Made available in DSpace on 2014-06-11T19:23:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-09-11Bitstream added on 2014-06-13T19:28:47Z : No. of bitstreams: 1 lacorte_lm_me_botib.pdf: 666125 bytes, checksum: 6fcd38caa7181d41d03115f5d379e2ad (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O câncer de próstata e a hiperplasia prostática benigna são as duas principais afecções do sistema genital masculino após a quinta década de vida. Além de aspectos étnicos, etários, genéticos, estudos sobre a contaminação ambiental por agentes químicos carcinogênicos, dos hábitos alimentares e do estilo de vida vêm adquirindo importância no entendimento das causas destas afecções. A exposição a contaminantes ambientais, tais como o cádmio e a ingestão de bebidas contendo cafeína têm sido associados com o aparecimento do câncer de próstata e com a hiperplasia prostática benigna, respectivamente. Além disso, existem evidências experimentais de que a exposição da próstata em períodos críticos da sua morfogênese e de rápido crescimento a disruptores endócrinos pode gerar alterações permanentes que levarão ao aparecimento de afecções nos indivíduos adultos e idosos. Neste sentido, por exemplo, a partir da puberdade é comum os homens adquirirem o hábito de fumar e/ou de ingerir bebidas estimulantes, estando, portanto, expostos ao cádmio, presente na fumaça do cigarro, e/ou a cafeína, presente nas bebidas. Desta forma, este trabalho avaliou os efeitos, isolados e combinados, do cádmio e da cafeína, em baixas concentrações, sobre a morfologia e fisiologia da próstata de ratos púberes. Para isto, ratos Wistar com 60 dias de idade foram divididos em quatro grupos (n=15), os quais receberam, via oral, na água de beber, pelo período de 30 dias: Água, Cádmio (10ppm), Cafeína (10mg/l) ou Cafeína+Cádmio, e as próstatas dorsolaterais e ventrais foram processadas histologicamente e foram feitas análises morfológicas, citoquímicas para fibras de colágeno, morfométricas e imunocitoquímicas. Também foram determinadas as concentrações plasmáticas de cádmio e testosterona e intra-prostática de cádmio no... / The prostate cancer and the benign prostate hyperplasia are the main male genitourinary system diseases after the fifty. Besides ethic, age and genetic aspects, studies about environmental contamination, diet and life stile have also emerged as important factors involved in the etiology of these diseases. The exposure to cadmium and the intake of caffeine-containing beverage have been associated with appearing of the prostate cancer and benign prostate hyperplasia, respectively. Furthermore, there are experimental evidences that prostate exposures to endocrine disruptors during a critic period of its morphogenesis and growth may influence the onset of late-life disease. In this sense, for example, from puberty on, many males became smokers and/or start to intake energetic beverage or even yet coffee, thus being exposed to cadmium, from cigarettes and/or to caffeine, from beverage. So, here we investigated the effects of cadmium and caffeine, isolated or combined, in low doses, on rat prostate morphology during puberty. For this, male Wistar rats (n=60), 2 months-old, were divided into four experimental groups (n=15), that received by drinking water and during 30 days: tap water, cadmium (10ppm), caffeine (10ppm), cadmium plus caffeine. The prostatic lobes ventral and dorsolateral were dissected out, weighted and processed for histology. It were made morphological and morphometrical analyses; cytochemistry for collagen and reticular fibers and immunocytochemistry for Ki-67. It were also determined the plasma concentrations of testosterone and cadmium and the ventral lobe intraprostatic concentration of cadmium. The plasma and intraprostatic concentrations of cadmium were increased in the animals treated with cadmium and cadmium plus caffeine. In the conditions of this experiment, the exposure to these two agents did not alter significantly neither the prostatic... (Complete abstract click electronic access below)

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / This study presents as its central theme the importance of using different didactic tools to overcome the learning difficulties in abstract content such as Cellular and Molecular Biology in the elementary and high school. The didactic resources offer to motivate students in the teaching-learning process, represent an alternative to overcome the exclusive use of the textbook as research material, reading for students and lessons planning for teachers. The thesis is divided in four chapters presented in the form of articles. The first chapter presents an investigation about behavior, acceptance and performance of students in high school facing the use of Information and Communication Technologies (ICT). Allied ICT analyzed the applicability of practical activities in teaching Biology to support the introduction of computer resources. Chapter two investigates whether students motivated by the use of different teaching strategies to better understand about organization and functioning of the cell. In the third one investigates the use of different didactic resources (practical class with microscope and historical replicas, reading comic books and model building) in understanding of Cell Biology for students of elementary school and whether the program about cell teaching is really suitable. The fourth chapter examines whether the program about cell teaching is worked differently in the elementary and high school and which idea that students have about Cell Biology at the different levels of education. The ICT, through the webquest tool, proved to be an important didactic resource for teaching Molecular Biology, as well as motivated and instigated the