A habilidade das células-tronco de se diferenciar em diferentes tipos celulares faz delas fortes candidatas para serem utilizadas em terapias celulares como tratamento de diversas doenças. No entanto, para explorar este potencial e necessário o estabelecimento de estratégias efetivas para modificações genéticas nessas células. Associado a outras tecnologias, o sistema de vetores lentivirais tem sido usado como um método atrativo para entrega de transgenes de interesse por possuírem uma alta eficiência de transdução. Além disso, eles permitem a transdução em células em proliferação ou quiescentes. A eficácia desses vetores para expressão de transgenes depende do uso de promotores corretos que possam garantir uma alta expressão genica e sustentável. Assim, o objetivo deste projeto foi comparar a eficiência dos promotores de citomegalovírus (CMV) e do fator de elongação-1<font face=\"Symbol\">a (EF1<font face=\"Symbol\">a) no sistema de entrega genica lentiviral em células-tronco mesenquimais de pele humana (HU). Para isso, foram construídos vetores lentivirais que possuem o promotor de CMV ou o promotor de EF1<font face=\"Symbol\">a, além do gene-repórter eGFP (\'\'enhanced green fluorescence protein\'\'). Para avaliar a eficiência de transfecção das construções, os vetores contendo os promotores e o gene-repórter (pLVCMVeGFP e pLVEF-1<font face=\"Symbol\">a-eGFP) foram utilizadas células 293T (produtora de partículas virais) e verificamos a presença da proteína fluorescente verde por microscopia de fluorescência, indicando a funcionalidade dos promotores. Visando analisar a eficiência das construções, células HU foram transduzidas e observamos a presença da proteína fluorescente nas transduções, demonstrando que os promotores encontram-se ativos em ambas as células. Após a verificação da eficácia das construções plasmidiais, foram feitas analises para avaliar a eficiência da transdução das construções em células HU. Para tal, as células foram transduzidas com lentivirus contendo um dos promotores analisados em diferentes multiplicidades de infecção (1, 5 e 10) e analisadas através da intensidade do sinal de fluorescencia e pela porcentagem de células eGFP positivas. Detectamos mais células eGFP positivas com a transdução do gene a partir do promotor PCMV do que com a do promotor PEF-1<font face=\"Symbol\">a. Assim, comparamos a eficiência destes promotores em MOI 1. Os resultados mostraram que a transdução com o promotor PEF-1<font face=\"Symbol\">a foi superior quando comparado ao promotor PCMV, portanto sendo a melhor escolha para esse sistema de entrega genica em células-tronco mesenquimais de pele humana. / The hability of stem cells to form a wide source spectrum of cell type makes them an interesting source for cell therapies. However, to exploit their remarkable potentials, the development of effective strategies for genetic modifications of MSCs is required. Lentiviral based vectors, with other techniques, offer an attractive system for efficient gene delivery in stem cells. These vectors efficiently transduce stem cells, and can infect dividing and nondividing cells. However, the efficiency of this vectors to genetic manipulation depends on the use of corrects cellular promoters for driving a high and stable expression of exogenous genes. In this study, we have chosen the cytomegalovirus (CMV) and the elongation factor 1-<font face=\"Symbol\">a promoters. We have compared the efficiency of this promoters in drive expression of the transgene in human dermal mesenchymal stem cells. The lentiviral vectors were constructed with the CMV promoter or the EF-1<font face=\"Symbol\">a promoter, together with the eGFP gene (enhanced green fluorescence protein). To evaluate the efficiency of the lentiviral vectors, 293T cells were transfected and analyzed for eGFP expression using fluorescence microscopy. We were able to observe the expression of eGFP, indicating that the vectors were working. Dermal mesenchymals stem cells were transduced with CMV- and EF-1<font face=\"Symbol\">a lentiviral vectors to evaluate the efficiency of the transductions. Efficiency of transductions was measured by flow cytometry (FACS) as percentage eGFP+ cells and signal intensity with different MOIs (multiplicity of infections).

