Introdução: Devido ao fato dos antiinflamatórios serem amplamente utilizados no meio atlético, da suposta melhora de desempenho pelo efeito analgésico, independentemente da presença ou não de lesão, e, por fim, em razão dos extensos relatos de efeitos adversos associados a esta classe farmacológica, o objetivo da presente Tese Doutoral foi verificar a potencialidade do antiinflamatório não-esteroidal (AINE) Ibuprofeno em enquadrar-se como doping segundo o Código Mundial Antidoping da Agência Mundial Antidoping (WADA-COI), segundo critérios de ergogenia e risco à saúde em atleta em corrida de duração. Para tanto, foram realizados um estudo observacional e três ensaios clínicos, randomizados e duplo-cego. Materiais e Métodos: No primeiro trabalho (laboratorial), 14 atletas especialistas em provas de longa duração realizaram dois testes progressivos de corrida em esteira rolante com 72 horas de intervalo (modelo cruzado), sendo administrada em cada teste dose única e por via oral de 1,2g de AINE ou Placebo (lactose). Os resultados indicaram que o uso de AINE reduziu a percepção de esforço no segundo limiar ventilatório (p 0,01), todavia com diminuição da velocidade associada (p=0,01) e redução do VO2máx (p=0,04). No segundo estudo, 20 sujeitos (2x10 sujeitos) condicionados e saudáveis, após determinação da velocidade associada ao segundo limiar ventilatório, foram submetidos a um protocolo de tempo limite para exaustão (tlim) em corrida antes e 48h após indução de dano muscular com exercícios concêntricos e excêntricos (em dinamômetro isoscinético) nos grupos musculares do compartimento anterior e posterior da coxa. No segundo teste (pós-dano) um grupo recebeu, em dose única e por via oral, 1,2g de AINE e o outro grupo Placebo. Os resultados indicaram redução significativa do tlim em ambos os grupos (p 0,01), contudo sem atenuação de queda pelo AINE (p=0,55). No terceiro e último experimento, 14 atletas realizaram duas provas simuladas (PS) de 10 km em pista com sete dias de intervalo. Em cada dia os sujeitos receberam tratamento farmacológico idêntico aos estudos anteriores (modelo cruzado) tendo sido monitorados a filtragem glomerular (FG) pela técnica de clearance de 51CrEDTA, assim como o desempenho (tempo total de teste). Em ambas PSs foi observada redução significativa da FG (p 0,01), porém sem diferenciação entre as situações de uso de AINE e Placebo (p=0,235). O desempenho foi impactado negativamente pelo fármaco (p=0,02). Conclusões específicas: em corredores condicionados e atletas, a administração profilática de Ibuprofeno em dose única por via oral possui potencial chance de redução do desempenho por impactar possivelmente a distribuição volêmica ao tecido ativo (efeito associado à redução de hiperemia tecidual e à resposta cronotrópica frente ao exercício). Não restou assegurada sua eficácia analgésica sobre a atenuação do desconforto agudo (gerado pela corrida) ou tardio (gerado por dano prévio) no que tange a relação dor X desempenho. E por fim, a administração de dose única deste Ibuprofeno antes da corrida (nas condições de análise), não potencializa a condição de insuficiência renal aguda gerada pelo próprio exercício. Conclusão geral: O presente modelo experimental indica que o uso do antiinflamatório não-esteroidal Ibuprofeno não apresenta potencialidade de enquadrar-se como doping segundo Código Mundial Antidoping da WADA. / Introduction: Considering that anti-inflammatory drugs are widely used in the athletic community because of their supposed improvement of performance due to their analgesic action, either in the presence of lesion or not, and the numerous reports of the adverse effects associated with this pharmacological class, the aim of the present Doctoral Dissertation was to investigate the possibility of nonsteroidal anti-inflammatory ibuprofen being fit to be considered as doping according to the World Anti-Doping Code of the World Anti-Doping Agency (WADA-COI), by the criteria of ergogeny and risk to health in athletes in long duration run. To that purpose, three randomized, double blind clinical trials were performed. Materials and Methods: In the first trial (laboratory setting), 14 athletes experienced in long duration runs were submitted to 2 progressive tests of running on treadmill with a 72-hour interval between the tests (crossover design), with oral administration of a single dose of 1.2g NSAID or placebo (lactose) before each test. The results showed that the use of NSAID reduced the perceived exertion at the second ventilatory threshold (p 0.01), yet with decreased associated speed (p=0.01) and reduced VO2máx (p=0.04). In the second trial, 20 fit healthy subjects (2x10 subjects), after determination of the speed associated with the second ventilatory threshold, were submitted to a limit time protocol for exhaustion (tlim) in run before and 48h after inducing muscle damage with concentric and eccentric exercises (in isokinetic dynamometer) in the muscle groups of the anterior and posterior thigh compartment. In the second test (postdamage), one group was given a single oral dose of 1.2g NSAID and the other, placebo. The results showed a significant reduction in tlim in both groups (p 0.01), still without attenuation of fall by the NSAID (p=0.55). In the third and last test, 14 athletes performed two 10-km simulated runs (SRs) on track with a 7-day interval. On each day the runners received the same pharmacological treatment as in the previous trials (crossover design) and had their glomerular filtration rate (GFR) monitored by the 51CrEDTA clearance rate technique as well as their performance (total time of test). In both runs a significant reduction in the GFR (p 0.01) was observed, yet with no difference between the situations of using NSAID and placebo (p=0,235). Performance was negatively affected by the drug (p=0,02). Specific conclusions: In experienced, fit runners and athletes, prophylactic Ibuprofen administration in oral single dose is potentially able to reduce performance as it is likely to adversely affect volemic distribution to the active tissue (an effect associated with reduction in tissue hyperemia and chronotropic response resulting from exercise). Its analgesic efficacy on attenuating acute (caused by the run) or late (caused by previous damage) discomfort Is not guaranteed as the pain X performance relation is concerned. Finally, a single dose of Ibuprofen administered before the run (in the conditions investigated here) does not potentialize the acute renal failure condition caused by the exercise itself. General conclusion: The present experimental model indicates that the use of non-steroidal anti-inflammatory Ibuprofen cannot be considered as doping according to the World Anti-Doping Code of the WADA.