students to build your knowledge. Moreover, the webquest presented applicability when combined with practical activity of DNA extraction. The different didactic resources had an important role in the student s motivation. Besides motivating, the different teaching tools helped in learning when the Cell Biology was related the student s daily life. The results indicated that the cell teaching is taught similarly in the elementary and high school. There was no greater maturity and conceptual evolution in high school, because the level of response complexity was similar to that found in elementary school. Thus, the didactic-pedagogic resources may be strategies important to stimulate students' curiosity, the desire for discovery and knowledge. / Este estudo apresenta como tema central a importância de se utilizar diferentes ferramentas didáticas com o intuito de superar as dificuldades de aprendizagem em conteúdos abstratos como a Biologia Celular e Molecular, no Ensino Fundamental e Médio. Os recursos didático-pedagógicos apresentam potencial para motivar os estudantes no processo de ensinoaprendizagem, representam uma alternativa ao uso exclusivo do livro didático como material de pesquisa, leitura para o aluno e planejamento das aulas para professor. A tese está dividida em quatro capítulos apresentados sob a forma de artigos. O primeiro capítulo apresenta uma investigação a respeito do comportamento, aceitação e desempenho dos estudantes de 3º ano do Ensino Médio frente à utilização das Tecnologias da Informação e Comunicação (TIC). Aliada às TIC analisou-se a aplicabilidade de atividades práticas no ensino de Biologia como suporte e complemento à introdução de recursos de informática. O capítulo dois investiga se estudantes motivados pela utilização de estratégias didáticas diversas compreendem melhor a organização e funcionamento da célula. No terceiro capítulo, investiga-se o efeito da utilização de diferentes recursos didáticos (aula prática com microscópio e réplicas históricas, leitura de gibi e confecção de modelo) como auxiliares na compreensão de conceitos de Biologia Celular por alunos do 8º ano do Ensino Fundamental bem como se o conteúdo programático sobre célula trabalhado nas escolas é adequado à série em questão. O quarto capítulo analisa se o conteúdo programático sobre célula é trabalhado de forma diferenciada no 8º ano do Ensino Fundamental e 2º ano do Ensino Médio e investiga qual a ideia que os estudantes apresentam sobre Biologia Celular nos diferentes níveis de ensino. As TIC, através da ferramenta webquest, demonstraram ser um importante recurso didático para o ensino de Biologia Molecular, pois além de motivar, instigaram os alunos a buscarem informações para construção do seu conhecimento. Além disso, a webquest apresentou aplicabilidade quando aliada à atividade prática de extração do DNA. A utilização de diferentes recursos didáticos teve um importante papel na motivação dos estudantes. Além de motivador, as diferentes ferramentas didáticas auxiliaram na aprendizagem quando a Biologia Celular foi relacionada aos assuntos do cotidiano dos alunos. Os resultados indicaram que o conteúdo sobre célula é ensinado de maneira semelhante no Ensino Fundamental e Médio. Não se observou maior maturidade e evolução conceitual no Ensino Médio, pois o nível de complexidade das respostas foi semelhante ao encontrado no Ensino Fundamental. Logo, se bem empregados, os recursos didático-pedagógicos podem ser importantes estratégias para estimular a curiosidade dos alunos, o desejo pela descoberta e pelo conhecimento.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A toxoplasmose é uma zoonose amplamente distribuída que afeta mais de um terço da população mundial e de grande importância na saúde pública. A maioria das infecções em humanos por Toxoplasma gondii é assintomática. A toxoplasmose é amplamente investigada visto que se apresenta como uma doença grave em pessoas imunodeprimidas (portadores da síndrome da imunodeficiência adquirida (SIDA), não tratados, indivíduos transplantados, paciente em tratamento quimioterápico ou em uso de drogas supressoras e gestantes). A toxoplasmose congênita frequentemente pode levar ao aborto espontâneo ou até mesmo resultar na formação de crianças com algum grau de atraso no desenvolvimento mental e/ou físicos, deste modo, a transmissão congênita pode ser muito mais importante do que se pensava, pois os parasitos encontrados na circulação sanguinea são capazes de infectar as células endoteliais dos vasos e os tecidos circunjacentes, podendo resultar no encistamento do T. gondii. Atualmente a toxoplasmose vem sendo investigada devido a sua associação a inúmeras outras doenças, assim, estudos sobre a evolução da infecção por T. gondii em diferentes tipos de células hospedeiras se fazem necessários para uma abordagem terapêutica adequada. Ao invadir a célula hospedeira o parasito possui a capacidade de recrutar as mitocôndrias promovendo mudanças na organização mitocondrial ao longo da progressão da infecção, garantindo um ambiente favorável a sua multiplicação. Diante disso, investigamos se o parasito possui a capacidade de interferir no metabolismo mitocondrial e na resposta apoptótica da célula endotelial. O presente trabalho teve como objetivo analisar o metabolismo mitocondrial através da respirometria de alta-resolução e da resposta apoptótica através do western blotting das células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) infectadas por 2, 6 e 20 horas por taquizoítos de T. gondii. A respirometria de alta-resolução revelou que o parasito interfere no metabolismo energético da célula hospedeira. A análise do conteúdo de proteínas da família Bcl-2 por western blotting revelou maior estímulo apoptótico no tempo inicial de