O Lopap é um ativador de protrombina da lagarta L. obliqua, pertence à família das lipocalinas e apresenta atividade antiapoptótica. O Lopap foi obtido na forma recombinante (rLopap), na levedura P. pastoris, por metodologia escalonável, e sua atividade foi avaliada in vitro e in vivo. O tratamento com rLopap reduziu o tempo de sangramento em animais anticoagulados com enoxaparina. Por outro lado, um peptídeo derivado do Lopap, designado antiapoptotic peptide (AP), foi capaz de induzir a síntese de colágeno em cultura de fibroblastos e na derme de animais. A região correspondente a AP apresentou propriedades físicas e estruturais semelhantes a seqüências relacionadas em outras lipocalinas com atividade antiapoptótica. Estes resultados abrem perspectivas para aplicações do Lopap, como uma molécula procoagulante, e de AP, através de sua ação na modulação celular, como um componente cosmético, no reparo e remodelamento tecidual e em disfunções que envolvem morte celular e perda de colágeno. / Lopap is a prothrombin activator from the L. obliqua caterpillar, belongs to the lipocalin family, and displays antiapoptotic activity. Lopap was obtained in the recombinant form (rLopap) in the P. pastoris yeast, by a scaled up methodology, and its activity was evaluated in vitro and in vivo. Treatment with rLopap reduced the bleeding time in animals anticoagulated with enoxaparin. On the other hand, a Lopap-derived peptide, designated antiapoptotic peptide (AP), was able to induce collagen synthesis in fibroblast culture and in the animal dermis. The region corresponding to AP had similar physical and structural properties when compared with other antiapoptotic lipocalins. These results open perspectives for the use of Lopap, as a procoagulante molecule, and the use of AP, based on its cell modulation effects, as a cosmetic component, aiding tissue repair and in dysfunctions involving cell death and loss of collagen.

O conhecimento da morfologia endotelial nas diferentes regiões da córnea é de suma importância para avaliação de endotélios corneanos saudáveis e doentes e de suas respostas ao uso de medicações. O objetivo do presente estudo foi descrever a morfologia do endotélio nas regiões central e periférica superior da córnea saudável de equinos, medir a área média das células pentagonais, hexagonais e heptagonais presentes nas regiões avaliadas, calcular o polimegatismo de cada tipo celular e correlacionar estes parâmetros entre os diferentes formatos celulares. Foram estudados dez equinos, machos ou fêmeas, de diferentes idades, provenientes de um abatedouro licenciado. Imagens da superfície posterior do endotélio da córnea foram obtidas com uso de microscopia eletrônica de varredura. A morfologia do endotélio de diferentes regiões da córnea foi avaliada. Além disso, foi correlacionada a variabilidade do tamanho celular médio com a morfologia endotelial. A análise estatística foi conduzida usando o teste de análise de variância (ANOVA) seguido do teste de Tukey (Post-Hoc), com nível de significância de 5%. As amostras avaliadas foram compostas em sua maioria por células hexagonais (60,5%), pentagonais (21,4%) e heptagonais (16,9%), células com quatro, oito ou nove lados compuseram 1,3%. A área celular média das células pentagonais foi 203,58 μm², das hexagonais foi 223,84 μm² e nas heptagonais foi 270,54 μm². O polimegatismo encontrado foi de 16% nas células pentagonais e hexagonais e de 20% nas heptagonais. A morfologia das células endoteliais de equinos saudáveis não diferiu entre as regiões central e periférica superior da córnea, sugerindo que a região central é representativa da região periférica. As células com sete lados apresentaram polimegatismo maior em relação às células de seis e de cinco lados. / The knowledge of the endothelial morphology in the different regions of the cornea is important for the evaluation of healthy and sick corneal endothelium and its response to drugs. In order to describe the endothelial morphology in the central and superior peripheral regions of the equines’ cornea, evaluate area from pentagonal, hexagonal and heptagonal cells present in the evaluated regions, calculate the polimegathism and correlate these parameters, two healthy corneas were collected of ten equine, male or female, of different ages. Images of the posterior surface of the corneal endothelium were taken with scanning electron microscope. The endothelial morphology was studied in the different regions of the equines’ cornea. In addition, the polimegathism and morphology was also correlated. A statistical analysis was conducted using the Analysis of Variance (ANOVA) followed by Tukey's Test (Post-Hoc), with a 5% level of significance. In the central region, the endothelium consisted of 58.8% hexagonal cells, 22.6% pentagon, 17.1% heptagonal and 1.4% cells with either four, eight or nine sides. In the superior peripheral region, 62.1% of the cells were hexagonal, 20.2% pentagon, 16.6% heptagonal and 1.1% cells with four or eight sides. The average cell area of the pentagonal cells was 210.77 ± 31.53 μm² in the central region and 196.39 ± 34.35 μm² in the superior peripheral region; in hexagonal cells, the average cell area found in the central region was 216.12 ± 37.09 μm² and 231.56 ± 34.95 μm² in the superior peripheral region; and in cells with seven sides, the average cell area was 261.76 ± 55.29 μm² in the central region and in the superior peripheral region was found 279.32 ± 52.37μm². When not considering the corneal regions, the polymegathism found was 16% in the pentagonal and hexagonal cells and 20% in the heptagonal cells. The morphology results obtained did not differ between the central and peripheral regions of the cornea, suggesting that the central region is representative of the peripheral region. The highest coefficient of variation was seen in cells with seven sides.

