Os receptores do tipo Toll compreendem a família de receptores de reconhecimento de padrões melhor caracterizados, que podem ativar diferentes respostas imunes, dependendo de quais receptores e conjuntos de adaptadores são utilizados. Os TLRs, como TLR2, TLR4 e TLR9, e sua sinalização foram implicados no reconhecimento de P. brasiliensis e na regulação da resposta imune, no entanto, o papel do TLR3 ainda não está claro. Assim, a compreensão da função endossomal do TLR3 na PCM experimental é crucial. Utilizamos modelos in vitro e in vivo de infecção por P. brasiliensis, camundongos C57Bl/6 e TLR3-/-, para avaliar a contribuição da TLR3 no desenvolvimento da infecção. Mostramos que ausência de TLR3 leva o aumento de óxido nítrico e a capacidade fagocítica por macrófagos nas primeiras 4 horas de interação com leveduras P. brasiliensis. Mostramos ainda que os camundongos TLR3-/- desempenham papel protetor após 30 dias de infecção intratraqueal com P. brasiliensis, mostrando diminuição do aumento de CFU, perfil de resposta Th1 e Th17, bem como aumento de células citotóxicas T CD8+ produtoras de IFN-γ e IL-17. As células citotóxicas T CD8+ mostraram ser essenciais para o controle da infecção nos camundongos TLR3-/-, uma vez que a depleção dessas células levou a progressão da doença. Em estágios iniciais, 3 e 5 dias de infecção, observamos aumento do recrutamento de neutrófilos para o pulmão. Estudos recentes indicam que o TLR3 é um receptor importante para a resposta imune na micose e sua ausência favorece a infecção por fungos. Em contraste, nossos resultados mostram que, no caso do PCM, o TLR3 é prejudicial ao hospedeiro, sugerindo que a ativação do TLR3 pode ser um possível mecanismo de escape de P. brasiliensis. / Toll-like receptors comprise the best-characterized pattern-recognition receptor family that can activate different immune responses, depending on which receptor and adaptor set are utilized. TLRs, such as TLR2, TLR4 and TLR9, and their signaling have been implicated in the recognition of P. brasiliensis and regulation of the immune response, however, the role of TLR3 remains unclear. Thus, understanding the endosomal function of TLR3 in experimental PCM is crucial. We used in vitro and in vivo models of infection by P. brasiliensis, C57Bl/6 and TLR3-/- mice, to assess the contribution of TLR3 on development of infection. We show that absence of TLR3 leads to increased nitric oxide and phagocytic capacity by macrophages in the first 4 hours of interaction with yeasts P. brasiliensis. We also showed that TLR3-/- mice play a protective role after 30 days of intratracheal infection with P. brasiliensis, showing a decrease in the CFU increase, Th1 and Th17 response profile, as well as an increase in cytotoxic CD8+ cells producing IFN-γ and IL-17. The cytotoxic T CD8+ cells were shown to be essential for the control of infection in TLR3-/- mice, since the depletion of these cells led to the progression of the disease. In the initial stages, 3 and 5 days of infection, we observed increased recruitment of neutrophils to the lung. Recent studies indicate that TLR3 is an important receptor for the immune response in mycosis and its absence favors fungal infection. In contrast, our results show that in the case of PCM, TLR3 is detrimental to the host, suggesting that TLR3 activation may be a possible escape mechanism of P. brasiliensis.

Paracoccidioidomicose é adquirida pela via respiratória e o óxido nitrico (NO) está envolvido na eliminação de patógenos. Nós propusemos investigar o papel do NO na doença em animais NO-/- sintase deficientes (iNOS-/-) e seu grupo WT. Na 2ª semana de infecção, a ausência de NO resultou em doença menos grave com aumento dos níveis de TNF-a acompanhado com o intenso afluxo de linfócitos T e macrófagos para os pulmões. Na 10ª semana, os animais iNOS-/- desenvolveram alta carga fúngica nos pulmões com menor afluxo de celulas T ativadas e macrófagos e presença de células T reguladoras CD4+CD25+FoxP3+ nos pulmões. Somente os animais iNOS-/- desenvolveram lesões pulmonares organizadas em granulomas, embora não foi detectado diferença na mortalidade para ambos os grupos. As diferenças morfológicas nas lesões foram abolidas pela depleção de TNF-a que induziu nos animais iNOS-/- uma mortalidade precoce e intenso afluxo inflamatório nos pulmões. Além disso, a depleção de linfócitos TCD8+ resultou em doença mais grave e menor recrutamento celular pulmonar nos animais iNOS-/-. / Paracoccidioidomycosis is acquired by the respiratory route and nitric oxide (NO) is involved in the killing of pathogens, we aimed to investigate the role of NO in the course of the disease using NO- synthase deficient (iNOS-/-) and WT mice. At week 2 postinfection, NO absence resulted in less severe infection associated with increased TNF-a levels besides a massive influx of activated T cells and macrophages to the lungs. By week 10, iNOS-/- mice developed increased fungal burdens allied with less pronounced influx of activated T cells and macrophages and increased presence of regulatory CD4+CD25+FoxP3+ T cells to the lungs. Only iNOS-/- mice developed organized pulmonary granulomas, although no differences in the mortality rates were detected. The differences in the morphology of lesions were partially abrogated by TNF-a depletion which, induced a precocious mortality of iNOS-/- and massive influx of inflammatory pulmonary cells. Indeed, the CD8+T cells depletion developed a more severe infection with less recruitment of pulmonary cells in iNOS-/- mice.