infecção, quando comparado aos demais tempos. Os resultados dos conteúdos de caspase 3, proteína efetora da apoptose, não demonstrou diferença nos tempos iniciais de infecção Entretanto, em tempos mais tardios, o conteúdo de caspase 3 mostrou-se significativamente aumentado quando comparado às HUVEC não infectadas. A dinâmica de replicação do parasito foi observada através do monitoramento pelo sistema Time-Lapse Nikon BioStation IMQ em tempo real das células infectadas por T.gondii. Portanto, nossos resultados sugerem que o protozoário ao recrutar as mitocôndrias da célula hospedeira interfere no metabolismo mitocondrial e na modulação da apoptose para garantir um ambiente favorável a sua multiplicação. / Toxoplasmosis is a widespread zoonosis that affects more than a third of the world population and of great public health importance. Most human infections with Toxoplasma gondii are asymptomatic. Toxoplasmosis is widely investigated since it presents itself as a serious disease in immunocompromised persons (holders of acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), untreated, transplant recipients, patients undergoing chemotherapy or suppressing drugs and pregnant). Congenital toxoplasmosis can often lead to miscarriage or even result in the formation of children with some degree of developmental delay mental and / or physical, thus congenital transmission may be much more important than previously thought, because the parasites found In the bloodstream are able to infect endothelial cells of blood vessels and surrounding tissues, which may result in encystment T. gondii. Currently toxoplasmosis has been investigated because of their association with other diseases, so, studies of the evolution of T.gondii infection in different types of host cells are necessary for an adequate therapeutic approach. To invade the host cell, the parasite has the ability to recruit mitochondria promoting changes in mitochondrial organization along the progression of infection, ensuring a favorable environment for their multiplication. Therefore, we investigated whether the parasite has the ability to interfere with mitochondrial metabolism and apoptotic response of endothelial cells. This study aimed to analyze the mitochondrial metabolism by high-resolution respirometry and apoptotic response by western blotting of endothelial cells of human umbilical vein (HUVEC) infected for 2, 6 and 20 hours per tachyzoites of T. gondii. The high-resolution respirometry revealed that the parasite interferes with the energy metabolism of the host cell. The analysis of the family protein content of Bcl-2 by western blotting revealed higher apoptotic stimulus at the initial time of infection, as compared to other times. The results of the contents of caspase 3 protein effector of apoptosis, showed no difference in the initial days of infection However, in more recent times, the content of caspase 3 was significantly increased when compared to non-infected HUVEC. The dynamics of parasite replication was observed by monitoring the system Time-Lapse Nikon BioStation IMQ in real time from infected cells by T. gondii. Therefore, our findings suggest that mitochondria in recruiting protozoan host cell interfere with mitochondrial metabolism and in the modulation of apoptosis to ensure a favorable environment for multiplication.

Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A diferenciação da oligodendroglia depende de alterações coordenadas no citoesqueleto e na sua relação com a membrana plasmática, um componente importante para a formação da bainha de mielina. A 23 nucleotídeo cíclico 3 fosfodiesterase (CNPase) está relacionada com a organização do citoesqueleto, sendo uma proteína ancoradoura de microtúbulos na membrana plasmática. In vitro, a CNPase compõe, com a F-actina e os microtúbulos, as estruturas semelhantes a nervuras ou os componentes radiais. A glicoproteína associada a mielina (MAG), também é importante para a formação dos véus de membrana e está associada a CNPase e a tubulina. Além disso, as três proteínas podem ser reguladas pela via de sinalização do AMPc/PKA. Buscando avaliar os efeitos da via do AMPc/PKA na regulação da diferenciação oligodendroglial, culturas de hemisférios cerebrais com 5 dias foram tratadas por 30 min ou 24 h com o inibidor (SQ22356-SQ [1 M]) ou com o ativador (forscolina [10M]) da adenilato ciclase ou com o inibidor da PKA, H-89 [1 M]. A oligodendroglia foi identificada pelo anticorpo anti-CNPase e por sua morfologia. Com 30 min de tratamento com forscolina, as células das culturas tratadas apresentaram prolongamentos maiores e menos véus de membrana quando comparadas às culturas controle. O tratamento com SQ também causou um aumento no tamanho dos prolongamentos e o tratamento com H-89 causou a redução no tamanho dos prolongamentos e nos véus de membrana. Com 24 h, as células tratadas com forscolina apresentaram poucos prolongamentos, já as culturas tratadas com SQ apresentaram um aumento no tamanho do prolongamento e as tratadas com H-89 demonstraram redução no véu de membrana. Observamos também alterações na distribuição da CNPase, tubulina e MAG, a primeira apresentou uma concentração próxima ao núcleo depois dos dois tempos de tratamento com H-89, o mesmo ocorreu com a tubulina. A CNPase adquiriu ainda um padrão puntiforme depois de 24 h de tratamento com ambos os inibidores. A MAG apresentou um aumento na concentração próximo ao núcleo depois de 30 min de tratamento com forscolina e SQ. O tratamento com SQ também reduziu a distribuição da MAG nos véus de membrana. A mesma redução foi observada depois de 24 h de tratamento com H-89. Esses resultados reforçam a participação da via do AMPc/PKA no desenvolvimento da oligodendroglia, incluindo a formação dos prolongamentos, suas ramificações e ainda a formação dos véus de membrana, com prováveis consequências na formação e manutenção da bainha de mielina. / Oligodendroglial differentiation depends on coordinated changes in the cytoskeleton and on its relationship with the plasmatic membrane, a critical site regarding the formation of the myelin sheath. 