Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-27T13:11:40Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 832503 bytes, checksum: c9ddb50df4ac046edfb1b18f02406400 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-27T13:11:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 832503 bytes, checksum: c9ddb50df4ac046edfb1b18f02406400 (MD5) Previous issue date: 2004-03-23 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Extratos enzimáticos de diferentes fungos foram avaliados quanto à maceração de raízes, a fim de se extrair mais fácil e rapidamente fêmeas de Meloidogyne spp. para estudos de controle biológico e para a identificação de espécies por eletroforese de isoenzimas. Raízes de tomateiro infectadas por Meloidogyne javanica foram imersas em extrato enzimático produzidas pelos fungos Aspergillus niger, Penicillium griseoroseum ou Penicillium italicum, separadamente ou em mistura de 50% de enzimas de cada fungo, em combinações de dois a dois, ou em tampão fosfato (testemunha), e incubadas a 30oC/24h. As enzimas produzidas pelo fungo P. griseoroseum foram as mais eficientes na degradação da parede das células das raízes de tomateiro, equiparando-se às enzimas comerciais importadas, pectinase + celulase (Clarex, Miles do Brasil - 15.000 ajdv/g; Sigma Chemical Ltda- 5.000 un.), utilizadas para a extração de fêmeas de Meloidogyne spp. Raízes com galhas parasitadas com as espécies M. incognita, M. javanica ou M. arenaria foram imersas em tampão de acetato de sódio apenas ou com enzimas liofilizadas de P. griseoroseum, em diferentes concentrações, e incubadas a 40°C/24h. A atividade de 200 U/mL proporcionou maior liberação de fêmeas, e essas foram submetidas à eletroforese de isoenzimas. Não foram observadas bandas, em gel de poliacrilamida, de fêmeas retiradas pela incubação em enzimas fúngicas, mas bandas foram vistas quando as fêmeas foram retiradas manualmente. Para avaliar o efeito das enzimas na adesão de endósporos aos juvenis de M. javanica, fêmeas foram retiradas manualmente e por maceração enzimática a 200 U/mL. Os endósporos de fêmeas extraídas por digestão enzimática apresentaram maior adesão a J2 de M. javanica em relação à testemunha. A reprodução dos endósporos de P. penetrans em fêmeas de M. javanica não foi afetada pela enzima. Para melhorar a quantificação de endósporos de P. penetrans em pó de raiz utilizado como inóculo para aplicação da bactéria no campo, as enzimas a 2% e 20% foram adicionadas a 2g do pó de raiz com P. penetrans e incubados a 40°C. O extrato enzimático na concentração de 20%, independente do tempo de incubação, possibilitou observar maior número de endósporos. O uso de enzimas fúngicas para a extração de fêmeas de Meloidogyne spp., demonstrou ser bastante eficiente e vantajoso, sem prejudicar a adesão e multiplicação de P. penetrans no nematóide; porém, não é recomendada para a identificação de M. javanica, M. incognita e M. arenaria por eletroforese de isoenzimas. / Enzymatic extracts from different fungi were evaluated for root maceration as an easier and faster way of extracting Meloidogyne spp. females from roots, to be used in biological control studies and in species identification by isozyme electrophoresis. Tomato roots infected by M. javanica were immersed in enzymatic extracts produced by Aspergillus niger, Penicillium griseoroseum or P. italicum, separately or in mixtures of 50% of enzymatic extracts of each fungus, two by two, or in phosphate buffer (control), and incubated at 30oC/24h. The enzymes produced by the fungus P. griseoroseum were the most efficient in the degradation of the tomato root cell walls, being comparable to the imported commercial enzymes pectinase + celulase (Clarex, Miles do Brasil - 15.000 ajdv/g; Sigma Chemical Ltda- 5.000 un.) used for Meloidogyne spp. females extraction. Galled roots parasitized by M. incognita, M. javanica or M. arenaria were immersed in sodium acetate buffer alone or with lyophilized enzymes of P. griseoroseum in different concentrations and incubated at 40°C/24h. The number of 200 U/mL of enzyme preparation provided the best female release, and the females attained using this concentration were subjected to isozyme electrophoresis analysis. No bands could be seen from the females extracted by incubation in fungal enzymes, in the poliacrilamide gel, but typic bands formed from females extracted manually. In order to evaluate the effect of enzymatic extraction on the attachment of endospores on second-stage juveniles (J2) of M. javanica, nematode females parasitized with Pasteuria penetrans were extracted from the roots manually or by maceration in enzyme extract at 200 U/mL. The endospores from females extracted by enzimatic digestion attached in higher number to the M. javanica J2 when compared to the control treatment. The endospore production in M. javanica females was not affected by the enzymes. To improve the endospore counting in root powder used as carrier for field applications, the enzymes at 2% and 20% were added to 2g of root powder containing P. penetrans endospores, and incubated at 40 °C. The enzyme extract at 20%, independent of the incubation time, allowed to observe a higher number of endospores. The use of fungal enzymes to extract Meloidogyne spp. showed to be very efficient and advantageous, without disturbing attachment or reproduction of P. penetrans in the nematode, however, it is not recommended for the identification of M. javanica, M. incognita nor M. arenaria by isozyme electrophoresis. / Dissertação importada do Alexandria

A ferrugem da videira, causada pelo fungo Phakopsora euvitis, é uma doença importante para a viticultura brasileira por causar desfolha precoce e, consequentemente, prejudicar a maturação dos frutos e comprometer as safras seguintes. Por ser um patógeno biotrófico, a preservação de urediniósporos para estudos com o patógeno, se faz em folhas do hospedeiro vivo. Em outras espécies de ferrugens é possível conservar os esporos em condições controladas por longos períodos de armazenamento. Outro ponto importante, para auxiliar na compreensão da epidemiologia do patossistema, está relacionado com as condições ambientais favoráveis na germinação de urediniósporos e na patogenicidade do fungo em folhas de videira. Com o objetivo de preservar o patógeno e determinar as condições ambientais favoráveis para a doença, foram avaliados: (1) O efeito da temperatura e desidratação na manutenção da viabilidade dos esporos; (2) O efeito da temperatura e do período de molhamento na germinação de