Verificou-se que microssomos de fígado apresentam uma atividade azo-redutásica completamente dependente de NADPH, usando DAB como substrato. Ao contrário de outros sistemas já descritos, a atividade azo-redutásica não pode ser identificada com a NADPH-citocromo c redutase, embora nossos resultados indiquem que esta enzima participa da reação. Não se pode excluir definitivamente a participação do citocromo b5 apesar de uma série de observações afastando essa possibilidade. Verificou-se que a atividade azo-redutásica pode ser induzida por tratamento com 3-MC, paralelamente à indução do citocromo P-450 tipo II. Isto sugere fortemente a participação desse citocromo na reação apesar desta não ser inibida por CO. O citocromo P-450 induzido por tratamento com 3-MC era funcionalmente ativo. A atividade azo-redutásica foi inibida especificamente pelo tratamento oral comoDAB, possibilitando a formulação de uma hipótese sobre a ação carcinogênica deste composto. Uma série de resultados mostra que a azo-redutase estudada é altamente específica podendo ser inibida por KCN e por mersalil. Face aos fatos expostos acima, as perspectivas do sistema parecem muito interessantes. A possibilidade do uso de novos métodos de fracionamento dos microssomos pode levar à resolução do sistema da azo-redutase. As semelhanças com a dessaturação de ácidos graxos, aliadas às indicações da existência de um novo tipo de citocromo P-450 que se combina com KCN, permitem descortinar maior amplitude para os limites do sistema da azo-redutase. Enfim, trata-se de uma reação de redução de um composto exógeno, com características até agora não relatadas, envolvendo processos biológicos de importância e cujo estudo terá prosseguimento. / Not available

Echinometra lucunter, o ouriço-do-mar responsável por 50% dos acidentes por animais marinhos, causa inflamação e dor quando os espinhos entram na pele, efeitos atribuídos ao trauma mecânico, além de acidentes por ingestão de ovas. O líquido celômico e o extrato aquoso de espinhos foram fracionados e purificados até a obtenção de moléculas puras, que foram testadas em modelos de inflamação. Foram feitas análises histológicas do espinho e de atividade enzimática do extrato de espinho. Foi isolada uma molécula do espinho e um peptídeo do líquido celômico, que causaram inflamação e dor. Foi verificada atividade enzimática de catepsina B/X. Foi observada uma estrutura histológica organizada no espinho, com células entre a porção calcificada, algumas contendo grânulos eletrodensos com conteúdo protéico, típicas secretoras. Conclui-se que o espinho e o líquido celômico de E. lucunter possuem toxinas inflamatórias, que participam do envenenamento e o espinho tem células secretoras de toxinas. A catepsina pode auxiliar no mecanismo de reparação do espinho, quando quebrado. / Echinometra lucunter, the sea urchin responsible for 50% of marine animals accidents, cause inflammation and pain by the spine penetration, effects attributed to the mechanical trauma. Accidents were reported after the ingestion of raw. The celomic fluid and spines were fractionated and purified, procedure repeated until pure molecules were obtained, tested for inflammation models. Histological analyses and enzymatic assays were performed. A molecule from spines and a peptide from the celomic fluid caused inflammatory effects. Moreover, a cathepsin B/X activity could be identified in the spines. An organized histological structure in the spine was observed, with cells embedded in a calcified matrix, as well as granulous cells displaying proteic contents, typical of secretory cells. It was possible to conclude that the spine and the celomic fluid of E. lucunter do contain inflammatory toxins that prolong the spine puncturing event itself, and the spine possesses a toxin secretory structure. The cathepsin would be present in a mechanism of tissue remodeling.