23cyclic nucleotide 3 phosphodiesterase (CNPase) is related to cytoskeleton modulation, anchoring microtubules to the plasmatic membrane. In vitro, CNPase composes, together with F-actin and microtubules, the vein-like structures or radial components in myelin sheath. Myelin associated glycoprotein (MAG) is important to membrane vellum formation and is associated with CNPase and tubulin. Besides, the AMPc/PKA pathway can regulate these three proteins. In order to evaluate the effects of the cAMP/PKA pathway modulation on oligodendroglial differentiation, cultures of cerebral hemispheres were treated for 30 min or 24 h with the adenylyl cyclase inhibitor SQ22536 SQ [1 lM] or with its activator forskolin [10 lM], or with the PKA inhibitor H-89 [1 lM]. Oligodendroglia was identified using anti-CNPase antibody as also by morphology. At 30 min, the cells treated with forskolin showed bigger processes and a shorter membrane vellum when compared to control cultures, the treatment with SQ caused an increase in the processes length, the H-89 treatment reduced the processes length and the membrane vellum. At 24 h, cultures treated with forskolin showed few processes when compared to control cultures. Cultures treated with SQ showed an increase in the processes length and after H89 treatment oligodendroglial cells presented a reduction in the membrane vellum. We also observed alterations in the distribution of CNPase, tubulin and MAG, the first showed an increase in the distribution closest to nucleus in both periods of H-89 treatment, the same pattern occurred for tubulin. The CNPase acquired a punctiform pattern after 24 hours of treatment with both inhibitors. The MAG also showed an increase closest to nucleus after 30 minutes of treatment with forskolin and SQ. The SQ treatment also caused a reduction in the protein distribution to membrane vellum. The same reduction is observed after 24 hours of treatment with H-89.These findings reinforce a role for AMPc/PKA pathway in oligodendroglial differentiation including the processes extension and arborization as also the formation of membranar vellum, with possible consequences in the formation and maintenance of myelin sheath.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A via de sinalização da cinase regulada por fatores extracelulares, da família das proteínas cinases ativadas por mitógenos (MAPK/ERK) é importante tanto para a sobrevivência como para a progressão da diferenciação de oligodendrócitos. Neste trabalho, a via da MAPK/ERK foi avaliada na oligodendroglia in vitro com a utilização de inibidores da MEK. A morfologia celular, assim como a distribuição de proteínas foram analisadas em diferentes estágios de maturação da oligodendroglia. Culturas primárias de oligodendrócitos foram tratadas com os inibidores da MEK PD98059 ou U0126, aos 5 ou 11dias in vitro (div), por 30min, 24 ou 48h. A oligodendroglia foi distinguida com marcadores estágio-específicos: A2B5, 23nucleotídeo cíclico 3 fosfodiesterase (CNPase) e proteína básica de mielina (MBP), e classificada de acordo com sua morfologia em diferentes estágios de desenvolvimento. O tratamento aumentou significativamente o número de células com morfologia mais imatura e diminuiu o número de células maduras. Além disso, aumentou o número de células redondas e sem prolongamentos as quais não puderam ser classificadas em nenhum dos estágios de desenvolvimento da oligodendroglia. Os efeitos mais evidentes foram observados logo após o menor tempo de tratamento. Células redondas eram positivas para CNPase e MBP, porém não foram marcadas com A2B5 ou com NG2, indicando que seriam células maduras incapazes de estender ou manter seus prolongamentos. De fato, estas mudanças foram acompanhadas por alterações na distribuição de proteínas de oligodendrócitos como a MBP e a CNPase, assim como alterações em proteínas de citoesqueleto, como actina, tubulina e na cinase de adesão focal (FAK). A MBP foi observada nas células tratadas em um padrão de distribuição desorganizado e disperso, oposto ao padrão contínuo que é observado nas células das culturas controle. Além disso, o tratamento causou uma desorganização na distribuição da CNPase, actina e tubulina. Nas células das culturas controle, estas proteínas apresentam um padrão organizado compondo as estruturas de citoqueleto semelhantes a nervuras. Após um pequeno período de tratamento (30min), actina e tubulina apresentaram o mesmo padrão de marcação puntiforme que a CNPase apresentou. O tratamento também reduziu os pontos de adesão focal demonstrados pela FAK. Com o decorrer do tratamento, após 24 e 48h, actina e tubulina aparentavam estar se reorganizando em um padrão filamentar. Estes resultados indicam um efeito importante da via da MAPK/ERK na ramificação e alongamento dos prolongamentos dos oligodendrócitos, com possíveis consequências para a formação da bainha de mielina. / The mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase (MAPK/ERK) pathway is important for both long-term survival and timing of the progression of oligodendrocyte differentiation. In this work, the MAPK/ERK signaling in oligodendroglia was studied in vitro by using MEK inhibitors. Cell morphology and distribution of proteins were analyzed in different stages of maturation. Primary cultures of oligodendroglia were treated with the MEK inhibitors PD98059 or U0126, at 5 or 11div for 30min, 24 or 48h. Oligodendroglial cells were