urediniósporos e na patogenicidade em mudas de \"Niágara Rosada\" inoculadas. Os resultados obtidos mostraram que a desidratação dos esporos proporcionou maior viabilidade destes ao longo do tempo, para todas as condições de armazenamento testadas. A desidratação seguida pelo armazenamento a -80°C conseguiu manter os esporos viáveis, com uma alta porcentagem de germinação, por até 150 dias de armazenamento. Os urediniósporos armazenados no ambiente, independente do processo de desidratação, não conseguiram manter sua viabilidade por um período superior a 15 dias. A faixa de temperatura para germinação de urediniósporos foi ampla, entre 10 e 30°C, com um ótimo em 20°C. A expressão de sintomas em plantas inoculadas foi maior nas temperaturas de 25 e 30°C. O período de molhamento mínimo estimado pelo modelo monomolecular foi de 7 horas para as plantas mantidas a 15 °C e 5 horas para as plantas mantidas a 20, 25 e 30 °C. Para períodos acima de 6 horas de molhamento, a maior severidade da doença ocorreu na temperatura de 30 °C. Não ocorreu sintomas em plantas inoculadas e mantidas a 35°C em nenhum dos períodos de molhamento testados. O período de latência da ferrugem foi de 7 dias para plantas inoculadas e mantidas a 25 e 30°C, estendendo-se para 13 dias quando as plantas foram mantidas a 15°C. / Grapevine rust, caused by Phakopsora euvitis, is an important disease in brazilian viticulture, causing early defoliation and jeopardizing the maturation of fruits and the following crop season. P. euvitis is a biotrophic pathogen, and for research purpose, uredospores are kept through inoculation in grapevine plants. In other species of rust, it is possible to preserve spore under controlled conditions for long periods of storage. Understand the favorable environmental conditions for uredospores germination and the pathogenicity of the fungus on grapevine leaves are important for the understanding of the pathosystem epidemiology. In order to preserve the pathogen and determine the favorable conditions for the disease were evaluated: (1) The effect of temperature and dehydration in maintaining the viability of the spores; (2) The effect of temperature and wetness period on uredospores germination and pathogenicity in \'Niágara Rosada\' inoculated plants. The results showed that spore dehydration maintained high viability, for all the tested storage conditions. Dehydration followed by storage at -80°C kept viable spores, with a high percentage of germination, for 150 days of storage. The uredospores stored in the environment, independent of the dehydration process, could not maintain their viability for a period exceeding 15 days. The temperature range for uredospores germination varied from 10 to 30°C, with an optimal at 20°C. The expression of symptoms in inoculated plants was higher at 25°C and 30°C temperatures. The minimum wetness period estimated by the monomolecular model was 7 hours for plants kept at 15 °C and 5 hours for plants kept at 20, 25 and 30 ºC. For wetness periods up to 6 hours, the highest disease severity occurred at 30 °C. There were no symptoms on inoculated plants maintained at 35°C in any of the tested wetness periods. The rust latency period was 7 days for inoculated plants kept at 25 and 30°C extending for 13 days when the plants were kept at 15°C.

Bacillus subtilis é uma bactéria gram positiva de solo, não patogênica, não colonizadora de tecidos, naturalmente transformável e formadora de esporos utilizada como modelo de estudo de bactérias gram-positivas. Essas características acarretam em vantagens para a produção de proteases de interesse industrial e para utilização como veículo de antígenos vacinais, porém a falta de vetores induzíveis torna sua utilização como ferramenta biológica pouco explorada. No presente trabalho descrevemos a construção de diferentes vetores capazes de expressar os antígenos subunidade B da toxina termo-lábil (LTB) e subunidade estrutural da fímbria CFA/I (CFAB) de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) e avaliamos seu potencial vacinal. Foi avaliada a imunogenicidade de linhagens capazes de expressar LTB sob o controle de diferentes promotores: PgsiB (induzido em condições de estresse), PlepA (promotor constitutivo) e Pspac (induzido pela adição de IPTG) e em diferentes locais da célula (ancorada à parede celular ou secretada para o meio externo). Avaliamos ainda a imunogenicidade de linhagens capazes de co-expressar LTB e a listeriolisina O (LLO) de Listeria monocytogenes. O antígeno CFAB foi produzido no citoplasma ou ancorado à parede celular de B. subtilis em condições de estresse e as linhagens bacterianas administradas sozinhas ou conjuntamente com a toxina termo-lábil (LT) como adjuvante de mucosa. Camundongos imunizados com células ou esporos de B. subtilis recombinantes desencadearam respostas de anticorpos sistêmicos e secretados específicos para os antígenos (LTB e CFAB), não alterados pela adição do adjuvante. A expressão de LLO causou a supressão da resposta de anticorpos específicos para o antígeno LTB. Os resultados obtidos demonstram a viabilidade do uso de B. subtilis como veículo vacinal. / Bacillus subtilis is a gram positive, generally regarded as safe and spore forming soil bacteria used as a model for genetic and phisiological studies. This safety status allow its use as host for production of industrial protases and its application as vaccine vehicles, however the lack of epissomal inducible expression systems disable the exploration of this organism as a biotechnologic tool. In this work we describe the construction of epissomal vectors able to express the B subunit of the heat-labile toxin (LTB) and the structural subunit of the CFA/I fimbrae (CFAB) from the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). We evaluate strains able to express LTB under the control of three promoters: PgsiB (stress inducible), PlepA (constitutive) e Pspac (IPTG inducible) and allowing the expression of LTB secreted or anchored to the cell wall We also evaluate the immunogenicity of strains able to co-express LTB and the listeriolysin O (LLO) from Listeria monocytogenes. CFAB was expressed in the cytoplasm or anchored to the cell wall and administred alone or with the mucosal adjuvant LT. Mice immunized both with cells or spores elicited secreted and systemic specific antibodies responses, which were not altered by the addition of the adjuvant LT. LLO expression suppressed the antibodies responses against LTB. The data shows the ability of B. subtilis to be used as vaccine vehicle.