Neste trabalho estudou-se o desenvolvimento de metodologia analitica para a determinação e quantificação de sete anti-inflamatórios não esteroides, amplamente consumidos para tratamento humano, além da cafeína, determinada como marcador antropogênico, em amostras aquosas ambientais. Os analitos estudados foram acetaminofeno (AC), ácido salicílico (AS), cafeína (CA), cetoprofeno (CE), diclofenaco (DC), dipirona (DP), ibuprofeno (IB) e naproxeno (NA) . Como padrão internos, foi utilizado o lindano (LI). A determinação destes analitos foi realizada utilizando-se cromatografia a gás acoplada à espectrometria de massas (GC-MS) utilizando MSTFA/Imidazol como derivatizante. As condições para a reação de derivatização foram otimizadas utilizando o planejamento Doehlert. O procedimento de pré-concentração utilizado foi a extração em fase sólida (SPE), tendo como sorvente um sistema de fase polimérica reversa. O procedimento de SPE foi baseado em trabalhos publicados na literatura, com metanol e água (ajustada a pH 3,0) para o condicionamento e eluição com acetonitrila. Os parâmetros de desempenho do método, como recuperação, linearidade, limite de detecção, limite de quantificação, repetitividade e reprodutibilidade foram avaliados de acordo com as normas estabelecidas pela ANVISA e INMETRO. Os limites de detecção ficaram entre 1,09 e 1079,14 ng L-1 e os de quantificaçõ entre 3,63 e 3597,12 ng L-1. Após as definições em relação ao método, amostras de água do Arroio Dilúvio (em Porto Alegre – RS) e de uma Estação Piloto de tratamento de efluente pertencente ao Instituto de Pesquisas Hidráulicas (IPH/UFRGS) , foram analisadas para avaliar a presença destes analitos. As amostras da ETE-piloto do IPH, foram coletadas nos meses de janeiro e fevereiro e as amostras do Arroio Dilúvio também foram coletadas no mesmo período. Considerando as amostras reais analisadas em algumas foram detectados e em outras quantificados os antiinflamatórios estudados. Nas amostras que estes compostos foram quantificados, a faixa de concentração variou entre 0,09 e 23,16 μg L-1. / In this work the development of an analytic methodology was studied to determine and quantify seven non-steroidal anti-inflammatory drugs, widely used in human treatment, and caffeine considered an anthropogenic marker. The compounds studied were acetaminophen (AC), salicylic acid (AS), caffeine (CA), ketoprofen (CE), diclofenac (DC), dipyrone (DP), ibuprofen (IB), naproxen (NA) and lindane (LI) as internal standard. The determination of these compounds was performed using gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS) with derivatization of the target analytes using MSTFA/Imidazole. The derivatization conditions were optimized with Doehlert design. Solid phase extraction (SPE) with a polymeric reversed solid phase was used as a pre-concentration system. The SPE procedure conditions were based previously established data in the literature, using methanol and water (adjusted to pH 3.0) for the conditioning step and acetonitrile for the elution step The performance parameters, such recovery, linearity, detection limit, quantification limit, repeatability and reproducibility were evaluated according to ANVISA and INMETRO determinations. The detection limits was in the range of 1,09 and 1079,14 ng L -1 and the quantification limits 3,63 and 3597,12 gn L-1. After method establishment, samples from a piloto sewage treatment plant and river water, both in Porto Alegre-RS, were analysed. The samples were collected in January and February 2012, both in the pilot plant and in the river water. In some real samples the antiinflammatories were detected and in others was possible quantify. In the samples were the analytes were quantified, the concentration range was 0,09 to 23,16 μg L-1.

Despite existing several pharmacological alternatives, it is growing the number of researchers interested in studying the pathophysiology and mediators of inflammation, because the drugs that are currently available on the market have limited efficiency and/ or have adverse effects that limit their use. Thus, it is necessary to continue the research in the search for more effective options. One alternative is the use of Punica granatum (pomegranate) that in the literature there are reports of the use of many of its parts in the treatment of infectious and inflammatory diseases. Considering the results obtained in previous studies on the actions of P. granatum and the need to increase the knowledge about their applications, this study aimed to evaluate the anti-nociceptive and anti-inflammatory potencial effects of ethanolic extract from fruits peels's Punica granatum (EEPG). Peels, from Maragogi-AL, were lyophilized, grinded, macerated in ethanol PA, filtered and the final product rotaevaporated, obtaining 65 g EEPG in which the phytochemical analysis revealed the presence of flavonoids, tannins and saponins. Toxicity tests were performed in vitro (MTT assay at doses of 1, 10 and 100 mg/ mL) and in vivo (acute toxicity test at doses of 500 and 1000 mg/ kg). To evaluate the antinociceptive activity were used as experimental models: writhing test induced by acetic acid, the hot plate test and formalin and glutamate-induced nociception. Anti-inflammatory activity evaluation was analyzed in the arthritis assay Freund agent-induced. To rule out a possible effect to alter the motor performance of the animals, the open field test was performed. Our results showed that the doses used showed no signs of toxicity in animals, with no death, change in weight or appetite, or change other parameters analyzed, whereas at the cellular level submaximal doses tested showed no cytotoxicity. EEPG treatment induced inhibition significantly and dependent-dose (ID50 = 7.9 ± 1.7 mg/ kg), the nociceptive action of acetic acid and Emax of 98.8 ± 1.2% was reached at the dose 100 mg/ kg. In the hot plate test no change in the latency time of the animals was observed. In the formalin test, the EEPG (100 mg/ kg, p.o.) did not inhibit the neurogenic phase (1st phase). However, the inflammatory phase (phase 2) was inhibited for 51.7%. For the induction of nociception induced by glutamate was observed that the EEPG possibly acts modulating negatively this pathway, either by antagonizing their actions receptor-mediated or inhibiting the L-arginine-nitric oxide pathway. In the arthritis assay, all doses tested were able to decrease inflammation in the paw from the 3rd day of treatment, extending