTION: The Phoneutria nigriventer arachnid, also known as armed-spider, has a complex venom, composed by several peptides that affect cellular ionic channels. Among these, only two neuropeptides, Tx2-5 and Tx2-6 induce penile erection in mice and rats and this effect has been associated with the production of nitric oxide by the activation of nitric oxide synthases. Moreover, there is a scarcity of studies focusing on the role of Tx2-6 in the induction of erection. OBJECTIVES: To identify the differently expressed genes in the erectile tissue of mice after erection induction by Tx2-6 using oligonucleotide microarrays. To validate microarray results by quantitative PCR and immunohistochemistry. MATERIALS AND METHODS: Swiss adult male mice were divided in two groups: control (n=10) were injected intracavernously with 20 gl of saline solution; and treated (n=10) were injected intracavernously with 0.006gg/mouse of the Tx2-6 peptide diluted in 20 gl of saline solution. After checking the penile erection in the treated group, all mice were sacrificed one hour after the beginning of erection for the removal of the penis. Penile organ was divided into two fragments, one piece was immediately frozen in liquid-nitrogen and stored at -80°C until RNA extraction to make the microarray and quantitative PCR experiments; the other was reserved for immunohistochemistry analysis. RESULTS: In the treated group, erection was noticed 30-45 minutes after Tx2-6 inoculation and lasted for 120 minutes. Control mice did not present any sign of erection. Considering as differentially expressed genes with a ±1.5 fold expression difference, of the 34,000 genes on the microarray we identified 3,803 (12.3%) genes differentially expressed between the groups (1,823 genes up-regulated and 1,980 genes down-regulated in the treated group compared to controls). The ednrb, sparc, fn1, sstr2, pdgfr genes were selected for validation of microarray results by using quantitative PCR and confirmed the up-regulation when compared to controls. After immunohistochemistry analysis the Fn1, Sstr2 and Pdgfr proteins were found increased in the treated group. CONCLUSIONS: The intracavernous inoculation of Tx2-6 modified the gene expression profile of erectile tissue of mice. The number of upregulated and down-regulated genes was similar. Further studies are needed to understand the molecular pathways that Tx2-6 affect to induce penile erection.

Bacillus thuringiensis (Bt) é uma bactéria entomopatogênica encontrada em várias partes do mundo e tem a capacidade de produzir cristais durante a fase estacionária do crescimento. Esses cristais são toxinas compostas por proteínas ativas contra uma ampla variedade de fases imaturas de insetos. As toxinas do Bt têm sido usadas como bioinseticidas por décadas no controle de insetos das ordens Coleoptera, Lepidoptera e Diptera, e algumas toxinas já foram selecionadas como efetivas contra ácaros, nematoides e insetos sugadores de floema da ordem Hemiptera, como os afídeos. Recentemente, foi comprovada a patogenicidade de três isolados de Bt a outro inseto dessa ordem, o psilídeo Diaphorina citri. Esse psilídeo é vetor das bactérias Candidatus Liberibacter spp., agentes causais da principal doença dos citros: o Huanglongbing ou HLB. A descoberta da capacidade endofítica de Bt em plantas de diferentes espécies vegetais abriu perspectivas para novos estudos usando o Bt para controle de insetos sugadores, como a D. citri. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito patogênico de cada toxina Cry ou Cyt presente nestes três isolados através de isolados de Bt recombinantes expressando as toxinas individualmente. Foram montados bioensaios para confirmar a taxa de mortalidade causada por isolados de Bt contra ninfas de D. citri. Os bioensaios foram feitos usando cinco plantas de laranja doce (Citrus sinensis (L.) Osbeck) e dez ninfas de 3º ínstar de D. citri por planta, além dos controles (sem Bt). A mortalidade das ninfas foi avaliada diariamente durante cinco dias. Durante a avaliação, as ninfas mortas foram coletadas para o isolamento do Bt além da detecção do gene da toxina por PCR. No final do experimento, as folhas jovens onde as ninfas se alimentavam também foram avaliadas quanto à presença do Bt. Nossos resultados confirmaram que os isolados de Bt previamente identificados como patogênicos a D. citri causaram elevada mortalidade (em média 68-93%) em ninfas de 3º ínstar. Dentre os isolados recombinantes testados, um deles apresentou grande destaque, causando a mortalidade de 68-81% das ninfas em 48 horas e 83-93% em 120 horas. Esse isolado possui