Estudos em nosso laboratório caracterizaram camundongos B10.A e A/J, respectivamente, como susceptíveis e resistentes à infecção pulmonar pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis. A imunidade inata desempenha papel fundamental no controle inicial dos patógenos e na regulação da resposta imune adquirida. Como os macrófagos alveolares são as primeiras células do hospedeiro a interagir com o fungo, propusemo-nos a estudar a capacidade fungicida e secretora dos macrófagos alveolares de camundongos susceptíveis e resistentes ao P. brasiliensis para melhor compreender a PCM pulmonar. Camundongos B10.A e A/J normais (n: 10-15) foram submetidos a lavagem bronco-alveolar (LBA) e a suspensão celular obtida (2x105 células/poço) foi pré-ativada durante a noite com IFN-γ, IL-12 ou a combinação destas duas citocinas (50.000, 10.000 e 2.000 pg/rnL) e desafiados in vitro com leveduras viáveis de P. brasiliensis (relação fungo-macrófagos de 1:50). Após 72h de incubação a atividade fungicida dos macrófagos foi avaliada através da contagem do número de fungos viáveis pelo método de unidades formadoras de colônias (UFC). A produção de nitrito e de citocinas foi avaliada no sobrenadante de cultivo através da reação de Griess e ELISA, respectivamente. Os dados foram expressos como média ± EP e analisados pelo teste T -Student. Nossos resultados mostraram que os macrófagos de camundongos B 10.A pré-ativados com IFN-γ, IL-12 ou ambas as citocinas nas diferentes concentrações ensaiadas apresentaram elevada capacidade fungicida (51-97%) acompanhada de produção aumentada de NO, IL-12 e MCP-l e baixa síntese de IL-10 e GM-CSF. Por outro lado, somente o tratamento com a mais alta concentração de IFN-γ foi capaz de induzir atividade fungicida em macrófagos alveolares de animais A/J. A síntese de NO ocorreu sempre em baixos níveis e nos sobrenadantes dos co-cultivos observamos altos níveis de IL-10 e GM-CSF associados a baixas concentrações de IL-12 e MCP-l. A inibição da síntese de NO por aminoguanidina demonstrou que a atividade fungicida dos macrófagos de animais B10.A, mas não de A/J, era mediada por este composto tratamento dos macrófagos com anticorpo monoclonal anti-IL-10 não alterou a capacidade fungicida dos macrófagos de ambas as linhagens, entretanto induziu franca produção de NO que, para animais A/J, não se traduziu em atividade microbicida aparente. Por outro lado. a neutralização de TGF-β induziu alta capacidade fungicida das células de animais A/J níveis aumentados de NO e TNF-α aliados a níveis reduzidos de IL-10. O mesmo tratamento não alterou a já elevada capacidade fungicida dos macrófagos alveolares de animais B10.A mas aumentou a produção de NO, IL-12 e TNF-α. Em conclusão, os macrófagos alveolares de camundongos B10.A são facilmente ativáveis por 1FN-γ e IL-12, apresentam elevada capacidade fungicida, NO-dependente, sobre leveduras do P. brasiliensis associada com a síntese de níveis elevados de NO e IL-12. Por outro lado, os macrófagos de camundongos A/J são pobremente ativados por 1FN-γ e IL-12, produzem baixos níveis de NO, a sua capacidade fungicida, que parece ser NO-independente, pode ser aumentada pela neutralização do TGF-β endógeno, mas não pelo tratamento com anti-IL-10. / Previous studies in our laboratory characterized B10.A and A/J mice as susceptible and resistant strains to pulmonary Paracoccidioides brasiliensis infection. Innate immunity plays a fundamental role on the control of the initial growth of pathogens as well as in the acquired immunity that subsequently develops. As alveolar macrophages are the first host cells to interact with P. brasiliensis we decided to study the fungicidal and secretory ability of alveolar macrophages from resistant and susceptible mice to P. brasiliensis to better understand the pulmonary model of paracoccidioidomycosis. Normal B10.A and A/J mice (n=10-15) were submitted to bronchoalveolar lavage (BAL) and cell suspensions (2x105 cells/well) were pre-activated ovemight with IFN-γ, IL-12 or the combination of these two cytokines (50,000, 10,000 and 2,000 pg/rnL). After that, macrophages were in vitro challenged with P. brasiliensis yeasts (1:50 fungus: macrophage ratio) and 72h later fungicidal activity was determined by colony forming units counts (CFU). Nitrite and cytokines production were determined in culture supematants by Griess reaction and ELISA, respectively. Data were expressed as means ± SE and analyzed by Student\'s t test. Our results showed that B10.A macrophages pre-activated with the different assayed concentrations of IFNγ, IL-12 or both cytokines presented elevated fungicidal ability (51¬-97%) concomitant with the presence of high levels of NO, IL-12 and MCP-l and low amounts of IL-10 and GM-CSF. NO synthesis occurred in low levels but high concentrations of IL-10 and GM-CSF associated to low amounts of IL-12 and MCP-1 were detected in the co-cultures supematants. NO synthesis inhibition by aminoguanidine clearly showed that the fungicidal ability of B10.A but not of A/J macrophages was NO¬ dependent. Treatment with anti-IL-10 monoclonal antibodies did not alter the fungicidal ability of macrophages from both mouse strains but enhanced NO synthesis which, however, did not alter the absent microbicidal ability of A/J macrophages. On the contrary, anti-TGF-β treatment induced an increased fungicidal ability of A/J cells associated with enhanced levels of NO and TNF-α besides diminished amounts of IL-10. The same treatment did not alter the high fungicidal ability of B10.A alveolar macrophages but increased NO, IL-12 and TNF-α production. In conclusion, alveolar macrophages from susceptible mice are easily activated by IFNγ and IL-12, present a high and NO-dependent ability to kill P. brasiliensis yeasts and secrete elevated levels of NO and IL-12. In contrast, alveolar macrophages from resistant mice are poorly activated by IFNγ and IL¬12, secrete low amounts of NO and high of IL-10. Their fungicidal ability which appears to be NO-independent can be restored by neutralization of endogenous TGF-β but not by anti-IL-10 treatment.

Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-07-17T11:08:48Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rosiane Rodrigues Fernandes - 2017.pdf: 2270674 bytes, checksum: ba23e121d632cd3d2cfe167438b7a57c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2017-07-17T11:09:40Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rosiane Rodrigues Fernandes - 2017.pdf: 2270674 bytes, checksum: ba23e121d632cd3d2cfe167438b7a57c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-17T11:09:40Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Rosiane Rodrigues Fernandes - 2017.pdf: 2270674 bytes, checksum: ba23e121d632cd3d2cfe167438b7a57c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2017-03-28 / Paracoccidioides brasiliensis is a thermodymorphic fungus, the etiological agent of Paracoccidioidomycosis, a systemic mycosis of high incidence in Latin America. During the infectious process, this fungus is subjected to oxidative stress, produced by host defense cells. Therefore, we sought to analyze the proteomic responses of the fungus when exposed to oxidative stress. Menadione is a compound that decreases the viability of yeasts of Paracoccidioides brasiliensis. The main results were the induction of antioxidant enzymes, such as superoxide dismutase, cytochrome c peroxidase, thioredoxin and peroxisomal catalase, enzymes that help the fungus to fight reactive oxygen species. In addition, proteins involved in metabolic pathways such as glycolysis, tricarboxylic acid cycle and glyoxylate cycle had increased expression, demonstrating a possible remodeling of fungus metabolism. There was the induction of enzymes of the pentose phosphate pathway, which has a prominent role in cells under oxidative stress, since it is an important mechanism producing NADPH (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate), an electron donor relevant to counteract the deleterious effects of reactive species of oxygen Heat shock proteins were also upregulated during the oxidative stress to which the fungus was exposed. In this work we investigated the response of a member of the species Paracoccidioides brasiliensis, Pb339 to oxidative stress, including the adaptive mechanisms of this fungus to this condition caused in vitro or by the defense system promoted by the host. / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico, agente etiológico da Paracoccidioidomicose, uma micose sistêmica de alta incidência na América Latina. Durante o processo infeccioso, este fungo é submetido ao estresse oxidativo, produzido pelas células de defesa do hospedeiro. Portanto, buscou-se analisar as respostas proteômicas do fungo ao ser exposto ao estresse oxidativo. Notou-se que a menadiona é um composto que diminui a viabilidade celular de leveduras de Paracoccidioides brasiliensis. Como principais resultados, obteve-se a indução de enzimas antioxidantes, como superóxido dismutase, citocromo c peroxidase, tiorredoxina e catalase peroxissomal, enzimas estas que auxiliam o fungo a combater espécies reativas de oxigênio. Além disso, proteínas envolvidas em vias metabólicas, como glicólise, ciclo do ácido tricarboxílico e ciclo do glioxilato tiveram aumento de expressão, demonstrando um possível remodelamento do metabolismo do fungo. Houve a indução de enzimas da via pentose fosfato, a qual possui uma função destaque em células sob estresse oxidativo, por constituir um importante mecanismo produtor de NADPH (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato), um doador de elétrons relevante para contrapor os efeitos deletérios das espécies reativas de oxigênio. Proteínas de choque térmico também foram reguladas positivamente durante o estresse oxidativo ao qual o fungo foi exposto. O foco do trabalho foi investigar a resposta de um membro de um membro da espécie Paracoccidioides brasiliensis, Pb339 ao estresse oxidativo, compreendendo os mecanismos adaptativos deste fungo a esta condição ocasionada in vitro ou pelo sistema de defesa promovido pelo hospedeiro.