to the end of it. Finally, in the open field test, it was possible to observe that no satisfactory change of analyzed motor parameters, rulling out a possible effect on this system. The results of this study not only support research on natural products, but also to search for new analgesic and anti-inflamatory drugs. Further studies are needed to define the mechanisms of action of the antinociceptive and anti-inflammatory activities of the fruits peel's of P. granatum, however, the results support the popular use of this plant. / Apesar das diversas alternativas farmacológicas existentes, é crescente o número de pesquisadores interessados em estudar os mediadores e a fisiopatologia da inflamação, pois os medicamentos que estão disponíveis no mercado apresentam eficácia limitada e/ou possuem efeitos adversos que restringem sua utilização. Sendo assim, é necessário que as pesquisas continuem na busca por opções mais eficazes. Uma das alternativas é a utilização de Punica granatum (romã) que na literatura há referência do uso de várias partes no tratamento de doenças infecciosas e inflamatórias. Diante dos resultados de estudos anteriores sobre as ações da P. granatum e a necessidade de aumentar o conhecimento sobre suas aplicações, este estudo experimental tem como objetivo avaliar o potencial antinociceptivo e anti-inflamatório do extrato etanólico da casca do fruto da Punica granatum (EEPG). As cascas, provenientes de Maragogi-AL, foram liofilizadas, trituradas, maceradas em etanol PA, filtradas e o produto final rotaevaporado, obtendo-se 65 g de EEPG que à análise fitoquímica constatou-se a presença de flavonoides, saponinas e taninos. Foram realizados ensaios de toxicidade in vitro (ensaio de MTT, nas doses de 1, 10 e 100 μg/mL) e in vivo (ensaio de toxicidade aguda, nas doses de 500 e 1000 mg/kg). Para avaliar a atividade antinociceptiva foram usados como modelos experimentais: ensaio de contorção abdominal induzido por ácido acético, teste da placa quente e nocicepção induzida por formalina e glutamato. A avaliação da atividade anti-inflamatória foi analisada no ensaio de artrite induzida por agente de Freund. Para descartar um possível efeito que alterasse a performance motora dos animais, foi realizado o teste do campo aberto. Os resultados mostraram que as doses utilizadas não demonstraram sinais de toxicidade nos animais, não havendo morte, alteração de peso ou apetite, nem alteração dos outros parâmetros analisados; enquanto que em nível celular as doses submáximas testadas não apresentaram citotoxicidade. O tratamento com EEPG induziu a inibição, de forma significativa e dose-dependente (DI50 = 7,9 ± 1,7 mg/kg) da ação nociceptiva do ácido acético e o Emax de 98,8 ± 1,2% foi alcançado na dose de 100 mg/kg. No ensaio de placa quente não foram observadas alterações no tempo de latência dos animais. No ensaio de formalina, o EEPG (100 mg/kg, v.o.) não inibiu a fase neurogênica (1ª fase). No entanto, a fase inflamatória (2ª fase) foi inibida em 51,7%. Na indução de nocicepção induzida por glutamato observou-se que o EEPG possivelmente age modulando negativamente esta via, seja por antagonizar suas ações via receptor ou inibição da via L-arginina-óxido nítrico. No ensaio de artrite, todas as doses testadas foram capazes de diminuir a inflamação na pata a partir do 3º dia de tratamento, prolongando-se até o final do mesmo. Por fim, no teste do campo aberto, foi possível obervar que não houve alteração satisfatória dos parâmetros motores analisados, descartando-se um possível efeito sobre esse sistema. Os resultados obtidos neste trabalho dão suporte não somente a pesquisa com produtos naturais, como também à pesquisa por novos fármacos analgésicos e anti-inflamatórios. Novos estudos são necessários para definição dos mecanismos de ação da atividade antinociceptiva e anti-inflamatória da casca do fruto da P. granatum, porém, os resultados obtidos dão suporte ao uso popular da planta.

O uso de produtos anti-inflamatórios e antioxidantes sintéticos representa uma grande preocupação nos dias atuais para a população. Importante destacar alguns aspectos relevantes quanto às dificuldades encontradas no tratamento, como o aumento da resistência aos fármacos e os efeitos colaterais da terapia convencional, que apresenta como consequência o desencadeamento de doenças graves, prejudicando e comprometendo a saúde humana. Os óleos voláteis têm sido alvo na busca de novas substâncias, por apresentarem como potencial fonte de novos agentes antioxidantes e anti-inflamatórios. Dentre as espécies vegetais caracterizadas pela produção deste metabólito secundário, estão aquelas pertencentes ao gênero Schinus, da família Anacardiaceae, de ampla ocorrência do Rio Grande do Sul. Nesse contexto, o presente trabalho objetivou analisar e identificar a composição química e avaliar as atividades biológicas a partir da extração do óleo volátil das espécies de Schinus weinmannifolius e Schinus polygamus, nativas do Rio Grande do Sul. Assim, o óleo volátil foi obtido por hidrodestilação de diversas coletas de folhas e frutos de S. weinmannifolius e folhas de S. polygamus. A análise química, realizada por cromatografia à gás acoplada à espectrometria de massas (CG-EM), demonstrou grande variedade de compostos presentes nas amostras, com predominância dos sesquiterpenos β-cariofileno, germacreno D, biciclogermacreno, germacreno A, δ-cadineno, espatulenol, óxido de cariofileno e α-cadinol para folhas e frutos de S. weinmannifolius e predominância do composto alifático n-nonano para S. polygamus. Os óleos obtidos foram submetidos aos ensaios de reação com 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH) e substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) para avaliação da atividade antioxidante, sendo esta ação apenas observada para as amostras de folhas de S. weinmannifolius coletadas no outono e inverno de 2016 pelo ensaio de TBARS. No método de DPPH as amostras de folhas de S. weinmannifolius coletadas no outono de 2015 e 2016 apresentaram baixa atividade antioxidante, na concentração de 100 μg/mL. A ação anti-inflamatória foi inicialmente avaliada pela técnica in vitro da câmara de Boyden, nas concentrações de 0,001 a 10 μg/mL. Todas as amostras apresentaram inibição significativa da migração leucocitária em relação ao controle, avaliada no ensaio de antiquimiotaxia. A avaliação da atividade anti-inflamatória in vivo, realizada pelo método de edema de pata, foi conduzida apenas para