O infarto do miocárdio (IM) é uma patologia causada pela obstrução parcial ou total das artérias coronárias responsáveis pela irrigação do miocárdio. Sabe-se que logo após o IM, o treinamento físico (TF) promove melhora e adaptações benéficas ao sistema cardiovascular. O objetivo do presente estudo foi traçar o perfil de microRNAs na área remanescente ao IM de ratos submetidos ou não ao TF através da técnica de microarray, selecionar e confirmar a expressão de um microRNA específico, por programas de bioinformática que tenha alvos que possam estar envolvidos com a melhora da função cardíaca com o TF. Também foi objetivo deste estudo, verificar a expressão do microRNA-1, do microRNA-29 e do microRNA-214 e dos respectivos alvos destes microRNAs, como o colágeno, NCX e SERCA2a. Para isso, ratos Wistar foram divididos em quatro grupos: SEDENTÁRIO SHAM (SED-SHAM), SEDENTÁRIO INFARTADO (SED-IM), TREINADO SHAM (TR-SHAM) e TREINADO INFARTADO (TR-IM). A função ventricular foi acompanhada com ecocardiografia antes e após oito semanas do protocolo de TF de natação. Os animais foram sacrificados, o RNA foi extraído e posteriormente foi traçado o perfil de microRNAs. Para seleção dos microRNAs foram estipulados dois padrões de expressão entre os grupos. De acordo com os critérios aplicados foram observados, apenas 6 microRNAs para o primeiro padrão de expressão e 3 microRNAs para o segundo padrão de expressão que satisfizeram todos os critérios. O microRNA-339-5p foi escolhido por apresentar expressão diferencial pronunciada como efeito do TF por ter dois genes (alvos selecionados por programas de bioinformática TargetScan, Miranda e PicTar), o Myo1c e o PGC-1 ?, que estão envolvidos com a regulação da função cardíaca. Neste estudo, foi possível verificar que nos grupos TR-SHAM e TR-IM ocorreu aumento da expressão da Myo1c e redução da expressão do microRNA-339-5p. Nossos resultados também mostraram que o TF induziu aumento na expressão dos microRNAs-29a/c, o que está relacionado com significativa diminuição na expressão gênica do COLIAI, COLIIIAI, diminuição na concentração de hidroxiprolina e fração volumétrica de colágeno de ratos com IM. Outro resultado deste estudo é que o TF induziu diminuição na expressão dos microRNAs-1 e 214, o que está relacionado com aumento na expressão protéica dos alvos SERCA-2a e NCX de ratos com IM. Esses efeitos estão associados com a melhora da função ventricular avaliada pela FEAT% (função sistólica) e pela relação E/A (função diastólica), realizado por avaliação ecocardiográfica após o período de TF. / Myocardial infarction (MI) is a disease caused by partial or total blockage of the myocardial coronary arteries. It is known that after MI, physical training (PT) improves and promotes beneficial adaptations to the cardiovascular system. The aim of this study was to analyse the microRNAs profile in the remaining area to MI in rats submitted to PT by microarray and select a specific microRNA by bioinformatics software that has targets involved with the improvement of cardiac function by PT. Also, the aim of this study was to verify the expression of the microRNA-1, microRNA-29 and microRNA-214 and its targets, such as collagen, NCX and SERCA2a. For this, rats were divided into four groups: SEDENTARY SHAM (SHAM - SED), INFARCTED SEDENTARY (SED-MI), TRAINED SHAM (TR-SHAM) and INFARCTED TRAINED (TR-IM). Ventricular function was monitored with echocardiography before and after eight weeks of the PT. The animals were sacrificed, the RNA was extracted and traced the profile of microRNAs. For selection of microRNAs were stipulated two patterns of expression between the groups. The first standard, 6 microRNAs were selected and in the second standard, 3 microRNAs were selected to satisfy all criteria. The microRNA- 339-5p was chosen because of pronounced differential expression with PT and have two target genes selected by bioinformatics programs (TargetScan, Miranda and PicTar) Myo1c and the PGC-1 ? are involved in the regulation of cardiac function. In this study, we found that the SHAM group and the group with MI undergoing PT increased expression of Myo1c in contrast to a decreased expression of microRNA-339- 5p. Our results also showed that PT induced increased expression of microRNA-29a/c, which is associated with a significant decrease in gene expression of COLIAI, COLIIIAI, the hydroxyproline xvii concentration and collagen volume fraction of rats with MI. Another result of this study is that the PT induced decrease in the expression of microRNA-1 and microRNA-214, which is related to the increase in protein expression of the targets SERCA-2a and NCX of rats with MI. These effects are associated with improved ventricular function assessed by FEAT % (systolic function) and E/A ratio (diastolic function), performed by echocardiography after the period of PT

Introdução - Evidências mostram que a ingestão de uma refeição hipercalórica, rica em lipídios e açúcares, provoca elevação da concentração plasmática de glicose e de triacilgliceróis (TG), bem como de lipopolissacarídeos (LPS) no período pós-prandial. Sugere-se que essa condição esteja envolvida na gênese da inflamação subclínica, caracterizada pelo aumento da concentração de biomarcadores pró-inflamatórios na circulação sanguínea, como o fator de necrose tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-1β, IL- 6 e as moléculas de adesão intracelular solúvel (sICAM)-1 e vascular solúvel (sVCAM)- 1, o que contribui para o aumento do risco para doenças cardiovasculares. Estudos recentes sugerem que os microRNA (miRNA) atuam como biomarcadores inflamatórios e a análise da sua expressão no período pós-prandial pode contribuir para a redução do risco de doenças cardiovasculares. Objetivo - Investigar o efeito de uma refeição hiperlipídica, rica em ácidos graxos saturados, sobre a expressão de microRNA e a concentração de LPS no plasma no período pós-prandial em mulheres saudáveis. Métodos - Realizou-se um estudo de intervenção no qual foi oferecido uma refeição matinal com alto teor de lipídios, principalmente, de ácidos graxos saturados, mais 500 mL de água, realizando-se coletas de sangue no período basal e 1, 3 e 5 horas após a ingestão da refeição hiperlipídica. A população do estudo foi composta por mulheres saudáveis (n = 11), com idade entre 20 e 40 anos, e IMC de 18,5 a 25 kg/m². Foram avaliadas as concentrações plasmáticas de glicose, insulina, perfil lipídico e de ácidos graxos, citocinas, moléculas de adesão, MCP-1 e LPS. Analisou-se pelo ensaio de PCR em tempo real, um perfil de expressão de 752 miRNA plasmáticos humanos. Essas análises foram realizadas em todos os tempos da coleta de sangue. Resultados - Houve aumento significativo das concentrações plasmáticas de LPS e TG nos tempos 1, 3 e 5 horas em relação ao período basal. As concentrações plasmáticas de insulina elevaram-se de forma significativa após 1 e 3 horas em comparação ao período basal, e reduziu após 5 h se comparado ao tempo 1 h. Os ácidos graxos saturados plasmáticos mirístico e palmítico aumentaram após o consumo da refeição. Houve aumento das concentrações plasmáticas de TNF-α após 5h se comparado ao basal e ao tempo 1 h. E houve aumento da concentração de sVCAM-1 após 5 h vs o basal. Em relação aos miRNA, 45 miRNA tiveram suas concentrações alteradas se comparadas entre