grande potencial de uso no controle biológico de D. citri através da produção de um bioinseticida ou produção de plantas de citros transgênicas. / Bacillus thuringiensis (Bt) is an entomopathogenic bacterium found in several locations around the world and has the ability to produce crystals during the stationary phase of growth. These crystals are composed of protein toxins that are active against a wide variety of insect larvae. The Bt toxins have been used for decades as biopesticides to control insects of the orders Coleoptera, Lepidoptera, and Diptera. Some toxins have been selected as effective for mites, nematodes and phloem-sucking insects of the order Hemipera, such as aphids. The pathogenicity of strains of Bt to Diaphorina citri, an hemipteran known as Asian citrus psyllid, has been recently demonstrated. This psyllid is the vector of the bacteria Candidatus Liberibacter spp., the causal agents of the main disease of citrus: Huanglongbing or HLB. The discovery of the ability of Bt strains to endophytically colonize plants of different species has opened new perspectives for studies. The aim of this work was to evaluate the pathogenic effect of each Cry or Cyt toxin present in these three isolates through the use of recombinant Bt isolates expressing each toxin individually. A series of bioassays were done in order to confirm the mortality caused by Bt strains against nymphs of D. citri. Bioassays were performed in five seedlings of Citrus sinensis (L.) Osbeck (five replicates/ bioassay) and using ten D. citri 3rd instar nymphs to each assay plant. A suspension containing Bt spores was inoculated via drench in each seedling, and five seedlings were maintained as negative control (without Bt). Mortality was assessed daily for five days. During the bioassays, dead nymphs were collected for further Bt isolation and detection by PCR. At the end of the experiment, young leaves where nymphs feed were also collected to Bt isolation and detection. Our results confirmed that the previously identified Bt isolates pathogenic to D. citri cause high mortality to 3rd instar nymphs. Among the ten recombinant isolates tested, one of them stood out, causing 68-81 % and 83-93% mortality after 48 and 120 hours of inoculation, respectively. The isolation of Bt from dead nymphs and young leaves, and PCR performed with specific primers confirmed the presence of the Bt isolates in psyllids and plants, and their involvement in psyllid mortality. This recombinant Bt with the higher mortality rate found in our results has the potential to be used as a bioinsecticide to control D. citri and the toxin gene can be used to genetic engineering of citrus.

De uma biblioteca de cDNA da glândula de veneno da cobra coral brasileira Micrurus corallinus foi isolada uma seqüência denominada NXH8. Esta seqüência de cDNA apresenta similaridade estrutural com a família de toxinas de serpentes em 'três dígitos' ricas em pontes dissulfeto. A subclasse melhor conhecida nesta família, são as alfa neurotoxinas. Uma outra seqüência distinta, denominada NXH1 e suas isoformas NXH3 e NXH7, foram isoladas anteriormente. Pertencem à mesma família de toxinas e estão presentes na mesma biblioteca. Alguns resultados da caracterização de NXH1, são utilizados neste estudo, em comparação com NXH8. Algumas características estruturais tornam a seqüência NXH8 diferente da classe usual das alfa neurotoxinas, vindo a constituir possivelmente uma nova subclasse da família. A proteína NXH8 foi expressa em diversos vetores de expressão em Escherichia coli. A proteína recombinante, expressa pelo vetor pRSET C - NXH8 foi utilizada para imunizar camundongos. O soro contra NXH8, assim como o soro anti - elapídico do Instituto Butantan, reconhece a toxina recombinante em ELISA e Western blot. O soro anti - NXH8 detecta apenas uma banda do veneno de M. corallinus em Western blot, mas apresenta reatividade cruzada com componentes do veneno de alguns elapídeos neotropicais e do velho mundo. Em contraste, dados anteriores demonstraram que o soro anti - NXH1 é específico para um componente único do veneno de M. corallinus. O veneno de M. corallinus tem alfa neurotoxinas que bloqueiam o receptor pós - sináptico nicotínico de acetilcolina nas membranas do músculo esquelético de ratos. O soro anti - NXH8 é capaz de impedir a ligação de componentes do veneno bruto a esses receptores. Já o soro contra NXH1 não apresenta a mesma capacidade inibitória. Isto indica que NXH8 tem afinidade pelo receptor nicotínico muscular de acetilcolina, ou que NXH8 compartilha de um epítopo neutralizante presente também nas alfa neurotoxinas