A paracoccidioidomicose (PCM), doença sistêmica de caráter granulomatoso, é causada pelo fungo termodimórfico Paracoccidioides brasiliensis (Pb). A gp43 secretada pelo Pb, possui um trecho específico de 15 aminoácidos designado como (P10), é reconhecido por linfócitos T. No presente trabalho, avaliamos a ativação da resposta imune e o efeito aditivo da imunização com o peptídeo P10, em camundongos induzidos à imunossupressão com dexametasona. Os resultados indicam um efeito aditivo da imunização com P10 e o tratamento com as drogas em camundongos BALB/c imunossuprimidos e infectados; associado a redução da carga fúngica no pulmão, baço e fígado desses animais, detectamos aumento de citocinas proinflamatorias, no homogenato de pulmão e no sobrenadante de cultura celular. Animais imunossuprimidos e imunizados com P10 apresentaram um aumento significativo na produção de Óxido Nítrico (NO). A eficiencia na resposta levou a um aumento na sobrevida de 100%. Estes resultados sugerem que o P10, representa uma alternativa promisoria na geração de uma vacina anti-PCM. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by Paracoccidioides brasiliensis (Pb). The gp43 secreted by Pb has a 15-mer peptide designated as P10 that is recognized by T lymphocytes. In the present work we evaluated the activation of immune response and the additive effect of P10 immunization in BALB/c mice induzed to immunossupression with Dexamethasone. Results indicate an additive effect of P10 immunization and the treatment with drugs in BALB/c mice immunosuppressed and infected; associated with a significant reduction in fungal burden in the lung, spleen and liver of these animals. Also, we detected an increase of proinflammatory cytokines such as IFN-<font face=\"symbol\">g, TNF-<font face=\"symbol\">a e IL-12, in lung homogenates and cell culture supernatant. Immunosuppressed animals that were immunized with P10 showed an increase in the Nitric Oxide production. The efficiency of response led to a 100% survival in animals immunized with P10 and treated with antifungal drugs. Our results suggest that P10 represents a promising alternative of anti-PCM vaccine generation.

Paracoccidioidomicose (PCM) é uma doença sistêmica granulomatosa causada pelo fungo termo-dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. A gp43 é o principal antígeno diagnóstico que contém o peptídeo de 15 aminoácidos designado como P10, que desenvolve a resposta imune do tipo Th1 dependente de IFN-<font face=\"Symbol\">g. No presente trabalho, comparamos a efetividade de diferentes adjuvantes em camundongos BALB/c infectados intratraquealmente com o isolado virulento Pb18. Alúmen, Adjuvante Completo e Incompleto de Freund, FliC flagelina e o lipídeo catiônico, foram testados em associação ou não com P10. Após 52 dias de infecção, o lipídeo catiônico mostrou os melhores resultados, com o menor número de UFCs, redução de fibrose e baixo número de células fúngicas no tecido pulmonar, além do incremento significativo de IFN-<font face=\"Symbol\">g e TNF-<font face=\"Symbol\">a e a redução dos níveis de IL-4 e IL-10. Estes resultados sugerem que a interação do peptídeo P10 com o lipídeo catiônico pode gerar uma melhor resposta imune mediada por células do tipo Th1, evitando a rápida disseminação da PCM experimental. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic granulomatous disease caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis. The gp43 is the major diagnostic antigen that contains the peptide P10. This peptide has 15 amino acids and develops a Th1- dependent IFN-<font face=\"Symbol\">g immune response. In this work, we compare the effectiveness of different adjuvants in BALB/c mice infected intratracheally with virulent isolate Pb18. Alum, Complete Adjuvant and Incomplete Freund\'s adjuvant, fliC flagellin from Salmonella enterica and cationic lipid were tested in combination or not with P10. After 52 days of infection, the cationic lipid showed the best results with the least number of colony forming units, reduction of fibrosis, low number of fungal cells in lung tissue and the significant increase of IFN-<font face=\"Symbol\">g and TNF-<font face=\"Symbol\">a with reduced levels of IL-4 and IL-10. These results suggest that, the interaction of peptide P10 with cationic lipids can lead to a better immune response mediated by Th1 type cells by avoiding the rapid spread of experimental PCM.