todos os tempos, destes 33 miRNA vs o basal. Conclusões - O aumento de TG e insulina após a refeição hiperlipídica pode contribuir para explicar a participação da dieta no desenvolvimento de um quadro inflamatório, promovido, também, por um quadro de endotoxemia pós-prandial. Junto a isso, os miRNA podem exercer papel importante na regulação deste quadro. Uma refeição hiperlipídica, com elevado teor de ácidos graxos saturados, ocasiona um quadro de endotoxemia metabólica e altera a expressão de microRNA plasmáticos envolvidos na regulação do processo inflamatório no período pós-prandial. / Introduction Evidence shows that a high caloric meal, rich in lipids and carbohydrates, increase glucose and triacyclglycerols (TG) concentrations, furthermore in lipopolysaccharides (LPS) in the postprandial period. This condition is involved with subclinic inflammation genesis, characterized by increased concentration of inflammatory biomarkers in blood circulation, like tumor necrose fator (TNF)-α, interleukin (IL)-1β, IL-6 and soluble intracellular adhesion molecule (sICAM)-1 and soluble vascular (sVCAM)-1, what contributes to rise cardiovascular disease risk. Recent studies indicate that microRNAs (miRNA) act as inflammatory biomarkers and analysis of their expression in the postprandial state could contribute to reduction of cardiovascular disease risk. Objective This study investigates the high-fat high-saturated meal effect above miRNA expression and LPS concentration at the postprandial period in healthy women. Methods An interventional study was carried out in which a breakfast with a high lipid content, mainly of saturated fatty acids, plus 500 mL of water was offered. Blood samples were collected at baseline and 1, 3 and 5 hours after ingestion of the high-fat meal. The study population consisted of healthy women (n = 11), aged between 20 and 40 years, and BMI of 18.5 to 25 kg / m². Plasma concentrations of glucose, insulin, lipid profile and fatty acids, cytokines, adhesion molecules, MCP-1 and LPS were evaluated. An expression profile of 752 human plasma miRNA was analyzed by the real-time PCR assay. These analyzes were performed at all times of blood collection. Results - There was a significant increase in the plasma concentrations of LPS and TG at times 1, 3, 5 hours in relation to the baseline. Plasma insulin concentrations increased significantly after 1 and 3 hours compared to baseline, and decreased after 5 h compared to 1 h. Myristic and palmitic saturated fatty acids increased after consumption of the meal. There was an increase in plasma concentrations of TNF-α after 5 hours compared to the baseline and at 1 h. And there was an increase in sVCAM-1 concentration after 5 hours vs baseline. Regarding the miRNA, 45 miRNA had their concentrations altered when compared among all the times, of these 33 miRNA vs the baseline. Conclusions - The increase of TG and insulin after the high-fat meal may contribute to explain diet participation in the development of an inflammatory condition, also promoted by postprandial endotoxemia. In addition, microRNAs may play a key role in the regulation of this condition. High-fat high-saturated meal generates a metabolic endotoxemia state and changes plasma microRNAs expression which are involved in regulation to inflammatory process in the postprandial period.

O aumento excessivo de peso corporal acompanhado do acúmulo de gordura visceral eleva o risco de morbidade por hipertensão, diabetes mellitus tipo 2 e doença cardiovascular (DCV). O estresse oxidativo e a inflamação desempenham papel etiológico nestas comorbidades. Neste contexto, os microRNA (miRNA) atuam na regulação pós-transcricional no intuito de manter a homeostase celular sob condições de estresse fisiológico. A expressão de miRNA pode ser modulada por nutrientes e compostos bioativos provenientes da alimentação, atuando sobre processos inflamatórios, reduzindo o risco e/ou atenuando a progressão das DCV. A castanha-do-brasil é a maior fonte alimentar de selênio, sendo considerada um alimento com potencial função antioxidante podendo ser utilizado em pacientes com elevado risco cardiovascular. Dessa forma, o objetivo do presente estudo foi avaliar a expressão de microRNA circulantes em mulheres com excesso de peso antes e após o consumo da castanha-do-brasil. Para isso, foram selecionadas 72 mulheres com excesso de peso que frequentam o serviço de endocrinologia do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP). As participantes foram distribuídas aleatoriamente em dois grupos: grupo intervenção (grupo Brazil Nut - BN), que consumiu uma unidade de castanha-do-brasil durante 60 dias, e grupo controle (CO), que não recebeu intervenção durante o mesmo período. Ao início e ao final da intervenção foram realizadas avaliações antropométricas e coleta de sangue. Foram incluídas no estudo 54 participantes: 29 do grupo BN e 25 do grupo CO. Nenhuma das variáveis antropométricas e bioquímicas apresentou variação significativa entre os grupos durante o período de intervenção. Conforme esperado, apenas o grupo BN apresentou um aumento significativo do selênio plasmático e eritrocitário durante o período de intervenção (> 200%; P<0,001). Foram avaliados 25 miRNA plasmáticos antes e após a intervenção. Dois miRNA (miR-454-3p e miR-584-5p) apresentaram aumento significativo (fold change maior que 2,2; P<0,05) após a ingestão de castanha-do-brasil. A análise dos seus possíveis alvos pelo software Ingenuity Pathway Analysis (IPA®, Qiagen) apontou que ambos estão relacionados com a via de ativação do VDR/RXR, podendo apresentar efeitos sobre a homeostase do cálcio, regulação do crescimento e função imune. O miR-454-3p apresentou, ainda, correlação positiva com a variação do selênio plasmático (r=0,432; P=0,005) e diversos miRNA apesentaram correlação significativa com parâmetros relacionados à síndrome metabólica e à resistência à insulina. Dessa forma, podemos concluir que o consumo da castanha-do-brasil por 60 dias é capaz de modular a expressão de miRNA circulantes em mulheres com excesso de peso, particularmente do miR-454-3p e do miR-584-5p, podendo estes serem utilizados como possíveis biomarcadores de ingestão e auxiliar, ainda, no entendimento dos mecanismos pelos quais o selênio exerce seu efeito na saúde dessa população. / Excessive body weight gain accompanied by visceral fat accumulation raises the morbidity risk due to hypertension, type 2 diabetes mellitus and cardiovascular disease (CVD). Oxidative stress and inflammation play etiological role in these comorbidities. In this context, microRNAs (miRNAs) act in post-transcriptional regulation in order to maintain cellular homeostasis under physiological stress. MicroRNAs expression can be modulated by nutrients and bioactive compounds from the diet, acting on inflammatory processes, reducing the risk and/or attenuating the progression of CVD. Brazil nut is the major food source of selenium, being considered a food with potential antioxidant function to be used in patients with high cardiovascular risk. Thus, the present study aimed to evaluate the expression of circulating miRNAs in overweight and obese women before and after Brazil nuts intake. Thus, we selected 72 overweight and obese women recruited at Division of Endocrinology and Metabolism from the Clinical Hospital (School of Medicine, University of São Paulo, São Paulo, Brazil). Participants were randomly assigned to two groups: intervention group (Brazil Nut - BN group), which consumed one Brazil nut for 60 days, and control group (CO), which received no intervention during the same period. At the baseline and at the end of the intervention were performed anthropometric assessments and blood collection. The study included 54 participants: 29 from the BN group and 25 from the CO group. None of the anthropometric and biochemical variables presented significant variation between the groups during the intervention period. As expected, only the BN group showed a significant increase in plasma and erythrocyte selenium during the intervention period (> 200%; P<0.001). We evaluated 25 circulating miRNAs before and after the intervention. Two miRNAs (miR-454-3p and miR-584-5p) presented a significant increase (fold change greater than 2.2; P <0.05) after Brazil nuts intake. The analysis of potential targets by the Ingenuity Pathway Analysis software (IPA®, Qiagen) indicated that both are related to the VDR/RXR activation pathway, and may have effects on calcium homeostasis, growth regulation and immune function. Furthermore, miR-454-3p presented a positive correlation with plasma selenium (r = 0.432, P = 0.005) and several miRNAs showed a significant correlation with parameters related to metabolic syndrome and insulin resistance. Thus, we conclude that Brazil nut inatke for 60 days is capable of modulating circulating miRNAs in overweight and obese women, particularly miR-454-3p and miR-584-5p, and these may be used as possible biomarkers of intake and help to understand the mechanisms by which selenium exerts its effect on health of this population.

As células-tronco embrionárias (CTEs), extraídas da massa celular interna do blastocisto, tem como características principais a capacidade de auto-renovação e a pluripotência. Durante o desenvolvimento, as células perdem seu potencial de diferenciação e adquirem um perfil de expressão gênica mais restrito, modulado por mecanismos epigenéticos, assim como por microRNAs. Membros da família miR-29 têm como transcritos alvos enzimas responsáveis pela metilação da citosina em 5mC (DNMT3a e 3b) e também da desmetilação (TET1, 2 e 3) do DNA, pela hidroxilação de 5mC em 5hmC. Recentes trabalhos sugerem que a modulação do miR-29 sobre estes alvos teria um papel no início da diferenciação em CTEs de camundongos e no aumento de eficiência da geração de iPS em células humanas. No presente trabalho, buscou-se compreender o papel regulatório do miR-29a em seus alvos epigenéticos no contexto da pluripotência e no início da diferenciação com atRA. Para tanto, duas linhagens celulares pluripotentes humanas (H1 e NTera- 2) foram submetidas a indução de diferenciação com atRA e ao ganho de função do miR-29a durante quatro dias de cultivo para análises de expressão gênica. Ademais, em NT2, realizamos ensaios funcionais por microscopia de imunofluorescência quantitativa para avaliar os efeitos do ganho e perda de função do miR-29a, DNMT3b e TET1, sobre a expressão nuclear de OCT4 e os perfis globais de 5mC e 5hmC após 96 horas de transfecção. Neste ensaio, também avaliamos o papel específico da regulação pós-transcricional de DNMT3b e TET1 pelo miR-29a, utilizando moléculas bloqueadoras dos sítios alvo (TSB) do miR-29a nestes transcritos. Observamos que sob a indução do atRA, os níveis de expressão do miR- 29a e de seus genes alvos (com exceção de DNMT3b), assim como dos marcadores de endoderme e ectoderme, aumentaram, seguido da diminuição dos marcadores de pluripotência em ambas as linhagens. A transfecção de moléculas mímicas do miR-29a, reduziu os níveis de seus transcritos alvos após dois e quatro dias em NT2 e H1, além de reduzir os níveis nucleares de DNMT3b em NT2. Ainda, ocorreu um aumento na expressão de genes da endoderme, mesoderme e ectoderme em H1 e a queda da expressão gênica e nuclear de OCT4 em NT2. Com o uso de siRNA específicos, demonstramos que o knockdown dos níveis nucleares de DNMT3b foi acompanhado de uma queda nos níveis globais de 5mC e um aumento de OCT4 e de 5hmC. Já o knockdown de TET1, elevou os níveis de 5mC, mas também os níveis de 5hmC e OCT4 nuclear. As avaliações com o uso de TSB contra os sítios de ligação do miR-29a em seus transcritos alvo, TET1 e DNMT3b, demonstraram que em células NT2, o bloqueio da ligação do miR endógeno aos seus alvos resultam no aumento dos níveis globais de 5hmC, indicando que a regulação póstranscricional destes alvos pelo miR-29 teria um importante papel na regulação epigenética de células pluripotentes. / Embryonic stem cells (CTEs), extracted from the internal cell mass of the blastocyst, are main characterized by the capacity for self-renewal and pluripotency. During development, the cells lose their differentiation potential and acquire a restricter gene expression profile, modulated by epigenetic mechanisms, as microRNAs. Members of the miR-29 family have as target transcripts enzymes for cytosine methylation in 5mC (DNMT3a and 3b) and for DNA demethylation (TET1, 2 and 3), by hydroxylation of 5mC in 5hmC. Recent studies suggest that the modulation of miR-29 on these targets plays a role in early differentiation of mouse CTEs and in increasing human iPS cell generation efficiency. In the present study, we sought to understand the regulatory role of miR-29a in its epigenetic targets in the context of pluripotency and in early differentiation with atRA. For this, two human pluripotent cell lines (H1 and NTera-2) were submitted to differentiation induction with atRA and function gain of miR-29a during four days of culture for gene expression analysis. Furthermore, in NT2, we performed functional assays by quantitative immunofluorescence microscopy to evaluate the gain- and loss-of-function of miR-29a, DNMT3b and TET1 in the OCT4 nuclear expression and global profiles of 5mC and 5hC, 96 hours posttransfection. In this assay, we also evaluated the specific role of post-transcriptional regulation of DNMT3b and TET1 by miR-29a, using target site blocking molecules (TSB) of miR-29a. We observed that under the induction of atRA, the miR-29a expression levels and its target genes (except of DNMT3b), further the markers of endoderm and ectoderm, increased, followed by decreased pluripotency markers in both cell lines. Transfection of mimic molecules of miR-29a reduced the levels of their target transcripts after two and four days in NT2 and H1, and reduced nuclear levels of DNMT3b in NT2. In addition, the expression of endoderm, mesoderm and ectoderm genes increased in H1 and gene and nuclear expression of OCT4 decreased in NT2. With the use of specific siRNA, we demonstrated that the knockdown of nuclear levels of DNMT3b was accompanied by a drop in global 5mC levels and an increase of OCT4 and 5hmC. While, the knockdown of TET1 increased the levels of 5mC, 5hmC and nuclear OCT4. Evaluations using TSB against the miR- 29a binding sites in their target transcripts, TET1 and DNMT3b, show that in NT2 cells blocking the binding of endogenous miR to their targets results in an increase in global 5hmC levels, indicating that the post-transcriptional regulation of these targets by miR-29 would play an important role in the epigenetic regulation of pluripotent cells.

