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Elucidation of Inositol Polyphosphate Dephosphorylation Pathways using Stable-Isotope Labelling and NMR spectroscopy

Nguyen Trung, Minh 29 September 2023 (has links)
Inositolpolyphosphate (InsPs) bilden eine ubiquitäre Gruppe an hochphosphorylierten, intrazellulären Signalmolekülen in eukaryotischen Zellen. Trotz deren Beteiligung an unzähligen biologischen Prozessen bleibt die Detektion von InsPs (insb. einzelner Enantiomere) eine Herausforderung, da die momentan verfügbaren Analysemethoden immer noch limitiert sind. In der vorliegenden Arbeit wird die stabile Isotopenmarkierung von myo-Inositol (Ins) und InsPs in Kombination mit Kernspinresonanzspektroskopie (engl. Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, NMR) erkundet, um diese Lücke zu schließen. Die Abhängigkeit von NMR-Daten und chemischer Struktur erlaubte die Analyse komplexer Mixturen aus InsPs aus in vitro-Experimenten und biologischen Proben. Durch stereospezifische 13C-Markierung konnten sogar Enantiomere voneinander unterschieden werden. Mit Hilfe dieser Methode wurden mehrere InsP-Stoffwechselwege untersucht. Als Erstes wurde das menschliche, Phytase-artige Enzym MINPP1 (engl. Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatase 1) detailliert in vitro und in lebenden Zellen charakterisiert. Dabei wurde ein bisher unbeschriebener InsP-Stoffwechselweg in menschlichen Zellen erstmals beschrieben. Als Zweites wurden InsP verdauende Bakterien aus der menschlichen Darmflora untersucht, sodass der Abbauweg von Inositolhexakisphosphat beleuchtet werden konnte. Als Drittes wurden DUSP-Enzyme (engl. Dual-Specificity Phosphatases) identifiziert und in vitro charakterisiert, die in der Lage sind, die Phosphoanhydrid-Bindung von Inositolpyrophosphaten (PP-InsPs) zu spalten. Die vorliegende Arbeit demonstriert, dass 13C-Markierung in Verbindung mit NMR ein mächtiges Werkzeug darstellt, um InsP-Stoffwechselvorgänge zu untersuchen. / Inositol polyphosphates (InsPs) comprise a ubiquitous group of densely phosphorylated intracellular messengers in eukaryotic cells. Despite their contributions to a myriad of biological processes the detection of InsPs remains challenging to this day, especially with regards to differentiating enantiomers, as the available analytical toolset is still limited. In this thesis the use of stable isotope labelling of myo-inositol (Ins) and InsPs is explored to address this shortcoming. Combining 13C-labelling and nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) provides both enhanced sensitivity and makes use of NMR’s strong structure-data dependency. This enabled the deconvolution of complex mixtures of InsPs from in vitro experiments or biological samples. With stereo-specific 13C-labels InsP mixtures could be resolved to individual enantiomers. Using this technique several InsP metabolic pathways were examined. Firstly, the human phytase-like enzyme Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatase (MINPP1) was characterized in depth in vitro and in living cells, establishing a hitherto undescribed inositol polyphosphate metabolic path in humans. Secondly, inositol phosphate digesting bacteria isolated from the human gut microbiome were investigated, shedding light on the metabolic fate of inositol hexakisphosphate in the digestive track. Thirdly, a set of Dual-Specificity Phosphatases (DUSPs) were identified to be able to hydrolyze the phosphoanhydride bond of inositol pyrophosphates (PP-InsPs) and characterized in vitro. The 13C-labelling approach of InsPs in junction with NMR represents a powerful tool for the study of inositol polyphosphate metabolism. In the thesis at hand, this method has facilitated our understanding of inositol polyphosphate pathways and it will be continuing doing so in the future in several biological contexts.