A transmissão de parasitas da malária por mosquitos vetores é dependente do desenvolvimento bem sucedido das formas infectantes de Plasmodium sp., especialmente os esporozoítas, que são as formas que infectam o hospedeiro vertebrado. A manipulação genética de mosquitos vetores tem sido uma estratégia alternativa na tentativa de controle da malária. Um componente extremamente importante desta estratégia é a escolha de uma molécula efetora capaz de reduzir a transmissão do patógeno. Microplusina é um peptídeo antimicrobiano rico em cisteína, originalmente descrito como um componente antimicrobiano da hemolinfa e dos ovos de carrapato bovino Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Testes anteriores utilizando o modelo experimental mosquito Aedes aegypti infectado por Plasmodium gallinaceum mostraram que a microplusina é altamente tóxico para esporozoítas de Plasmodium gallinaceum em concentração relativamente baixa, sem apresentar toxicidade aos mosquitos vetores Aedes aegypti. Nosso objetivo foi analisar a expressão da microplusina e seu efeito na infecção de P. gallinaceum em mosquitos transgênicos. Obtivemos quatro linhagens através da integração de um transgene contendo a região promotora do gene da vitelogenina de Ae. aegypti, peptídeo sinal maltase-like I de Ae. aegypti e a sequência codificadora da microplusina (PMOS [3xP3-EGFP-AeVg Micro]). A atividade anti esporozoítas da microplusina expressa pelos mosquitos transgênicos mostrou diferença significante as linhagens. O desenho de novas moléculas utilizando como molde moléculas efetoras existentes e testadas, possibilitará o aperfeiçoamento da expressão de genes exógenos em mosquitos transgênicos, tornando-os refratários ao parasita. / Transmission of malaria parasites by mosquito vectors is dependent on the successful development of Plasmodium sp. infective forms, particularly the sporozoites, which are the forms that enter the vertebrate host. The genetic manipulation of mosquito vectors has been a strategy for malaria control. An extremely important component of this strategy is the effector molecule of choice which reduces parasite transmission. Microplusin is a cysteine-rich antimicrobial peptide originally described as an hemolymph and eggs antimicrobial component of the cattle tick Boophilus microplus. Previous tests using the experimental model Plasmodium gallinaceum infected Aedes aegypti showed that microplusin is highly toxic to P. gallinaceum sporozoites in relatively low concentration, without showing toxicity to the mosquito vector A. aegypti. Our goal was to analyze transgenic mosquitoes expressing microplusin and its effect on infection of P. gallinaceum. We obtained four lines through the integration of transgene that containing the promoter region of the A. aegypti vitelogenin gene, the maltase-like I signal peptide of A. aegypti and microplusin coding sequence (pMos[3xP3-EGFPAeVg-Micro]). The activity anti sporozoites microplusin expressed by transgenic mosquitoes showed significant differences between strains. The design of effector molecules using information from existing and tested molecules as template will enable the improvement of the expression of foreign genes in transgenic mosquitoes, making them resistant to the parasite.

Neozygites floridana is an important natural enemy of Tetranychus urticae in many crops, including strawberry. In this crop there has been some changes in the production system from open field to low tunnel. This new system presents benefits to strawberry production, moreover this system increases problems with spider mites and some fungal plant pathogens; consequently increasing the use of pesticides. In order to integrate N. floridana in the management of spider mites in strawberry there are still many important aspects to be revealed on the biology, epizootiology of the fungus and the effect of crop systems on its prevalence in the field. For this, three studies were performed, being the first one about the effect of strawberry production systems (low tunnel and open field) and pesticide application on population dynamics of two-spotted spider mite T. urticae, its natural enemies (N. floridana and predatory mites), and plant diseases, the experiment was performed in Inconfidentes-MG. The population of T. urticae attained the highest level in treatments with chemical control of pest, independently of the crop system, low tunnel or open field. The fungus N. floridana was observed late in both crop seasons, in treatments with and without inoculative releases, and has suggested that it might be a natural occurrence of the fungus. The highest prevalence of the fungus were observed in treatments with high densities of T. urticae. The predatory mites occurred naturally during the two crop seasons, and the most abundant species was Neoseiulus anonymus (Chant) (57.5%). The incidence of fungal plant diseases are greater in the open field than in low tunnel, however it seems that the crop system do not affect the new disease \"vermelhao\". The second study aimed to reveal the abiotic and biotic factors involved in the regulation of resting spores formation in the hosts T. urticae and T. evansi. The Brazilian isolate ESALQ1420 produced a large number of resting spores (51.5%) in T. urticae at a temperature 11 °C, photoperiod of 10L:14D, light intensity of 42-46 (?mol m-2s-1), on non-senescent plants. Small percentages of mites with resting spores (0-5 %) were found for the Norwegian isolate NCRI271/04 under the conditions tested, and very low percentages of resting spores (up to 1%) were observed in T. evansi infected by the Brazilian isolate ESALQ1421.The third study was therefore conducted phylogenetic analysis of isolates of N. floridana and develops efficient real-time PCR-based analysis for detection and quantification of N. floridana propagules from the soil. The phylogenic three showed that Neozygites is a fungal group far from other Entomophthoromycota and that N. floridana present high intra-specific variability. This data indicates that the isolates from different Tetranychus species may be in fact different Neozygites species, not described yet. We developed a real-time PCR probe for detection and quantification of N. floridana in the soil. This molecular probe was successful in quantifying