O presente trabalho refere-se ao estudo do papel dos microRNAs no controle pós-transcricional das células T de camundongos Non Obese Diabetic (NOD) modelo que reproduz o diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1). Durante o desenvolvimento do trabalho, procurou-se esclarecer a hipótese de que os microRNAs controlam os níveis de determinados RNAs mensageiros (mRNAs) das células T durante a indução ou perda de tolerância imunológica. Portanto, a expressão alterada dos microRNAs estaria contribuindo com o processo da autoimunidade. Sendo assim, o objetivo do estudo foi identificar os perfis de expressão e as redes de interação entre um conjunto de microRNAs e seus respectivos mRNAs alvos nos timócitos e nos linfócitos T CD3+ periféricos durante o desenvolvimento do diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1) em camundongos NOD. Para avaliar a expressão de genes codificadores de mRNAs, sendo estes possíveis alvos de microRNAs, utilizou-se a tecnologia de microarrays. O uso de programas de análise e para a construção das redes foi imprescindível. Acreditase que fenômenos complexos como a regulação pós-transcricional de células T e seu envolvimento no processo de tolerância imunológica, bem como o surgimento de doenças autoimunes, podem ser melhor compreendidos por meio da genômica funcional. Os resultados encontrados evidenciam uma expressão diferenciada de mRNAs e microRNAs em timócitos e linfócitos T CD3+ periféricos durante o desenvolvimento do diabetes mellitus do tipo 1 (DM-1). As diferenças nos perfis transcricionais encontradas envolvem expressão de genes (mRNAs) relacionados diretamente ao sistema imune, a diferenciação e ativação de linfócitos T e a apoptose, bem como a outros processos relacionados a resposta imune. Além disso, as redes de interação microRNA-mRNA encontradas no presente trabalho evidenciam interações já conhecidas e apresentam novas interações, mostrando a participação de um grupo de microRNAs que estão atuando no controle pós-transcricional do diabetes do tipo 1 em camundongos NOD, contribuindo com a melhor compreensão do controle genético-molecular das doenças autoimunes, principalmente do diabetes do tipo 1. / This study refers to the role played by microRNAs in the post-transcriptional control of T cells from non obese diabetic (NOD) mice model which reproduces the type 1 diabetes (T1D). During the study, it was tried to clarify the hypothesis that microRNAs control certain messenger RNAs (mRNAs) levels of the T cells during the induction or loss of immunological tolerance. Therefore, the altered expression of microRNAs might be contributing to the process of autoimmunity. Thus, the study aim was to identify the expression profiles and interaction networks between a set of microRNAs and their mRNA targets in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes during the development of type 1diabetes (T1D) in NOD mice. The microarray technology was used to evaluate the expression of mRNAs as possible targets of microRNAs involved in this process. The use of bioinformatics software to reconstruct the networks was essential. It was realized that complex phenomena as post-transcriptional regulation in T cells and their involvement in the immune tolerance process, as well as the emergence of autoimmune diseases can be better understood only by means of functional genomics. The results show differential expression of mRNAs and microRNAs in thymocytes and peripheral CD3+ T lymphocytes during the development of type 1 diabetes (T1D). The differences found in the transcriptional profiles involve mRNAs related to the immune system, differentiation and activation of T lymphocytes and apoptosis as well as other processes related to immune response. In addition, the microRNA-mRNA interaction networks obtained in this study evidence the predicted interactions as well as new ones, showing the participation of a group of microRNAs that may be acting in post-transcriptional control of type 1 diabetes in NOD mice contributing to a better understanding of the molecular genetic control of autoimmune diseases in specially type 1 diabetes.

