Text in Afrikaans / Summaries in Afrikaans and English / This study aims to investigate and explain how the L2 -facilitator can effectively employ the various facilitation skills of language teaching in Afrikaans Second Language within the Outcomes Based Education framework in the learner-centred classroom. The facilitator is critical in providing an opportunity for multicultural learners to develop the necessary language learning skills to enjoy Afrikaans Second Language/Additional Language learning as an interesting learning experience within a positive learning milieu. In the learner-centred U -classroom, learners too must accept responsibility for their own and their peers' learning within the co-operative learning group. This study reveals how the L2 -facilitator can develop the necessary knowledge and skills concerning groupwork, such as the strategies enhancing L 2 -learning, effective group facilitation skills, learner attitudes towards the facilitator, problem-solving skills, co-operative learning as a control technique, communication, learners' behaviour and the advantages of groupwork. Furthermore, elements of classroom negotiation and the facilitator's methods of working in this negotiated partnership are also discussed. Since language learning is integral to lifelong learning, multicultural learners must be motivated to learn Afrikaans Second/ Additional language with greater enthusiasm. This necessitates the L2 -facilitator creating an interesting, challenging and authentic language learning environment where mutual respect and trust are emphasised. This study reveals how the L2 -facilitator could develop his/her knowledge of task-based L2 -teaching and use it with the effective techniques of facilitation and negotiation skills in the taskorientated second language classroom to lead learners to effective Afrikaans L2 -learning. The new National Language Standardisation Policy 200112002 necessitates the facilitator of Afrikaans L 2 -teaching/learning within the Outcomes Based Education framework and the revised Curriculum 2005 to be aufait with assessment and his/her role in assessment. Being knowledgeable on the various criteria and strategies regarding assessment is therefore imperative. Finally, chapter five illustrates practically how the facilitator could plan, organise, base, integrate and present authentic Afrikaans L 2 -lessons/work based on the theoretical knowledge and aspects of facilitation skills, group-work, task-based learning and assessment discussed in chapters two to four. / Daar word in die studie gepoog om te ondersoek en te verduidelik hoe die T2-fasiliteerder die verskillende fasiliteringsvaardighede ten opsigte van T2 -Afrikaansonderrig binne die UGO -raamwerk in die leerdergesentreerde T2-klaskamer effektief kan gebruik. Die fasiliteerder behoort sy multikulturele leerders die geleentheid te gun om die nodige taalleervaardighede te ontwikkel sodat hulle Afrikaans Tweedetaalleer/ Addisionele Taalleer as 'n interessante leerervaring binne 'n positiewe leerklimaat kan geniet. In die leerdergesentreerde T2 -klaskamer moet die leerders ook die verantwoordelikheid vir bulle eie leer, en vir die leer van ander leerders binne kooperatiewe leergroepe kan aanvaar. Die wyse waarop die fasiliteerder van T2-leer die nodige kennis en vaardighede ten opsigte van groepwerk kan ontwikkel, word deur die studie aan die lig gebring. Die verskillende strategiee wat die aanleer van die tweedetaal binne groepwerk bevorder, effektiewe groepsfasiliteringsvaardighede, leerders se gesindhede teenoor die fasiliteerder, die probleemoplossingsvaardighede, kooperatiewe leer as beheertegniek, kommunikasie, leerdergedragswyses en die voordele van groepwerk kom aan bod. Elemente van klaskameronderhandeling en die fasiliteerder se werkswyse in die onderhandelingsvennootskap word ook bespreek. Aangesien taalleer 'n integrale faset van lewenslange leer vorm, moet multikulturele leerders gemotiveer word om Afrikaans Tweedetaal/ Addisionele Taal op 'n meer entoesiastiese wyse te kan leer. Die T2 -fasiliteerder moet 'n interessante, uitdagende, outentieke taalleeromgewing skep waarin wedersydse respek en vertroue beklemtoon word. Die studie toon die wyse aan waarop die T2 -fasiliteerder sylhaar kennis in verband met taakgerigte T2 -onderrig kan ontwikkel en dit met die effektiewe fasiliteringstegnieke en onderhandelingsvaardighede in die taakgeorienteerde T2-klaskamer kan kombineer en gebruik om leerders tot effektiewe T2 -Afrikaansleer/ Addisionele Taalleer te kan lei. Die nuwe Nasionale Taalstandaardiseringsbeleid 2001/2002 vereis dat die fasiliteerder van T2-Afrikaansonderrig/-leer binne die UGO -raamwerk en die hersiene Kurrikulum 2005 deeglike kennis moet dra van assessering en sylhaar rol in assessering. Deeglike kennis ten opsigte van die verskillende assesseringskriteria en assesseringstegnieke is dus noodsaaklik. Daar word in hoofstuk vyf aangetoon op watter wyse die fasiliteerder outentieke praktiese T2-Afrikaanslesse/-werk, kan beplan, organiseer en dit op die teoretiese kennis en aspekte ten opsigte van fasiliteringsvaardighede, groepwerk, taakgerigte leer en assessering wat in hoofstukke twee tot vier bespreek word, kan toepas en geintegreerd kan aanbied. / Afrikaans and Theory of Literature / D.Litt. et Phil. (Afrikaans)

