Orientador: Paula Rahal / Banca: Clarice Arns / Banca: João Pessoa Araújo Junior / Banca: Maurício Lacerda Nogueira / Banca: Cristiane Damas Gil / Resumo: A Hepatite C é a inflamação do fígado causada pela infecção pelo vírus da hepatite C (HCV). Essa inflamação ocorre na maioria das pessoas infectadas pelo vírus e, dependendo da intensidade e tempo de duração, pode levar à cirrose e câncer do fígado. No momento não existem vacinas eficazes e o tratamento convencional com peg-IFN e ribavirina tem eficácia bastante limitada e efeitos colaterais graves. Terapias moleculares utilizando a RNAi demonstraram ser eficientes na inibição deste vírus in vitro. O objetivo deste trabalho foi desenvolver diferentes metodologias para inibição da replicação do HCV utilizando-se da técnica de RNAi. Foram desenvolvidas 5 moléculas de dicer substrate siRNA, que em sua maioria foram capazes de reduzir a replicação viral em até 90% em relação ao controle negativo. Ainda, não foi observada a seleção de mutantes resistentes do vírus após o tratamento com os DsiRNAs por 21 dias. Também foram desenvolvidos 3 vetores lentivirais contendo sequencias codificantes de shRNA contra o HCV. Com a utilização destas partículas lentivirais foi possível reduzir a replicação do HCV em aproximadamente 99% em relação ao controle negativo. Neste estudo foi demonstrado que o HCV pode ser inibido eficientemente utilizando tecnologias distintas de RNAi. Os DsiRNAs são mais potentes que os tradicionais siRNAs e com menor probabilidade de selecionar mutantes resistentes. Os vetores lentivirais são eficientes na entrega dos genes contendo os shRNAs e potentes na inibição do HCV. Ambas as tecnologias no futuro poderão ser utilizadas na terapia alternativa de pacientes crônicos ou no caso dos DsiRNAs de forma preventiva à infecção / Abstract: Hepatitis C virus (HCV) frequently establishes persistent infections in the liver, leading to the development of chronic hepatitis, and, potentially, to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma at later stages. No vaccine is available for HCV and the current standard of care, which consists of pegylated interferon-α and ribavirin, has limited efficacy against certain HCV genotypes, and also produces significant adverse effects. Molecular therapies have proven to be effective in the inhibition of the virus in vitro. Molecular therapies based on RNAi has shown good efficiency on knockdown of HCV in vitro.The aim of this study was to develop different methodologies for inhibiting HCV replication using the RNAi technique. We developed five dicer substrate siRNA molecules, which mostly were able to reduce viral replication by 90% compared to the negative control. Still, there was no selection of resistant mutants of the virus after treatment with DsiRNAs for 21 days. In addition, we developed lentiviral vectors containing sequences encoding shRNA against HCV. With the use of these lentiviral particles, it was possible to reduce HCV replication by approximately 99% compared to negative control. In this study, it was demonstrated that HCV could be effectively inhibited using different RNAi technologies. The DsiRNAs are more powerful than traditional siRNAs and less likely to select resistant mutants. The lentiviral vectors are efficient in delivery of genes containing shRNAs and potent in the inhibition of HCV. Both technologies in the future may be used in alternative therapy for chronic patients or in case of DsiRNAs preventively to infection / Doutor

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Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:45Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-15Bitstream added on 2014-08-27T15:57:02Z : No. of bitstreams: 1 000778124.pdf: 2188391 bytes, checksum: fd262617e1148f5350687c3217aafda3 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A Hepatite C é a inflamação do fígado causada pela infecção pelo vírus da hepatite C (HCV). Essa inflamação ocorre na maioria das pessoas infectadas pelo vírus e, dependendo da intensidade e tempo de duração, pode levar à cirrose e câncer do fígado. No momento não existem vacinas eficazes e o tratamento convencional com peg-IFN e ribavirina tem eficácia bastante limitada e efeitos colaterais graves. Terapias