OBJETIVO: Investigar o efeito da expressão de RNAm dos SMADs e de microRNAs (miRNAs) que possuem o TGFB1 como alvo na expressão gênica (RNAm e proteína) de TGF-&#946;1 e seu papel na fisiopatologia da angiogênese em pacientes com mielofibrose (MF) e trombocitemia essencial (TE). MÉTODOS: Foram incluídos 21 pacientes com MF primária (MFP), 21 com MF pós-TE (MFPTE) e 24 com TE, além de 98 indivíduos controles pareados de acordo com gênero e idade com os pacientes. As análises realizadas no sangue periférico foram: quantificação das concentrações plasmáticas e de RNAm de TGFB1, VEGFA e FGF2; quantificação de RNAm de SMADs 1 a 7 e de miRNAs 193a-5p, 369-5p, 542-5p, 590-3p, e 590- 5p; e detecção das mutações JAK2V617F (com quantificação alélica), MPLW515K/L e CALR. Em 26 biópsias de medula óssea dos pacientes, foram determinados o grau de microvasculatura (angiogênese estimada - CD34), a imunoexpressão de TGF-b1 ativo, TGF-&#946;1 latente e c-MPL. RESULTADOS: As concentrações de TGF- &#946;1 plasmático foram semelhantes entre os pacientes e controles, enquanto o VEGFA plasmático foi maior em todos os grupos de pacientes comparados aos seus controles. O FGF2 plasmático também foi maior em todos os grupos de pacientes, e a expressão de seu RNAm foi maior nos pacientes com TE do que em seus controles. As expressões de SMADs e de miRNAs foram semelhantes entre pacientes e controles. TGF-&#946;1 e FGF2 plasmáticos apresentaram correlações positivas nos pacientes com MFP, e correlações negativas nos seus controles, assim como nos controles de MFPTE. Em todos os grupos estudados foi observada correlação positiva entre TGF-&#946;1 e VEGFA plasmáticos. Além disso, foram demonstrados diferentes perfis de correlações entre a expressão gênica de TGF-&#946;1 e os diversos SMADs e miRNAs em cada grupo de pacientes e controles. Os pacientes com MFP com maior angiogênese (de acordo com a mediana da concentração plasmática de VEGFA e FGF2) apresentaram maiores concentrações plasmáticas de TGF-&#946;1 do que aqueles com menor angiogênese. A angiogênese medular estimada (CD34) não foi diferente entre os três grupos de pacientes estudados. Além disso, não foram encontradas correlações entre a imunoexpressão de CD34 e as expressões de RNAm de TGFB1, VEGFA e FGF2 medulares nem em leucócitos de sangue periférico, ou a concentrações plasmáticas de TGF-&#946;1, VEGFA e FGF2. As imunoexpressões de TGF-b1 ativo, TGF-&#946;1 latente e c-MPL foram semelhantes entre os três grupos de pacientes. As frequências das mutações avaliadas foram similares às descritas na literatura. Os pacientes com MFPTE portadores de mutação CALR apresentaram menores concentrações plasmáticas de VEGFA e FGF2 do que os JAK2V617F positivos, enquanto os pacientes com TE portadores de mutação CALR exibiram menores concentrações plasmáticas de TGF-&#946;1 do que os portadores de JAK2V617F. CONCLUSÕES: O presente trabalho permitiu confirmar a correlação positiva entre o TGF-&#946;1 com outros dois marcadores de angiogênese (VEGFA e FGF2). As expressões de SMADs e de miRNAs estudados foram semelhantes entre pacientes e controles, visto não haver diferenças na expressão gênica de TGF-&#946;1. Entretanto, disparidades encontradas nas correlações entre a expressão gênica de TGF-&#946;1 e diferentes SMADs e miRNAs nos pacientes e controles poderiam indicar que a regulação da expressão gênica de TGF-&#946;1 nas doenças estudadas seja distinta da apresentada nos indivíduos sem essas doenças. / AIM: To investigate the effects of the expression of SMADs mRNA and microRNAs (miRNAs) that target TGFB1 in TGF-&#946;1 gene expression (mRNA and protein) and its role in the angiogenesis pathophysiology in myelofibrosis (MF) and essential thrombocythemia (ET) patients. METHODS: Twenty-one primary MF (PMF), twenty-one MF post-ET (MPET) and twenty-four ET patients were included, besides 98 controls matched for gender and age with patients. In peripheral blood were assessed: TGF-&#946;1, VEGFA and FGF2 plasmatic levels and mRNA quantification; SMADs 1 to 7 mRNA quantification and miRNAs 193a-5p, 369-5p, 542-5p, 590-3p, and 590-5p quantification; and detection of JAK2V617F (and allele burden), MPLW515K/L and CALR mutations. Estimated angiogenesis (microvessel grade - CD34), active TGF-b1, latent TGF-&#946; and c-MPL immunoexpression were determined in 26 bone marrow biopsies. RESULTS: Plasmatic TGF-&#946;1 levels were similar in patients and controls, while all the patients groups had higher plasmatic VEGFA than controls. Plasmatic FGF2 was higher in all the patients groups, and its mRNA expression was higher in ET patients than in controls. No differences in SMADs and miRNAs expression were found between patients and controls. There was a positive correlation between plasmatic TGF-&#946;1 and FGF2 in PMF, and a negative correlation between these variables in their controls, as well as in MPET controls. In all studied groups, there was a positive correlation between plasmatic TGF-&#946;1 and VEGF. In addition, different profiles of correlations were demonstrated between TGF-&#946;1 gene expression and the several SMADs and miRNAs studied in each group of patients and controls. PMF patients with higher angiogenesis (according to the median of VEGFA and FGF2 plasma levels) had higher plasmatic TGF-&#946;1 levels than those with lower angiogenesis. Estimated angiogenesis (CD34) in bone marrow biopsies were not different among PMF, MPET and ET patients. Moreover, there were no correlation between CD34 immunoexpression and TGFB1, VEGFA and FGF2 mRNA bone marrow or peripheral blood expression or plasmatic levels, as well as latent TGF-&#946;1, active TGF-b1, and c-MPL immunoexpression were similar in patients studied groups. The frequencies of evaluated mutations were similar to previously reported. MPET patients harboring CALR mutations had lower plasmatic VEGFA and FGF2 than JAK2V617F mutated, while ET patients carrying CALR mutations had lower plasmatic TGF-&#946;1 than JAK2V617F mutated. CONCLUSIONS: This study confirmed the positive correlation among TGF-&#946;1 and two other markers of angiogenesis (VEGFA and FGF2). SMADs and miRNAs expressions were similar between patients and controls, since there were no differences in TGF-&#946;1 gene expression between patients and controls. However, disparities found in the correlations between TGF-&#946;1 gene expression and different SMADs and miRNAs in patients and controls may indicate that TGF-&#946;1 gene expression regulation in studied diseases is distinct from those presented by individuals without these diseases.