Made available in DSpace on 2017-07-10T14:17:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 aniele_ tomadon.pdf: 1946569 bytes, checksum: 9b3b2e8ea732badbc11f5df6fa34a988 (MD5) Previous issue date: 2016-02-01 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Paracoccidioidomycosis (PCM), caused by the dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, is one of the most prevalent systemic mycosis in Latin America. Infection can occur accidentally through direct inoculation or mainly through inhalation of propagules of P. brasiliensis, which are installed initially in the lungs and can spread to organs and tissues of the host. In the acute form of the disease the major clinical manifestation is the febrile lymphoproliferative syndrome, occurring osteoarticular involvement; the same for the chronic form, in which 60% of cases, bone and joint changes usually treated for extended periods with conventional antifungal agents. Drug therapy is the most widely used to treatment the disease, however, high costs, poor adherence to treatment and adverse side effects, take the need to search for alternative therapies such as photodynamic (PDT), which has low cost and toxicity, local action and does not induce resistance to microorganisms. In vitro studies have shown positive results of PDT against various fungi, but there are no in vivo reports on its action in the control of P. brasiliensis. In this sense, the present study aimed to evaluate the PDT response in an experimental model of arthritis by P. brasiliensis. For this purpose, male Wistar rats (n = 42) were divided into groups submitted to inoculation with P. brasiliensis and PBS (control) in the right knee joint. After the development of arthritis, the mice were treated from the eighth to the eleventh day to the therapy: Groups L40 and L120 laser treated at dosages of 40 and 120 J/cm2, AM group treated with the photosensitizer methylene blue and PDT40 and PDT120 groups treated with PDT at doses of 40 and 120 J/cm2. The laser and AM therapies were used individually as a control for PDT. The groups were evaluated: edema, by measuring the lateral-lateral diameter of the joint; the intensity of arthritis, for histopathology and titration of anti-gp43 antibody by ELISA. The results showed that the edema formation was lower in the groups treated with PDT 40 and 120 J/cm2 (p = 0.8359 and p = 0.7167, respectively). The analysis of the intensity of arthritis as assessed by histopathology showed that the group treated with PDT 120 J/cm2 had the lowest morphological changes in the joint. Titration of anti-gp43 antibodies, showed the highest production of specific antibodies in the yeast group, but the differences were not significant when comparing the groups. Thus, the morphological evidence of normal tissue recovery aspects, the joint subjected to PDT 120 J/cm2, revealed the potential use of this therapy in reducing arthritis caused by P. brasiliensis / A Paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo fungo dimórfico Paracoccidioides brasiliensis, é uma das micoses sistêmicas de maior prevalência na América Latina. A infecção pode ocorrer acidentalmente por inoculação direta ou, principalmente, através da inalação de propágulos de P. brasiliensis, que se instalam inicialmente nos pulmões e podem se disseminar para órgãos e tecidos do hospedeiro. Na forma aguda da doença a principal manifestação clínica é a síndrome linfoproliferativa febril, podendo ocorrer acometimento osteoarticular; o mesmo para a forma crônica, onde em 60% dos casos há alterações ósseas e articulares, geralmente tratadas por longos períodos com antifúngicos convencionais. A terapia medicamentosa é a mais utilizada para o controle da doença, entretanto, custos elevados, baixa adesão ao tratamento e efeitos colaterais adversos, levam a necessidade de se pesquisar terapias alternativas, como a fotodinâmica (TFD), que apresenta baixo custo e toxicidade, ação local e não induz resistência aos microorganismos. Estudos in vitro têm demonstrado resultados positivos da TFD contra diversos fungos, mas não existem relatos in vivo sobre sua ação no controle de P. brasiliensis. Nesse sentido, o presente estudo objetivou avaliar a resposta da TFD em modelo experimental de artrite por P. brasiliensis. Para tanto, ratos Wistar machos (n=42), foram distribuídos em grupos submetidos à inoculação de P. brasiliensis e PBS (controle) na articulação do joelho direito. Após o desenvolvimento da artrite, os grupos foram tratados, do oitavo ao décimo primeiro dia com as terapias: grupos L40 e L120 tratados com laser nas dosagens de 40 e 120 J/cm2, grupo AM tradado com o fotossensibilizador azul de metileno e grupos TFD40 e TFD120 tratados com TFD nas dosagens de 40 e 120 J/cm2. Os tratamentos com laser e AM foram utilizados de forma individual como controle para a TFD. Nos grupos foram avaliados: o edema, através da medida do diâmetro látero-lateral da articulação; a intensidade da artrite, por exame histopatológico e a titulação do anticorpo anti-gp43, por ELISA. Os resultados mostraram que, a formação do edema foi menor nos grupos tratados com TFD 40 e 120 J/cm2 (p=0,8359 e p=0,7167, respectivamente). A análise da intensidade da artrite, revelou que o grupo tratado com TFD 120 J/cm2 apresentou as menores alterações morfológicas na articulação. A titulação de anticorpos anti-Gp43, demonstrou a maior produção de anticorpos específicos no grupo levedura, porém as diferenças não foram significativas na comparação entre os demais grupos. Assim, as evidências morfológicas de recuperação de aspectos teciduais normais, na articulação submetida a TFD 120 J/cm2, revelaram o potencial uso desta terapia na redução da artrite causada por P. brasiliensis.