a amostra que melhor resultado obteve no ensaio in vitro, folhas de S. weinmannifolius, verificando-se inibição significativa do edema na segunda hora de tratamento, na dose de 100 mg/kg. Os resultados encontrados suportam o uso tradicional dos óleos de Schinus como agentes anti-inflamatórios. / The use of synthetic anti-inflammatory and antioxidant products represents a major worry these days for the population. It is important to highlight some aspects relevant concerning the difficulties of the treatment, such as the increase in drug resistance and the side effects of conventional medication, leading to the development of serious diseases, impairing and compromising human health. Volatile oils have been the target of this search for new substances, as they are potential sources of new antioxidant and anti-inflammatory agents. Among the plant species characterized by the production of this chemical group, are those belonging to the Schinus genus, from the Anacardiaceae family, of large occurrence in Rio Grande do Sul. In this context, the present work aimed to analyze and identify the chemical composition and to evaluate the biological activities from the extraction of volatile oil from species of Schinus weinmannifolius and Schinus polygamus, native from Rio Grande do Sul. Thus, the volatile oil was obtained by hydrodistillation of several leaves and fruit collections of S. weinmannifolius and S. polygamus leaves. The chemical analysis, performed by gas chromatography coupled with mass detector (GC-MS), demonstrated great variety of compounds present in the samples, with predominance β-caryophyllene, germacrene D, bicyclogermacrene, germacrene A, δ-cadinene, espatulenol, caryophyllene oxide and α-cadinol for leaves and fruits of S. weinmannifolius and predominance of the compound aliphatic n-nonane for S. polygamus. The obtained oils were submitted to the reaction with 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and thiobarbituric acid reactive substances (TBARS) assays to evaluate the antioxidant activity, being this action only observed for leaves samples of S. weinmannifolius collected in autumn and winter of 2016 by the TBARS assay. In the DPPH method, leaves samples of S. weinmannifolius collected in the autumn of 2015 and 2016 presented low antioxidant activity at the concentration of 100 μg/mL. The anti-inflammatory potential was initially performed by the in vitro technique of the Boyden chamber, at concentrations 0,001 to 10 μg/mL. All samples showed significant inhibition of leukocyte migration in relation to the control, evaluated in the antichemotactic assay. The evaluation of in vivo anti-inflammatory activity by the paw edema method was conducted only for the sample that obtained the best result in the in vitro test, S. weinmannifolius oil, with significant inhibition of edema in the second hour of treatment, at dose 100 mg/kg. The results found support the traditional use of Schinus oils as anti-inflammatory agent.

O objetivo deste trabalho foi otimizar a extração dos compostos fenólicos presentes na casca do fruto de Punica granatum L. (romã) com diferentes locais de coletas e adquiridas comercialmente, bem como desenvolver e validar método analítico para separação e quantificação de punicalaginas totais por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e cromatografia líquida de ultra eficiência (CLUE), ensaios de pureza como determinação de água e cinzas totais e testar a atividade anti-inflamatória pela avaliação antiquimiotáxica in vitro do extrato e fração enriquecida de punicalagina. Para a otimização da extração com amostra coletada em Alegrete/15, diferentes técnicas extrativas foram testadas, entre elas: maceração, ultrassom, ultraturrax e refluxo, sendo esta última à escolhida. Análises de fatores críticos que influenciam na resposta, sendo eles temperatura, granulometria, porcentagem do solvente extrator, relação massa vegetal/solvente e tempo, foram realizadas, utilizando software estatístico MiniTab®. O método por CLAE foi desenvolvido, permitindo a separação e quantificação dos anômeros punicalagina α e β, com o emprego de coluna cromatográfica Kromasil® C18 – 5μm x 4.6mm x 150mm e fase móvel constituída por água acidificada com ácido trifluoroacético : acetonitrila acidificada com TFA.. O método pôde ser considerado eficiente e confiável, sendo linear, preciso, robusto, exato e específico, podendo ser utilizado para análise do extrato de P. granatum. O extrato bruto, bem como a fração de punicalaginas foram testados e reduziram significativamente a migração leucocitária nas concentrações mais elevadas (10 e 1 μg/mL) em relação ao controle positivo, indicando potencial atividade inibitória da migração leucocitária. / The objective of this work was to optimize the extraction of the phenolic compounds present in the fruit bark of Punica granatum L. (pomegranate) with different collection sites and commercially acquired, as well as to develop and validate an analytical method for the separation and quantification of total punicalagins by liquid chromatography (HPLC) and ultra-high performance liquid chromatography (HPLC), purity tests such as water determination and total ashes, and to test the anti-inflammatory activity by the in vitro antichemistoxic evaluation of the extract and enriched fraction of punicalagin. For the optimization of the extraction with sample collected in Alegrete / 15, different extractive techniques were tested, among them: maceration, ultrasound, ultraturrax and reflux, the latter being chosen. Analysis of critical factors influencing the response, being temperature, particle size, solvent extractor percentage, vegetable mass / solvent ratio and time, were performed using MiniTab® statistical software. The HPLC method was developed allowing separation and quantification of the punicalagin α and β anomers using a Kromasil® C18 - 5μm x 4.6mm x 150mm chromatographic column and mobile phase consisting of water acidified with trifluoroacetic acid: acetonitrile acidified with TFA The method could be considered efficient and reliable, being linear, precise, robust, exact and specific, and it can be used for the analysis of the extract of P. granatum. The crude extract as well as the fraction of punicalaginas were tested and significantly reduced the leukocyte migration at the highest concentrations (10 and 1 μg / mL) in relation to the positive control, indicating potential inhibitory activity of leukocyte migration.