The thesis of this study is that both Pentecostal and non-Pentecostal churches can grow at a time when only the Pentecostal churches have grown. The stagnation that has occurred in many ''mainline" churches.need not be allowed to increase or continue. In Venda (Northern Province) both the Lutherans and the Pentecostals have enjoyed visible growth. Chapter 1 introduces the thesis, the choice of the study area, the objectives of the study, and the typology, methodology and relevance of the study. Chapter 2 looks at the history and socio-economic backgrowtd of the Vhavenda. Chapter 3 describes traditional Vhavenda beliefs and rituals. The Vhavenda world-view is different from that of the West but closer to that of the East and the Bible. Chapter 4 concentrates on missionary Christianity in Venda and briefly discusses the missionary methods adopted by the Berlin Missionary Society. Chapter 5 discusses the coming of Pentecostalism to South Africa and Venda. Chapter 6 examines how the Lutherans and the Apostolic Faith Mission church conducted their mission during the "maturation of Apartheid'' in Venda. Major events in the collision between apartheid and the Vhavenda are highlighted. Chapter 7 discusses the unfinished work of the church in Venda. Chapter 8 examines the challenge for Christian mission in the twenty-first century. / Christian Spirituality, Church History and Missiology / D.Th (Missiology)

Purpose of engaged task is elaborate a functional mechanism to emergency brake for escalators company Otis. To this purpose is gradually reached up in several phases. In primary phase was taken view on similar products from competitive company and do not get in conflict with patent right, in second phase was needed delimitate working space for brake and exact specification of straining. In next steps the proposal and test phase is blending together. In this moment emergency brake has own shape and first tests are showing the functions, but as well necessity modification of same elements on brake and on escalator.

This Master Thesis is the research done in the country of Rwanda. The project leads to study the climate of this country in order to establish whether this climate could be used to produce energy from air and to implement the first wind turbine for serving the nation.   After an introduction about the historical background of wind power, the thesis work deals with assessment of wind energy potential of Rwanda in focusing of the most suitable place for wind power plants. The best location with annual mean wind speed, the rate of use of turbine with hub height for an annual production per year, the mean wind speeds for 6 sites of Rwanda based on ECMWF for climatic data for one year at relief of altitude of 100m and coordinates are reported too.   The result of energy produced and calculations were done based on power hitting wind turbine generator in order to calculate Kinetic energy and power available at the best location to the measurement over the period of 12 months, that could be hoped for long term.   With help of logarithmic law, where wind speed usually increases with increasing in elevation and the desired wind speeds at all 6 sites were used. The annual energy production was taken into account at the best site with desired wind speed at the initial cost of turbine as well as the cost of energy (COE).However, with comparison of the tariff of EWSA, the price of Wind designed in this Research per kWh is cheaper and suitable for people of Rwanda. / <p><em>Rwanda has considerable opportunities development energy from hydro sources, methane gas, solar and peat deposits. Most of these energy sources have not been fully exploited, such as solar, wind and geothermal. As such wood is still being the major source of energy for 94 per cent of the population and imported petroleum products consume more than 40 per cent of foreign exchange. Energy is a key component of the Rwandan economy. It is thus recognized that the current inadequate and expensive energy supply constitutes a limiting factor to sustainable development. Rwanda’s Vision 2020 emphasizes the need for economic