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termo-dimórfico que se apresenta na forma de hifa a 25?C e forma de levedura a 37?C. Após inalação de conídios e propágulos de hifas presentes no ambiente, o fungo encontra no hospedeiro as condições ideais para transição em levedura, capaz de causar a doença paracoccidioidomicose (PCM), primariamente pulmonar, podendo ser seguida de disseminação sistêmica. O processo infeccioso é caracterizado pelo reconhecimento de constituintes de leveduras por receptores de células do sistema imune, especialmente fagócitos, que são ativados e produzem citocinas. Neutrófilos são as primeiras células recrutadas para o local da infecção, onde combatem o patógeno, fagocitando-o e liberando mediadores e efetores, como citocinas, ROS (Espécies Reativas de Oxigênio) e NETs (Armadilhas extracelulares de neutrófilos). Esses eventos, além de fatores ambientais e genéticos, têm influência sobre a resistência do hospedeiro ao fungo e, consequentemente, sobre a progressão da doença. Um aspecto da epidemiologia da doença impressiona: a incidência de PCM é mais alta em homens do que em mulheres, especialmente na idade reprodutiva. Especula-se que a melhor resposta das mulheres ao fungo possa relacionar-se à maior concentração de estrógeno, uma vez que esse hormônio, in vitro, inibe a transição de hifa em micélio. Adicionalmente, nosso grupo verificou, em modelo murino de PCM, que machos e fêmeas divergem quanto à resposta imunitária frente ao fungo, favorecendo a resistência de fêmeas. Todavia, neutrófilos, a despeito de sua aparente relevância em infecções fúngicas, nunca foram estudados quanto ao eventual papel na determinação de diferenças de gênero constatadas na PCM. Este trabalho teve como objetivo comparar neutrófilos de homens e mulheres quanto às funções reguladoras e efetoras, quando essas células são infectadas in vitro com leveduras de P. brasiliensis (multiplicidade de infecção (MOI) 5:1). Participaram do estudo 38 homens e mulheres saudáveis, com idade entre 23 e 35 anos. Como critério de inclusão no estudo, as mulheresIX deveriam estar entre o primeiro e o 15º dia do ciclo menstrual ou utilizarem anticoncepcional à base de estrógeno na data da coleta. Os neutrófilos, purificados a partir do sangue periférico e incubados com leveduras de P. brasiliensis e, estudados quanto às habilidades de fagocitose e eliminação de leveduras, produção de citocinas e ROS desenvolvidas por células oriundas de homens e mulheres. Os resultados indicam que os neutrófilos de mulheres mataram o fungo com maior eficiência e produziram maiores concentrações de TNF. Entretanto, dentre as funções neutrofílicas testadas, algumas não foram afetadas pelo gênero do doador, como a habilidade de fagocitose e a produção de ROS. Alguns ensaios foram precedidos da adição ao meio de ?-estradiol sintético. Na presença do hormônio sintético, verificamos que (i) neutrófilos de homens limitaram o crescimento fúngico de maneira mais eficiente; (ii) neutrófilos de homens e mulheres diminuíram a produção de TGF-?. Concluímos que há diferenças entre funções de neutrófilos oriundos de homens e de mulheres frente à infecção por P. brasiliensis. Parte dos déficits funcionais detectados em neutrófilos de homens frente à infecção fúngica foi revertida pela adição de estrógeno ao meio em que se procederam os ensaios. As observações feitas neste trabalho permitem postular que os neutrófilos, sob efeito do estrógeno, contribuem para que as mulheres sejam mais resistentes à PCM. / Paracoccidioides brasiliensis is a thermo-dimorphic fungus that appears as hyphae at 25 ° C and yeast at 37 ° C. After inhalation of conidia and propagules of hyphae resident in the environment, the fungus finds in the host the ideal conditions for transition in yeast, capable of causing the disease Paracoccidioidomycosis (PCM), primarily pulmonary, and may be followed by systemic dissemination. The infectious process implies in recognition of fungal constituents by immune cell receptors, especially phagocytes, which are activated. Neutrophils, the first recruited cells to the infection focus, fight the pathogen and initiate cytokines\' releasing and effector events, such as reactive oxygen species (ROS) production and extracellular traps (NETs) formation. Together, they influence the host resistance to the fungus and, consequently, the disease course. One aspect of the PCM epidemiology is impressive: its incidence is higher in men than in women, especially during their reproductive period. It is speculated that the women\'s better response to