N. floridana at relatively high DNA concentrations seeded into the soil. / Neozygites floridana é um importante inimigo natural de Tetranychus urticae em diversas culturas, incluindo morango. Nesta cultura tem havido uma mudança no sistema de produção, passando de cultivo em campo aberto para túnel baixo. Este novo sistema apresenta benefícios na produção de morango, no entanto pode aumentar problemas com ácaros fitófagos e algumas doenças fúngicas, consequentemente aumentando o uso de agrotóxicos. Para a integração de N. floridana no manejo de ácaros fitófagos em morango, existem ainda muitos aspectos importantes a serem conhecidos sobre a biologia, epizootiologia do fungo e efeito dos sistemas de cultivo sobre a sua prevalência em campo. Para isso três estudos foram realizados, sendo o primeiro estudo sobre o efeito de sistemas de produção de morango (túnel baixo e campo aberto) e da aplicação de agrotóxicos sobre a dinâmica populacional do acaro rajado T. urticae, seus inimigos naturais (N. floridana e ácaros predadores) e doenças de plantas, o experimento foi realizado em Inconfidentes-MG. A população de T. urticae atingiu altos níveis em tratamentos com controle químico de pragas, independente do sistema de cultivo, túnel baixo ou campo aberto. O fungo N. floridana foi observado no final de ambos os ciclos de cultivos, nos tratamentos com e sem liberações inoculativas, sugerindo que houve incidência natural do fungo. As maiores prevalências do fungo foram observadas em tratamentos com altas densidades de T. urticae. Os ácaros predadores ocorreram naturalmente durante os dois ciclos de cultivo, sendo Neoseiulus anonymus (Chant) a espécie mais abundante (57.51%). A incidência de doenças fúngicas foi maior em campo aberto do que em túnel baixo, no entanto parece que o sistema de cultivo não afetou a incidência da nova doença vermelhão. No segundo estudo objetivou-se conhecer os fatores abióticos e bióticos envolvidos na formação de esporos de resistência nos hospedeiros T. urticae e Tetranychus evansi. O isolado brasileiro ESALQ1420 produziu um grande número de esporos de resistência (51.5%) em T. urticae, a uma temperatura de 11 ° C, fotoperíodo de 10F:14E, intensidade de luz de 42-46 (?mol m-2s-1), em plantas senescentes. Pequenas percentagens de ácaros com esporos de resistência (0-5%) foram encontrados para o isolado Norueguês NCRI271/04 sob as condições testadas, e muito baixas percentagens de esporos de resistência (ate 1%) foram observados em T. evansi infectados pelo isolado brasileiro ESALQ1421. O terceiro estudo objetivou analisar filogeneticamente os isolados de Neozygites patogênicos a ácaros, e desenvolver ferramenta utilizando PCR em tempo real para a detecção e quantificação de propágulos de N. floridana a partir do solo. A arvore filogenética mostrou que Neozygites e um grupo de fungos distante dos demais Entomophthoromycota, e que estes fungos apresentaram alta variabilidade intraespecífica entre isolados de N. floridana. Estes resultados indicam que isolados provenientes de diferentes espécies hospedeiras do gênero Tetranychus podem ser de fato diferentes espécies de Neozygites não descritas ainda. Desenvolveu-se uma sonda molecular para detecção e quantificação de N. floridana no solo utilizando PCR em tempo real. Esta sonda foi eficiente na quantificação de N. floridana, em concentrações relativamente altas de DNA inoculado no solo.

Com este estudo, objetivou-se avaliar o efeito de estirpes de Bacillus thuringiensis (Bt) na degradabilidade e digestibilidade da dieta, emissão de gases, microbiota ruminal, parâmetros sanguíneos e desempenho de ovinos. O estudo foi dividido em 2 experimentos: ensaio in vitro de produção de gases para a avaliação de 6 diferentes estirpes de Bt (907, 1192, 2036, 2493, 2496 e S1185) e ensaio in vivo com a estirpe selecionada 2036 para investigação de possíveis interferências na digestão e saúde dos animais. A simulação do ambiente ruminal foi realizada em garrafas de vidro incubadas a 39 oC por 24 h. O delineamento foi o inteiramente casualizado com 7 tratamentos (Sem Bt (controle), Bt 907, Bt 1192, Bt 2036, Bt 2493, Bt 2496 e Bt S1185) com 4 repetições em duplicata. O processo fermentativo foi avaliado pelos resultados de matéria seca degradada (MSD), matéria orgânica degradada (MOD), produção líquida de gases totais, produção líquida de metano e eficiência da conversão de metano. Produtos da fermentação (pH, nitrogênio amoniacal (N-NH3) e ácidos graxos de cadeia curta (AGCC)) e micro-organismos ruminais (Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, fungos anaeróbicos, arqueas metanogênicas e protozoários) também foram estudados. Apenas a estirpe Bt 907 reduziu a MSD e MOD em relação ao controle, com manutenção da população de F. succinogenes, pois as demais estirpes reduziram a população desta bactéria. No ensaio in vivo 20 cordeiros Santa Inês com 3 meses de idade e 18 ± 3,5 kg PV foram utilizados e divididos em 2 grupos: 10 animais tratados com 2,5x106 esporos de Bt 2036 por kg PV/d e 10 animais não tratados (controle). Estes foram alojados em baias individuais em delineamento inteiramente casualizado e receberam dieta composta de feno de capim Tifton-85 (Cynodon spp.) ad libitum e 300 g/animal/d de concentrado, que foi ajustado de acordo com as exigências de crescimento. O período experimental in vivo teve duração de 63 dias, dos quais 53 compreendeu o teste de desempenho dos animais, com aferição do consumo 3 vezes na semana e pesagem quinzenal, e os 10 dias subsequentes destinou-se aos ensaios de digestibilidade aparente, balanço de nitrogênio, síntese de proteína microbiana e emissão de metano entérico. Durante todo o experimento, coletas se sangue foram realizadas quinzenalmente a fim de avaliar os parâmetros hematológicos (hemácias, hemoglobina, hematócrito e leucócitos) e bioquímicos (glicose, proteínas totais, albumina, aspartato aminotransferase, ureia e creatinina) dos animais para o diagnóstico de possível intoxicação. Características da fermentação ruminal também foram investigadas em 3 momentos (início, meio e fim do experimento) sobre as variáveis pH, N-NH3, AGCC, abundância relativa das espécies F. succinogenes, R. flavefaciens, populações de arqueas metanogênicas, fungos anaeróbicos e contagem de protozoários, por meio