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Characterization of metagenomically identified channelrhodopsins

Oppermann, Johannes 13 April 2021 (has links)
Kanalrhodopsine (ChRs), lichtgesteuerte Ionenkanäle, vermitteln phototaktische Reaktionen in beweglichen Algen und sind als optogenetische Werkzeuge zur Manipulation der Zellaktivität mittels Lichts weit verbreitet. Viele Kationen- und Anionen-leitende ChRs (CCRs und ACRs) wurden aus kultivierbaren Chlorophyten- und Cryptophytenarten identifiziert. Die meisten mikrobiellen Organismen kann jedoch nicht kultiviert werden, was zu einem unvollständigen Bild der ChR-Vielfalt führt. Die Metagenomik öffnet die Tür für Erkenntnisse über die Verteilung von ChRs in unkultivierten Organismen. Diese Arbeit beschreibt die biophysikalische Charakterisierung von zwei Gruppen metagenomisch identifizierter ChRs. Die MerMAIDs (Metagenomically discovered marine, anion-conducting, and intensely desensitizing ChRs) sind eine neue ChR-Familie und zeigen nahezu komplette Photostrom-Inaktivierung unter Dauerlicht. Die Photoströme lassen sich durch einen Photozyklus erklären, der zur Akkumulation eines langlebigen und nicht-leitenden Photointermediats führt. Ein konserviertes Cystein ist für dieses Phänomen entscheidend, da seine Substitution zu einer stark reduzierten Inaktivierung führt. Die Prasinophyten ChRs, die große carboxyterminale Domänen aufweisen, wurden in großen, marinen Viren identifiziert, die sie von ihren beweglichen und einzelligen Grünalgen-Wirten durch lateralen Gentransfer übernommen haben. Heterolog exprimiert, sind die viralen ChRs nur nach Ergänzung von Transportsequenzen und carboxyterminaler Kürzung funktional. Die Grünalgen- und viralen ChRs sind Anionen-leitend mit nicht-inaktivierenden Photoströmen, wenn sie in Säugetierzellen exprimiert werden, obwohl die viralen Vertreter weniger leitfähig und zytotoxisch sind. Nichtsdestotrotz repräsentiert diese ChR-Gruppe die ersten Grünalgen- und Virus-ACRs. Diese Arbeit zeigt eine breite Verteilung der ACRs unter marinen mikrobiellen Organismen und die Bedeutung der Funktionsmetagenomik bei der Entdeckung neuer ChRs. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels mediating phototactic responses in motile algae and widely used as optogenetic tools to manipulate cellular activity using light. Many cation- and anion-conducting ChRs (CCRs and ACRs) have been identified from culturable chlorophyte and cryptophyte species. However, most microbial organisms cannot be cultured, resulting in an incomplete view of the diversity of ChRs. Metagenomics opens the door to gather insights on the distribution of ChRs in uncultured organisms. Here, the biophysical characterization of two groups of metagenomically identified ChRs is described. The MerMAIDs (Metagenomically discovered marine, anion-conducting, and intensely desensitizing ChRs) represent a new ChR family with near-complete photocurrent desensitization under continuous illumination. The photocurrents can be explained by a single photocycle leading to the accumulation of a long-lived and non-conducting photointermediate. A conserved cysteine is critical for this phenomenon, as its substitution results in a strongly reduced desensitization. The prasinophyte ChRs, harboring large carboxy-terminal extensions, were identified in marine giant viruses that acquired them from their motile and unicellular green algal hosts via lateral gene transfer. Expressed in cell culture, the viral ChRs are only functional upon the addition of trafficking sequences and carboxy-terminal truncation. The green algal and viral ChRs are anion-conducting and display non-desensitizing photocurrents when expressed in mammalian cells, though the viral representatives are less conductive and cytotoxic. Nonetheless, this group of ChRs represents the first green algal and viral ACRs. This thesis highlights a broad distribution of ACRs among marine microbial organisms and the importance of functional metagenomics in discovering new ChRs.