distinguished by using stage specific markers: NG2 proteoglycan, A2B5, 23nucleotide-cyclic 3phosphodiesterase (CNPase) and myelin basic protein (MBP), and classified according to their morphology into different developmental stages. Treatment significantly increased the number of cells with more immature morphologies and decreased the number of mature cells. Furthermore, it increased the number of rounded cells that could not be classified into any of the oligodendroglial developmental stages. The strongest effects were usually observed shortly after treatment. Rounded cells were CNPase/MBP positive and they were not stained by anti-NG2 or A2B5, indicating that they were mature cells unable either to extend and/or to maintain their processes. In fact, these changes were accompanied by alterations in the distribution of the oligodendroglial proteins MBP and CNPase, and alterations in cytoskeleton proteins, as actin, tubulin and the focal adhesion kinase (FAK). MBP was observed in a continuous distribution in cell body and processes in control cultures. Furthermore, in treated cultures a disorganized pattern of distribution of CNPase, actin and tubulin was observed. In control cultures, these proteins compose the cytoskeleton vein-like structures. By the other side, after a short time of MEK inhibition (30min), actin and tubulin showed the same punctual pattern observed in CNPase distribution. Treatment also caused a reduction of focal adhesion sites showed by FAK. As treatment progressed, after 24 and 48h, actin and tubulin seemed to be rearranged into a filament-like pattern. These data showed an effect of the MAPK/ERK pathway on oligodendroglial branching, with possible consequences for the formation of the myelin sheath.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Camundongos C57BL/6 machos com oito semanas de idade alimentados com diferentes dietas durante 16 semanas: de alta densidade energética (ADE, 26% das calorias de carboidrato, 60% de gordura e 14% de proteína) ou dieta padrão (CO, 76% das calorias de carboidrato, 10% de gordura e 14% de proteína). Comparado ao grupo CO, o grupo ADE apresentou maior ganho de massa e maior depósito de tecido adiposo, bem como maiores níveis plasmáticos de triglicerídeos, LDL-c, ALT, AST e fosfatase alcalina e com maiores níveis de corticosterona plasmática, glicose de jejum e insulina com uma consequente resistência à insulina (avaliado pelo HOMA-IR). No TOTG, a glicose plasmática aumentou ao máximo após 15 min. da administração de glicose oral em ambos os grupos. Entretanto os níveis de glicose foram maiores no grupo ADE que no grupo CO (P<0.0001). O clearance de glicose no grupo ADE foi reduzido, permanecendo aumentado após 120 min. (P<0.001), caracterizando intolerância a glicose no grupo ADE. O teste intraperitoneal de tolerância à insulina mostrou uma rápida redução na glicose plasmática após 15 minutos da administração de insulina em ambos os grupos, mas significativamente aumentada no grupo ADE (P<0.0001), permanecendo desta forma até os 120 min. após a administração. Concluindo, camundongos C57BL/6 respondem a dieta ADE desenvolvimento os sinais e sintomas associados à síndrome metabólica observada em humanos. Por conseguinte, este modelo animal poderá ajudar-nos a compreender melhor as alterações em órgãos alvos associadas com a síndrome metabólica, assim como a possibilidade de tratamentos diferentes. / Eight-week-old male C57BL/6 mice fed different diets during 16 weeks: very high-fat chow (HFC, 26% of calories from carbohydrates, 60% from fat, and 14% from protein), or standard chow (SC, 76% of calories from carbohydrates, 10% from fat, and 14% from protein). Compared to SC mice, the HFC mice showed greater mass gain and greater total visceral fat pads, as well as higher plasma levels of triglycerides, LDL-C, ALT, AST and ALK, and higher plasma corticosterone, fasting plasma glucose and insulin with the consequent insulin resistance (assessed by HOMA-IR). In OGTT, The plasma glucose increased to a maximum after 15 min of glucose oral administration in both groups. However, the glucose level in HFC mice was higher than in SC mice (P<0.0001). The clearance of glucose in HFC mice showed a delay, remaining elevated after 120 min (P<0.001), characterizing an impairment of glucose clearance in HFC mice when compared to SC mice. The insulin tolerance test demonstrated quick decrease of plasma glucose after 15 min of insulin administration in both groups, but plasma glucose remained significantly high in HFC mice when compared to SC mice (P<0.0001) in the following time-points until 120 min. In conclusion, C57BL/6 mice respond to a very high-fat diet developing the aggregate of symptoms and signs associated with the metabolic syndrome seen in humans. Therefore, this animal model could help us better understand the target organ alterations associated with the syndrome and the possibility of different treatments.