Submitted by Nadir Basilio (nadirsb@uninove.br) on 2018-06-21T18:29:06Z No. of bitstreams: 1 Eduardo Tadeu Santana.pdf: 3781492 bytes, checksum: 5fb6eff774c2c39d42bab565b9e807ef (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-21T18:29:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Eduardo Tadeu Santana.pdf: 3781492 bytes, checksum: 5fb6eff774c2c39d42bab565b9e807ef (MD5) Previous issue date: 2015-12-18 / The ligation of the anterior descending coronary artery is the most commonly used experimental model to induce myocardial infarction (MI) in rodents. A high mortality in the acute phase and the heterogeneity of the size of the MI obtained are drawbacks recognized in this model. In an attempt to solve the problem, our group recently developed a new MI experimental model which is based on application of myocardial ablation radio-frequency currents (AB-RF) that yielded MI with homogeneous sizes and significantly reduce acute mortality. In addition, cardiac structural and functional changes aroused by AB-RF were similar to those seen in animals with MI induced by coronary artery ligation. Herein, we evaluated modifications of gene expression that govern post-MI milieu in occlusion and ablation models. We analyzed 48 mRNA expressions of 9 different signal transduction pathways (signs of cell survival and metabolism, matrix extracellular, cell cycle, oxidative stress, apoptosis, calcium signaling, hypertrophy markers, angiogenesis and inflammation) in rat left ventricle 1 week after MI promoted by either coronary occlusion and AB-RF. Furthermore, high-throughput miRNA analysis was also assessed after either MI procedures. Interestingly, mRNA expression levels and miRNA expressions were similar in both models after MI, with few specificities in each model. This study reports for the first time the global changes in rat cardiac mRNA and miRNA contents after two different MI procedures and identifies key signaling regulators modulating the pathophysiology of these two models that might culminate in heart failure. Furthermore, these analyses would enhance our present knowledge regarding altered pathophysiology of these two different MI models. / A ligadura da artéria coronariana descendente anterior é o modelo experimental mais comumente usado para induzir o infarto do miocárdio (IM) em roedores. Entretanto, uma elevada taxa de mortalidade na fase aguda e a heterogeneidade do tamanho do IM obtidos são desvantagens reconhecidas neste modelo. Em uma tentativa de resolver o problema, o nosso grupo desenvolveu recentemente um novo modelo experimental de insuficiência cardíaca que se baseia na aplicação de correntes de radiofrequência ablação do miocárdio (AB-RF), produzindo IM com tamanhos homogêneos e com significativamente redução da mortalidade aguda. Além disso, alterações estruturais e funcionais do coração deste modelo foram semelhantes aos observados em animais com infarto induzido por ligação da artéria coronária. Aqui, nós avaliamos modificações da expressão de RNA mensageiro (RNAm) de genes após IM induzido por oclusão e ablação. Foram analisadas as expressões de 48 RNAm de 9 diferentes vias de transdução de sinal (sinais de sobrevivência celular e metabolismo, matriz extracelular, ciclo celular, estresse oxidativo, apoptose, sinalização de cálcio, marcadores de hipertrofia, angiogênese e inflamação) no ventrículo esquerdo de ratos uma semana após o IM promovido por oclusão coronária e AB-RF. Além disso, a análise de alto rendimento de miRNA também foi avaliada após ambos procedimentos de IM. Curiosamente, os níveis de expressão de RNAm e expressão de miRNA foram semelhantes em ambos os modelos após o IM, com algumas especificidades em cada modelo. Este estudo relata pela primeira vez as mudanças globais nos conteúdos de RNAm e miRNA após dois procedimentos de IM diferentes e identifica reguladores que podem modular a fisiopatologia desses dois modelos, culminando em insuficiência cardíaca.

INTRODUÇÃO: Cardiotoxicidade é frequentemente associada ao uso crônico de doxorubicina (DOX) podendo levar a cardiomiopatia e insuficiência cardíaca. A identificação de miRNAs cardiotoxicidade-específicos e seu potencial como biomarcadores poderia fornecer uma ferramenta prognostica valiosa e uma potencial área de intervenção. METODOLOGIA: Este é um sub-estudo do ensaio clínico prospectivo \"Efeito do Carvedilol na Prevenção da Cardiotoxicidade Induzida por Quimioterapia\" (ensaio CECCY) no qual incluiu 56 pacientes do sexo feminino (idade 49.9±3.3) provenientes do braço placebo. Os pacientes incluídos foram submetidos à quimioterapia com DOX seguido por taxanos. Troponina cardiaca I (cTnI), fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) e microRNAs foram mensurados periodicamente. RESULTADOS: Os níveis circulantes de miR-1, -133b, -146a e -423-5p aumentaram significativamente durante o tratamento (18.6, 11.5, 10.6 e 12.1-vezes respectivamente; p < 0.001) enquanto miR-208a e -208b foram indetectáveis. cTnI aumentou de 6.6 ± 0.3 para 46.7 ± 5.5 pg/ml (p < 0.001) enquanto FEVE tendeu a diminuir de 65.3±0.5 para 63.8±0.9 (p=0.053) após 12 meses; deis pacientes (17.9%) desenvolveram cardiotoxicidade. miR-1 foi associado a mudanças na FEVE (r2=0.363, p < 0.001) enquanto miR-1 e -133b foram associados a cTnI (r2 = 0.675 e 0.758; p < 0.001). Além disso, miR-1 antecipou a cardiotoxicidade e mostrou uma area sobre a curva maior que cTnI para discriminar pacientes que desenvolveram cardiotoxicidade daqueles que não desenvolveram (AUC = 0.849 e 456, p<0.001 e 0.663, respectivamente). CONCLUSÃO: Nossos dados sugerem miR-1 como um potencial novo biomarcador de cardiotoxicidade induzida por DOX em pacientes com câncer de mama. Estes resultados podem levar a novas estratégias de detecção precoce do risco de lesão cardíaca induzida por DOX bem como a introdução de uma nova área para intervenção / INTRODUCTION: Cardiotoxicity is frequently associated with the chronic use of doxorubicin (DOX) and may lead to cardiomyopathy and heart failure. Identification of cardiotoxicity-specific miRNA biomarkers could provide clinicians with a valuable prognosis tool and a potential area for intervention. METHODS: This is an ancillary study from the prospective trial \"Carvedilol Effect in Preventing Chemotherapy-Induced Cardiotoxicity.\" (CECCY trial) which included 56 female patients (49.9±3.3 age) from placebo arm. Enrolled patients were treated with DOX followed by taxanes. Cardiac troponin I (cTnI), left ventricle ejection fraction (LVEF) and miRNAs were measured periodically. RESULTS: Circulating levels of miR-1, -133b, -146a and -423-5p increased along the treatment (18.6, 11.5, 10.6 and 12.1-fold respectively; p < 0.001); miR-208a and -208b were undetectable. cTnI increased from 6.6±0.3 to 46.7 ± 5.5 pg/ml (p < 0.001) while LVEF tended to decrease from 65.3±0.5 to 63.8±0.9 (p=0.053) over 12 months; ten patients (17.9%) developed cardiotoxicity. miR-1 was associated to changes in LVEF (r2=0.363, p < 0.001) while miR-1 and -133b were associated to cTnI (r2 = 0.675 and 0.758; p < 0.001). Furthermore, miR-1 anticipated cardiotoxicity and showed greater area under the curve than cTnI to discriminate between patients who did and did not developed cardiotoxicity (AUC = 0.849 and 456, p < 0.001 and 0.663, respectively). CONCLUSION: Our data suggest circulating miR-1 as a potential new biomarker of DOX-induced cardiotoxicity in breast cancer patients. These results may lead to new earlier strategies to detect drug-induced cardiac injury risk before it develops to an irreversible stage or introduce new area for intervention