do veneno da cobra coral M. corallinus. / A cDNA sequence encoding a putative new toxin, NXH8, was isolated from the cDNA library constructed from the venom gland of the Brazilian coral snake, Micrurus corallinus. This sequence shows a structural similarity with the snake toxin family known as 'three-fingered' toxins, a family of toxins with approximately 60 to 70 amino acids and usually 4 to 5 disulfide bonds. Irrespective of whether these proteins are functionally different, their amino acid sequences can be readily aligned, using 8 half-cystines as conserved elements, suggesting the presence of common structural features. The best known subclass of three-finger-type toxins are the curaremimetic toxins, also called alpha-neurotoxins, found in most venoms from Elapid and Sea snakes. Another toxin with a distinct sequence, known as NXH1 and its isoforms NXH3 and NXH7 had been previously isolated. They belong to the same family of toxins and were characterized from the same cDNA library. In the present study, a comparative biochemical, pharmacological and structural analyses of NXH1 and NXH8 were described. Few structural characteristics of NXH8 seem to indicate that it differs from the usual class of alpha – neurotoxins, belonging, possibly, to a new subclass of 'three-finger' toxins. The NXH8 protein was expressed in various E. coli expression vectors and the resulted recombinant toxin from pRSETC-NXH8 plasmid was used as a "toxoid" for mice immunization. The anti - NXH8 sera, as well as the anti – elapid sera from the Butantan Institute, recognized the recombinant toxin by both ELISA and Western blot assays. In contrast to the claim that anti - NXH1 sera is specific to one component of M. corallinus’s venom, the anti – NXH8 sera show cross reactivity to venom of some Neotropical and Old World elapids. The M. corallinus's venom contains alpha – toxins, which inhibit post-synaptic nicotinic acetylcholine receptor of neonatal rat skeletal muscle membrane. The anti - NXH8 serum was capable of blocking the binding of the components of the crude venom to these receptors. In contrast, the anti – NXH1 serum did not show this inhibitory effect. This indicates that either NXH8 presents affinity for muscular nicotinic acetylcholine receptor or it shares a neutralizing epitope also present in M. corallinus’s alpha – neurotoxins.

Orientador: Tomomasa Yano / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T11:52:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bernedo-Navarro_RobertAlvin_D.pdf: 2646572 bytes, checksum: 02b50bc28d5be6cddb78abfe621a047c (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Escherichia coli produtora de toxina de Shiga (STEC) é um grupo de importantes patógenos para humanos. Essas bactérias são relacionadas a várias doenças, como por exemplo, Síndrome Urêmica Hemolítica e produzem potentes toxinas denominadas toxinas de Shiga. Essas toxinas, tanto Stx1 quanto Stx2, compartilham um receptor celular comum, a globotriaosilceramida (Gb3) e exibem a mesma atividade biológica intracelular. O desenvolvimento de novos agentes neutralizantes dos danos induzidos por Stx pode representar uma estratégia promissora para o tratamento das doenças causadas por STEC em humanos. No presente estudo, nós desenvolvemos peptídeos sintéticos que exibem atividade neutralizante contra a citotoxicidade induzida por Stx tanto in vitro quanto in vivo e, além disso, que se ligam eficientemente ao receptor Gb3. O peptídeo P12-26 compete eficientemente com Stx2 para a ligação ao Gb3 in vitro. Além disso, os peptídeos PC7-12, P12-26 e PC7-30 inibiram a citotoxicidade de Stx1 e Stx2 em células Vero. Nós observamos que o peptídeo PC7-30 em forma de loop e o peptídeo P12-26 que é linear produziram as maiores porcentagens de inibição de Stx1 e Stx2 em células Vero, respectivamente. No entanto, o peptídeo P12-26 não inibiu a letalidade em camundongos, enquanto que o peptídeo PC7-30 inibiu a letalidade causada pela toxina Stx1. Nossos resultados indicam que os peptídeos P12-26 e PC7-30 são candidatos promissores para o desenvolvimento de agentes terapêuticos contra as doenças em seres humanos causadas por STEC / Abstract: Shiga toxin-producing Escherichia coli strains are important pathogens for humans. These bacteria are linked with severe diseases such as hemolytic uremic syndrome and produce potent known as Shiga toxins. These toxins, Stx1 and Stx2, share a common cellular receptor called globotriaosylceramide (Gb3) and exhibit the same intracellular biological activity. The development of new neutralizing agents for Stx-induced damage may represent