As respostas inflamatórias no cérebro são mediadas principalmente pela microglia, mas evidências crescentes sugerem uma importância crucial dos astrócitos. A S100B, uma proteína ligante de cálcio e secretada por astrócitos, tem propriedades neurotróficas e de citocina inflamatória. No entanto, não se sabe se sinais primários que ocorrem durante a indução de uma resposta inflamatória como, por exemplo, lipopolissacarídeo (LPS) modulam diretamente a S100B. A neuroinflamação está implicada na patogênese ou na progressão de uma variedade de distúrbios neurodegenerativos e muitos estudos procuram uma conexão entre S100B e doenças degenerativas, incluindo a doença de Alzheimer e esquizofrenia. O uso terapêutico de fármacos anti-inflamatórios não-esteroidais (AINEs) para estas doenças tem aumentado. No entanto, existem poucos estudos sobre o efeito desses fármacos em relação à proteína S100B. Neste trabalho, nós avaliamos se os níveis de S100B no líquido cefalorraquidiano (LCR) e soro de ratos Wistar são afetados por injeção de LPS administrado por via intraperitoneal (IP) ou intracerebroventricular (ICV), bem como se as culturas primárias de astrócitos respondem diretamente ao LPS. Além disso, nós avaliamos o conteúdo e a secreção de S100B medido por ELISA (bem como o conteúdo de GFAP e secreção de TNF-α) em culturas primárias de astrócitos expostos a dexametasona e quatro classes químicas diferentes de AINEs (ácido acetilsalicílico, ibuprofeno, diclofenaco e nimesulida) durante 24 h. Os nossos dados sugerem que a secreção de S100B no tecido cerebral é estimulada rapidamente e persistentemente (durante pelo menos 24 h) por administração ICV de LPS. Este aumento da S100B no LCR foi transitório quando o LPS foi administrado IP. Em contraste com estes resultados de S100B, observou-se um aumento nos níveis de TNF-α no soro, mas não no LCR, após a administração IP de LPS. Em astrócitos isolados e em fatias de hipocampo frescas, observou-se uma estimulação direta da secreção de S100B por LPS numa concentração de 10 ug/ml. Um envolvimento de TLR4 foi confirmado pelo uso de antagonistas específicos deste receptor. No entanto, baixas concentrações de LPS em culturas de astrócitos foram capazes de induzir uma diminuição na secreção de S100B após 24 h, sem alteração significativa no conteúdo intracelular de S100B. Além disso, após 24 horas de exposição ao LPS, observou-se um decréscimo na glutationa e um aumento na proteína ácida fibrilar glial. Também foi observado que os AINEs apresentam diferentes efeitos sobre parâmetros gliais. O ácido acetilsalicílico e o diclofenaco foram capazes de aumentar a GFAP, enquanto que a nimesulida, um inibidor seletivo de COX-2, e a dexametasona diminuiram a secreção de S100B. No entanto, todos os AINEs reduziram os níveis de PGE2. Juntos, esses dados contribuem para a compreensão dos efeitos de LPS em astrócitos, especialmente sobre a secreção de S100B, e nos ajuda a interpretar mudanças nesta proteína no LCR e soro em doenças neuroinflamatórias. Além disso, tecidos periféricos que expressam S100B talvez devam ser regulados diferentemente, uma vez que a administração IP de LPS não foi capaz de aumentar os níveis séricos de S100B. Em relação aos AINEs, a PGE2 parece estar envolvida no mecanismo de secreção de S100B, mas vias adicionais, não claras neste momento, necessitam de uma maior caracterização. O papel inflamatório de S100B em doenças degenerativas, onde também são observados níveis elevados da COX-2 e PGE2, poderia ser atenuado por inibidores de COX-2. / Inflammatory responses in brain are primarily mediated by microglia, but growing evidence suggests a crucial importance of astrocytes. S100B, a calciumbinding protein secreted by astrocytes, may act as a neurotrophic or an inflammatory cytokine. However, it is not known whether primary signals occurring during induction of an inflammatory response (e.g. lipopolysaccharide, LPS) directly modulate S100B. Neuroinflammation has been implicated in the pathogenesis or progression of a variety of neurodegenerative disorders and several studies have looked for a connection of S100B, and degenerative diseases including Alzheimer’s disease and schizophrenia. The therapeutic use of non-steroid anti-inflammatory drugs (NSAID) to these diseases has growth up. However, there are few reports about the effect of these drugs on S100B. In this work, we evaluated whether S100B levels in cerebrospinal fluid (CSF) and serum of Wistar rats are affected by LPS administered by intraperitoneal (IP) or intracerebroventricular (ICV) injection, as well as whether primary astrocyte cultures respond directly to lipopolysaccharide. Moreover we evaluated S100B content and secretion measured by ELISA (as well as GFAP content and TNF-α secretion) in primary astrocyte cultures exposed to dexamethasone and 4 different chemical classes of NSAID (acetyl salicylic acid, ibuprofen, diclofenac and nimesulide) for 24 h. Our data suggest that S100B secretion in brain tissue is stimulated rapidly and persistently (for at least 24 h) by ICV LPS administration. This increase in CSF S100B was transient when LPS was IP administered. In contrast to these S100B results, we observed an increase in in TNFα levels in serum, but not in CSF, after IP administration of LPS. In isolated astrocytes and in acute hippocampal slices, we observed a direct stimulation of S100B secretion by LPS at a concentration of 10 μg/mL. An involvement of TLR4 was confirmed by use of specific inhibitors. However, lower levels of LPS in astrocyte cultures were able to induce a decrease in S100B secretion after 24 h, without significant change in intracellular content of S100B. In addition, after 24 h exposure to LPS, we observed a decrease in astrocytic glutathione and an increase in astrocytic glial fibrillary acidic protein. We also observe that NSAIDs have distinct effects on glial parameters. ASA and diclofenac are able to increase GFAP, while nimesulide, a selective COX-2 inhibitor, and dexamethasone were able to decrease S100B secretion. However, all anti-inflammatories were able to reduce levels of PGE2. Together, these data contribute to the understanding of the effects of LPS on astrocytes, particularly on S100B secretion, and help us to interpret cerebrospinal fluid and serum changes for this protein in neuroinflammatory diseases. Moreover, non-brain S100B-expressing tissues may be differentially regulated, since LPS administration did not lead to increased serum levels of S100. With respect to NSAIDs, PGE2 is possibly involved in the mechanism of S100B secretion but additional pathways, unclear at this moment, demand further characterization. The inflammatory role of S100B in degenerative diseases, where also is observed elevated levels of COX-2 and PGE2, could be attenuated by COX-2 inhibitors in which elevated levels of COX-2.