Angiogenesis and inflammation act simultaneously in several pathophysiological processes. The interactions with the extracellular matrix (ECM) are required in inflammatory angiogenesis. The non-enzymatic disintegrins comprise a family of peptides, low molecular weight, derived from the venom of snakes, which strongly inhibit the functions of integrins. In this study we evaluated the therapeutic effect of disintegrin DisBa-01, derived from the venom of the snake Rhinocerophis alternatus in inflammatory angiogenesis induced by synthetic implants in mice. Treatment with DisBa-01 inhibited the main key components of fibrovascular tissue induced by implants as inflammation and angiogenesis, without changing the fibrogenic component. This experimental model is the implementation of a synthetic matrix in the subcutaneous tissue of the animal, which induces the formation of fibrovascular tissue rich in inflammatory cells, blood vessels and MEC. The model of synthetic implants, also allows the simultaneous evaluation of inflammation, angiogenesis and tissue repair. The inhibitory effects of DisBa-01 were observed by MPO activity (representing activated neutrophils), NAG activity (representing activated macrophage), the chemokines CXCL -1, MCP-1 and the cytokine TNF- &#945;. The anti-angiogenic activity was observed through the reduction of hemoglobin content, number of vessels, blood flow intra-implant by laser doppler and the levels of VEGF and FGF cytokines. The evaluation of DisBa-01 in multiple parameters provides additional evidence to the therapeutic potential of this disintegrin. / A angiogênese e a inflamação atuam simultaneamente em diversos processos fisiopatológicos. A angiogênese inflamatória é dependente de uma série de interações com a matriz extracelular (MEC) que são mediadas principalmente por receptores integrinas. Assim, peptídeos que possam atuar sobre as integrinas vêm sendo amplamente estudados. Alguns peptídeos como as desintegrinas funcionam como antagonistas das integrinas. As desintegrinas compreendem uma família de polipeptídeo não enzimáticos, de baixo peso molecular, derivados a partir da peçonha de serpentes, que inibem fortemente as funções das integrinas. Neste estudo avaliou-se o efeito terapêutico da desintegrina DisBa-01, derivada da peçonha da serpente Rhinocerophis alternatus na angiogênese inflamatória induzida por implantes sintéticos em camundongos. Este modelo experimental consiste na implantação de uma matriz sintética no tecido subcutâneo do animal, que induz a formação de tecido fibrovascular rico em células inflamatórias, vasos sanguíneos e MEC. O modelo de implantes sintéticos, também permite a avaliação concomitante da inflamação, angiogênese e do reparo tecidual. O tratamento intra-implante com diferentes doses de DisBa-01 inibiu os principais componentes inflamatórios e angiogênicos do tecido fibrovascular. Os efeitos anti-inflamatórios da DisBa-01 foram observados por reduções na atividade de MPO (representando neutrófilos ativados), NAG (representando macrófagos ativados), nas quimiocinas CXCL-1, MCP-1 e pela citocina TNF-&#945;. A atividade anti-angiogênica foi observada através da redução do conteúdo de hemoglobina, do número de vasos em cortes histológicos, bem como por uma redução no fluxo sanguíneo intra-implante através da imagem de perfusão por laser doppler e dos níveis das citocinas pró-angiogênicas VEGF e FGF. No entanto, o tratamento não foi capaz de produzir efeitos significativos sobre os principais componentes do reparo tecidual, como o colágeno e a citocina TGF-&#946;. A avaliação de DisBa-01 nos múltiplos parâmetros reveladas neste estudo demonstrou evidências adicionais ao potencial terapêutico desta desintegrina. / Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Lichen planus is a chronic inflammatory disease mediated by T cells of unknown cause. Skin, nails and mucous membranes can be affected, and the disease is more common in middleaged adults, especially in women. Oral lichen planus (OLP) manifests as reticular (white) and erosive (red) lesions that are eventually painful. Histologically, it is characterized by dense lymphocytic infiltrate beneath the epithelium, apoptosis of keratinocytes, liquefaction of the basal layer, epithelial hyperplasia and hyperkeratosis. Oral lichenoid reactions (OLR) are distinguished from OLP by the presence of precipitating factors, unilateral lesions and diffuse inflammatory infiltrate. Metallothionein is a protein involved in anti-oxidative response and anti-apoptotic pathways. Ki-67 is a cellular proliferation marker and is expressed only in cells that are in cell division (phases G1, S, G2 and M of the cell cycle). The tumor suppressor gene p16 is involved in the pRb pathway and participates in the regulation of the cell cycle, repairing possible damage to DNA. The aim of this study was to evaluate possible molecular differences, related to oxidative stress and cell proliferation between OLP and OLR, and the two major forms of OLP in order to better understand the pathogenesis of these lesions and facilitate the differential diagnosis between them. Immunohistochemistry for metallothionein, Ki-67 and p16 detection was performed in 42 and 23 cases of OLP and OLR, respectively. Reactivity for metallothionein was more frequently observed in OLP cases than in OLR cases (p = 0,01; Mann-Whitney U test). Significant difference was found between the reticular and atrophic lesions of OLP for p16 protein (p = 0,04; Mann-Whitney U test). There was no significant difference between the lesions in relation to Ki-67 antigen. The results of this study suggest that metallothionein protein may be a useful marker of differential diagnosis between OLP and OLR, and that p16 protein may be a differential marker of reticular and atrophic/erosive lesions of OLP. / O líquen plano é uma doença inflamatória crônica, mediada por células T e de causa desconhecida. Pele, unhas e mucosas podem ser afetadas, e a doença é mais comum em adultos de meia-idade, especialmente em mulheres. Histologicamente, é caracterizada por denso infiltrado linfocitário subepitelial em banda, apoptose de queratinócitos, liquefação da camada basal, hiperplasia e hiperqueratose epitelial. O líquen plano oral (LPO) se manifesta clinicamente como lesões reticulares (brancas) e atróficas/erosivas (vermelhas), que são eventualmente dolorosas. Reações liquenóides orais (RLO) distinguem-se do LPO pela presença de fatores precipitantes, lesões unilaterais e infiltrado inflamatório difuso. A metalotioneína é uma proteína envolvida em resposta antioxidante e vias