ACTH (hormônio adrenocorticotrópico) e fatores peptídicos de crescimento regulam a proliferação celular em células adrenocorticais. Resultados preliminares de ensaios biológicos, cromatografia de heparina-sefarose e \"Westem blotting\" indicaram a produção de fatores peptídicos de crescimento das famílias de PDGF e de FGF na linhagem celular adrenocortical Y-1. No entanto a relação entre o estímulo promovido por ACTH e a expressão de fatores peptídicos de crescimento e sua contribuição para o controle do ciclo celular em células adrenocorticais ainda não estão definidas. Os principais objetivos deste projeto consistiram em: 1. Detectar e caracterizar os fatores peptídicos de crescimento e seus correspondentes receptores expressos em células adrenocorticais; 2. Investigar a regulação da expressão de fatores peptídicos de crescimento sob o estímulo de ACTH; 3. Definir os mecanismos de ação para os fatores peptídicos de crescimento localmente expressos e sua contribuição na regulação do ciclo celular. Os modelos experimentais utilizados foram: a linhagem Y-1 de células tumorais de adrenocorticais de camundongo e culturas primárias de células adrenocorticais de rato. Os resultados obtidos foram: 1. Fatores peptídicos de crescimento e seus respectivos receptores, correspondentes a PDGF (A e B), FGF2 (isoformas de alto e de baixo peso molecular), IGF (1 e 2), TGF&#946; (1, 2 e 3), VEFG-A, TGF&#945; e EGF, foram detectados por RT-PCR e confirmados por clonagem e sequenciamento; 2. mRNAs correspondentes às formas de \"splicing\" alternativo para FGF2, bem como as isoformas de baixo (LMW-FGF2) e de alto (HMW-FGF2) peso molecular para a proteína FGF2 foram detectados em células Y-1. Os níveis basais de LMW-FGF2 foram aumentados sob estímulo de ACTH; 3. Com relação à distribuição subcelular em células adrenocorticais, LMW-FGF2 endógeno (produzido sob estímulo de ACTH) foi encontrado predominantemente no citoplasma, enquanto LMW-FGF2 exógeno (recombinante) foi internalizado para o núcleo de maneira dose e tempo-dependente; 4. Receptores para FGF foram detectados e caracterizados em células adrenocorticais. As isoformas detectadas, correspondentes a FGFRlb, FGFR2c e FGFR3b, foram reguladas sob tratamentos de ACTH e de FGF2. A expressão de FGFRs foi silenciada utilizando-se RNAs de interferência (RNAi), permitindo investigar a contribuição da sinalização promovida por FGF e seus receptores no ciclo celular. / ACTH and locally produced peptide growth factors regulate the proliferation in adrenocortical cells. Our previous results of biological assays, heparin-sepharose chromatography and Western blot indicated that PDGF and FGF-like factors are synthesized in Y-1 adrenocortical cell line. But the interaction among the ACTH stimulation and locally produced peptide growth factors, and their contribution for the cell cycle control, remains to be investigated. The main objectives of these project were: 1. To characterize peptide growth factors and their respective receptors expressed in adrenocortical cells; 2. To investigate the regulation of the expression of peptide growth factors under ACTH stimulation; 3. To find the mechanism of action of the locally produced peptide growth factors and to determine their contribution in the cell cycle control. The experimental models utilized were the Y-1 mouse adrenocortical cell line and primary cultures from rat adrenocortex. The results found were: 1. Several peptide growth factors and their respective receptors, corresponding to PDGF (A and B), FGF2 isoforms, IGF (1 and 2), TGF&#946; (1 , 2 and 3), VEGF-A, TGF&#945; and EGF were detected by RT-PCR and confirmed by cloning and sequencing; 2. Two mRNAs splicing variants, as well the low (LMW-FGF2) and the high (HMW-FGF2) molecular weigh isoforms for FGF2 were detected in adrenocortical cells. The very low basal level of the endogenous LMW-FGF2 in untreated cells was up regulated after the ACTH stimulation; 3. In regard to the intracellular distribution of FGF2 in adrenocortical cells, the endogenous (ACTH induced) LMW-FGF2 was found predominantly in he cytoplasm, but the exogenous (recombinant) LMW-FGF2 was internalized into the nucleus in a time and dose dependent manner; 4. FGFRs corresponding to FGFRlb, FGFR2c and FGFR3b isoforms were detected and characterized in adrenocortical cells. All of them were up regulated under ACTH and FGF2 treatments. The expression of FGFRs could be silenced by RNAi approach, allowing to investigate the contribution of the FGF signaling for the cell cycle control.