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Structural characterization of Ni-containing metalloenzymes from archaea by X-ray crystallography and transmission electron microscopy

Ilina, Yulia 07 November 2019 (has links)
In der vorliegenden Arbeit werden zwei Enzymsysteme – Ni-haltige Kohlenmonoxid-Dehydrogenase (CODH) und [NiFe]-haltige Hydrogenase – strukturell untersucht. Im 1. Teil werden die Untersuchungen des ACDS-Komplexes aus A. fulgidus mittels Transmissionselektronenmikroskopie (Negativkontrastierung und der Kryo-Einbettung) geschildert. Die 3D-Rekonstruktion mit einer Auflösung von 29 Å wird de novo ermittelt und drei mögliche Positionen für die CODH-Untereinheit vorgeschlagen. Im 2. Teil wird die Röntgenkristallstrukturanalyse der CODH-Untereinheit des ACDS Komplexes aus A. fulgidus geschildert. Das Protein besteht aus α- und ε-Untereinheiten, die zusammen eine α2ε2-Stöchiometrie bilden (Afα2ε). Während die Gesamtstruktur von Afα2ε2 jener von M. barkeri (Mbα2ε2) ähnelt, führt der Austausch der koordinierenden Cys zu Asp und Glu zu einer Deletion des verbrückenden FeS-Zentrums. Die Rolle der ε-Untereinheit wird durch kinetische Studien untersucht. Die CO-abhängige FAD-Reduktionsaktivität von Afα2ε2 folgt einer Michaelis-Menten Kinetik. Die Mbα2ε2 hat ein ähnliches Kinetikverhalten. Im Gegensatz dazu weist die CODH-II von C. hydrogenoformans, die keine ε-Untereinheit hat, eine lineare Abhängigkeit der CO-abhängigen FAD-Reduktionsaktivität von Flavin auf. Diese Beobachtungen sind im Einklang mit der Annahme, dass die ε-Untereinheit ein Gerüst für die Flavinbindung bereitstellt. Der 3. Teil ist der F420-reduzierenden Hydrogenase aus M. barkeri (MbFRH) gewidmet. Die Struktur von MbFRH wird mittels Röntgenkristallographie bestimmt und ergibt eine dodekamerische Anordnung von ca. 1.2 MDa. Zusammen mit der etablierten Elektronenübertragungskette, beobachtet in FRH aus M. marburgensis, wird in MbFRH auch ein [2Fe2S]-Cluster und eine Fe-Stelle detektiert. Schließlich führen die schwingungsspektroskopischen Analysen zusammen mit der Röntgenkristallographie zu dem Schluss, dass MbFRH in einem bisher strukturell nicht charakterisierten, katalytisch aktiven Nia-S Zustand isoliert wird. / In this work, we structurally characterize two metal-based enzyme systems from archaea: Ni-containing CO dehydrogenase (CODH) and [NiFe] containing hydrogenase. In the first chapter we investigate, using transmission electron microscopy, the ACDS complex from A. fulgidus (AfACDS). The purified ACDS complex can be visualized as an intact globular protein particle by negative stain and vitrification techniques. The 3D reconstruction is determined de novo to 29 Å-resolution by single-particle analysis. We suggest three possible positions for the CODH subunit within ACDS by rigid-body fitting. In the second chapter we determine the X-ray crystal structure of the CODH subunit. The 220 kDa protein is composed of α- and ε-subunits that form a heterodimer with (α2ε2) stoichiometry (Afα2ε2). While the overall structure of Afα2ε2 resembles the previously reported structure of the α2ε2-subunit from M. barkeri (Mbα2ε2), the naturally-occurring exchange of the Cys to Asp and Glu results in a depletion of the bridging iron-sulfur cluster. The role of the ε-subunit is investigated by kinetics studies. CO-dependent FAD reduction activity of Afα2ε2 exhibits Michaelis-Menten type kinetics. The same kinetic type is demonstrated for the Mbα2ε2-subunit. In contrast, the ε-subunit lacking CODH-II from C. hydrogenoformans shows linear dependency between CO-dependent FAD reduction activity and flavin concentration. The data suggests that the ε-subunit provides a scaffold for the flavin binding. In the third chapter we study the F420-reducing hydrogenase from M. barkeri (MbFRH). Its structure is solved by X-ray crystallography, revealing a dodecameric arrangement of 1.2 MDa. Along with the established ET chain observed in FRH from M. marburgensis, one solvent-exposed [2Fe2S] cluster and an additional Fe metal site are detected. The combined approach of X-ray crystallography and vibrational spectroscopy reveals that MbFRH is isolated in the previously structurally uncharacterized Nia-S state.