growth, private investment and economic transformation supported by a reliable and affordable energy supply as a key factor for the development process. To achieve this transformation, the country will need to increase energy production and diversify into alternative energy sources. Rwandan nations don’t have small-scale solar, wind, and geothermal devices in operation providing energy to urban and rural areas. These types of energy production are especially useful in remote locations because of the excessive cost of transporting electricity from large-scale power plants. The application of renewable energy technology has the potential to alleviate many of the problems that face the people of Rwanda every day, especially if done so in a sustainable manner that prioritizes human rights.</em></p>

Made available in DSpace on 2011-05-04T12:36:29Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009 / Este trabalho propõe analisar o fenômeno da terceirização desenvolvido ao longo das duas últimas décadas em Bio-Manguinhos. Trata-se de um estudo de caso realizado na unidade de produção de vacinas e reagentes para diagnóstico da Fundação Oswaldo Cruz. Inicialmente foi realizado um estudo de cenário, analisando a política de gestão do trabalho desenvolvida pelo Estado brasileiro para as instituições públicas. A seguir, a análise passou a verificar a inserção da Fiocruz nessas políticas, desde a sua criação e no decorrer de vigência de diferentes formas de contratação, alternando da extrema rigidez para a total flexibilidade sempre com foco na gestão do trabalho, e, como essas políticas se refletiram no desempenho de Bio-Manguinhos. Baseado no contexto da conformação do Estado e na análise do desempenho da unidade, o trabalho critica a falta de planejamento e de prospecção dessas políticas, que favoreça a inovação de processos, produtos e procedimentos e o desempenho pleno de uma unidade de produção de insumos para a saúde, tão necessários ao atendimento das necessidades da população brasileira. Critica também, a ausência de um modelo de Estado consolidado que sirva de arcabouço à formulação dessas políticas. Devido às fortes críticas dos órgãos de controle acerca da extrapolação dos limites da terceirização praticada nas últimas duas décadas e à falta de definição clara desses marcos legais, o trabalho apresenta uma metodologia baseada nas atribuições dos cargos do plano de carreiras da Fiocruz e culmina com a apresentação de uma matriz de atribuições passíveis de serem realizadas por contratação indireta. Conclui pela necessidade de convivência de dois quadros de trabalhadores: um permanente formado por servidores, estáveis e de carreira e outro flexível, executado por contratação indireta, de caráter eventual, temporário ou de apoio às atividades relacionadas à missão de Bio-Manguinhos. O trabalho ainda sugere a aplicação da mesma metodologia às demais unidades da Fiocruz e que a instituição afirme, frente aos órgãos de controle, quais atividades que ela precisa manter no quadro de servidores permanente e quais ela quer delegar a terceiros sem contudo, ferir a legislação vigente. Por fim, constata-se que a metodologia apresentada ameniza, mas não resolve o problema, dessa forma, recomenda-se à Fiocruz buscar mecanismos que altere o modelo de gestão pelo qual está submetida a fim de viabilizar as duas formas de incorporação de mão-de-obra.

La violence faite aux femmes est une réalité encore très présente, surtout dans les sociétés patriarcales, même après des décennies de lutte féministe. C’est aussi un thème privilégié en littérature. La présente thèse propose justement une analyse de ce thème à travers deux romans assez récents qui mettent tous deux de l’avant des aspects particuliers de la question : Un dimanche à la piscine à Kigali de Gil Courtemanche et Je m’appelle Bosnia de Madeleine Gagnon. Nous tenterons de cerner les différentes formes de violences à l’œuvre dans les deux narrations : la violence faite aux filles, celle faite aux femmes, et enfin la violence spécifique qu’engendrent les conflits armés avec le viol comme arme de guerre. Nous proposerons une analyse intersectionnelle de ces formes de violences afin de mesurer les représentations et les répercussions des notions de classe et de race eu égard aux toiles de fond différentes des deux romans : le génocide chez Courtemanche, le nettoyage ethnique chez Gagnon. Nous aborderons aussi les narrations sous l’angle de l’agentivité. Dans des sociétés fondamentalement patriarcales, quel pouvoir peuvent espérer avoir les personnages féminins sur leur destin personnel et collectif? Y a-t-il pour ces femmes fictives des stratégies possibles pour atteindre une liberté d’action, si mince soit-elle?