de coletas de líquido ruminal. Não houve influência da estirpe sobre as variáveis estudadas. Conclui-se que na avaliação in vitro apenas a estirpe Bt 907 reduziu a MSD e MOD com manutenção da população F. succinogenes e no experimento in vivo a inclusão de esporos de Bt 2036 na dieta não afetou de forma negativa o desempenho e nem a saúde dos ovinos / The objective of present study was to evaluate the effect of Bacillus thuringiensis (Bt) strains on degradability and digestibility of the diet, gas production, ruminal fermentation, blood parameters and performance in sheep. The study was divided into 2 experiments: in vitro gas production to evaluate six different Bt strains (907, 1192, 2036, 2493, 2496 and S1185) and in vivo assay with the selected strain (Bt 2036) to investigate possible interference in digestion and health of animals. The rumen simulation was performed in glass bottles incubated at 39 °C for 24 h. A completely randomized design with 7 treatments (No Bt (control), Bt 907, Bt 1192, Bt 2036, Bt 2493, Bt 2496 and Bt S1185) was used, with 4 replications in duplicate. The fermentation process was evaluated using dry matter degradability (DMD), organic matter degradability (OMD), net gas production, methane output and conversion efficiency. Fermentation products (pH, ammonia nitrogen (N-NH3), short chain fatty acids (SCFA)) and ruminal microorganisms (Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, anaerobic fungi, methanogenic archaea and protozoa) were also studied. Only strain Bt 907 reduced DMD and OMD in relation to the control and F. succinogenes populations were maintained, whereas other strains of this bacterium population were reduced. An in vivo assay using 20 Santa Ines lambs at 3 months of age and 18 ± 3.5 kg BW was carried out. These animals were divided into 2 groups: 10 animals treated with 2.5x106 spores of Bt 2036 per kg BW/d and 10 untreated animals (control). These were housed in individual pens in a completely randomized design and were fed a diet of Tifton-85 (Cynodon spp.) hay ad libitum and 300 g/animal/d of concentrate, which was adjusted according to animal growth. The in vivo experimental period lasted 63 days, of which 53 included the performance test of the animals, with measurement of feed consumption three times a week and fortnightly weighing. The final 10 days was devoted to tests of digestibility, nitrogen balance, microbial protein synthesis and enteric methane emission. Throughout the experiment, blood was collected fortnightly to assess hematological parameters (erythrocytes, hemoglobin, packed cell volume and leukocytes) and biochemical profiles such as (Glucose, total protein, albumin, aspartate aminotransferase, urea and creatinine) for the diagnosis of possible intoxication. Ruminal fermentation characteristics were investigated at three times (Initial, middle and end of the experiment) using pH, N-NH3, SCFA, microorganism population size (such as F. succinogenes, R. flavefaciens, methanogenic archaea, anaerobic fungi and protozoa) through ruminal fluid collections. There was no influence of Bt 2036 on ruminal fermentation characteristics. It is concluded that, for the in vitro evaluation, only strain Bt 907 reduced DMD and OMD, with F. succinogenes population being maintained and for the in vivo studies, the inclusion of Bt 2036 spores in the diet did not negatively affect health and performance of lambs

OBJETIVOS: Estudar o ambiente interno em escolas públicas situadas em duas cidades (Atibaia e São Paulo), com diferentes níveis de poluição atmosférica, mediante a identificação e quantificação dos principais alérgenos presentes na poeira e no ar das salas de aula dessas escolas, assim como a avaliação da existência de padrão sazonal para cada um dos alérgenos estudados. MATERIAIS E MÉTODOS: As amostras de poeira foram coletadas de uma única sala de aula em cada escola, uma vez por mês durante um ano. A cada visita foram medidas a temperatura e umidade relativa do ar. A aspiração da poeira foi realizada em 8 pontos da sala, sendo 2 próximos à janela, 2 junto à porta, 2 junto à lousa e 2 no centro. Uma das amostras aspirada de cada local foi analisada quanto à sua composição, através de leitura por ELISA, utilizando-se anticorpos monoclonais (Indoor Biotechnologies-USA), para dosagem dos seguintes alérgenos: Der p 1, Der f 1, Blo t 5, Fel d 1, Can f 1, Asp f 1, Alt a 1, Bla g 1 e Bla g 2. A outra amostra foi semeada em agar Sabouraud para cultura para fungos. As amostras de ar foram coletadas por 20 minutos com o aparelho de Andersen N-6, um impactador de 6 estágios, colocado no centro da sala de aula. Os gêneros dos fungos foram identificados pela observação macroscópica das xi colônias e pelas características microscópicas das hifas, determinadas pela técnica de Ridell. RESULTADOS: Os resultados mostraram baixos níveis (< 2ug/g) de alérgenos de ácaros (Der p 1, Der f 1 e Blo t 5) na maioria das amostras de poeira dos pisos das escolas. Também foram encontrados baixos níveis (< 1ug/g) dos alérgenos animais (Fel d 1 e Can f 1), sendo que maiores níveis de Can f 1 foram detectados nas amostras da escola de São Paulo. Os alérgenos de barata não foram detectados nas duas escolas. As maiores quantidades de alérgenos de ácaros ocorreram durante a primavera e as menores no outono. Em Atibaia, verificaram-se maiores níveis de alérgenos de ácaros e esporos de fungos junto à lousa. Foram identificados 19 gêneros de fungos nas amostras de poeira e 25 gêneros nas amostras de ar das duas escolas. Destacaram-se Cladosporium nas amostras coletadas com aparelho de Andersen e Trichoderma nas amostras aspiradas. Considerando-se o total de esporos de fungos obtidos com aparelho de Andersen, não houve diferença estatisticamente significante entre as escolas de Atibaia e São Paulo, assim como não houve diferença entre as estações do ano. Em relação às amostras de poeira coletadas com aspirador, São Paulo apresentou os maiores níveis de UFC/g de poeira. CONCLUSÃO: Os pisos e o ar das escolas estaduais estudadas parecem não representar fonte importante de exposição à alérgenos de ácaros, fungos, cães, gatos e baratas, independente da presença de poluição atmosférica / Objective: To study indoor environment in public schools located in two cities (Atibaia and São