Células tronco embrionárias (CTE) são capazes de proliferar indefinidamente mantendo a sua pluripotência, isto é, a capacidade de se diferenciar em diversos tipos celulares perante estímulos adequados. Esse potencial tem sido intensamente estudado, de modo a permitir a utilização dessas células em terapias de reposição celular. Trabalhos anteriores demonstraram que as proteínas kinases C (PKC) são importantes moduladores moleculares de cascatas de sinalização que levam ao processo de proliferação e auto-renovação das CTE. Porém o papel exato das diferentes isoenzimas das PKCs ainda não foi elucidado. Isso ocorre porque a família das PKCs é composta por pelo menos dez isoenzimas e apenas, recentemente, desenvolveram-se moduladores específicos para as diferentes isoenzimas, o que permitirá estudar o papel específico dessas quinases. No presente trabalho verificamos que a ativação da PKC&#948; induziu a proliferação de CTE indiferenciadas sem induzir a diferenciação das mesmas. Para tentar elucidar as vias de sinalização mediadas pela PKC&#948 que levam à proliferação das CTE indiferenciadas realizamos estudos de fosfoproteômica o que possibilitou a identificação de potenciais alvos diretos e indiretos da PKC&#948. Dentre os alvos identificados foram encontradas diversas proteínas relacionadas com proliferação, transcrição, tradução e resposta ao stress (chaperonas), contribuindo para a hipótese de que a ativação da PKC&#948; leva à proliferação das CTE indiferenciadas. Em diversos sistemas, a ativação da PKC&#948; leva à ativação da MAPK, em particular das ERK1/ 2, sendo essa via capaz de induzir a proliferação de diversas linhagens celulares. Identificamos diversas proteínas alvos da PKC&#948, que interagem também com componentes da via das MAPKs. Desta forma, verificamos a influência da ativação da PKC&#948 na via das MAPKs. De fato, a ativação da PKC&#948 na linhagem de CTE murinas indiferenciadas, E14TG2a, ativou a MEK, ERK1/ 2 e o fator de transcrição ELK-1. Como estudos anteriores demonstraram que a inibição da ERK1/ 2 mantém CTE indiferenciadas e que a ativação desta via poderia levar à diferenciação de CTE, investigamos a cinética de ativação da ERK pela PKC&#948. Demonstramos que a ativação da ERK pela PKC&#948 se da de modo transiente e que apesar da PKC&#948 não translocar para o núcleo, sua ativação induz a fosforilação e translocação nuclear da ERK, que atuará na fosforilação do fator de transcrição ELK-1. Desta forma, concluímos que a PKC&#948 induz a proliferação das CTE murinas indiferenciadas ativando transitoriamente a via das ERK1/ 2, que translocam para o núcleo fosforilando fatores de transcrição como a ELK1 e levando possivelmente ao aumento de proliferação dessas células. A ativação transiente das ERK1/ 2 pela PKC&#948 é importante para a auto-renovação das CTE. / Embryonic stem cells (ESC) are able of proliferating indefinitely maintaining their pluripotency, which is the capability to differentiate in different cell types upon appropriate stimuli. Pluripotency has been intensely investigated in order to allow the use of these cells in cellular replacement therapies. Previous work has demonstrated that the serine/ threonine kinases, such as, Protein kinases C (PKC) are important modulators of signaling cascades that lead to the process of proliferation and self-renewal of ESC. However, the exact role of the different PKC isoenzymes still remains to be elucidated. Due to the fact that the PKC family is composed of at least ten different isoenzymes and only recently isoenzyme specific modulators have been developed, which now allows the elucidation of these kinases roles. In the present work we verified that activation of PKC&#948 induced undifferentiated ESC have their proliferation rate increased. Trying to elucidate the signaling pathways mediated by PKC&#948 that lead to the proliferation increase we performed phosphoproteomic studies to identify potential PKC&#948 targets. Between the targets identified we found several proteins related with proliferation, protein transcription, translation and stress response (chaperones). These targets contributed to the hypothesis that PKC&#948 activation leads to undifferentiated ESC proliferation. In different cell lines, PKC&#948 activation leads to MAPK activation, through ERK1/ 2 activation, which are frequently involved with cellular proliferation. We also identified several targets of PKC&#948 that Interact with several components of MAPK`s signaling cascade. PKC&#948 activation in murine undifferentiated ESC line, E14TG2a, led to MEK, ERK1/ 2 and the transcription factor Elk-1 activation. Some articles demonstrate that the inhibition of ERK1/2 are responsible to maintains ESC undifferentiated and that it`s activation could lead to ESC differentiation. Analysing the kinetics of ERK activation in the ESC by PKC&#948, we show that ERK activation was transient and despite the fact that PKC&#948 does not translocated to the nucleus upon activation, but induces ERK activation and it`s nuclear translocation, where ERK could phosphorylate the transcription factor Elk-1. In conclusion PKC&#948 induces undifferentiated murine ESC proliferation increase by a transient ERK activation and it`s nuclear translocation.