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Molekularer Mechanismus protonenleitender Kanalrhodopsine und protonengekoppelte Zwei-Komponenten-Optogenetik

Vierock, Johannes Tobias Theodor 29 July 2020 (has links)
Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtaktivierte Ionenkanäle motiler Algen. Heterolog exprimiert erlauben sie es, Ionenflüsse durch Licht zu steuern. Bevorzugt geleitet werden von den meisten ChRs Protonen. Ausprägung und Wirkung lichtaktivierter Protonenflüsse sowie der molekulare Mechanismus protonenselektiver ChRs werden in vorliegender Arbeit untersucht und zur Entwicklung neuer optogenetischer Werkzeuge genutzt. Eine besonders hohe Protonenselektivität zeigten die grün- und rotlicht-aktivierten Kanäle CsChR und Chrimson aus den Algen Chloromonas subdivisa und Chlamydomonas noctigama. Im spektroskopisch detailliert untersuchten CrChR2 aus Chlamydomonas reinhardtii änderte sich die Protonenselektivität nach Anregung mit einem ns-Laserblitz sogar innerhalb eines Aktivierungszyklus und war insbesondere nach Öffnung des Kanals sowie in Folge der Lichtadaptation hoch. Als unentbehrlich für eine effiziente Protonenleitung erwiesen sich in allen drei Kanälen konservierte, titrierbare Reste entlang der Pore, deren individuelle Bedeutung für die Protonenleitung sich je nach Protein wesentlich unterschied. Entsprechend genügte in Chrimson der Austausch einzelner Glutaminsäuren des extrazellulären Halbkanals, dieses in einen grün- oder rotlichtaktivierten Natriumkanal zu transformieren. Aminosäuresubstitutionen der unmittelbaren Retinalumgebung verschoben hingegen das Aktionsmaximum von Chrimson röter als 600 nm und damit röter als in allen bisher beschriebenen ChRs. In Chrimson versperrt hierbei ein zusätzliches äußeres Tor den extrazellulär Halbkanal, während die Retinalbindetasche in Struktur und funktionaler Bedeutung der einzelnen Reste wesentlich jener der Protonenpumpe Bacteriorhodopsin ähnelt. Als Zwei-Komponenten-Optogenetik wurden schließlich protonen-, kationen- und anionenleitende ChRs unterschiedlicher Farbsensitivität fusioniert sowie lichtgetriebene Protonenpumpen mit protonenaktivierten Ionenkanälen kombiniert und neue optogenetische Perspektiven eröffnet. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels from green algae. Expressed in host cells they are used to control ion fluxes by light and are widely applied in Neurosciences. Although generally classified as either cation or anion channels, most ChRs preferentially conduct protons. This thesis compares proton conductance of different ChRs, examines the molecular mechanism of proton selective ChRs and explores the usage of light regulated proton fluxes in two-component-optogenetics. Proton selectivity varied strongly among different ChRs and was most pronounced for the green- and red-light activated channels CsChR and Chrimson from the algae Chloromonas subdivisa and Chlamydomonas noctigama, that conducted predominantly protons even at high pH. In CrChR2 from Chlamydomonas reinhardtii proton selectivity also changed during a single activation cycle and was especially high directly after channel opening and later on following light adaptation. In all three channels efficient proton conductance depended on conserved titratable residues along the pore with different contribution of the individual side chains in each protein. The substitution of single glutamic acids in the extracellular half pore converted Chrimson into a green or red-light activated sodium channel. A single point mutation close to the retinal chromophore shifted peak absorption of Chrimson beyond 600 nm - further red than all other cation conducting ChRs. Whereas the retinal binding pocket of Chrimson resembles the proton pump Bacteriorhodpsin, the overall pore structure corresponds to other ChRs, but features an additional outer gate, that occludes the extracellular half pore and is important for both, proton selectivity and red light absorption. Finally different Two-Component-Optogenetic approaches combined proton and anion selective ChRs of distinct colour as well as light-driven proton pumps and proton-activated ion channels with major prospect for future optogenetic applications.