Paulo) with different degrees of air pollution, identifying and measuring the most important allergens in classroom dust and air samples and evaluating the existence of seasonal variation for each allergen. Methods: Dust samples were obtained from a single classroom in each school, once a month during a year. During each visit temperature and relative humidity were measured. Floor dust was collected from eight different sites: 2 near the door, 2 near the window, 2 near the blackboard and 2 in the middle of the room. One sample collected from each site was analyzed by using mAb-based ELISAs (Indoor Biotechnologies-USA) for Der p 1, Der f 1, Blo t 5, Asp f1, Alt a 1, Fel d 1, Can f 1, Bla g 1 and Bla g 2. The other samples were plated on Sabouraud dextrose agar. Air samples were collected for 20 minutes with a N-6 Andersen sampler, a six-stage impactor, located in the middle of the classroom. Fungal genera were identified by macroscopic observation of the colonies and by the microscopic characteristics of the sporulating hyphae determined by the Ridell technique. Results: The results showed low levels (<2ug/g) of mite allergens (Der p 1, Der f 1 and Blo t 5) in most dust samples collected from the classroom\'s floor. Low levels (<1ug/g) of animal allergens (Fel d 1 and Can f 1) were found too, and higher levels of Can f 1 were detected in dust samples from São Paulo. Cockroach allergens (Bla g 1 and Bla g 2) were undetectable in all samples. Higher levels of mite allergens occurred during spring and lower during autumn. Higher levels of mite allergens and fungal spores were found near the blackboard in Atibaia. A total of 19 different fungal genera were distinguished in dust samples, while 25 genera were identified in air samples. The most frequently isolated fungal genera in Andersen samples was Cladosporium and in dust samples was Trichoderma. Considering total mold spores obtained with Andersen sampler, there was no statistically significant difference between São Paulo and Atibaia schools, neither between the seasons of the year. In relation to dust samples collected with vaccum cleaner, the school from São Paulo presented higher levels of UFC/g of dust. Conclusion: The floor and air from these two elementary schools in São Paulo seems not to represent an important source of exposure to allergens from mites, molds, cats, dogs and cockroach, independent on the presence of air pollution.

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New azolics such as posaconazole and voriconazole began to be used, but with limitations due to the high cost, the use of physical methods such as cryosurgery, thermotherapy, laser therapy and both. The low cure rates and high rates of relapse of the disease may be related to the different treatment methods employed and the lack of a standardized regimen itself. The objective of this work was to evaluate the in vitro sensitivity of conidia and in vitro induced muriform cells of Fonsecaea spp. in the presence of different antifungal agents, to date there are no studies evaluating the action of drugs using the pathogenic form of the fungus, reinforcing the importance of this study, following the method established in the standard M38-A2, Clinical and Laboratory Standards Institute. The minimum inhibitory concentration for each drug was obtained after 5 days of interaction, posaconazole showed better in vitro inhibitory activity for conidia (CIMMG = 0.632μg / ml) and muriform cells (CIMMG = 1μg / ml). In the analysis of the fungicidal concentration, in both conidia and muriform cells, posaconazole presented lower value (CFMMG = 6.72μg / ml, in both). The fungus samples presented distinct times to differentiate their conidia in muriform cells, therefore we believe that although they belong to the same genus the fungi present physiological peculiarities still unknown. In the in vitro susceptibility tests PCZ had the lowest inhibitory and fungicidal concentrations in both conidia and muriform cells, thus investing in susceptibility testing was important to identify sensitive or resistant strains. / A cromoblastomicose (CBM) é uma doença fúngica caracterizada por lesões crônicas cutâneas e subcutâneas, decorrentes da implantação transcutânea prévia de diferentes fungos negros, pertencentes a família Herpotrichiellaceae, o principal agente pertencente ao gênero Fonsecaea. A região amazônica é a principal área endêmica do Brasil, o estado do Pará a principal área endêmica no país e segunda no mundo. Não há uma padronização de tratamento, é usado a terapia medicamentosa, com diferentes esquemas, principalmente itraconazol. Novos azólicos como posaconazol e voriconazol começaram a ser utilizados, mas com limitações devido ao alto custo, o uso de métodos físicos como a criocirurgia, termoterapia, terapia a laser e a combinação de ambos. As baixas taxas de cura e altas taxas de recidivas da doença pode estar relacionado aos diferentes métodos de tratamento empregados e a própria falta de um esquema padronizado. O objetivo deste trabalho foi avaliar a sensibilidade in vitro de conídios e células muriformes, induzidas in vitro, de Fonsecaea spp. frente a diferentes antifúngicos, até o momento não há estudos que avaliem a ação de fármacos usando a forma patogênica do fungo, reforçando a importância deste estudo, seguindo o método estabelecido na norma M38-A2, do Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). A concentração inibitória mínima para cada fármaco utilizado foi obtida após 5 dias de interação, o posaconazol apresentou melhor atividade inibitória in vitro para conídios (CIMMG=0.632μg/ml) e células muriformes (CIMMG=1μg/ml). Na análise da concentração fungicida, tanto em conídios quanto em células muriformes, o posaconazol apresentou menor valor (CFMMG=6.72μg/ml, em ambos). As amostras fúngicas apresentaram tempos distintos para diferenciar seus conídios em células muriformes, portanto acreditamos que apesar de pertencerem ao mesmo gênero os fungos apresentam particularidades fisiológicas ainda desconhecidas. Nos testes de suscetibilidade in vitro, o PCZ teve as menores concentrações inibitórias e fungicidas tanto em conídios quanto em células muriformes,com isso investir em testes de suscetibilidade foi impor importante para identificar cepas sensíveis ou resistente.