a promising strategy for the treatment of diseases caused by STEC infections. In this study, we developed synthetic peptides that exhibit neutralizing activity against Stxinduced cytotoxicity both in vitro and in vivo and that bind efficiently to the Gb3 receptor. The peptide P12-26 competed efficiently with Stx2 for binding to Gb3 in vitro. Moreover, the peptides PC7-12, P12-26 and PC7-30 inhibited the cytotoxicity of Stx1 and Stx2 in Vero cells. We observed that the loop-constrained peptide PC7-30 and linear peptide P12-26 produced higher percentages of inhibition of Stx1 and Stx2 in Vero cells, respectively. However, the peptide P12-26 did not inhibit lethality in mice, whereas the loopconstrained peptide PC7-30 inhibited the lethality caused by Stx1. Our results indicate that the peptides P12-26 and PC7-30 are promising candidates for the development of therapeutic agents against diseases caused by STEC in humans / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Carlos Arturo Levi D'Ancona / Tese (Doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T10:56:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ferreira_RuiterSilva_D.pdf: 2813399 bytes, checksum: a60122cb9b6dd6b69a465a84a16f289e (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Introdução: O tratamento da incontinência urinária é aspecto importante no processo de reabilitação de pacientes portadores de lesão medular (LM). Objetivos: Os objetivos desse estudo foram avaliar o impacto na qualidade de vida (QV) e nos parâmetros urodinâmicos de pacientes portadores de LM tratados com injeção intradetrusora de onabotulinumtoxina ou uso oral de oxibutinina. Pacientes e Métodos: Sessenta e oito pacientes portadores de LM e hiperatividade detrusora neurogênica foram randomizados em dois grupos. Grupo I (n=34) receberam 15 mg/dia de cloridrato de oxibutinina por via oral e grupo II (n=34) foram tratados com injeção intradetrusora de 300U de onabotulinumtoxina em 30 pontos da parede vesical com preservação do trígono. Parâmetros urodinâmicos como capacidade cistométrica máxima (CCM), pressão detrusora máxima (Pdetmax) e complacência foram avaliados juntamente com escores de QV obtidos pelo questionário Qualiveen. As avaliações foram feitas antes da randomização dos pacientes, quatro, 12 e 24 semanas após inicio do tratamento. O nível de significância adotado foi de 5%. Resultados: Sete pacientes não completaram o estudo. Dos 61 pacientes, 49 pertenciam ao sexo masculino (80,3%) com idade média de 31,84 (DP ± 8,73) anos no grupo I e 33,54 (DP ± 11,86) anos no grupo II, p=0,839. Após 24 semanas, o aumento médio da CCM no grupo I foi de 126,24 (DP ± 62,22) ml e de 289,25 (DP ± 134,52) ml no grupo II, p<0,001. A Pdetmax apresentou redução média de 21,09 (DP ± 19,95) cm H2O no grupo I e de 48,75 (DP ± 29,34) cm H2O no grupo II, p<0,001. A complacência vesical apresentou aumento médio de 6,85 (DP ± 5,13) ml/cm H2O no grupo I e de 25,82 (DP ± 24,00) ml/cm H2O no grupo II, p=0,006. O número de perdas urinárias em 24h apresentou diminuição média de 2,34 (DP ± 1,89) episódios no grupo I e de 7,55 (DP ± 3,52) episódios no grupo II, p<0,001. Os escores do impacto específico dos problemas urinários do questionário Qualiveen apresentaram redução média de 0,26 (DP ± 0,33) no grupo I e de 1,48 (DP ± 0,70) no grupo II, p<0,001. Os escores do índice de qualidade de vida apresentaram aumento médio de 0,12 (DP ± 0,26) no grupo I e de 0,63 (DP ± 0,45) no grupo II, p<0,001. Conclusão: A injeção intradetrusora de onabotulinumtoxina e a administração oral de oxibutinina promoveram melhora significativa nos parâmetros urodinâmicos e na qualidade de vida de pacientes portadores de hiperatividade detrusora devido a LM. Porém, a comparação dos dois tratamentos demonstrou que a onabotulinumtoxina apresentou resposta significativamente melhor quando comparada à oxibutinina / Abstract: Introduction: The treatment of urinary incontinence is an important issue in the rehabilitation of patients with spinal cord injury (SCI). Objectives: The goals of this study were to evaluate the impact on Quality of Life (QoL) and urodynamic parameters on patients with SCI who were treated with intradetrusor injections of onabotulinumtoxinA or oral oxybutynin. Patients and Methods: Sixty-eight patients with SCI and neurogenic detrusor overactivity were randomized into two groups. Patients in Group I (n=34) received 15 mg/day oxybutynin orally, and patients in Group II (n=34) were treated with intradetrusor injections of 300U onabotulinumtoxinA into 30 different segments of the urinary bladder wall, sparing of the trigone. Urodynamic