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Plant and soil microbial responses to drought stress in different ecosystems: the importance of maintaining the continuum

von Rein, Isabell 31 July 2017 (has links)
Der Klimawandel bedroht Ökosysteme auf der ganzen Welt. Besonders der Anstieg in Länge, Intensität und Häufigkeit von Dürren kann bedeutenden Einfluss auf den globalen Kohlenstoffkreislauf haben. Die Frage, ob Pflanzen und Mikroorganismen anfällig gegenüber ökologischem Stress wie Dürren sind, wurde bereits in vielen Studien für verschiedene Ökosysteme und mit verschiedenen Ansätzen untersucht, aber Analysen von Dürreauswirkungen, die ober- und unterirdische Interaktionen von Pflanzen und Mikroorganismen mit einbeziehen, sind eher selten. Deshalb wird in der vorliegenden Studie die Frage erörtert, wie Trockenheit und/oder Hitze die Interaktionen von Pflanzen und Mikroorganismen in Bezug auf ihre Kohlenstoff-Verbindung beeinflussen. Dies dient zur Bestimmung der Stärke der Pflanze-Mikroorganismen-Kohlenstoff-Verbindung, wenn das Ökosystem an seine Grenzen gebracht wird. Der Fokus liegt deshalb auf durch Trockenstress und Hitze hervorgerufenen Veränderungen in der ober-unterirdischen Kohlenstoff-Dynamik in zwei vom Klimawandel bedrohten Ökosystemen. Es wurde untersucht, wie extreme Klimaereignisse, deren Häufigkeit in Zukunft weiter ansteigen soll, die Kohlenstoff-Verbindung zwischen Pflanzen und Mikroorganismen beeinflusst und wie mikrobielle Gemeinschaften unter diesen Umständen reagieren, um die Resistenz und Reaktionsmechanismen von Ökosystemen im zukünftigen Klimawandel besser vorhersagen zu können. In Kapitel 4 wurde ein Buchenwaldunterholz-Ökosystem untersucht. Buchenwaldmonolithen wurden einem extremen Klimaereignis (Trockenheit und/oder Hitze) ausgesetzt. Die Stärke der Pflanze-Mikroorganismen-Kohlenstoff-Verbindung und Veränderungen in der mikrobiellen Gemeinschaftsstruktur und -aktivität wurden mithilfe von stabilen 13C Isotopenmethoden und Ansätzen auf molekularer Basis, wie 16S rRNA- und Phospholipid-Analysen, bestimmt. In Kapitel 5 wurde ein kleines aquatisches Ökosystems untersucht. Zwei emerse aquatische Makrophyten, Phragmites australis und Typha latifolia, wurden in einem Mesokosmos-Experiment mit Sediment aus einem Soll einer einmonatigen Dürre ausgesetzt. Mithilfe einer 13CO2 Pulsmarkierung, sowie PLFA- und nicht-strukturbildenden Kohlenhydrat-Analysen wurde Kohlenstoff von den Blättern in die Wurzeln bis ins Sediment verfolgt, wo er teilweise in mikrobielle Phospholipide eingebaut wird. Diese Studie hat gezeigt, dass die zwei untersuchten Ökosysteme Trockenstress und Hitze relativ gut widerstehen können, zumindest kurzfristig, und dass das Kohlenstoff-Kontinuum, beziehungsweise die Verbindung zwischen ober- und unterirdischen Gemeinschaften, auch unter starkem Stress intakt bleibt. Zusammenfassend scheint es, dass Ökosysteme stark von einem funktionierenden Pflanze-Boden/Sediment-Mikroorganismen Kohlenstoff-Kontinuum abhängen und versuchen, es auch unter starkem Stress zu erhalten, was möglicherweise dazu beiträgt, dem Anstieg von extremen Dürreperioden aufgrund des Klimawandels besser zu widerstehen. / Climate change is threatening ecosystems around the world. Especially the increase in duration, intensity, and frequency of droughts can have a considerable impact on the global carbon cycle. The question whether plants and microbes are susceptible to environmental stress like drought has been assessed in many studies for different ecosystem types and by using numerous approaches, but research on drought effects that includes above- and belowground interactions is rather scarce. Therefore, the present study assesses the question of how drought and/or heat influence the interactions of plants and microbes, especially the carbon coupling, in order to determine the strength of plant-microbe carbon linkages when an ecosystem is pushed to its limits. The focus of this study thus lies on changes in aboveground-belowground carbon dynamics and the subsequent effects on the soil microbial community under drought and/or heat stress in two climate-threatened ecosystems. It was evaluated how extreme climate events, that are predicted to be more frequent in the near future, affect the carbon coupling between plants and microorganisms and how microbial communities respond under these circumstances, in order to be able to better predict ecosystem resistance and response mechanisms under future climate change. In chapter 4 a beech forest understory ecosystem was investigated. An extreme climate event (drought and/or heat) was imposed on beech forest monoliths and the strength of the plant-microbe carbon linkages and changes in the microbial community structure and activity were determined by using stable 13C isotope techniques and molecular-based approaches like 16S rRNA and microbial phospholipid-derived fatty acid (PLFA) analysis. In chapter 5 a small aquatic ecosystems was investigated. Two emergent aquatic macrophytes, Phragmites australis and Typha latifolia, were grown on kettle hole sediment and then exposed to a month-long summer drought in a mesocosm experiment. By conducting a 13CO2 pulse labeling as well as PLFA and non-structural carbohydrate analyses, the fate of carbon was traced from the plant leaves to the roots and into the sediment, where some of the recently assimilated carbon is incorporated into microbial PLFAs. Overall, this study showed that the two investigated ecosystems can endure environmental stress like heat and drought relatively well, at least in the short-term, and that the carbon continuum, or the linkage between above- and belowground communities, remained intact even under severe stress. In conclusion, it seems that ecosystems strongly depend on and try to maintain a functional plant-soil/sediment microorganism carbon continuum under drought, which might help to withstand the increase in extreme drought events under future climate change.