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Methotrexate (MTX) is an antimetabolite drug analogue of folic acid with wide clinical application, used in high doses for the treatment of cancer and in low doses for the treatment of autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and psoriasis. Although effective, the MTX has several side effects. The oxidative stress seems to be involved with the toxicity caused by the MTX in various organs. Despite the effect on the imbalance of oxidative metabolism, the influence of polymorphisms of antioxidant enzymes on MTX toxicity is not well studied. In this context, the present study aimed to examine whether the Ala16Val polymorphism of the antioxidant enzyme superoxide dismutase manganese dependent (SOD2), which affects the efficiency of the detox enzyme, could have an effect on the cytotoxic response to MTX. For this, an in vitro study using peripheral blood mononuclear cells (PBMC) obtained from healthy donors harboring different genotypes of polymorphism Ala16Val-SOD (= genotypes AA, VV and AV) was performed. Once obtained, PBMCs were treated with MTX at concentrations of 10 and 100 μM for 24 and 72 hours and analyzed for the effect on viability, modulation of the oxidative metabolism-inflammatory and apoptotic. PBMC-AA which have a naturally SOD2 30 to 40% more efficient than the PBMC- VV, showed more resistance to treatment with MTX compared to PBMC-AV/VV assessed. As production levels of EROS and lipid peroxidation significantly increased in cells exposed to MTX, regardless of genotype, however, increased levels of protein carbonylation were observed only in PBMC-AV/VV. The PBMC-AA demonstrated decreased activity of SOD2 and the levels of glutathione peroxidase with PBMC-AA were higher. The levels of caspase-8 and -3 were increased in PBMC exposed to MTX, but the modulation of these genes, as well as Bax and Bcl-2 genes involved in apoptotic route, was genotype dependent. The MTX was able to raise the levels of inflammatory cytokines and decrease the level of anti-inflammatory cytokine IL-10, regardless of genotype. The results suggest that Ala16Val-SOD2 polymorphism is capable of modulating the cytotoxic response of PBMC to the MTX. / O Metotrexato (MTX) é um fármaco antimetabólito análogo do ácido fólico, com vasta aplicação clinica, utilizado em doses elevadas no tratamento de neoplasias e em baixas doses para o tratamento de doenças autoimunes, como a artrite reumatoide e a psoríase. Apesar de efetivo, o MTX possui diversos efeitos colaterais. Assim, o estresse oxidativo parece estar envolvido com a toxicidade causada pelo MTX a diversos órgãos. Apesar do efeito no desequilíbrio do metabolismo oxidativo, a influência de polimorfismos de enzimas antioxidantes sobre a toxicidade ao MTX ainda não é bem estudada. Nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo analisar se o polimorfismo Ala16Val da enzima antioxidante superóxido dismutase dependente de manganês (SOD2), que afeta a eficiência detoxificadora da enzima, poderia ter efeito sobre a resposta citotóxica ao MTX. Para tanto, foi realizado um estudo in vitro utilizando células mononucleares do sangue periférico (CMSP), obtidas de doadores saudáveis portadores de diferentes genótipos do polimorfismo Ala16Val-SOD (genótipos = AA, VV e AV). Uma vez obtidas, as CMSPs foram tratadas com MTX nas concentrações de 10 e 100 μM por 24 e 72 horas, sendo posteriormente analisado o efeito sobre a viabilidade, modulação do metabolismo oxidativo-inflamatório e apoptótico. As CMSP-AA, que naturalmente apresentam uma SOD2 30 a 40% mais eficiente do que as CMSP-VV, apresentaram maior resistência ao tratamento com MTX em relação às CMSP-AV/VV. Quanto aos níveis de produção de EROS (espécies reativas de oxigênio) e lipoperoxidação, houve aumento significativo nas células expostas ao MTX independente do genótipo, entretanto, o aumento dos níveis de carbonilação de proteínas foi observado apenas em CMSP-AV/VV. Nas CMSP-AA houve diminuição da atividade da SOD2. Já quanto aos níveis de Glutationa Peroxidase, as CMSP-AA apresentaram uma elevação mais intensa. Os níveis das caspases 3 e 8 foram aumentados nas CMSP expostas ao MTX, mas a modulação desses genes, assim como do Bax e Bcl-2 (genes envolvidos rota apoptótica), foi genótipo-dependente. O MTX foi capaz de elevar os níveis das citocinas inflamatórias e diminuir o nível da citocina antiinflamatória IL-10, independente do genótipo. Os resultados sugerem que o polimorfismo Ala16Val-SOD2 é capaz de modular a resposta citotóxica de CMSP ao MTX.