O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). A AIDS é uma doença de distribuição mundial, e estima-se que existam atualmente pelo menos 36,9 milhões de pessoas infectadas com o vírus. Durante o seu ciclo replicativo, o HIV promove diversas alterações na fisiologia da célula hospedeira a fim de promover sua sobrevivência e potencializar a replicação. A rápida progressão da infecção pelo HIV-1 em humanos e em modelos animais está intimamente ligada à função da proteína acessória Nef. Dentre as diversas ações de Nef está a regulação negativa de proteínas importantes na resposta imunológica, como o receptor CD4. Sabe-se que esta ação resulta da indução da degradação de CD4 em lisossomos, mas os mecanismos moleculares envolvidos ainda são totalmente elucidados. Nef forma um complexo tripartite com a cauda citosólica de CD4 e a proteína adaptadora 2 (AP-2), em vesículas revestidas por clatrina nascentes, induzindo a internalização e degradação lisossomal de CD4. Pesquisas anteriores demonstraram que o direcionamento de CD4 aos lisossomos por Nef envolve a entrada do receptor na via dos corpos multivesiculares (MVBs), por um mecanismo atípico, pois, embora não necessite da ubiquitinação de carga, depende da ação de proteínas que compõem os ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) e da ação de Alix, uma proteína acessória da maquinaria ESCRT. Já foi reportado que Nef interage com subunidades dos complexos AP-1, AP-2, AP-3 e Nef não parece interagir com subunidades de AP-4 e AP-5. Entretanto, o papel da interação de Nef com AP-1 e AP-3 na regulação negativa de CD4 ainda não está totalmente elucidado. Ademais, AP-1, AP-2 e AP-3 são potencialmente heterogêneos devido à existência de isoformas múltiplas das subunidades codificadas por diferentes genes. Todavia, existem poucos estudos para demonstrar se as diferentes combinações de isoformas dos APs são formadas e se possuem propriedades funcionais distintas. O presente trabalho procurou identificar e caracterizar fatores celulares envolvidos na regulação do tráfego intracelular de proteínas no processo de regulação negativa de CD4 induzido por Nef. Mais especificamente, este estudo buscou caracterizar a participação do complexo AP-1 na modulação negativa de CD4 por Nef de HIV-1, através do estudo funcional das duas isoformas de ?-adaptina, subunidades de AP-1. Utilizando a técnica de Pull-down demonstramos que Nef é capaz de interagir com ?2. Além disso, nossos dados de Imunoblot indicaram que a proteína ?2-adaptina, e não ?1-adaptina, é necessária no processo de degradação lisossomal de CD4 por Nef e que esta participação é conservada para degradação de CD4 por Nef de diferentes cepas virais. Ademais, por citometria de fluxo, o silenciamento de ?2, e não de ?1, compromete a diminuição dos níveis de CD4 por Nef da membrana plasmática. A análise por imunofluorêsncia indireta também revelou que a diminuição dos níveis de ?2 impede a redistribuição de CD4 por Nef para regiões perinucleares, acarretando no acúmulo de CD4, retirados por Nef da membrana plasmática, em endossomos primários. A depleção de ?1A, outra subunidade de AP-1, acarretou na diminuição dos níveis celulares de ?2 e ?1, bem como, no comprometimento da eficiente degradação de CD4 por Nef. Além disso, foi possível observar que, ao perturbar a maquinaria ESCRT via super-expressão de HRS (uma subunidade do complexo ESCRT-0), ocorreu um acumulo de ?2 em endossomos dilatados contendo HRS-GFP, nos quais também detectou-se CD4 que foi internalizado por Nef. Em conjunto, os resultados indicam que ?2-adaptina é uma importante molécula para o direcionamento de CD4 por Nef para a via ESCRT/MVB, mostrando ser uma proteína relevante no sistema endo-lisossomal. Ademais, os resultados indicaram que as isoformas ?