anti-apoptóticas. Ki- 67 é um marcador de proliferação celular e é expresso somente em células que estão em divisão celular (fases G1, S, G2 e M do ciclo celular). O gene supressor de tumor p16 está envolvido na via de sinalização pRb e atua na regulação do ciclo celular, reparando possíveis danos ao DNA. O objetivo deste estudo foi avaliar possíveis diferenças moleculares, relacionadas ao estresse oxidativo e proliferação celular entre LPO e RLO, bem como as duas formas clínicas principais de LPO, a fim de melhor compreender a patogênese dessas lesões e facilitar o diagnóstico diferencial entre elas. Imuno-histoquímica para detecção de metalotioneína, Ki-67 e p16 foi realizada em 42 e 23 casos de LPO e RLO, respectivamente. Reatividade para metalotioneína foi mais frequente em casos de LPO do que em casos de RLO (p = 0,01; Mann-Whitney U). Foram observadas diferenças significativas entre as lesões reticulares e atróficas/erosivas de LPO para a proteína p16 (p = 0,04; Mann-Whitney U). Não houve diferença significativa entre as lesões em relação ao antígeno Ki-67. Os resultados deste estudo sugerem que a proteína metalotioneína pode ser um marcador útil do diagnóstico diferencial entre LPO e RLO, e que a proteína p16 pode ser um marcador diferencial das lesões reticulares e atróficas/erosivas de LPO. / Mestre em Biologia Celular e Estrutural Aplicadas

A formulação de vacinas efetivas frequentemente requer a adição de adjuvantes capazes de otimizar as respostas imunes humoral e celular. Com o objetivo principal de contribuir para o desenvolvimento de novos adjuvantes, este trabalho foi desenvolvido buscando aprofundar o conhecimento do mecanismo de ação imunoadjuvante de preparações de saponinas de Quillaja brasiliensis e suas formulações em complexos imunoestimulantes do tipo ISCOM. Como a toxicidade das saponinas é um fator crítico para seu uso em preparações vacinais, inicialmente foram realizados ensaios visando comparar a toxicidade in vitro e in vivo de saponinas extraídas de Quillaja brasiliensis com saponinas de ação imunoestimulante reconhecidas, extraídas de Quillaja saponaria (Quil A). O potencial imunoadjuvante das saponinas solúveis de Q. brasiliensis foi avaliado utilizando preparações com dois antígenos: ovalbumina (OVA) e vírus da diarreia viral bovina (BVDV). Numa etapa seguinte, a atividade imunoadjuvante de ISCOMs preparados com saponinas de Q. brasiliensis foram avaliadas em duas vias de administração. O potencial imunomodulador dessas saponinas foi verificado em experimentos de recrutamento celular in vivo e expressão de genes relacionados ao sistema imune. Os resultados mostraram que saponinas de Q. brasiliensis são menos tóxicas que as de Quil A e apresentam atividade adjuvante similar, caracterizada por um perfil Th1/Th2 balanceado. Q. brasiliensis promoveu uma forte resposta imune celular do tipo Th1 caracterizada por uma robusta reação de hipersensibilidade celular tardia (DTH) e pela produção de IFN- e IL-2. A resposta imune induzida pelos ISCOMs produzidos a partir de saponinas de Q. brasiliensis foram superiores às respostas induzidas pelas saponinas solúveis. Os testes in vivo mostraram que as saponinas de Q. brasiliensis promovem um ambiente imunocompetente no local da inoculação e nos linfonodos drenantes. Esse ambiente foi caracterizado pelo intenso influxo celular (neutrófilos, células NK, células dendríticas, linfócitos T e B), além da expressão diferencial de genes relacionados à ativação do sistema imune. Em suma, os resultados mostraram que saponinas de Q. brasiliensis são seguras e seus potencial adjuvante foi equivalente a saponinas com ação imunoadjuvante conhecida de Q. saponaria. / Effective vaccine formulations frequently require addition of adjuvants able to optimize the cellular and humoral immune responses. With the goal to contribute to the development of new classes of adjuvants, this work was developed in order to achieve deep knowledge on the imunoadjuvant mode of action for Quillaja brasiliensis saponins incorporated into immunostimulant complex (ISCOM). The toxicity of saponins is a critical factor for its usage as vaccine preparations. At first, in vivo and in vivo citoxicity assays were carried out to compare to the effects between saponins extracted from Quillaja brasiliensis and the immunostimulant saponins already known from Quillaja saponaria (Quil A). Imunoadjuvant potential of soluble saponins from Q. brasilienis was evaluated using preparations of two antigens: ovoalbumin (OVA) and bovine viral diarrhea (BVD). As a next step, imunoadjuvant activity of ISCOMS prepared with Q. brasiliensis saponins was evaluated using two routes of administration. The immunomodulatory potential of these saponins was tested during in vivo cell recruitment assays and gene expression related to immune system. Our results demonstrated that Q. brasilienis saponins are less toxic than those from Quil A and presenting similar adjuvant activity, characterized by a Th1/Th2 balance profile. Q.brasiliensis induced a strong Th1 cell-mediated immune responses indicated by a robust delayed type hypersensitivity (DTH) as well as IFN-у and IL-2 production. The immune response induced by ISCOMs from Q. brasiliensis saponins was higher than the one induced by soluble saponins. In vivo experiments indicated that saponins from Q. brasiliensis generate an immunocompetent environment at the injection site and draining lymph nodes. This environment was characterized by an intense cell influx (neutrophils, NK cells, dendritic cells, B and T cells) as well as differential gene expression related to immune system activation. In essence, the results showed that saponins from are safe and their adjuvant potential was equivalent to saponins with imunoadjuvant activity of Q. saponaria.