moleculares utilizando a RNAi demonstraram ser eficientes na inibição deste vírus in vitro. O objetivo deste trabalho foi desenvolver diferentes metodologias para inibição da replicação do HCV utilizando-se da técnica de RNAi. Foram desenvolvidas 5 moléculas de dicer substrate siRNA, que em sua maioria foram capazes de reduzir a replicação viral em até 90% em relação ao controle negativo. Ainda, não foi observada a seleção de mutantes resistentes do vírus após o tratamento com os DsiRNAs por 21 dias. Também foram desenvolvidos 3 vetores lentivirais contendo sequencias codificantes de shRNA contra o HCV. Com a utilização destas partículas lentivirais foi possível reduzir a replicação do HCV em aproximadamente 99% em relação ao controle negativo. Neste estudo foi demonstrado que o HCV pode ser inibido eficientemente utilizando tecnologias distintas de RNAi. Os DsiRNAs são mais potentes que os tradicionais siRNAs e com menor probabilidade de selecionar mutantes resistentes. Os vetores lentivirais são eficientes na entrega dos genes contendo os shRNAs e potentes na inibição do HCV. Ambas as tecnologias no futuro poderão ser utilizadas na terapia alternativa de pacientes crônicos ou no caso dos DsiRNAs de forma preventiva à infecção / Hepatitis C virus (HCV) frequently establishes persistent infections in the liver, leading to the development of chronic hepatitis, and, potentially, to liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma at later stages. No vaccine is available for HCV and the current standard of care, which consists of pegylated interferon-? and ribavirin, has limited efficacy against certain HCV genotypes, and also produces significant adverse effects. Molecular therapies have proven to be effective in the inhibition of the virus in vitro. Molecular therapies based on RNAi has shown good efficiency on knockdown of HCV in vitro.The aim of this study was to develop different methodologies for inhibiting HCV replication using the RNAi technique. We developed five dicer substrate siRNA molecules, which mostly were able to reduce viral replication by 90% compared to the negative control. Still, there was no selection of resistant mutants of the virus after treatment with DsiRNAs for 21 days. In addition, we developed lentiviral vectors containing sequences encoding shRNA against HCV. With the use of these lentiviral particles, it was possible to reduce HCV replication by approximately 99% compared to negative control. In this study, it was demonstrated that HCV could be effectively inhibited using different RNAi technologies. The DsiRNAs are more powerful than traditional siRNAs and less likely to select resistant mutants. The lentiviral vectors are efficient in delivery of genes containing shRNAs and potent in the inhibition of HCV. Both technologies in the future may be used in alternative therapy for chronic patients or in case of DsiRNAs preventively to infection

Made available in DSpace on 2014-08-27T14:36:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-08-23Bitstream added on 2014-08-27T15:57:19Z : No. of bitstreams: 1 000723028_20150823.pdf: 1028906 bytes, checksum: 197bceaec267086e9658eb5a35574fe1 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-08-24T10:46:34Z: 000723028_20150823.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-24T10:47:09Z : No. of bitstreams: 1 000723028.pdf: 1485800 bytes, checksum: aaac9adf54c11e7df2321502f879e475 (MD5) / A hepatite C é consequência da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) e estima-se que cerca de 150 milhões de pessoas em todo o mundo estejam cronicamente infectadas. Estudos têm demonstrado interações entre proteínas virais e do hospedeiro durante o ciclo de replicação do HCV e estas interações podem ser utilizadas para o desenvolvimento de novas terapias contra a hepatite C. As proteínas de choque térmico (Hsp) são proteínas celulares que interagem com proteínas do HCV e a inibição destas proteínas poderiam reduzir a replicação viral. Neste estudo, as proteínas celulares Hsp90 e Hsp27 foram inibidas por siRNA isoladamente ou em combinação com a inibição das regiões virais 5'UTR, NS3 e NS5A. Foi utilizada uma cultura celular estável Huh7 expressando um replicon subgenomico do HCV e todas as moléculas de siRNA