-adaptinas não só possuem funções distintas, mas também parecem compor complexos AP-1 com diferentes funções celulares, já que apenas a variante AP-1 contendo ?2, mas não ?1, participa da regulação negativa de CD4 por Nef. Estes estudos contribuem para o melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na atividade de Nef, que poderão também ajudar na melhor compreensão da patogênese do HIV e da síndrome relacionada. Em adição, este trabalho contribui para o entendimento de processos fundamentais da regulação do tráfego de proteínas transmembrana no sistema endo-lisossomal. / The Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the etiologic agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). AIDS is a disease which has a global distribution, and it is estimated that there are currently at least 36.9 million people infected with the virus. During the replication cycle, HIV promotes several changes in the physiology of the host cell to promote their survival and enhance replication. The fast progression of HIV-1 in humans and animal models is closely linked to the function of an accessory protein Nef. Among several actions of Nef, one is the most important is the down-regulation of proteins from the immune response, such as the CD4 receptor. It is known that this action causes CD4 degradation in lysosome, but the molecular mechanisms are still incompletely understood. Nef forms a tripartite complex with the cytosolic tail of the CD4 and adapter protein 2 (AP-2) in clathrin-coated vesicles, inducing CD4 internalization and lysosome degradation. Previous research has demonstrated that CD4 target to lysosomes by Nef involves targeting of this receptor to multivesicular bodies (MVBs) pathway by an atypical mechanism because, although not need charging ubiquitination, depends on the proteins from ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery and the action of Alix, an accessory protein ESCRT machinery. It has been reported that Nef interacts with subunits of AP- 1, AP-2, AP-3 complexes and Nef does not appear to interact with AP-4 and AP-5 subunits. However, the role of Nef interaction with AP-1 or AP-3 in CD4 down-regulation is poorly understood. Furthermore, AP-1, AP-2 and AP-3 are potentially heterogeneous due to the existence of multiple subunits isoforms encoded by different genes. However, there are few studies to demonstrate if the different combinations of APs isoforms are form and if they have distinct functional properties. This study aim to identify and characterize cellular factors involved on CD4 down-modulation induced by Nef from HIV-1. More specifically, this study aimed to characterize the involvement of AP-1 complex in the down-regulation of CD4 by Nef HIV-1 through the functional study of the two isoforms of ?-adaptins, AP-1 subunits. By pull-down technique, we showed that Nef is able to interact with ?2. In addition, our data from immunoblots indicated that ?2- adaptin, not ?1-adaptin, is required in Nef-mediated targeting of CD4 to lysosomes and the ?2 participation in this process is conserved by Nef from different viral strains. Furthermore, by flow cytometry assay, ?2 depletion, but not ?1 depletion, compromises the reduction of surface CD4 levels induced by Nef. Immunofluorescence microscopy analysis also revealed that ?2 depletion impairs the redistribution of CD4 by Nef to juxtanuclear region, resulting in CD4 accumulation in primary endosomes. Knockdown of ?1A, another subunit of AP-1, resulted in decreased cellular levels of ?1 and ?2 and, compromising the efficient CD4 degradation by Nef. Moreover, upon artificially stabilizing ESCRT-I in early endosomes, via overexpression of HRS, internalized CD4 accumulates in enlarged HRS-GFP positive endosomes, where co-localize with ?2. Together, the results indicate that ?2-adaptin is a molecule that is essential for CD4 targeting by Nef to ESCRT/MVB pathway, being an important protein in the endo-lysosomal system. Furthermore, the results indicate that ?-adaptins isoforms not only have different functions, but also seem to compose AP-1 complex with distinct cell functions, and only the AP-1 variant comprising ?2, but not ?1, acts in the CD4 down-regulation induced by Nef. These studies contribute to a better understanding on the molecular mechanisms involved in Nef activities, which may also help to improve the understanding of the HIV pathogenesis and the related syndrome. In addition, this work contributes with the understanding of primordial process regulation on intracellular trafficking of transmembrane proteins.