the fungus may be related to the estrogen higher concentration they have, since this hormone, in vitro, inhibits the yeast\'s growth. Additionally, our group has previously reported that in a murine PCM model, males and females differ on the immune response to the fungus, which favors the females\' resistance. However, neutrophils, despite their apparent relevance in fungal infections, have never been studied for their possible contributive role in the gender differences found in PCM. This work aimed to compare the neutrophils regulatory and effector functions in men and women when these cells were in vitro infected with P. brasiliensis yeasts. Healthy men and women aged between 23 and 35 have participated in the study. To be included, at the date of neutrophil harvesting women should be between the first and the 15th day of the menstrual cycle or use estrogen-based contraceptives. Neutrophils purified from peripheral blood were incubated with P. brasiliensis and assessed for the capacity of phagocytosis and elimination of yeasts, as well asXI for the production of cytokine and ROS. Neutrophils from women killed the fungi more efficiently and produced higher concentrations of TNF. Nonetheless, the donor gender has not affected some tested neutrophil functions, namely phagocytosis ability and ROS production. Moreover, assays performed in the presence of synthetic ?-estradiol showed that (i) men neutrophils started to kill yeasts more efficiently than in the absence of the hormone; (ii) neutrophils from men and women decreased the production of TGF-?. We conclude that in vitro infection with P. brasiliensis unveiled differences between men and women neutrophils\' functions. Part of the functional insufficiency verified in men\'s neutrophils of fighting against the fungal infection reversed by the estrogen addition to the assay medium. The results of this work allow postulating that neutrophils contribute to the women\'s resistance to paracoccidioidomycosis.

A paracoccidioidomicose é uma enfermidade sistêmica causada principalmente pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis. Recentemente, observou-se que a capacidade fagocítica dos macrófagos alveolares (MA) em animais diabéticos está diminuída em comparação aos MA de animais sadios, e que a insulina estimula a atividade fagocítica em MA oriundos de animais diabéticos e sadios por mecanismos diferentes. Neste projeto, usando um modelo de carência relativa de insulina (diabetes mellitus experimental), estudamos a intervenção da insulina em um modelo de infecção sistêmica. Após aprovação do comitê de ética (protocolo CEUA/FCF/421), camundongos machos da linhagem C57BL/6 (diabéticos, 60 mg/kg aloxana/10 dias, e seus respectivos controles) receberam injeção intratraqueal contendo suspensão de leveduras de P. brasiliensis ou volume equivalente de PBS estéril. Animais dos grupos de tratamento receberam insulina pela via subcutânea diariamente por 12 dias. Nas amostras, foram avaliados: a) o número de células dos lavados peritoneal (LPe) e broncoalveolar (LBA), o leucograma, e a glicemia (monitor de glicose); b) os níveis séricos de insulina no soro pela técnica de ELISA; c) as concentrações de citocinas (TNF-&#945;, IL-6, IL-4, IL-10, IL-12, CINC-1, CINC-2, CINC-3) nos LPe e LBA e nos homogenatos (ELISA). Após incubação de 55 dias, comparados aos controles (2.9±0,4g e 192±7.5 mg/dL), animais tornados diabéticos (0.87 ± 0,25 g e 570,1 ± 9,27mg/dL) apresentaram redução no ganho de massa corpórea durante o período de experimentação e elevados níveis de glicose sanguínea. O tratamento de insulina reduziu os níveis de glicose (547±36,8mg/dL vs.323,6±36,9mg/dL), embora não o suficiente para tornar os animais normoglicêmicos. Comparados aos controles, animais diabéticos apresentaram número reduzido de leucócitos no LPe (2.2 x106 ± 0.2cells/mm3 vs 1.3 x106 ± 0.1cells/mm3) e, no LBA, reduzidas concentrações de CINC-2 (662,3±73,8pg/mL vs 312,7±114,7pg/mL), CINC-1 (115,5.0±25,5pg/mL vs 88,3±24,7pg/mL) e IL-10(320,9±58,4pg/mL vs 161,0±59,4pg/mL) depois da infecção. O tratamento com insulina restaurou a concentração de leucócitos nos LPe de animais diabéticos, mas não no LBA. Os dados sugerem que a insulina modula a produção/liberação de citocinas, sem alterar a migração de leucócitos para LBA e restaurando a migração destes para LPe durante o curso da paracoccidioidomicose. / Paracoccidioidomycosis is a systemic disease mainly caused by Paracoccidioides brasiliensis fungus that interact with antigen-presenting cells, changing its main biological functions. Recently