dirigidas ao genoma do vírus mostraram eficiência na redução da replicação viral. A melhor resposta foi obtida pelo siRNA 5'UTR, que apresentou bons resultados também nos estudos à longo prazo. A inibição da proteína celular Hsp27 aumentou os níveis de replicação do vírus, entretanto a supressão de Hsp90 mostrou redução da replicação viral e a utilização desta molécula juntamente com a molécula de siRNA dirigida para 5'UTR mostraram uma diminuição de mais de 90% da replicação viral. Entretanto a inibição prolongada de Hsp90 levou à morte celular, evidenciando o importante papel desta proteína na sobrevivência das células. Portanto o presente trabalho sugere que a terapia combinada de siRNAs pode ser uma alternativa eficiente no combate à hepatite C em pacientes com HCC uma vez que a inibição de Hsp90 atua tanto na supressão tumoral quanto na replicação do HCV / Hepatitis C is a consequence of infection by hepatitis C virus (HCV) and it is estimated that approximately 150 million people are chronically infected worldwide. Several studies have demonstrated interactions between viral and host proteins during the HCV replication cycle and these interactions might be used for development of new therapies against hepatitis C. The heat shock proteins (Hsp) are cellular proteins that interact with proteins of HCV and inhibition of these proteins could reduce viral replication. In this study, cellular proteins Hsp90 and Hsp27 were inhibited by siRNA targeting the mRNA of these proteins in combination with siRNA to viral 5'UTR region, NS3 and NS5A. We used a stable cell line expressing HCV subgenomic replicon and all siRNA molecules targeting the viral genome showed effectiveness in reducing viral replication. The best response was achieved by siRNA 5'UTR, which showed good results on long term studies. The inhibition of cellular protein Hsp27 increased virus replication, but knockdown of Hsp90 showed reduced viral replication. Use of this molecule together with the siRNA molecule directed to 5'UTR showed a decrease of more than 90% viral replication. However, the prolonged inhibition of Hsp90 led to cell death, demonstrating the important role of this protein in cell survival. Finally this work suggests that the combination therapy of siRNAs can be an effective alternative to treat hepatitis C in patients with HCC since reduction of Hsp90 expression if effective on tumor suppression and in HCV replication

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Programa de Pós-Graduação em Agronomia, 2018. / Submitted by Fabiana Santos (fabianacamargo@bce.unb.br) on 2018-08-17T21:16:25Z No. of bitstreams: 1 2018_CarolinaSenhorinhoRamalho.pdf: 1487059 bytes, checksum: 301d2c8ba2b5d034e440b516646d5bd7 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2018-08-21T17:17:40Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2018_CarolinaSenhorinhoRamalho.pdf: 1487059 bytes, checksum: 301d2c8ba2b5d034e440b516646d5bd7 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-21T17:17:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2018_CarolinaSenhorinhoRamalho.pdf: 1487059 bytes, checksum: 301d2c8ba2b5d034e440b516646d5bd7 (MD5) Previous issue date: 2018-08-17 / O tomateiro (Solanum lycopersicum L.) apresenta importância econômica e alimentar, sendo uma das principais hortaliças produzidas no Brasil. O alto custo de produção e grandes perdas econômicas da cultura do tomateiro estão fortemente relacionados a problemas fitossanitários, dentre eles, a infestação de mosca branca Bemisia tabaci que além de causar danos como inseto sugador, atua como vetor de diferentes gêneros virais, o que torna fundamental manter populações baixas desse inseto vetor no campo. A mosca branca é responsável por causar grandes danos à agricultura, por possuir desenvolvimento rápido e ser adaptada a diversos hospedeiros. A natureza invasora da mosca branca e sua alta taxa de reprodução dificultam o controle e favorecem o desenvolvimento de resistência aos inseticidas utilizados no seu combate, evidenciando a necessidade de alternativas mais eficientes de controle. O silenciamento gênico pós-transcricional via RNA interferente (RNAi) é uma das estratégias da engenharia genética, que pode ser utilizada na busca da obtenção de plantas resistentes a