O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS). A AIDS é uma doença de distribuição mundial, e estima-se que existam atualmente pelo menos 36,9 milhões de pessoas infectadas com o vírus. Durante o seu ciclo replicativo, o HIV promove diversas alterações na fisiologia da célula hospedeira a fim de promover sua sobrevivência e potencializar a replicação. A rápida progressão da infecção pelo HIV-1 em humanos e em modelos animais está intimamente ligada à função da proteína acessória Nef. Dentre as diversas ações de Nef está a regulação negativa de proteínas importantes na resposta imunológica, como o receptor CD4. Sabe-se que esta ação resulta da indução da degradação de CD4 em lisossomos, mas os mecanismos moleculares envolvidos ainda são totalmente elucidados. Nef forma um complexo tripartite com a cauda citosólica de CD4 e a proteína adaptadora 2 (AP-2), em vesículas revestidas por clatrina nascentes, induzindo a internalização e degradação lisossomal de CD4. Pesquisas anteriores demonstraram que o direcionamento de CD4 aos lisossomos por Nef envolve a entrada do receptor na via dos corpos multivesiculares (MVBs), por um mecanismo atípico, pois, embora não necessite da ubiquitinação de carga, depende da ação de proteínas que compõem os ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) e da ação de Alix, uma proteína acessória da maquinaria ESCRT. Já foi reportado que Nef interage com subunidades dos complexos AP-1, AP-2, AP-3 e Nef não parece interagir com subunidades de AP-4 e AP-5. Entretanto, o papel da interação de Nef com AP-1 e AP-3 na regulação negativa de CD4 ainda não está totalmente elucidado. Ademais, AP-1, AP-2 e AP-3 são potencialmente heterogêneos devido à existência de isoformas múltiplas das subunidades codificadas por diferentes genes. Todavia, existem poucos estudos para demonstrar se as diferentes combinações de isoformas dos APs são formadas e se possuem propriedades funcionais distintas. O presente trabalho procurou identificar e caracterizar fatores celulares envolvidos na regulação do tráfego intracelular de proteínas no processo de regulação negativa de CD4 induzido por Nef. Mais especificamente, este estudo buscou caracterizar a participação do complexo AP-1 na modulação negativa de CD4 por Nef de HIV-1, através do estudo funcional das duas isoformas de ?-adaptina, subunidades de AP-1. Utilizando a técnica de Pull-down demonstramos que Nef é capaz de interagir com ?2. Além disso, nossos dados de Imunoblot indicaram que a proteína ?2-adaptina, e não ?1-adaptina, é necessária no processo de degradação lisossomal de CD4 por Nef e que esta participação é conservada para degradação de CD4 por Nef de diferentes cepas virais. Ademais, por citometria de fluxo, o silenciamento de ?2, e não de ?1, compromete a diminuição dos níveis de CD4 por Nef da membrana plasmática. A análise por imunofluorêsncia indireta também revelou que a diminuição dos níveis de ?2 impede a redistribuição de CD4 por Nef para regiões perinucleares, acarretando no acúmulo de CD4, retirados por Nef da membrana plasmática, em endossomos primários. A depleção de ?1A, outra subunidade de AP-1, acarretou na diminuição dos níveis celulares de ?2 e ?1, bem como, no comprometimento da eficiente degradação de CD4 por Nef. Além disso, foi possível observar que, ao perturbar a maquinaria ESCRT via super-expressão de HRS (uma subunidade do complexo ESCRT-0), ocorreu um acumulo de ?2 em endossomos dilatados contendo HRS-GFP, nos quais também detectou-se CD4 que foi internalizado por Nef. Em conjunto, os resultados indicam que ?2-adaptina é uma importante molécula para o direcionamento de CD4 por Nef para a via ESCRT/MVB, mostrando ser uma proteína relevante no sistema endo-lisossomal. Ademais, os resultados indicaram que as isoformas ?