parameters such as maximum cystometric capacity (MCC), maximum detrusor pressure (Pdetmax) and bladder compliance were evaluated, and QoL scores were obtained by applying the Qualiveen questionnaire. Evaluations were performed prior to randomisation and at 4, 12 and 24 weeks of treatment. The significance level was set at 5%. Results: Seven patients did not complete the study. Of the 61 patients, 49 (80.3%) were male. The mean age of patients was 31.84 (SD ± 8.73) years old in group I and 33.54 (SD ± 11.86) years old in group II (p=0.839). After 24 weeks, the mean increase in MCC in group I was 126.24 (SD ± 62.22) mL compared to 289.25 (SD ± 134.52) mL in group II (p<0.001). We determined a mean decrease of 21.09 (SD ± 19.95) cm H2O in Pdetmax in group I compared to 48.75 (SD ± 29.34) cm H2O in group II (p<0.001). Furthermore, the mean increase in bladder compliance was 6.85 (SD ± 5.13) mL/cm H2O in group I compared to 25.82 (SD ± 24.00) mL/cm H2O in group II (p=0.006). A mean decrease in 24-hour urine leakage of 2.34 (SD ± 1.89) episodes occurred in group I, with a mean decrease of 7.55 (SD ± 3.52) episodes in group II (p<0.001). Scores in the Qualiveen questionnaire that focused on the specific impact of urinary dysfunction were decreased by a mean of -0.26 (SD ± 0.33) in group I and -1.48 (SD ± 0.70) in group II (p<0.001). Importantly, the Qualiveen scores related to the QoL index increased by a mean of 0.12 (SD ± 0.26) in group I and 0.63 (SD ± 0.45) in group II (p<0.001). Conclusions: Both intradetrusor injections of onabotulinumtoxinA and oral administration of oxybutynin resulted in a significant improvement in urodynamic parameters and QoL in patients with detrusor overactivity due to SCI. However, a comparison of the two treatments showed a significantly improved response with onabotulinumtoxin. A compared to oxybutynin / Doutorado / Cirurgia / Doutor em Cirurgia

Global change poses new threats for life in the oceans forcing marine organisms to respond through molecular acclimatory and adaptive strategies. Although bivalve molluscs are particularly tolerant and resilient to environmental stress, they must now face the challenge of more frequent and severe Harmful Algal Blooms (HABs) episodes. These massive outbreaks of microalgae produce toxins that accumulate in the tissues of these filter-feeder organisms, causing changes in their gene expression profiles, which in turn modify their phenotype in order to maintain homeostasis. Such modifications in gene expression are modulated by epigenetic mechanisms elicited by specific environmental stimuli, laying the foundations for long-term adaptations. The present work aims to examine the links between environmental stress in bivalve molluscs (with especial emphasis on Harmful Algal Blooms) and specific epigenetic marks triggering responses through modifications in gene expression patterns. Overall, a better understanding of the molecular strategies underlying the conspicuous stress tolerance observed in bivalve molluscs will provide a framework for developing a new generation of biomonitoring strategies. In addition, this strategy will represent a valuable contribution to our knowledge in acclimatization, adaptation and survival. With that goal in mind, the present work has generated transcriptomic data using RNA-Seq and microarray technologies, facilitating the characterization and investigation of the epigenetic mechanisms used by the Mediterranean mussel Mytilus galloprovincialis during responses to HAB exposure. That information was made publicly available through a specialized online resource (the Chromevaloa Database, chromevaloa.com) assessing the response of chromatin-associated transcripts to Okadaic Acid. Specific epigenetic marks have been assessed under lab-controlled exposure experiments simulating the natural development of the HAB Florida Red Tide (FRT). Results demonstrate a role for the phosphorylation of histone H2A.X and DNA methylation in the response to FRT in the Eastern oyster Crassostrea virginica. Lastly, the study of co-expression networks based on RNA-Seq data series from the Pacific oyster Crassostrea gigas reveals dynamic transcriptomic patterns that vary with time, stressor and tissue. However, consistent functional profiles support the existence of a core response to general conditions of environmental stress. Such response involves metabolic and transport processes, response to oxidative stress and protein repair or disposal, as well as the activation of immune mechanisms supporting a tightly intertwined neuroendocrine-immune regulatory system in bivalves.