pragas com maior especificidade. A estratégia de RNAi foi utilizada com o objetivo de obter plantas de tomateiro resistentes à mosca branca, pelo silenciamento do gene da v-ATPase de Bemisia tabaci, devido à expressão de siRNAs. Explantes cotiledonares de tomateiro da variedade Micro-Tom foram transformados via Agrobacterium tumefaciens EHA 105 contendo um plasmídeo, que possui um cassete de supressão para o silenciamento do gene da v-ATPase de mosca branca. Foram geradas 13 linhagens transgênicas, confirmadas por PCR pela detecção do transgene de 576 pb correspondente à região do gene da v-ATPase. A inserção do transgene no genoma em alguns eventos foi confirmada por meio da análise de Southern blot. Análise da progênie confirmou a presença do inserto na geração T1, segregando em proporção mendeliana 3:1 e 15:1. Um bioensaio realizado com folhas destacadas das plantas T0 mostrou que a mortalidade de moscas brancas pode chegar próximo a 100% em cinco dias de interação com algumas linhagens. / The tomato plant (Solanum lycopersicum L.) is economically important, being one of the main vegetables produced in Brazil. The high cost of production and huge economical losses in tomato cultivation are strongly related to phytosanitary problems, among them the whitefly Bemisia tabaci, besides causing damage as a sucking insect, acts as a vector of different viral genus, which needs keeping low populations in rural areas. The whitefly is responsible for a great damage to agriculture due its quick development and adaptation to several hosts. The invasive nature of the whitefly and its high reproduction rate hinder the control and favor the development of resistance to insecticides, which evidences the need for more efficient alternatives control. The post-transcriptional gene silencing via interfering RNA (RNAi) is one of the genetic engineering’s strategies that should be used for obtaining resistant plants to plagues with greater specificity. The RNAi mechanism was utilized to obtaining tomato resistant plants to the whitefly by silencing the v-ATPase gene from Bemisia tabaci. Cotyledonary explants from Micro-Tom variety were transformed via Agrobacterium tumefaciens EHA 105 containing a suppression cassette for the whitefly’s v-ATPase gene silencing. Thirteen transgenic lines were generated, confirmed by PCR, through the detection of a 576 pb transgene fragment corresponding to the v-ATPase gene. The transgene insertion into de genome of some events was confirmed by Southern blot analysis. Progeny analysis confirmed the presence of the transgene into the T1 progeny, segregating in Mendelian proportion 3:1 e 15:1. A preliminary bioassay performed with detached leaves from T0 plants showed a whiteflies’ mortality around 100% in some lines after five days of interaction.

Orientador: Paula Rahal / Coorientador: Bruno Moreira Carneiro / Banca: Maurício Lacerda Nogueira / Banca: Isabel Maria Vicente Guedes de Carvalho Mello / Resumo: A hepatite C é consequência da infecção pelo vírus da hepatite C (HCV) e estima-se que cerca de 150 milhões de pessoas em todo o mundo estejam cronicamente infectadas. Estudos têm demonstrado interações entre proteínas virais e do hospedeiro durante o ciclo de replicação do HCV e estas interações podem ser utilizadas para o desenvolvimento de novas terapias contra a hepatite C. As proteínas de choque térmico (Hsp) são proteínas celulares que interagem com proteínas do HCV e a inibição destas proteínas poderiam reduzir a replicação viral. Neste estudo, as proteínas celulares Hsp90 e Hsp27 foram inibidas por siRNA isoladamente ou em combinação com a inibição das regiões virais 5'UTR, NS3 e NS5A. Foi utilizada uma cultura celular estável Huh7 expressando um replicon subgenomico do HCV e todas as moléculas de siRNA dirigidas ao genoma do vírus mostraram eficiência na redução da replicação viral. A melhor resposta foi obtida pelo siRNA 5'UTR, que apresentou bons resultados também nos estudos à longo prazo. A inibição da proteína celular Hsp27 aumentou os níveis de replicação do vírus, entretanto a supressão de Hsp90 mostrou redução da replicação viral e a utilização desta molécula juntamente com a molécula de siRNA dirigida para 5'UTR mostraram uma diminuição de mais de 90% da replicação