O prion celular (PrPc) é uma glicoproteína ligada à membrana plasmática por uma âncora de GPI (glycosylphosphatidylinositol). A sua isoforma anormal (PrPsc) é uma molécula infecciosa que causa várias doenças neurodegenerativas em mamíferos. A etiologia dessas doenças está associada a uma mudança conformacional pós-traducional de PrPc que ocorre após sua internalização (Prusiner, 1998). Na tentativa de desvendar as funções fisiológicas de PrPc, nosso grupo tem identificado e caracterizado as interações celulares que PrPc participa. A primeira delas é a interação entre PrPc e STI1 (Stress Inducible Protein 1). Essa interação transduz sinalização por cAMP e PKA levando a neuroproteção contra morte celular programada (Chiarini e cols, 2002; Zanata e cols, 2002). A segunda é a interação específica que existe entre PrPc e as proteínas da matriz extracelular, laminina e vitronectina, contribuindo para os processos neuronais, tais como crescimento, manutenção (Graner e cols., 2000 a e b) e regeneração dos neuritos (Hajj e cols., submetido), além da formação de memória de curta e longa duração (Coitinho e cols., submetido). Na primeira parte deste trabalho, procuramos investigar os genes regulados pelos sinais resultantes dessas interações e também pela remoção de PrPc usando a técnica de \"differential display\'\' RT-PCR. Na segunda parte do trabalho, caracterizamos que a interação PrPc - laminina é capaz de induzir uma sinalização transitória de cálcio, a qual ocorre mesmo na ausência de cálcio do meio extracelular. PrPc é uma molécula que cicla continuamente entre a membrana plasmática e os compartimentos intracelulares. Estudos recentes têm correlacionado o processo de internalização de PrPc com alguns dos seus papeis fisiológicos, tais como, homeostase de Cu2 + (Brown, 2001 ), interação com receptor de laminina (Gauczynski e cols, 2001) e até na conversão de PrPc para PrPsc (McKinley e cols, 1991; Arnold e cols, 1995). Portanto, na terceira parte deste trabalho, caracterizamos a localização e o tráfego celular de PrPc mostrando que PrPc está localizado na membrana plasmática e em compartimentos intracelulares e que trafega pelo Golgi, membrana plasmática, endossomos iniciais e de reciclagem. Foram mapeados ainda domínios na região amino-terminal responsáveis pela internalização de PrPc e na região carboxi-terminal como participantes da via secretora. Este trabalho contribuiu para o esclarecimento de alguns eventos biológicos relacionados à sinalização e ao tráfego de PrPc. Estes achados são de grande importância para a determinação das funções celulares de PrPc e ainda dos mecanismos envolvidos com as doenças relacionadas com esta molécula. / The cellular prion protein (PrPc) is a glycoprotein anchored to the plasma membrane by GPI (Glycosyl-phosphatidylinositol). Its abnormal isoform (PrPsc) is the infectious protein responsible for several neurodegenerative diseases. The main etiology of the prion diseases is related to conformational changes in the PrPc molecule, which occur after its internalization (Prusiner, 1998). In order to elucidate the physiological functions of PrPc, our group identified and characterized interactions between PrPc and other cellular molecules. The first is the interaction between PrPc and STI 1 (Stress Inducible Protein 1). This interaction has an important role in the neuroprotection against apoptosis through cAMP and PKA signaling (Chiarini et al., 2002; Zanata et al., 2002). PrPc also interacts with proteins of the extracellular matrix such as laminin and vitronetin. These interactions contribute for neurite outgrowth, maintenance and regeneration (Graner et al., 2000 a and b; Hajj et al., submitted) and also in memory formation (Coitinho et al., submitted). In the first part of this work we have applied the differential dysplay RTPCR technique in order to identify genes that are regulated by PrPc - STI 1 interaction and also by the deletion of PrPc. In the second part we have demonstrated that PrPc-laminin interaction induces transient calcium signaling in neuronal cells, which occurs even in the absence of extracellular calcium. PrPc cycles continuously between the plasma membrane and intracellular compartments. This mechanism is associated with some of the physiological function of PrPc, such as Cu2+ homeostasis (Brown, 2001 ), interaction with laminin receptor (Gauczynski et al., 2001 ), and PrPc conversion into PrPsc (McKinley et al., 1991; Arnold et al., 1995). Thus, in the third part of this project, we have characterized the PrPc localization at the cell surface and in intracellular compartments. The protein trafficking through Golgi apparatus, plasma membrane, early and recycling endosomes was also defined. Moreover, we have determinated that N-terminus PrPc domain is responsible for its internalization while C-terminus participates in PrPc delivery. Therefore, this work has contributed to elucidate biological events related to the cell signaling and trafficking of PrPc, which are important for the characterization of PrPc physiological functions and to understand the pathological mechanisms related to this molecule.