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Site-specific functionalization of antigen binding proteins for cellular delivery, imaging and target modulation

Schumacher, Dominik 09 November 2017 (has links)
Antikörper und Antigen-bindende Proteine, die an Fluorophore, Tracer und Wirkstoffe konjugiert sind, sind einzigartige Moleküle, welche die Entwicklung wertvoller diagnostischer und therapeutischer Werkzeuge ermöglichen. Allerdings ist der Konjugationsschritt sehr anspruchsvoll und trotz intensiver Forschung noch immer ein bedeutender Engpass. Zusätzlich sind Antigen-bindende Proteine oftmals nicht dazu in der Lage, die Zellmembran zu durchdringen und im Zellinneren nicht funktionsfähig. Daher ist ihre Verwendung auf extrazelluläre Targets beschränkt, was eine bedeutende Anzahl wichtiger Antigene vernachlässigt. Beide Limitierungen bilden Kernaspekte dieser Arbeit. Mit Tub-tag labeling wurde ein neuartiges und vielseitiges Verfahren für die ortsspezifische Funktionalisierung von Biomolekülen und Antigen-bindenden Proteinen entwickelt, und so die Palette der Proteinfunktionalisierungen bedeutend erweitert. Tub-tag wurde erfolgreich für die ortsspezifische Funktionalisierung verschiedener Proteine und Antigen-bindender Nanobodies angewendet, die für konfokale Mikroskopie, Proteinanreicherung und hochauflösende Mikroskopie eingesetzt wurden. In einem weiteren Projekt wurden zellpermeable Antigen-bindende Nanobodies hergestellt und somit das schon lange Zeit bestehende Ziel, intrazelluläre Targets durch in vitro funktionalisierte Antigen-bindende Proteine zu visualisieren und manipulieren, erreicht. Hierzu wurden zwei verschiedene Nanobodies an ihrem C-Terminus cyclischen zellpenetrierenden Peptiden unter Verwendung von Expressed Protein Ligation funktionalisiert. Diese Peptide ermöglichten die Endozytose-unabhängige Aufnahme der Nanobodies mit sofortiger Bioverfügbarkeit. Mit Tub-tag labeling und der Synthese von zellpermeablen Nanobodies konnten wichtige Bottlenecks im Bereich der Proteinfunktionalisierung und Antikörperforschung adressiert werden und neue Tools für die biochemische und zellbiologische Forschung entwickelt werden. / Antibodies and antigen binding proteins conjugated to fluorophores, tracers and drugs are powerful molecules that enabled the development of valuable diagnostic and therapeutic tools. However, the conjugation itself is highly challenging and despite intense research efforts remains a severe bottleneck. In addition to that, antibodies and antigen binding proteins are often not functional within cellular environments and unable to penetrate the cellular membrane. Therefore, their use is limited to extracellular targets leaving out a vast number of important antigens. Both limitations are core aspects of the presented thesis. With Tub-tag labeling, a novel and versatile method for the site-specific functionalization of biomolecules and antigen binding proteins was developed expanding the toolbox of protein functionalization. The method is based on the microtubule enzyme tubulin tyrosine ligase. Tub-tag labeling was successfully applied for the site-specific functionalization of different proteins including antigen binding nanobodies which enabled confocal microscopy, protein enrichment and super-resolution microscopy. In addition to that, cell permeable antigen binding nanobodies have been generated constituting a long thought goal of tracking and manipulating intracellular targets by in vitro functionalized antigen binding proteins. To achieve this goal, two different nanobodies were functionalized at their C-terminus with linear and cyclic cell-penetrating peptides using expressed protein ligation. These peptides triggered the endocytosis independent uptake of the nanobodies with immediate bioavailability. Taken together, Tub-tag labeling and the generation of cell-permeable antigen binding nanobodies strongly add to the functionalization of antibodies and their use in biochemistry, cell biology and beyond.