GNAS est un locus soumis à empreinte parentale. Ce locus produit différents transcrits et protéines en utilisant des promoteurs distincts. Le transcrit bialléique Gsα, les transcrits soumis à empreinte maternelle GNAS-AS1, XLαs et A/B et un transcrit soumis à empreinte paternelle NESP55. L’expression de ces transcrits est contrôlée par des régions différentiellement méthylées (DMRs). Le locus GNAS est impliqué dans plusieurs maladies. La PseudoHypoParathyroïdie (PHP) également appelée inactivating PTH/PTHrP Signaling Disorder (iPPSD, pour la description de la nouvelle classification) englobe un groupe de maladies rares, très hétérogène caractérisé par la résistance des organes à l'action de la PTH. Les iPPSD2 sont dues à des mutations perte de fonctions de Gsα, les iPPSD3 à des anomalies de méthylation d’une ou plusieurs DMRs. Les tumeurs intracanalaires papillaires et mucineuses du pancréas (TIPMPs) sont des tumeurs kystiques caractérisées par une prolifération papillaire intracanalaire de l’épithélium des canaux pancréatiques. Les TIPMPs sont des précurseurs de l’adénocarcinome pancréatique comprenant trois degrés de dysplasie selon le phénotype histologique, légère, moyenne et haut grade.L’objectif de mon travail était d’étudier l’implication des transcrits non codants et des GNAS-miRNAs à l’aide de deux modèles pathologiques les iPPSD2 et 3 et les TIPMPs.Projet TIPMP :Nous avons identifié que la perte d’empreinte du locus GNAS est un événement fréquent dans les TIPMPs et semble associée à des marques d’activation de la transcription du locus. De plus, d’autres gènes soumis à l’empreinte parentale, comme MEG3 et DIRAS3, présentent également des modifications de leurs marques épigénétiques.Projet iPPSD2 et 3 :Résultat 1 : Croissance longitudinale, taille finale et IMC des patients iPPSD2 et 3. Les patients iPPSD2 naissent hypotrophiques, ont une petite taille finale et développe un surpoids. Les patients iPPSD3 naissent macrosomiques mais atteignent une taille finale normale et un IMC moyen normal. Mes résultats suggèrent un rôle majeur de Gsα et de Xlαs dans la croissance fœtale, postnatale, pubertaire et l’accumulation de la masse grasse.Résultat 2 : Cibles des GNAS-miRNAs et phénotype des patients iPPSD3. Mes données d’expression des GNAS-miRNAs dans les lymphocytes et les fibroblastes de patients matUPD20/patUPD20 montrent qu’ils sont soumis à l’empreinte parentale. In silico, les cibles de ces miRNAs sont classées en 3 groupes : signalisation de l’AMPc, signalisation du calcium et croissance. La transfection dans les cellules HEK des GNAS-miRNAs m’a permis de confirmer certaines cibles moléculaires comme la cible du miR-296-3p, PRKAG1 et la cible des miRs 296-5p et 296-3p, GNB2 tous les deux impliqués dans la voie de l’AMPc.Résultat 3 : étude d’une nouvelle DMR : GNAS-AS2. Cette DMR récemment identifiée présente une perte de méthylation chez la plupart des patients iPPSD3 comparés aux contrôles. Nous avons identifié pour la première fois, un sous-groupe de patients iPPSD3 qui présente une perte de méthylation de la DMR GNAS-AS1:TSS-DMR, mais pas de GNAS-AS2. Ces patients ont un profil de iPPSD3 autosomique dominant, sans délétion du centre d’empreinte STX16. Mes résultats montrent : 1-absence de délétion ou remaniement génomique en whole genome sequencing dans une famille atteinte, 2-la DMR GNAS-AS2 possède deux sous domaines distincts et 3-la transmission de cette anomalie est maternelle.Les transcrits de GNAS jouent un rôle important dans des phénomènes fondamentaux comme la croissance ante et post natale, la tumorigenèse, la signalisation endocrine AMPc dépendante et l’acquisition de la masse grasse. Afin de mieux comprendre les pathologies de l’empreinte il est important d’identifier des biomarqueurs comme les miRNAs et de les corréler aux phénotypes des patients iPPSD. / GNAS is a locus subjected to parental imprinting. This locus produces different transcripts and proteins using distinct promoters: the Gsα biallelic transcript, the maternally imprinted transcripts GNAS-AS1, XLαs and A/B and a paternal imprinted transcript NESP55. The expression of these transcripts is controlled by differentially methylated regions (DMRs). The GNAS locus is involved in several diseases. PseudoHypoParathyroidism (PHP) also called inactivating PTH/PTHrP Signaling Disorder (iPPSD, for the description of the new classification) encompasses a group of heterogeneous rare diseases, characterized by the resistance of organs to the action of PTH. IPPSD2 are due to Gsα loss of function mutations, iPPSD3 to methylation abnormalities at one or several GNAS DMRs. Intraductal Papillary Mucinous Neoplasm (IPMN) are cystic tumors characterized by Intraductal papillary proliferation of the pancreatic duct epithelium. IPMNs are precursors of pancreatic adenocarcinoma comprising three degrees of dysplasia according to the histological phenotype, low, medium and high grade.The aim of my work was to study the implication of non-coding transcripts and GNAS-miRNAs using two pathological models, iPPSD2 and 3 and IPMN.IPMN project:We have identified that loss of imprinting at the GNAS locus is a common trait in IPMN and appears to be associated with transcriptional activation events of the GNAS transcripts. In addition, other genes subjected to parental imprinting, such as MEG3 and DIRAS3, also show changes in their epigenetic marks.Project iPPSD2 and 3:Result 1: Longitudinal growth, final height and BMI of iPPSD2 and 3 patients. iPPSD2 patients are born hypotrophic, display a final short stature and are overweight. IPPSD3 patients are born macrosomic but reach a normal final height and normal mean BMI. My results suggest a major role of Gsα and Xlαs in fetal, postnatal, pubertal growth and fat mass accumulation.Result 2: Targets of GNAS-miRNAs and phenotype of iPPSD3 patients. Expression of GNAS-miRNAs in lymphocytes and fibroblasts of matUPD20/patUPD20 patients suggested that GNAS-miRNAs are subjected to parental imprinting. In silico, the targets of these miRNAs are classified in 3 groups: cAMP signaling, calcium signaling and growth. Transfection of the GNAS-miRNAs into HEK cells confirmed certain molecular targets such as the miR-296-3p target, PRKAG1 and the miRs 296-5p and 296 -3p target, GNB2, both transcripts being involved in cAMP pathway.Result 3: characterization of a new DMR: GNAS-AS2. GNAS-AS2 is a recent characterized DMR with loss of methylation in most iPPSD3 patients compared to controls. We have identified for the first time a subset of iPPSD3 patients with loss of methylation at the GNAS-AS1:TSS-DMR but not at the GNAS-AS2 DMR. These patients have an autosomal dominant form of iPPSD3, without deletion of the STX16 imprinting control element. My results show: 1- lack of deletion or genomic rearrangement through whole genome sequencing in an affected family, 2- GNAS-AS2 DMR has two distinct subdomains and 3- this anomaly is maternally inherited.GNAS transcripts play an important role in fundamental biological processes such as ante and postnatal growth, tumorigenesis, endocrine cAMP dependent signaling pathways and fat mass acquisition. It is important to identify new biomarkers such as miRNAs and correlate them with phenotypical factors of iPPSD patients.