Made available in DSpace on 2015-03-04T18:51:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese Completa.pdf: 5651353 bytes, checksum: 51c96a7210d03ea18a0c2bf0251eec36 (MD5) Previous issue date: 2009-06-01 / As leucemias são desordens proliferativa nas células tronco hematopoiéticas pluripotentes caracterizada por mutações que comprometem seus precursores mielóides ou linfóides levando ao desenvolvimento de leucemias similares quanto ao fenótipo (Mielóide ou Linfóide) e forma (Crônica ou Aguda). Descrito em 1960, o cromossomo philadelphia (Ph) foi a primeira anomalia cromossômica associada a uma neoplasia, a Leucemia Mielóide Crônica (LMC). Em 1973, foi demonstrado que o cromossomo Ph resulta da translocação recíproca entre os braços longos do cromossomo 9 e 22 [t(9;22)(q34;q11)], produzindo um gene quimérico BCR-ABL, encontrado em 95% dos casos de LMC. A proteína quimérica codificada, BCR-ABL, com atividade tirosina quinase descontrolada, é o fator causal da LMC. Durante os anos 1990, uma série de moléculas sintéticas foram desenvolvidas e testadas para inibir especificamente a atividade tirosina quinase da proteína BCR-ABL, o Imatinib (STI-571 ou Gleevec) foi a primeira dessas drogas aprovadas e usadas como agente terapêutico contra a LMC, demonstrando redução do número de células leucêmicas em quase todos pacientes. No entanto muitos pacientes com resistências primárias ou secundárias foram frequentemente relatados. Os mecanismos de resistência são provavelmente heterogêneos, e no mínimo dois mecanismos envolvendo o gene BCR-ABL foram descritos em estudos realizados in vivo: amplificação do gene e ocorrência de mutações que resultam em substituições de aminoácidos associadas com o fenótipo de resistência. Diferentes níveis de resistência são frequentemente associadas a mutações pontuais recorrentes encontradas no domínio quinase da proteína c-ABL em regiões como: sítio catalítico, alça de ativação (A-loop) e alça de fosforilação (P-loop). Os primeiros estudos computacionais foram realizados com o mutante Thr334Ile e mutações na região do P-loop, e ajudaram a entender num nível molecular, os mecanismos de resistência ao Imatinib. Neste trabalho, realizamos um estudo estrutural e termodinâmico das interações entre os ligantes Imatinib e Nilotinib no sítio ativo da proteína c-ABL selvagem e em 12 proteínas com mutações específicas, além de determinar a importância do solvente (com particular interesse na molécula de água denominada Cw - que medeia a interação fármaco-proteína) no processo de resistência aos fármacos. No presente trabalho, utilizamos o método semi-empírico de energia de interação linear (LIE) de maneira alternativa: analisando as interações entre diferentes mutantes da proteína c-ABL e um inibidor (Imatinib ou Nilotinib). Os coeficientes de LIE obtidos foram os seguintes: com Cw fixa (restrição de Cw na posição inicial) = 0,2169; = 0,0654; = 1,4159; e Cw livre (sem restrição de Cw na posição inicial) = 0,0394; = 0,0077; = -2,0503. O melhor ajuste dos coeficientes de LIE foram obtidos nas simulações sem restrição da posição inicial de uma molécula de água conservada (Cw), essa escolha foi baseada no valor de energia livre absoluta da proteína c-ABL selvagem ( ) ser sempre um número mais negativo quando comparado com o valor da energia livre absoluta de cada proteína c-ABL mutada. O uso do método LIE (Linear Interaction Energy) com essa estratégia foi eficiente para analisar o efeito da interação entre diferentes proteínas c-ABL mutantes e um ligante (Imatinib ou Nilotinib). Até o momento não existem simulações de dinâmica molecular na presença de outros domínios da proteína BCR-ABL: SH2 e SH3.