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Unconventional signaling properties of inositol pyrophosphates

Kurz, Leonie 22 November 2024 (has links)
Inositolpyrophosphate (PP InsPs) sind Signalmoleküle in eukaryotischen Zellen, die u.a. als Sensoren für ATP- und Phosphat fungieren, und insbesondere durch allosterische Regulation und posttranslationale Modifikationen (PTMs) wirken. Diese Arbeit ist in zwei Teile unterteilt, die sich auf zwei verschiedene ungewöhnliche Eigenschaften dieser Moleküle konzentrieren. Der erste Teil untersucht PP-InsPs in Lösung, mit Schwerpunkt auf ihrer Fähigkeit, abhängig von pH und Metallionen ihre Konformation zu ändern. Diese Eigenschaft ist einzigartig unter biologisch vorkommenden kleinen Molekülen. Drei eng verwandte Moleküle, InsP6, 5PP InsP5 und InsP8, wurden mittels NMR Spektroskopie charakterisiert, um herauszufinden, ob sie unter annähernd zytosolischen Bedingungen ihre Konformation ändern können. Dies war der Fall für InsP8, welches deshalb bezüglich Protonierung und Komplexbildung genauer untersucht wurde. Zu guter Letzt konnten ITC Experimente demonstrieren, dass eine Lösungsumgebung, die die Konformationsänderung von InsP8 begünstigt, auch seine Bindung an eine damit interagierende Proteindomäne verstärkt. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der Pyrophosphorylierung von Proteinen, einer PTM, die nach derzeitigem Wissen non-enzymatisch von PP InsPs auf phosphorylierte Aminosäurereste übertragen wird – im Gegensatz zur enzymatischen Phosphorylierung durch Kinasen. Ein Probenvorbereitungsprotokoll zum Nachweis von endogener Pyrophosphorylierung in Zellen wurde entwickelt und mit synthetischen Standardpeptiden validiert. Anschließend wurde es an drei menschlichen Zelllinien erprobt, und konnte über einhundert Modifikationsstellen identifizieren, zumeist auf Proteinen im Zellkern. Dies beweist zum ersten Mal die Existenz von endogener Pyrophosphorylierung. Proteomics an Knockout-Zelllinien bestätigten die Hypothese, dass Pyrophosphorylierung von 5PP-InsP5 (InsP7) abhängig ist. Mikroskopie und qPCR-Experimente lieferten Hinweise auf eine Funktion in der Regulation der Ribosomenbiogenese. / Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) are messenger molecules in eukaryotic cells, that serve as sensors of phosphate and ATP, among other functions, signaling e.g. through allosteric regulation and posttranslational modifications. This work is structured into two parts, focusing on two different unusual features of these molecules. The first part investigates PP-InsPs in solution, with emphasis on the messengers’ ability to undergo a pH and metal ion dependent conformational change, a feature unique among biological small molecules. Three closely related molecules, InsP6, 5PP InsP5 and InsP8 were characterized by NMR, to determine if they could change conformation under conditions approximating a cytosolic environment. This was the case for InsP8, which was therefore studied in more detail regarding protonation and complexation. Finally, ITC experiments showed that solution conditions favoring the conformational change of InsP8 also improved its binding to a known interacting protein domain. The second part of the thesis is concerned with protein pyrophosphorylation, a post-translational modification thought to be transferred non-enzymatically from PP InsPs to phosphorylated amino acid residues – opposed to the usual enzymatic phosphorylation through kinases. A sample preparation workflow for detection of endogenous pyrophosphorylation in cells has been developed and validated using synthetic standard peptides. It was then applied to three human cell lines, discovering more than one hundred modified sites, mostly on nuclear proteins, and proving for the first time the existence of endogenous pyrophosphorylation. Proteomics on knockout cell lines confirmed the hypothesis that pyrophosphorylation depends on 5PP-InsP5 (InsP7). Finally, microscopy and qPCR experiments suggested a regulatory role in ribosome biogenesis.

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