it was observed that the phagocytic capacity of these cells in diabetic animals for IgG opsonized targets is decreased compared to healthy animals, and that insulin stimulates the phagocytic activity in alveolar macrophages in from diabetic and healthy animals, by different mechanisms. In this project, using a model of relative lack of insulin (experimental diabetes mellitus), we studied the intervention of insulin in a model of systemic infection. After approval by the committee of ethics (protocol CEUA/FCF/421), C57BL/6 male diabetic (60mg/kg aloxan/10days) mice and their respective controls were subjected to intratracheal injection of suspension of P. brasiliensis or an equivalent volume of TBS sterile. In the forty-third day, insulin-treated mice were treated subcutaneously daily with insulin for 12 days at 6 P.M. We evaluated: a) the number of cells of the peritoneal(PeL) and bronchoalveolar (BAL) fluids, the leucogram and the glucose levels; b) the levels of insulin on the serum by the technique of ELISA; c) the levels of cytokines (TNF-&#945;, IL-6, IL-4, IL-10, IL-12, CINC-1, CINC-2, CINC-3) in the BAL and PeL fluid, and on organ homogenates. After 55 days, relative to controls (2.9±0,4g and 192±7.5 mg/dL)), mice rendered diabetic (0.87 ± 0,25 g and 570,1 ± 9,27mg/dL) exhibited a reduction in body weight gain during the experimental period and sharply elevated blood glucose levels. Treatment of diabetic animals with insulin induced a reduction in blood glucose levels (547±36,8mg/dL vs.323,6±36,9mg/dL), but it was not sufficient to reduce glycemia to control values. In addition, relative to controls, infected diabetic mice exhibited a reduction in the number of leukocytes into the PeL fluid ((2.2 x106 ± 0.2cells/mm3 vs 1.3 x106 ± 0.1cells/mm3) and reduced BAL concentrations of CINC-2 (662,3±73,8pg/mL vs 312,7±114,7pg/mL), CINC-1 (115,5.0±25,5pg/mL vs 88,3±24,7pg/mL) and IL-10 (320,9±58,4pg/mL vs 161,0±59,4pg/mL) after P. brasiliensis infection. Treatment of diabetic mice with insulin restored concentrations of leukocytes in the PeL fluid but not in the BAL. Data presented suggest that insulin modulates the production/release of cytokines but not leukocyte migration to the BAL while restoring this paramether on the PeL during the course of P. brasiliensis fungus-induced PCM.

A Paracoccidioidomicose é micose sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides brasiliensis, endêmico na América Latina, especialmente Brasil. Para melhor avaliarmos a resposta imune celular frente a diferentes componentes do fungo, como gp43, considerada o antígeno imunodominante de P. brasiliensis, filtrado de cultura livre de gp43 (Filtrado), e gp43 tratada com metaperiodato (meta), utilizamos os ensaios de linfoproliferação e ELISA para detecção das citocinas IL-4, IL-10, IL-12 e IFN-. Os resultados com relação à gp43 corroboram dados da literatura e de nosso laboratório demonstrando que gp43 é o antígeno imunodominante do fungo e pode estar envolvido no mecanismo de anergia dos linfócitos T de pacientes com a micose ativa. Com o Filtrado observamos respostas linfoproliferativas positivas, porém menores que com gp43, também evidenciando a anergia de linfócitos T de pacientes, e a indução de IL-10 em células de controles curados, podendo representar assim um mecanismo de imunossupressão. Com relação à meta, esta não induziu resposta linfoproliferativa nem a síntese de citocinas, sugerindo não ser um antígeno apropriado para esse tipo de avaliação. / Paracoccidioidomycosis is a systemic mycosis caused by Paracoccidioides brasiliensis, endemic in latin América, specially Brazil. To better understand the cellular immune responses to different components of the yeast, such as gp43, considered the immunodominant antigen, a culture filtrate free of gp43 (CF), and gp43 treated with metaperiodate, we used lymphoproliferative assays and ELISA to detect the cytokines IL-4, IL-10, IL-12 e IFN-. The results with gp43 were consistent with the literature and previous with data from our Laboratory showing that gp43 is the immunodominant antigen of P. brasiliensis and is likely involved with the anergy of T-cells from patients. With CF we observed positive, but weaker, proliferative responses. It also evidenced the T-cell anergy of patients and the preferential induction of IL-10 in cells from cured controls. The latter can represent a mechanism of anergy induction. With meta, we observed that neither induce proliferative responses nor cytokine secretion, being apparently an inappropriate antigen for use in cellular immunoassays.