Dissulfeto isomerase protéica (PDIA1 ou PDI) é uma chaperona e ditiol-dissulfeto oxido-redutase residente do reticulo endoplasmático (RE). PDI é essencial à regulação da proteostase por ter função no enovelamento oxidativo de proteínas e na via de degradação associada ao RE (ERAD). Além disso, PDI interage fisicamente e regula a atividade de NADPH oxidases, e fora da célula é um regulador redox essencial à atividade de proteínas extracelulares. Este pool epi/pericelular da PDI (pecPDI) regula função de proteínas de membrana/secretadas, como integrinas, glicoproteínas gp120 do virus HIV e outras, com múltiplas funções que incluem: trombose, ativação plaquetária, adesão celular, infecção viral e remodelamento vascular. A rota de externalização da PDI permanece obscura, e seu conhecimento pode indicar mecanismos dos efeitos (fisio)patológicos da PDI. A secreção da PDI pela rota RE-Golgi foi sugerida em células endoteliais infectadas pelo vírus da dengue, células pancreáticas e tireoideanas. No entanto, uma varredura sistemática das possíveis rotas de externalização da PDI não foi previamente realizada. Neste estudo, mostramos que células endoteliais (EC) externalizam constitutivamente, por rotas distintas, dois pools de PDI, de superfície celular e solúvel, enquanto na EC não estimulada PDI não foi detectada significativamente em micropartículas. PDI externalizada corresponde a ca.1,4% do pool total de PDI celular. Tanto a PDI de superfície celular como a solúvel foram majoritariamente secretadas pela via de secreção não-convencional do tipo IV independente de GRASP. Contudo, a via de secreção clássica também contribui para externalização basal da PDI de superfície celular, mas não da solúvel basal ou estimulada por PMA, ATP e trombina indicando que todas envolvem escape do Golgi. Além disso, a externalização constitutiva da PDI de superfície em célula muscular lisa vascular também ocorre por via independente de Golgi. Externalização da PDI não foi detectavelmente mediada pela secreção não-convencional do tipo I, II, III, lisossomos secretórios, endossoma de reciclagem e transporte ativo (dependente de ATP) em EC. Considerando que chaperonas são vias essenciais de resposta a estresses, investigamos o efeito de estresse do RE e choque térmico na pecPDI. Estresse do RE não altera a PDI de superfície celular, mas aumenta PDI solúvel. Ambos os pools de PDI não foram alterados por choque térmico, embora a recuperação desse estresse diminua a secreção de PDI. Estes dados sugerem que a liberação de PDI é um processo regulado, dependente da natureza do estresse. Bloqueio da síntese de proteínas com cicloheximida não altera pecPDI, indicando que PDI recém-sintetizada não é preferencialmente externalizada e que o tráfego da PDI independe de outras proteínas recém-sintetizadas. Um aspecto importante do estudo foi indicar uma resiliência da pecPDI à modulação individual de distintas vias secretoras, consistente com uma estrita auto-regulação e possibilidade de vias sinérgicas e complementares. Estes resultados indicam que a externalização da PDI de superfície e PDI secretada possam ser externalizadas por mecanismos independentes. Estes processos compõem um processo regulado estritamente, consistente com papel homeostático da pecPDI / Protein disulfide isomerase (PDIA1 or PDI) is dithiol-disulfide oxireductase chaperone resident in the endoplasmic reticulum (ER). PDI is essential for proteostasis, due to its support of oxidative protein folding and ER-associated protein degradation (ERAD). In addition, PDI associates with NADPH oxidase(s) and regulate its activity, while outside of the cell, PDI redox-dependently modulates extracellular proteins. This epi/pericellular PDI (pecPDI) pool is known to regulate membrane/secreted proteins such as integrins, HIV glycoprotein gp120 and others, with functions that involve thrombosis, platelet function, cell adhesion, viral infection and vascular remodeling. PDI externalization route remains enigmatic and its elucidation can help understand some (patho)physiological PDI effects. An ER-Golgi route for PDI secretion has been as described on dengue virus-infected endothelial cells pancreatic and thyroid) cells. However, none of these papers addressed PDI secretion routes in a systematic fashion. Here, we show that endothelial cells (EC) constitutively externalize, through different routes, two PDI pools, a cell-surface and a secreted one, while in nonstimulated ECs PDI was not significantly detected in microparticles. Externalized PDI corresponds to < 2% of total cellular PDI pool. Both cell-surface and soluble PDI were predominantly externalized through unconventional type IV GRASP-independent pathway(s). However, the classical secretory pathway also contributes to basal cell-surface, but not soluble, PDI externalization, as PMA, ATP or thrombin-stimulated secretion also involve Golgi bypass. Furthermore, constitutive cell-surface PDI externalization in vascular smooth muscle cells also occurs in a Golgi-independent way. PDI externalization was not detectably mediated by non-conventional type I, II and III secretion routes, secretory lysosomes, recycling endosomes and ATP dependent active transport in EC. Since chaperones are essential for cellular stress response, we assessed the effects of ER stress and heat-shock on pecPDI. ER stress did not affect cell-surface PDI but increased the soluble pool. Both PDI pools were unaltered by heat shock, while stress recovery decreased PDI secretion. These data suggest that PDI release is finely tuned and dependent on the type of stress. Blockade of protein synthesis with cycloheximide did not change pecPDI levels, suggesting that newly-synthesized PDI is not preferentially externalized and that PDI traffic does not require newly-synthesized proteins. An important aspect of the study was the evidence for pecPDI resilience to individual modulation of distinct secretion routes, consistent with strict auto-regulation and possible synergic or complementary pathways. Overall, our data suggest that cell-surface and secreted PDI pool externalization are regulated through independent mechanisms, which in both cases involve Type IV non-conventional routes, with some minor contribution of Golgi-dependent secretory pathway. These patterns compose a strictly regulated process, consistent with an important homeostatic role for pecPDI