-adaptinas não só possuem funções distintas, mas também parecem compor complexos AP-1 com diferentes funções celulares, já que apenas a variante AP-1 contendo ?2, mas não ?1, participa da regulação negativa de CD4 por Nef. Estes estudos contribuem para o melhor entendimento dos mecanismos moleculares envolvidos na atividade de Nef, que poderão também ajudar na melhor compreensão da patogênese do HIV e da síndrome relacionada. Em adição, este trabalho contribui para o entendimento de processos fundamentais da regulação do tráfego de proteínas transmembrana no sistema endo-lisossomal. / The Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the etiologic agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS). AIDS is a disease which has a global distribution, and it is estimated that there are currently at least 36.9 million people infected with the virus. During the replication cycle, HIV promotes several changes in the physiology of the host cell to promote their survival and enhance replication. The fast progression of HIV-1 in humans and animal models is closely linked to the function of an accessory protein Nef. Among several actions of Nef, one is the most important is the down-regulation of proteins from the immune response, such as the CD4 receptor. It is known that this action causes CD4 degradation in lysosome, but the molecular mechanisms are still incompletely understood. Nef forms a tripartite complex with the cytosolic tail of the CD4 and adapter protein 2 (AP-2) in clathrin-coated vesicles, inducing CD4 internalization and lysosome degradation. Previous research has demonstrated that CD4 target to lysosomes by Nef involves targeting of this receptor to multivesicular bodies (MVBs) pathway by an atypical mechanism because, although not need charging ubiquitination, depends on the proteins from ESCRTs (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport) machinery and the action of Alix, an accessory protein ESCRT machinery. It has been reported that Nef interacts with subunits of AP- 1, AP-2, AP-3 complexes and Nef does not appear to interact with AP-4 and AP-5 subunits. However, the role of Nef interaction with AP-1 or AP-3 in CD4 down-regulation is poorly understood. Furthermore, AP-1, AP-2 and AP-3 are potentially heterogeneous due to the existence of multiple subunits isoforms encoded by different genes. However, there are few studies to demonstrate if the different combinations of APs isoforms are form and if they have distinct functional properties. This study aim to identify and characterize cellular factors involved on CD4 down-modulation induced by Nef from HIV-1. More specifically, this study aimed to characterize the involvement of AP-1 complex in the down-regulation of CD4 by Nef HIV-1 through the functional study of the two isoforms of ?-adaptins, AP-1 subunits. By pull-down technique, we showed that Nef is able to interact with ?2. In addition, our data from immunoblots indicated that ?2- adaptin, not ?1-adaptin, is required in Nef-mediated targeting of CD4 to lysosomes and the ?2 participation in this process is conserved by Nef from different viral strains. Furthermore, by flow cytometry assay, ?2 depletion, but not ?1 depletion, compromises the reduction of surface CD4 levels induced by Nef. Immunofluorescence microscopy analysis also revealed that ?2 depletion impairs the redistribution of CD4 by Nef to juxtanuclear region, resulting in CD4 accumulation in primary endosomes. Knockdown of ?1A, another subunit of AP-1, resulted in decreased cellular levels of ?1 and ?2 and, compromising the efficient CD4 degradation by Nef. Moreover, upon artificially stabilizing ESCRT-I in early endosomes, via overexpression of HRS, internalized CD4 accumulates in enlarged HRS-GFP positive endosomes, where co-localize with ?2. Together, the results indicate that ?2-adaptin is a molecule that is essential for CD4 targeting by Nef to ESCRT/MVB pathway, being an important protein in the endo-lysosomal system. Furthermore, the results indicate that ?-adaptins isoforms not only have different functions, but also seem to compose AP-1 complex with distinct cell functions, and only the AP-1 variant comprising ?2, but not ?1, acts in the CD4 down-regulation induced by Nef. These studies contribute to a better understanding on the molecular mechanisms involved in Nef activities, which may also help to improve the understanding of the HIV pathogenesis and the related syndrome. In addition, this work contributes with the understanding of primordial process regulation on intracellular trafficking of transmembrane proteins.

SLOVENE NATIONAL THEATRE IN LJUBLJANA Author Report Of The Diploma Work Author: Bc. Petr Hýl Supervisor: doc. ing. arch. Zdeněk Makovský