viral. Entretanto a inibição prolongada de Hsp90 levou à morte celular, evidenciando o importante papel desta proteína na sobrevivência das células. Portanto o presente trabalho sugere que a terapia combinada de siRNAs pode ser uma alternativa eficiente no combate à hepatite C em pacientes com HCC uma vez que a inibição de Hsp90 atua tanto na supressão tumoral quanto na replicação do HCV / Abstract: Hepatitis C is a consequence of infection by hepatitis C virus (HCV) and it is estimated that approximately 150 million people are chronically infected worldwide. Several studies have demonstrated interactions between viral and host proteins during the HCV replication cycle and these interactions might be used for development of new therapies against hepatitis C. The heat shock proteins (Hsp) are cellular proteins that interact with proteins of HCV and inhibition of these proteins could reduce viral replication. In this study, cellular proteins Hsp90 and Hsp27 were inhibited by siRNA targeting the mRNA of these proteins in combination with siRNA to viral 5'UTR region, NS3 and NS5A. We used a stable cell line expressing HCV subgenomic replicon and all siRNA molecules targeting the viral genome showed effectiveness in reducing viral replication. The best response was achieved by siRNA 5'UTR, which showed good results on long term studies. The inhibition of cellular protein Hsp27 increased virus replication, but knockdown of Hsp90 showed reduced viral replication. Use of this molecule together with the siRNA molecule directed to 5'UTR showed a decrease of more than 90% viral replication. However, the prolonged inhibition of Hsp90 led to cell death, demonstrating the important role of this protein in cell survival. Finally this work suggests that the combination therapy of siRNAs can be an effective alternative to treat hepatitis C in patients with HCC since reduction of Hsp90 expression if effective on tumor suppression and in HCV replication / Mestre

Orientadores: Iscia Teresinha Lopes-Cendes, Ivan de Godoy Maia / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-04T19:04:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira_TiagoCampos_D.pdf: 3895694 bytes, checksum: d999bfc92e9a2e2c757db34bbfc7d7fa (MD5) Previous issue date: 2005 / Doutorado / Genetica Animal e Evolução / Doutor em Genetica e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:20:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 4383.pdf: 5759644 bytes, checksum: 0a6a6bb722062f7934be619267686311 (MD5) Previous issue date: 2012-04-24 / Universidade Federal de Minas Gerais / Selenium (Se) is an essential element found in selenoproteins as the 21st amino acid (Selenocysteine Sec).For the Sec incorporation and the related biosynthetic pathaway, several elements are required: tRNASec, a UGA codon and a Sec insertion sequence (SECIS), a conserved motif downstream of the selenoprotein encoding gene. Selenoproteins generally participate in the cellular redox balance, playing an important role on cell growth and proliferation. These proteins, as well as the the Sec synthesis pathway, are present in members of the Bacteria, Archaea and Eukarya domains, being identified in several protozoa, including the kinetoplastids. Auranofin, a gold-contaning antirheumatic drug, is a known selenoproteins inhibitorand Trypanosoma brucei and Leishmania majorcells are sensitive to this compound, with a LD50 in nanomolar range. This indicates a possible dependence of these parasites on selenoproteins. Theselenophosphate synthetase (SELD/SPS2) is responsible for the formation of monoselenophosphate from selenide and ATP, being essencial for selenoprotein biosynthesis. SPS2 knockdown led to apoptosis under sub-optimal growth conditions. The selenoproteome of these flagellated protozoa consists of distant homologs of the mammalian SelK and SelT, and a novel selenoprotein designated SelTryp, a kinetoplastidspecific protein. The functions of any of these selenoproteins are not known.We have investigated the effect of their downregulation in T. brucei to interpret their possible physiological role. The TbSelK depletion shows no effect on growth under optimal conditions, but the cells became more sensitive to endoplasmic reticulum stress agents and oxidative stress, suggesting