O suco de laranja possui características que dificultariam ou mesmo impediriam o crescimento de microrganismos, mesmo assim já foram isolados fungos filamentosos, leveduras, bem como bactérias lácticas e termorresistentes. Dentre as bactérias termorresistentes e deteriorantes está a Alicyclobacillus acidoterrestris que tem causado prejuízos no setor de suco de laranja concentrado e congelado. Esta bactéria está apta a crescer em temperaturas abaixo de 35°C, constituindo um risco aos sucos de laranja que estejam contaminados. Mesmo os que já passaram por tratamento térmico, se forem estocados em local sem refrigeração, podem sofrer deterioração. Como os métodos tradicionais de descontaminação e conservação não têm se mostrado eficientes na inviabilização dessa bactéria, outras formas de esterilização tornam-se necessárias, dentre elas destacam-se as radiações gama e ultra-sônica. A radiação gama é capaz de esterilizar alimentos e reduzir as cargas microbiológicas, permitindo assim ampliar o período de armazenamento. A aplicação de ultra-som tem sido utilizada atualmente com o objetivo de controle microbiológico, sendo essa técnica eficiente por causar a destruição das células microbianas. Sendo o Brasil o maior produtor e exportador de suco de laranja concentrado congelado, no presente trabalho foram conduzidos dois experimentos com o objetivo de determinar a resistência da bactéria A. acidoterrestris às radiações gama e ultra-sônica, em suco de laranja previamente contaminado. As amostras de suco de laranja foram diluídas a 11,5 °Brix e inoculadas com uma suspensão bacteriana, passando pelos processos de radiação gama com as doses de 0, 2; 4; 6 e 8, kGy e ultra-sônica com as freqüências de 25, 35 e 42 kHz e com os tempos de exposição de 0, 1, 5, 10 e 20 minutos. Após o tratamento, as amostras foram armazenadas em temperatura ambiente (25±2°C) e de refrigeração (4±1°C). Para as análises microbiológicas as amostras foram diluídas em escala decimal, plaqueadas pela técnica de \"pour plate\". As placas de Petri permaneceram em estufa a46±2°C, por 48 horas, após esse período procedeu-se a contagem das UFC mL-1. A qualidade microbiológica do suco foi avaliada em determinados períodos de armazenamento (1, 10, 20, 30 e 40 dias). Através de análise de variância dos experimentos conduzidos com as radiações, observou-se que houve efeito significativo (p<0,05) com relação à dose de radiação gama que apresentou uma redução da carga microbiana com o aumento da dose de radiação e à interação do período com a temperatura de armazenamento demonstrou que houve uma oscilação na contagem total para a temperatura ambiente, mas para a temperatura de refrigeração uma diminuição gradativa com o aumento do período de armazenamento, A freqüência do ultra-som mostrou uma diminuição da contagem microbiana com o aumento da freqüência e o período de armazenamento apresentou a maior contagem no primeiro dia. Os dois tratamentos mostraram-se eficientes na redução bacteriana, mas não na completa eliminação da A. acidoterrestris. / The orange juice has attributes could make that hard or even block the growth. of microorganisms, even so already have been isolated filamentous fungi, yeast, as well lactics and heat resistant bacteria. Alicyclobacillus acidoterrestris is a heat resistant bacteria that has done damage in the orange juice concentrated and frozen business. This bacterium is able the grown in temperatures below 35°C constituting a risk to orange juices that have been contaminated. Even those that already pass trough thermal treatment may deteriorated, if they are storage in place without refrigeration. As the traditional methods of decontamination and conservation have not been effective in inviabilizated this bacterium, others methods of sterilization are need, among them are gamma and ultrasound radiation. The gamma radiation is able to sterilize foods and reduce the microbiology density, allowing in this way to enhance the period of storage. The ultrasound application has been used currently with the aim to microbiology control, been this technique effective in the microbial cell destruction. The Brazil, are the major producer and exporter of concentrated frozen orange juice, due to it, the present work was carried out to two experiments with the aim to determinate the resistance of the bacterium Alicyclobacillus acidoterrestris to gamma and ultrasound irradiation, in the orange juice, priory contaminated. The orange juice samples was diluted to 11,5°Brix and the bacteria suspensions was added, passed by process of radiation gamma with dose of 0, 2, 4, 6 and 8 kGy and ultrasonic with the frequency of 25, 35 and 42 kHz and with the time of exposition of 0, 1, 5, 10 and 20 minutes. After the treatment, the samples were storaged in room temperature (25±2°C) and of refrigeration (4±1°C). For the microbial analyses, the samples were diluted in to decimal scale, plated by \"pour plate\" technique. The Petri plates were storage in warn temperature (46±2°C) by 48 hours, after it the UFC was counted mL. The microbiological quality of the juice was evaluated in determinated period of storaged (1, 10, 20, 30 e 40 days). By statistical of variance of the experiment conducted with the radiations, it was noted that has been significant effect (p>0,05) to gamma radiation doses where occurred microbial density reduction with the raised of radiation doses and the interaction of the period with the storage temperature, where at room temperature occurred a oscillation in the total counting of bacteria, but for refrigeration temperature the total counting of bacteria reduced with the raised of storage period. The ultrasound frequency showed also reduction to the microbial counting with the raised of the ultrasound frequency and the period of storage showed the highest bacteria counting in the first day. Both treatment, were effective to promote bacteria reduction, but not completed elimination of A. acidoterrestris.