Introdução: Devido ao fato dos antiinflamatórios serem amplamente utilizados no meio atlético, da suposta melhora de desempenho pelo efeito analgésico, independentemente da presença ou não de lesão, e, por fim, em razão dos extensos relatos de efeitos adversos associados a esta classe farmacológica, o objetivo da presente Tese Doutoral foi verificar a potencialidade do antiinflamatório não-esteroidal (AINE) Ibuprofeno em enquadrar-se como doping segundo o Código Mundial Antidoping da Agência Mundial Antidoping (WADA-COI), segundo critérios de ergogenia e risco à saúde em atleta em corrida de duração. Para tanto, foram realizados um estudo observacional e três ensaios clínicos, randomizados e duplo-cego. Materiais e Métodos: No primeiro trabalho (laboratorial), 14 atletas especialistas em provas de longa duração realizaram dois testes progressivos de corrida em esteira rolante com 72 horas de intervalo (modelo cruzado), sendo administrada em cada teste dose única e por via oral de 1,2g de AINE ou Placebo (lactose). Os resultados indicaram que o uso de AINE reduziu a percepção de esforço no segundo limiar ventilatório (p 0,01), todavia com diminuição da velocidade associada (p=0,01) e redução do VO2máx (p=0,04). No segundo estudo, 20 sujeitos (2x10 sujeitos) condicionados e saudáveis, após determinação da velocidade associada ao segundo limiar ventilatório, foram submetidos a um protocolo de tempo limite para exaustão (tlim) em corrida antes e 48h após indução de dano muscular com exercícios concêntricos e excêntricos (em dinamômetro isoscinético) nos grupos musculares do compartimento anterior e posterior da coxa. No segundo teste (pós-dano) um grupo recebeu, em dose única e por via oral, 1,2g de AINE e o outro grupo Placebo. Os resultados indicaram redução significativa do tlim em ambos os grupos (p 0,01), contudo sem atenuação de queda pelo AINE (p=0,55). No terceiro e último experimento, 14 atletas realizaram duas provas simuladas (PS) de 10 km em pista com sete dias de intervalo. Em cada dia os sujeitos receberam tratamento farmacológico idêntico aos estudos anteriores (modelo cruzado) tendo sido monitorados a filtragem glomerular (FG) pela técnica de clearance de 51CrEDTA, assim como o desempenho (tempo total de teste). Em ambas PSs foi observada redução significativa da FG (p 0,01), porém sem diferenciação entre as situações de uso de AINE e Placebo (p=0,235). O desempenho foi impactado negativamente pelo fármaco (p=0,02). Conclusões específicas: em corredores condicionados e atletas, a administração profilática de Ibuprofeno em dose única por via oral possui potencial chance de redução do desempenho por impactar possivelmente a distribuição volêmica ao tecido ativo (efeito associado à redução de hiperemia tecidual e à resposta cronotrópica frente ao exercício). Não restou assegurada sua eficácia analgésica sobre a atenuação do desconforto agudo (gerado pela corrida) ou tardio (gerado por dano prévio) no que tange a relação dor X desempenho. E por fim, a administração de dose única deste Ibuprofeno antes da corrida (nas condições de análise), não potencializa a condição de insuficiência renal aguda gerada pelo próprio exercício. Conclusão geral: O presente modelo experimental indica que o uso do antiinflamatório não-esteroidal Ibuprofeno não apresenta potencialidade de enquadrar-se como doping segundo Código Mundial Antidoping da WADA. / Introduction: Considering that anti-inflammatory drugs are widely used in the athletic community because of their supposed improvement of performance due to their analgesic action, either in the presence of lesion or not, and the numerous reports of the adverse effects associated with this pharmacological class, the aim of the present Doctoral Dissertation was to investigate the possibility of nonsteroidal anti-inflammatory ibuprofen being fit to be considered as doping according to the World Anti-Doping Code of the World Anti-Doping Agency (WADA-COI), by the criteria of ergogeny and risk to health in athletes in long duration run. To that purpose, three randomized, double blind clinical trials were performed. Materials and Methods: In the first trial (laboratory setting), 14 athletes experienced in long duration runs were submitted to 2 progressive tests of running on treadmill with a 72-hour interval between the tests (crossover design), with oral administration of a single dose of 1.2g NSAID or placebo (lactose) before each test. The results showed that the use of NSAID reduced the perceived exertion at the second ventilatory threshold (p 0.01), yet with decreased associated speed (p=0.01) and reduced VO2máx (p=0.04). In the second trial, 20 fit healthy subjects (2x10 subjects), after determination of the speed associated with the second ventilatory threshold, were submitted to a limit time protocol for exhaustion (tlim) in run before and 48h after inducing muscle damage with concentric and eccentric exercises (in isokinetic dynamometer) in the muscle groups of the anterior and posterior thigh compartment. In the second test (postdamage), one group was given a single oral dose of 1.2g NSAID and the other, placebo. The results showed a significant reduction in tlim in both groups (p 0.01), still without attenuation of fall by the NSAID (p=0.55). In the third and last test, 14 athletes performed two 10-km simulated runs (SRs) on track with a 7-day interval. On each day the runners received the same pharmacological treatment as in the previous trials (crossover design) and had their glomerular filtration rate (GFR) monitored by the 51CrEDTA clearance rate technique as well as their performance (total time of test). In both runs a significant reduction in the GFR (p 0.01) was observed, yet with no difference between the situations of using NSAID and placebo (p=0,235). Performance was negatively affected by the drug (p=0,02). Specific conclusions: In experienced, fit runners and athletes, prophylactic Ibuprofen administration in oral single dose is potentially able to reduce performance as it is likely to adversely affect volemic distribution to the active tissue (an effect associated with reduction in tissue hyperemia and chronotropic response resulting from exercise). Its analgesic efficacy on attenuating acute (caused by the run) or late (caused by previous damage) discomfort Is not guaranteed as the pain X performance relation is concerned. Finally, a single dose of Ibuprofen administered before the run (in the conditions investigated here) does not potentialize the acute renal failure condition caused by the exercise itself. General conclusion: The present experimental model indicates that the use of non-steroidal anti-inflammatory Ibuprofen cannot be considered as doping according to the World Anti-Doping Code of the WADA.