that SelK is an ER stress-regulated protein and plays an important role in protecting T. brucei cells from ER stress agent. The TbSelT gene silence by RNA interference hampers the parasite survival, but the sensitivity to the agents tested was not asevident as it was forTbSelK, suggesting a role for TbSelT in protection against stress, but not specifically ER stress. Our results show the importance of selenocysteine and selenoproteins to parasite survival. / Selênio (Se) é um elemento essencial encontrado em selenoproteínas na forma do 21º aminoácido selenocisteína (Sec U). A incorporação co-traducional de Sec depende de uma complexa via de síntese, de um códon de terminação UGA em fase de leitura e uma estrutura terciária do RNA mensageiro conhecida como elemento SECIS. A maioria das selenoproteínas conhecidas participa de processos de manutenção do estado redox das células, tendo um importante papel no crescimento e proliferação celular. Essas proteínas, bem como os componentes da via de síntese de Sec, estão presentes em membros dos domínios de Bactérias, Arquéais e Eucaria, tendo sido identificada em diversos protozoários, incluindo os kinetoplastidas. Auranofin, um composto de ouro usado como agente antireumático, tem sido descrito como um inibidor de selenoproteínas através de sua ligação com o aminoácido selenocisteína e células de Trypanosoma brucei e Leishmania major são altamente sensíveis a este composto, apresentando um LD50 na faixa de nanomolar. Esta evidência indica uma possível dependência destes parasitas por selenoproteínas e consequentemente pela sua via de síntese. A selenofosfato sinetase (SELD/SPS2) é a enzima responsável pela síntese de monoselenofosfato a partir de seleneto e ATP, sendo, portanto uma proteína fundamental na síntese de selenocisteína. Sua depleção levou a apoptose celular quando mantidas em condições de estresse. Esse efeito pode ser causado pela consequente falta das selenoproteínas ou pelo acúmulo de espécies tóxicas de selênio, como o seleneto. Os protozoários apresentam número reduzido de selenoproteínas e kinetoplastidas apresentam 3, duas homólogas distantes de mamíferos, SelK e SelT, e uma nova proteína exclusiva denominada SelTryp, que não apresentam homologia com nenhuma outra proteína descrita. O papel dessas proteínas não é conhecido, e nós investigamos suas possíveis funções através da inibição de sua expressão. A depleção de TbSelK não mostrou efeito sob condições normais, mas tornou as células mais sensíveis a agentes indutores de estresse de retículo endoplasmático, o que nos permite inferir uma função de manutenção da homeostase dessa organela. A depleção de TbSelT causou uma diminuição no crescimento celular, mas o aumento da sensibilidade aos agentes indutores de estresse não foi tão pronunciada como em TbSelK. Nossos resultados revelam a importância de selenocisteína para parasitas, uma vez que esses organismos enfrentam diversos tipos de estresses para manter a viabilidade e a progressão da doença nos diferentes hábitats encontrados ao longo do seu ciclo de vida.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:22:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2981.pdf: 6989540 bytes, checksum: 48d65263f0c7e6493fadd24c1378e4d0 (MD5) Previous issue date: 2009-10-14 / Financiadora de Estudos e Projetos / ADAMs is a term used to describe the presence of disintegrin and metalloprotease domains(A Disintegrin And Metalloprotease) in a certain class of multi-functional membrane proteins,expressed in several animal species such as mammals and insects. They play important rolesin many physiological processes as in fertilization, myoblast fusion, migration, proliferationand cell survival, as well in diseases including breast, prostate, and pancreas cancer. ADAM9is involved in cellular processes such as adhesion, migration and signaling of tumor cells andit is involved in the metastatic spreading. Aims: To analyze the expression of ADAM9 intumor cell lines (MDA-MB-231 and DU-145), no tumors (FH and C2C12), and to generateknockout clones for ADAM9 expression using silencing RNA techniques for the study ofADAM9 effects on invasion, proliferation and gene expression of MDA-MB-231 cells.Methods: Cells were cultured and plated (2x106 cells/plate of 