O Trypanosoma cruzi é um protozoário flagelado agente causador da Doença de Chagas, patologia endêmica da América Latina. Tripomastigotas de T. cruzi expressam em sua superfície celular glicoproteínas denominadas Tc-85 e pertencentes à superfamília gp85/trans-sialidase. Vários membros desta superfamília têm sido implicados na invasão das células hospedeiras pelo T. cruzi e componentes da matriz extracelular, como fibronectina e laminina, foram descritos como alguns de seus ligantes. Utilizando a técnica de phage display, a seqüência GGIALAG foi identificada por ligar-se especificamente e de uma forma dose-dependente ao H3.3p, uma proteína recombinante que corresponde a um fragmento interno de um membro clonado da Tc85 (Tc85-11). A análise através de alinhamento identificou o receptor de procineticina 2 (PKR2) como candidato putativo. Os receptores de procineticina (PKR1 e PKR2) são expressos em muitos tecidos e estruturalmente são membros da família da rodopsina, com sete domínios transmembranares e sítios putativos para modificações pós-traducionais. Os ligantes, as procineticinas 1 e 2, são peptídeos envolvidos em uma variedade de processos biológicos, tais como angiogênese, hematopoiese, diferenciação de monócitos, ativação de macrófagos, sobrevida neuronal, ativação do bulbo olfatório, motilidade gastrointestinal, nocicepção, ritmo circadiano, coordenação do comportamento circadiano e sua fisiologia e na função reprodutiva. Com o objetivo de verificar se os PKRs poderiam ser receptores de Tc85, foi utilizada a linhagem epitelial MCF10A, derivada de células mamárias humanas, que expressam PKR2 e PKR1, avaliado pelas técnicas de imunofluorescência, Western Blot e RT-PCR. A estratégia envolveu ensaios de ligação da proteína recombinante H3.3p e ensaios de inibição da invasão por T. cruzi em células MCF10A utilizando anticorpo anti-PKR2 ou um peptídeo sintético com a sequência GGIALAG. Este trabalho mostrou que 1. H3.3p se liga à superfície de MCF10A, detectado por imunofluorescência indireta, utilizando anticorpo monoclonal G1/G8 (que reconhece H3.3p); 2. H3.3p se liga a uma banda de ~45 kDa em um extrato de MCF10A, observado em um blot de nitrocelulose (\"overlay\") 3. O peptídeo sintético GGIALAG inibe a ligação do H3.3p à banda de ~45 kDa do extrato de MCF10A, região reconhecida pelo anticorpo anti-PKR2; 4. Os antígenos reconhecidos por anticorpos anti-PKR2 e anticorpos anti-GGIALAG colocalizam na superfície da célula MCF10A, avaliada por microscopia confocal; 5. Anticorpos anti-PKR2 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 6. O peptídeo sintético GGIALAG (0,2mM) inibe até ~ 40% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi; 7. Anticorpos anti-PKR1 inibem até ~ 60% da infecção de MCF10A pelo T. cruzi. Em conjunto, e aliado ao fato de PKRs serem expressos numa grande variedade de tecidos e órgãos, incluindo alguns classicamente alvo de T. cruzi, os dados sugerem que PKRs são ligantes para T. cruzi durante a infecção. Os dados sugerem ainda que a seqüência de aminoácidos GIALAG, presente em PKR2 estaria envolvida neste processo. / Trypanosoma cruzi is a flagellated protozoan causing Chagas\' disease. Trypomastigotes, an infective stage of T. cruzi, express at the cell surface members of Tc85, glycoproteins that belong to the gp85/trans-sialidase gene superfamily. Several members of the superfamily have been implicated in the invasion of host cells by T. cruzi and components of the extracellular matrix, as fibronectin and laminin, were described as their ligands. Using the phage display technique, a sequence (GGIALAG) was identified that specifically binds in a dose-dependent manner to H3.3p, a recombinant protein corresponding to an internal fragment of a cloned member of Tc-85. Alignment analysis identified the prokineticin receptor 2 (PKR2), as a putative candidate. Prokineticin receptors (PKR1, PKR2) are expressed in many tissues and are members of the rhodopsin family, with seven transmembrane domains and putative post-translational modifications. The ligands, prokineticins 1 and 2, are peptides involved in a variety of biological processes, such as angiogenesis, hematopoiesis, monocyte diferentiation, neuronal survival, machophage activation, olfactory bulb activation, gastrointestinal motility, pain sensitization, circadian rhythm and coordination of circadian behavior and physiology, as well as in reproduction function. In order to verify whether PKRs may be Tc85 receptors, MCF10A, a human mammary epithelial cell line, which expresses PKRs, as assessed by indirect immunofluorescence, Western Blot and RT-PCR, was employed as host cell. The strategy involved binding assays of H3.3p to MCF10A and invasion assay of MCF10A by T. cruzi in the presence of the synthetic peptide GGIALAG or in the presence of anti-PKR1, anti-PKR2 and anti-GGIALAG antibodies. This work shows that: 1. H3.3p binds to the surface of MCF10A; 2. H3.3p binds to a ~45 kDa band in a nitrocellulose blot of MCF10A cell extract (overlay); 3. The synthetic peptide GGIALAG inhibits the binding of H3.3p to the ~45 kDa band of MCF10A cell extract in the same region recognized by anti-PKR2 antibody; 4. The antigens recognized by anti-PKR2 antibody and by anti-GGIALAG antibody co-localize at the cell surface of MCF10A; 5. Anti-PKR2 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; 6. The synthetic peptide GGIALAG (0.2 mM) inhibits by ~40% the infection of MCF10A by T. cruzi. 7. Anti-PKR1 antibody inhibits by ~60% the infection of MCF10A by T. cruzi; Altogether, and supported by the fact that PKR2 is widely expressed, including some classical targets of T. cruzi, the data herein indicate a possible role of PKR2, in particular the amino acid sequence GGIALAG, as a ligand for T. cruzi infection.