Les microARN (miARN) sont de petits ARN non-codants dont la principale fonction est de réprimer l’expression génique en s’hybridant par complémentarité de séquence à leurs cibles ARN. L’activité des miARN est également régulée par leurs cibles qui entrent en compétition pour leur liaison. Certains de ces ARN compétiteurs endogènes (ARNce) résistent à la répression induite par le miARN et vont alors les séquestrer. Ils sont appelés éponges à miARN. La dérégulation des réseaux d’ARNce et des éponges à miARN est impliquée dans des processus pathologiques tels que le cancer. Au cours de ma thèse, nous nous sommes intéressés à la séquestration des miARN dans le mélanome cutané. Le mélanome provient de la transformation maligne du mélanocyte, une cellule spécialisée dans la production de pigment. S’il n’est pas pris en charge à temps, des métastases apparaissent et se disséminent rapidement dans l’organisme (ganglions, foie, poumons, cerveau, etc.). Des solutions thérapeutiques existent mais une faible proportion de patients y répondent de manière efficace nécessitant de nouvelles stratégies de traitement. Nous avons mis en évidence que l’ARN messager (ARNm) de TYRP1, gène spécifiquement exprimé dans le mélanocyte et donc le mélanome, porte le rôle d’éponge à miARN dans le mélanome métastatique. Ce rôle est indépendant de la fonction protéique de TYRP1. Nous avons déterminé que l’ARNm de TYRP1 séquestre le suppresseur de tumeurs miR-16 via des sites de liaison (MRE-16) non-canoniques. Les MRE-16 non-canoniques permettent à l’ARNm de TYRP1 de ne pas être dégradé par le miR-16 et le rendent donc plus stable dans la cellule de mélanome. La majorité du pool de miR-16 est ainsi séquestrée et ne peut donc plus réprimer ses cibles intervenant dans la prolifération cellulaire et la croissance tumorale in vivo. Afin de remettre en activité le miR-16 au sein de la cellule de mélanome, nous avons utilisé la technologie du « target site blocker » (TSB), un oligonucléotide antisens modifié ayant une forte stabilité et affinité pour sa cible. Le TSB, spécifique du MRE-16 de l’ARNm de TYRP1, entre en compétition pour la liaison à l’ARNm de TYRP1 avec le miR-16 pour permettre sa libération et son action sur ses cibles effectrices. Nous avons montré in vitro et in vivo via un modèle murin de xénogreffe de tumeur dérivée de patient que la stratégie du TSB est efficace contre le mélanome métastatique. Ces travaux ont permis l’identification d’un nouveau mécanisme oncogénique basé sur la séquestration de miARN et proposent une nouvelle stratégie de thérapie ciblée contre le mélanome métastatique. / MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs. They fine tune gene-expression through specific complementary interaction with their RNA targets. The miRNA repressive function towards a given RNA is highly regulated and in part dependent on the abundance of its other targets competing for miRNA’s binding. Some of these competing endogenous RNAs (ceRNAs) can resist to miRNA-mediated RNA decay thereby sequestering miRNAs. They are named miRNA sponges. Deregulation of ceRNAs and miRNA sponges networks are implicated in many pathologic processes including cancer. My PhD work focused on miRNA sequestration in cutaneous melanoma. Melanomas arise from the malignant transformation of melanocytes; the skin-cell specialized in pigment production. Most melanoma undergoes metastatic evolution, with metastatic cells spreading rapidly in the entire organism (lymph node, liver, lungs, brain, etc.). Early and complete resection of primary in situ melanoma is thus determinant for patient outcome. Since 2010, potent therapeutic options have been developed. Unfortunately, patients ultimately develop resistance while some are non-responders. There is thus an urgent need to develop new therapeutic strategies to treat metastatic melanoma. We have identified that the Tyrosinase Related Protein 1 (TYRP1) mRNA function as a miRNA sponge. TYRP1 is specifically expressed in the melanocytic lineage. TYRP1 mRNA governs melanoma growth endorsing thereby a non-coding function. We demonstrated that TYRP1 mRNA sequesters the tumor suppressor miR-16 via non-canonical miRNA binding sites (MREs-16). Non-canonical miR-16 binding lacks mRNA decay function favoring TYRP1 mRNA stability and miRNA sequestration. Sequestered miR-16 can no more repress its canonical targets involved in cell proliferation and tumor growth. To reset miR-16’s activity and block melanoma growth, we used “Target Site Blocker” (TSB). TSBs are modified antisense oligonucleotides with enhanced stability and affinity to its target. We designed a TSB, named TSB-T3, overlapping specially TYRP1 non-canonical MRE-16. We first showed that TSB-T3 binds to TYRP1 mRNA and competes with miR-16. Freed miR-16 binds to its canonical targets inducing their decay. TSB-T3 blocks melanoma cell growth in vitro and in vivo, using patient-derived tumor xenograft. We thus showed for the first time that TSB’s strategy redirecting a tumor suppressor miRNA is a potent tool to monitor metastatic melanoma growth. Together my PhD work brings out a new oncogenic mechanism based on miRNA sequestration and proposes an original strategy of targeted therapy against metastatic melanoma.