6cm) for 24 hours in DMEM(10% FBS) and lysed for western blotting and zymography. To check for inhibition ofadhesion to immobilized collagen I, MDA-MB-231 cells and FH (5x106 cells/ml) werelabeled with CMFDA, and then incubated with anti-ADAM9D and anti-RP3ADAM9 indifferent concentrations. For ADAM9 silencing, it was used a kit (Silencer ® siRNA StarterKit - Ambion), 2x105 cells (MDA-MB-231) and the transfection agent (Lipofectamine 2000 -Invitrogen). The cells were plated in 5ml of culture medium DMEM/plate. On the third daycells were treated with the transfection agent and RNA silencing primers. Total RNA wasisolated for RT-PCR, and proliferation and invasion in matrigel assays. Results: All the celllines studied expressed ADAM9 in the tested conditions. MMP-2 (Gelatinase-A) activity wasdetected in the cell extracts of all studied cell lines. Silencing of ADAM9 did not affect therate of MDA-MB-231 proliferation, at 4, 5, 6, 7, 8, 9 and 10 days after silencing (24 or 48hours of incubation in 96-well plates). Silencing of human ADAM9 inhibited tumor cellinvasion in matrigel (71,51±8,02%) when compared to control. Conclusion: The generation ofMDA-MB-231 knockout clones lacking ADAM9 expression using siRNA technique did notaffect the rate of cell proliferation but inhibited tumor cell matrigel invasion, suggesting thatADAM9 is an important molecule in the processes of invasion and metastasis. / ADAMs é um termo usado para descrever a presença de domínios desintegrina emetaloprotease (A Disintegrin And Metalloprotease) em uma determinada classe de proteínasde membrana, multifuncionais, expressas em diferentes espécies animais como mamíferos einsetos. Elas possuem funções importantes em muitos processos fisiológicos como nafertilização, fusão de mioblastos, migração, proliferação e sobrevivência celular, entre outros,bem como em processos patológicos tais como muitos tipos de tumores humanos, incluindomama, próstata, pâncreas, fígado, rins e pele. A ADAM9 está envolvida em diversosprocessos celulares, tais como adesão celular, migração e sinalização de células tumorais,contribuindo para o desenvolvimento de metástases. Objetivos: Analisar a expressão daADAM9 em linhagens de células tumorais (MDA-MB-231 e DU-145) e não tumorais (FH eC2C12), gerar clones com o gene que codifica para a ADAM9 silenciados e verificar o efeitoda ausência desta proteína na invasão, proliferação e expressão gênica das células MDA-MB-231. Métodos: As células foram cultivadas e posteriormente plaqueadas (2x106 células/placade 6cm) por 24 horas e em 5ml de meio de cultura DMEM (10% de FBS) e lisadas para oensaio de western blotting e zimografia. Para o ensaio de inibição de adesão as células MDAMB-231 e FH (5x106 células/ml) foram marcadas com CMFDA (clorometil diacetatofluoresceína) e posteriormente incubadas com os anticorpos anti-ADAM9D e anti-RP3ADAM9 em diferentes concentrações. Para a técnica de RNAi foi utilizado um kit(Silencer® siRNA Starter Kit Ambion), 2,0x105 de células (MDA-MB-231) e agente detransfecção (Lipofectamina 2000 - Invitrogen). As células foram plaqueadas em 5ml de meiode cultura DMEM/placa. No terceiro dia de plaqueamento as células foram tratadas comagente de transfecção e primer de silenciamento do RNA, para serem utilizadas na RT-PCR,ensaio de proliferação e invasão em matrigel. Resultados: Todas as linhagens estudadasexpressaram a ADAM9 nas condições de estudo. A atividade MMP-2 (gelatinase-A)intermediária estava presente em todos os tipos celulares testados. O silenciamento deADAM9 não afetou a taxa de proliferação das células MDA-MB-231 após 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10dias do silenciamento (24 ou 48 horas de incubação). O silenciamento da ADAM9 humanainibiu a invasão celular em células de câncer de mama (MDA-MB-231) em matrigel (71,51 ±8,02%) quando comparados com o controle. Conclusão: A geração de clones knockout sem aexpressão da ADAM9 utilizando a técnica de silenciamento de RNA em células de câncer demama (MDA-MB-231), não afetou a taxa de proliferação celular. No entanto, a invasão dascélulas tumorais em matrigel foi inibida em aproximadamente 70% quando comparada com ocontrole, demonstrando que ADAM9 é uma importante molécula envolvida no processo deinvasão e metástase.