ABSTRACT Introduction: Obesity has become a growing public health concern around the world and has been more and more identified in early stages of life. It is interlinked with inflammatory responses such on it’s genesis as on it’s maintenance, which on long term can lead to many cardio-metabolic comorbidities, diabetes and others, all of them improving a lower quality of life.Objective: to compare inflammatory, metabolic, adiposity characteristics and insulin resistance markers between eutrophic and obese schoolers of 8 years old. Method: clinic-laboratory study involving 8 years’ old children, with exploratory lining to compare the average of many parameters (waist circumference, tricipital fold, fasting glucose, fasting insulin, Homa – IR index, total cholesterol and HDL-c, triglycerides, IL-6, IL-1b, IL-10, FNT-a and adiponectin. Among the children weighted and measured at schools in Palhoça-SC, there were 34 selected to compose the eutrophic’s and obese’s groups based on calculed BMI. There were collected and processed blood samples from these children to get the dosages. The data were analyzed using Graf Pad prism’s software 6.0. The Student T Test (results as mean ± SDP) and Wilcox & Mann-Witney (results as median ±interquartile range) were used. Results: BMI, WC, TCF, RCP-hs and fasting insulin were significant higher in obesity group. IL-6, IL-10, IL-1b, FNT-a,HDL, TG, Homa-ir index and fasting glucose didn’t show differences. Conclusion: Our group of obese children aged 8 years shows disturbances in anthropometric characteristics, fasting insulin and CRP-hs levels that indicate a low grade inflammatory process and consequent cardio-vascular risk in the future. / Submitted by Milcia Almeida Zaidan (milcia.zaidan@unisul.br) on 2018-07-04T17:54:58Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) comparação de marcadores inflamatórios,.pdf: 2854772 bytes, checksum: 8b087da3279211299bdc8d6cc89963d7 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Correa da Cruz (caroline.cruz@unisul.br) on 2018-07-04T18:31:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) comparação de marcadores inflamatórios,.pdf: 2854772 bytes, checksum: 8b087da3279211299bdc8d6cc89963d7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-04T18:31:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) comparação de marcadores inflamatórios,.pdf: 2854772 bytes, checksum: 8b087da3279211299bdc8d6cc89963d7 (MD5) Previous issue date: 2018 / Introdução: A obesidade tornou-se um crescente problema de saúde pública mundial e cada vez mais está sendo identificada em fases precoces da vida. Estárelacionada com características inflamatórias tanto em sua gênese quanto em sua manutenção,o que a longo prazo pode originar várias comorbidades, como a síndrome metabólica, diabetes tipo 2 e alterações cardiocirculatórias entre outras, todas associadas à piora da qualidade de vida. Identificar quando estas alterações se iniciam e como se apresentam pode ajudar na prevenção e no manejo da doença. Objetivo: comparar marcadores inflamatórios, metabólicos, de características de adiposidade e de resistência à insulina entre escolares de 8 anos de idade eutróficos e obesos. Método: estudo clínico-laboratorial envolvendo crianças de 8 anos, com delineamento exploratório para comparação da média de diferentes parâmetros (circunferência abdominal, prega tricipital, glicemia de jejum, insulinemia de jejum, índice Homa-ir, colesterol total e HDL-c, triglicerídeos, IL-6, IL-1b, IL-10, FNT-a). Entre crianças examinadas nas escolas de Palhoça, foram selecionadas por conveniência 34 para compor os grupos de eutróficos (P<85) e obesos (P>97), baseado no IMC calculado. Coletou-se sangue destas crianças e procedeu-se às dosagens. Os dados foram analisados utilizando-se software Graf Pad Prism, versão 6.0. Foi usado teste t de student (resultados como média ± EPM) e Wilcoxon e Mann-Witney (resultados em mediana – intervalo interquartil). O intervalo de confiança foi definido em 0,95 (95%).Resultados: IMC, CA e PTC, insulina de jejum e PCR-us foram significativamente aumentados no grupo dos obesos. IL-6, IL-10, IL-1b, FNT-a,HDL, TG, índice Homa-ir e glicemia de jejum não mostraram alterações significativas entre os grupos. Conclusão: as crianças obesas de 8 anos do nosso estudo já apresentam alterações antropométricas, de insulina e de PCR-us que denotam um processo inflamatório de baixo grau e alterações iniciais relativas a risco cardiovascular futuro.

Orientador: Rosana Rossi Ferreira / Banca: Willian Zambuzi / Banca: Marcelo Telascrêa / Resumo: Introdução: Diante da constatação clínica de que muitos pacientes não conseguem benefício completo da remissão de ulcerações crônicas venosas de etiologia multifatorial utilizando tratamentos convencionais associados ou não à Fitoterapia, o Setor de Biotecnologia do Hemocentro de Botucatu estabeleceu desde 2003, um protocolo de produção de curativos bioativos, que interagem com a lesão e estimulam a recuperação da área danificada por indução das células-tronco comissionadas da pele via fatores de crescimento. Através da utilização da Engenharia de Tecidos que consiste na regeneração de órgãos e tecidos, obtidos através da coleta de partes de órgãos ou tecidos do indivíduo, que, dissociados em células, são cultivadas sobre arcabouços ou suportes sintéticos (scaffolds). A Cordia ecalyculata, conhecida como porangaba, é da família das boraginaceas, é um arbusto cujo principio ativo é a alantoína que possui capacidade anti-inflamatória favorecendo a proliferação celular, acelerando a regeneração da pele lesada, epitelização e a proliferação de novas células. Através do conhecimento popular deste fitoterápico propõe-se para estudo a avaliação da ação anti-inflamatória dos extratos da planta em arcabouços (scaffolds) através da liberação de citocinas pro e anti-inflamatórias. Objetivos: 1) Comparar os índices de apoptose e viabilidade celular em cultura de células-tronco mesenquimais (CTMs) 2) quantificar os níveis de citocinas anti-inflamatórias liberadas em culturas de células-tronco mesenquimais isoladas de tecido adiposo na presença de cola de fibrina, gel de plaquetas, quitosana dopada sob a ação de Cordia ecalyculata. 3) Criar um banco de citocinas anti-inflamatória e 4) Definir as melhores condições de cultura celular para se obter elevadas concentrações de citocinas anti-inflamatórias; Material e Método: foi coletado fragmento de pacientes distintos nos quais o... / Abstract: Introduction: In front of the medical finding that many patients can't earn total benefit of multifactor a etiology chronicle venous sorenesses using conventional treatments, relate door not with phitotherapy, the Biotechnology Department of the Botucatu blood center stablished, since 2003, a protocol of bioactive healing production that interface with the sore and stimulate the recover of the damaged area by the introduction of stem cells, commissioned from the skin by growing factors. Using the Tissue Engineering, that consists, in the organ and tissues regeneration, obtained by collection pieces of organs or tissues of the subject, that, dissociated in cells, are cultivated on scaffolds. The Cordia ecalyculata, known as porangaba, belongs to the boraginaceas Family, is a a plant, which the active ingredient is the allantoin, that has the anti-inflamatory capacity helping the cell proliferation, boosting the damaged skin recover and epitelization. By the popular knowledge of this phytotherapic, it proposes to study the evaluation of the anti-inflamatory action of the plant extracts in scaffolds by the liberation of pro cytokines and anti-inflamatory. Objectives: 1) compare the apoptosis index and the cell feasibility in mesenchymal stem cell culture. 2) Quantify the anti-inflamatory citokines level liberated in mensenchymal stem cell culture isolated in fat tissue in the presence of fibrin glue, platelet gel, and doped chitosan by the action of Cordia ecalyculata. 3) Develop a anti-inflamatory citokynes bank. 4) Define the best cell culture conditions to obtain big concentrations of anti-inflamatory citokynes. Material and Method: it was collected fragment of distinct patients in which the tissue was rigorously submited to the asepsis protocol, mechanical dissociation, isolation, CTM-TA cell culture. The cells were cultivated until the needed number to the studies using the Cordia, in which is known expresses the surfaces markers ... / Mestre