SOUZA, Pedro Filho Noronha de.Purificação, caracterização bioquímica e atividade antimicrobiana de uma nova albumina 2s da torta da mamoneira (Ricinus communis L.), com atividade inibitória contra tripsina. 2012. 114 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-06-27T14:14:02Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_pfnsouza.pdf: 1847174 bytes, checksum: 6675a05ab248cfb741080071e366161c (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:11:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_pfnsouza.pdf: 1847174 bytes, checksum: 6675a05ab248cfb741080071e366161c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:11:34Z (GMT). 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Unfortunately, its use as food has not been possible because of the presence of toxic elements and allergens (ricin, ricinine, complex allergens) in its composition, unless it were previously submitted to a detoxification process. To date, the existing technologies to this end are not economically viable on an industrial scale. Therefore, studies to add value to this abundant byproduct generated in the castor bean biodiesel productive chain is of paramount importance. Thus, in this context, this study was performed to identify, isolate, purify and characterize new bioactive molecules of de-oiled castor cake with biotechnological potential. Through extraction of soluble proteins with 50 mM Tris-HCl pH 7.5, fractionation with ammonium sulfate (50-75%), following by hydrophobic interaction chromatography in Phenyl-Sepharose column and ion exchange chromatography (DEAE-Sepharose), a protein, named Rc-2S-Alb, able to inhibit trypsin was purified. Rc-2S-Alb has a molecular mass of approximately 75.8 kDa, as determined by SDS-PAGE, and under reducing conditions showed a large and a small protein band of 15.8 kDa and 10.5 kDa, respectively. Its NH2-terminal sequence showed similarity with the following proteins: putative 2S albumin precursor (89%), chain A of RicC3 (89%), and chain A of mabilin-1 (89%), all from R. communis seeds; and with the short chain of a "napin-like" protein from Brassica napus (89%). In addition, these similar proteins have two highly conserved domains: QEVQRKDLS and YLRQS. Comparison of the partial primary structure of Rc-2S-Alb generated by the ESI-Q-TOF MS/MS analysis of 17 tryptic peptides, showed 43% similarity to Mabinlin-1 (pI/Mr 6.7 and 29.3 kDa) from R. communis. There were also high similarities among the three-dimensional structures of Rc-2S-Alb, RicC3 and Mabinlin-1. Rc-2S-Alb did not inhibit the spore germination of the phytopathogenic fungi Fusarium oxysporum and Rizoctonia solani, but promoted aggregation of their respective spores. Moreover, Rc-2S-Alb did not inhibit the mycelial growth of Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rizoctonia solani and Collethotricum gloeosporioides. Contrary, Rc-2S-Alb was effective in inhibiting the growth of the human pathogenic bacteria Pseudomonas aeruginosae, Klebsiella pneumoniae and Bacillus subtilis, at low concentrations. In conclusion, it was established a protocol to purify a new 2S albumin from castor bean cake, which inhibits trypsin and has important antibacterial activity. Thus, the Rc-2S-Alb should be further studied in order to verify its effectiveness as new alternative therapeutic agent against resistant bacteria to commercial antibiotics, which will contribute to improve the human health. / A mamoneira (Ricinus communis L.) é uma cultura importante para a região Nordeste do Brasil, onde, recentemente, tem sido utilizada para produção de biodiesel. O Nordeste detém 90% da produção brasileira de mamona, sendo o Ceará, o segundo maior produtor. No processo de extração de óleo das sementes de mamoneira para produção de biodiesel, o resíduo resultante, denominado de torta da mamona, representa um subproduto pouco utilizado. Apesar disso, essa torta é rica em proteínas e micronutrientes, como nitrogênio, fósforo e potássio, atributo que a qualifica como um insumo que poderia ser utilizado como adubo orgânico, ou mesmo como ração animal, o que lhe agregaria valor comercial. Todavia, seu uso como alimento não tem sido possível por causa da presença de elementos tóxicos e alergênicos (Ricina, Ricinina, Complexos Alergênicos) na sua composição, a não ser que passasse por processamento para sua destoxificação. Infelizmente, tecnologia economicamente viável para esse fim, em escala industrial, ainda é inexistente. Portanto, há necessidade de pesquisas que venham a agregar valor a esse subproduto abundante da cadeia produtiva do biodiesel. Assim, nesse contexto, o presente trabalho está inserido num projeto cujo objetivo maior é identificar, isolar, purificar e caracterizar novas moléculas bioativas da torta delipidada de sementes de mamoeira com potencial biotecnológico. Através de extração de proteínas solúveis com tampão Tris-HCl, 50 mM, pH 7,5, e fracionamento do extrato obtido com sulfato de amônio (50-75%), cromatografia de interação hidrofóbica em coluna Phenyl-Sepharose e cromatografia de troca iônica (DEAE-Sepharose) foi possível purificar uma albumina 2S, denominada Rc-2S-Alb, capaz de inibir tripsina. A Rc-2S-Alb apresentou massa molecular de, aproximadamente, 75,8 kDa, determinada por SDS-PAGE, mas, em condições redutoras, apareceu como uma banda maior de 15,8 kDa e outra menor com 10,5 kDa. Sua sequência NH2-terminal revelou haver similaridade (89%) com o precursor putativo da albumina 2S de R. communis já descrita, com a cadeia A da estrutura da RicC3 (89%), com a cadeia A da mabilin-1, ambas, também, de R. communis (89%), com a cadeia pequena de uma proteina “napin-like”de Brassica napus (89%). Em todas essas proteínas similares, dois domínios, QEVQRKDLS e YLRQS, são altamente conservados. Comparação da estrutura primária gerada por ESI-Q-TOF MS/MS, a apartir de 17 peptídeos trípticos da Rc-2S-Alb, mostrou similaridade de 43% com a Mabinlin-1 (pI/Mr de 6,7 e 29.3 kDa) de R. communis. Em relação à estrutura tridimensional da Rc-2S-Alb, ela apresentou similaridade com a de Ric C3 e Mabinlin-1. A Rc-2S-Alb foi incapaz de inibir a germinação de esporos dos fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum e Rizoctonia solani, mas foi capaz de promover a aglomeração dos mesmos. A Rc-2S-Alb também não foi capaz de inibir o crescimento micelial dos fungos Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rizoctonia solani e Collethotricum gloeosporioides. Por outro lado, a Rc-2S-Alb foi eficiente em inibir o crescimento de Pseudomonas aeruginosae, Klebsiella pneumoniae e Bacillus subtilis, todas as bactérias patogênicas a seres humanos, quando em baixas concentrações. Como conclusão, foi possível a purificação de uma nova albumina 2S da torta da mamona, capaz de inibir tripsina e com atividade antibacteriana importante. Assim, a Rc-2S-Alb deve ser explorada no sentido de verificar sua eficácia como um novo agente terapêutico alternativo no combate a bactérias resistentes aos produtos disponíveis, hoje, no mercado, o que, se confirmado, poderá contribuir para a melhoria da saúde humana.