A incidência de melanomas tem crescido mundialmente. Apesar de representar um potencial problema de saúde pública pela sua incidência crescente, melanomas ainda se apresentam como tumores de difícil tratamento, especialmente quando diagnosticados em estadios avançados. A taxa de resposta a quimioterapia não ultrapassa 30% de resposta clínica objetiva nestes casos. As bases moleculares da quimiorresistência não são ainda completamente esclarecidas e seu conhecimento será útil para o delineamento de estratégias de quimiossensibilização. Em estudos anteriores, observamos que o tratamento de linhagem de células de melanoma metastático humano com o quimioterápico cisplatina induz o acúmulo de proibitina nas células sobreviventes. Proibitina é uma molécula expressa ubiquamente na maioria das células. Há evidências de que a forma nuclear esteja envolvida com o processo de morte celular e inibição de E2F1 enquanto a forma citoplasmática parece atuar como chaperona mitocondrial, garantindo sua homeostasia. O objetivo deste projeto foi avaliar a compartimentalização subcelular e a expressão de proibitina, após tratamento com 25 M de cisplatina por 24 horas em diferentes linhagens de melanoma metastático humano; e, o efeito de sua subexpressão, usando-se small interference (si) RNA. Nós mostramos que nas linhagens de melanoma humano LB373Mel, SKMel 37 e Mel 85, a proibitina foi encontrada predominantemente no citoplasma, associada, pelo menos em parte, com a mitocôndria. Após tratamento com cisplatina, uma porção da proibitina também foi encontrada no núcleo, como pode ser detectado utilizando-se anticorpo monoclonal (clone II-14-1). Experimentos de knockdown de proibitina por siRNA obtiveram sucesso em duas de três linhagens. Nessas duas linhagens (LB373Mel e Mel 85), o bloqueio do acúmulo de proibitina após tratamento com cisplatina levou à quimiossensibilização. A quimiossensibilização à cisplatina não foi observada na linhagem SKMel 37, que foi capaz de acumular proibitina mesmo quando tratada com siRNA específico para proibitina. A conclusão deste projeto é que a expressão de proibitina é parte da resposta celular que leva a sobrevivência de células de melanoma expostas à cisplatina / The incidence of melanomas has grown world-wide. Besides representing a potential problem of public health for its increasing incidence, melanomas are tumors of difficult treatment, especially when diagnosed in advanced phases. The clinical objective response rate does not exceed 30% in these cases. The molecular bases of chemoresistance are not completely clarified and their understanding will be useful for the delineation of chemosensitization strategies. In previous studies, we observed that the treatment of a human metastatic melanoma cell line with the chemotherapeutic agent cisplatin induced the accumulation of prohibitin in the surviving cells. Prohibitin is ubiquitously expressed molecule in most cells. There is evidence that the nuclear form is involved with the process of cell death and inhibition of E2F1, while the cytoplasmic form seems to act as mitochondrial chaperone, guaranteeing its homeostasis. The aim of this project was to evaluate the subcellular compartmentalization and protein expression profile of prohibitin, after treatment with 25M of cisplatin for 24 hours in different human metastatic melanoma cell line, and the effect of its underexpression, using siRNA. We showed that, in human melanoma cell lines, LB373Mel, SKMel 37 and Mel 85, prohibitin was found predominantly in the cytoplasm, associated at least in part with the mitochondria. Upon cisplatin treatment, a fraction of prohibitin was also found in the nucleus, as detected by using a monoclonal antibody (clone II-14-10). Knockdown experiments were successful in two out of three cell lines. In these two cell lines (LB373Mel and Mel 85) blockage of the accumulation of prohibitin upon cisplatin treatment led to chemosensitization. Chemosensitization to cisplatin was not observed for SKMel 37 cells, which accumulated prohibitin even when treated with prohibitin specific siRNA oligonucleotides. Altogether, we concluded that expression of prohibitin is part of the cellular response that leads to cell survival in melanoma cells exposed to cisplatin