Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Sabendo da importÃncia de cÃlulas de mamÃferos em cultura para avaliar a citotoxicidade de novas substÃncias com aÃÃo terapÃutica, o presente trabalho determinou, inicialmente, a atividade citotÃxica por MTT e hemolÃtica de 7 diterpenos clerodanos (Ãcido hardiwickiico, casearinas L, O, U e sua forma degradada, e casearinas X e Y) isolados a partir das folhas de Casearia sylvestris frente a um painel de 9 linhagens de cÃlulas tumorais e a eritrÃcitos de camundongos. Na ausÃncia de hemÃlise de todos os diterpenos, a Casearina U (Cas U) mostrou ser o mais ativo contra cÃlulas tumorais. A atividade citotÃxica da Cas U parece depender do anel formado pelos carbonos C-18 e C-19, uma vez que a hidrÃlise Ãcida e sua abertura levam à diminuiÃÃo ou perda total da bioatividade. Posteriormente, os estudos de mecanismo de aÃÃo com a Cas U (0,4; 0,8 e 1,6 Âg/mL) revelaram reduÃÃo concentraÃÃo-dependente na viabilidade celular por azul de tripan e na sÃntese de DNA por incorporaÃÃo de BrdU, sendo o mecanismo antiproliferativo da Cas U independente de aÃÃo inibitÃria sobre a topoisomerase I. As anÃlises morfolÃgicas feitas por hematoxilina/eosina e por incorporaÃÃo de brometo de etÃdio/laranja de acridina mostraram alteraÃÃo no padrÃo de morte em favorecimento da necrose proporcional à concentraÃÃo, como desintegraÃÃo membranar e picnose nuclear (1,6 Âg/mL), embora tenha ocorrido tambÃm retraÃÃo celular, condensaÃÃo e fragmentaÃÃo da cromatina nucleares (0,4 e 0,8 Âg/mL), sinais condizentes com apoptose. Nos ensaios de fragmentaÃÃo do DNA por citometria de fluxo e de genotoxicidade por cometa, a atividade da Cas U foi concentraÃÃo-dependente e sem diferenciaÃÃo entre cÃlulas normais (linfÃcitos perifÃricos humanos) e cancerosas (HL-60). A avaliaÃÃo antitumoral (10 e 25 mg/kg/dia, intraperitoneal; 25 mg/kg/dia, oral) em camundongos transplantados com Sarcoma 180 revelou atividade apenas na maior dose via intraperitoneal, causando reduÃÃo de 90 % do crescimento tumoral e alteraÃÃes renais incipientes e reversÃveis, enfatizando a potencialidade da Cas U como molÃcula modelo para a sÃntese de novos compostos com propriedades anti-cÃncer. / Knowing the importance of mammalian cell culture in evaluating the cytotoxicity of new substances with therapeutic action, this work initially examined the cytotoxicity (by MTT assay) and hemolytic activity of 7 clerodane diterpenoids (acid hardiwickiico, casearins L, O and U and its degradation product, and casearins X and Y) isolated from leaves of Casearia sylvestris against a panel of 9 tumor cell lines and on mouse erythrocytes. All diterpenes studied showed no hemolytic effect, while casearin U (Cas U) was found to be the most active against tumor cells. Cytotoxic activity of Cas U seems to depend on the ring structure formed by carbons C-18 and C-19, since acid hydrolysis and ring opening led to a decrease or total loss of bioactivity. Subsequently, studies on the mechanism of action of Cas U (0.4, 0.8 and 1.6 Âg/mL) revealed a concentration-dependent decrease in cell viability as determined by trypan blue dye exclusion and in DNA synthesis assayed by BrdU incorporation, where this antiproliferative mechanism of Cas U was not found to be dependent on an inhibitory action on topoisomerase I. Morphological analysis assessed by hematoxylin/eosin and ethidium bromide/acridine orange staining showed alterations in the pattern of cell death toward necrosis according to concentration, as seen by membrane disintegration and pyknotic nuclei (1.6 Âg/mL). However, there also were cell volume reduction, and condensation and fragmentation of nuclear chromatin, consistent signs with apoptosis. DNA fragmentation was examined by flow cytometry and genotoxicity determined with the comet assay, and Cas U activity was found to be dependent on concentration but did not differ between normal (human peripheral lymphocytes) and malignant (HL-60) cells. Antitumor activity of Cas U was tested in mice transplanted with sarcoma 180 (10 and 25 mg/kg/day, intraperitoneally; 25 mg/kg/day, orally), and only the highest intraperitoneal dose was found to effective, leading to 90 % inhibition of tumor growth, with reversible changes in the kidneys. These findings point to the potential of Cas U as a model molecule to synthesize new compounds with anticancer properties.

Submitted by Marlene Santos (marlene.bc.ufg@gmail.com) on 2016-07-13T18:41:03Z No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcos Túlio da Silva - 2016.pdf: 959423 bytes, checksum: a4fe5ae93a1e4702d47417018019a577 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-07-14T13:56:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcos Túlio da Silva - 2016.pdf: 959423 bytes, checksum: a4fe5ae93a1e4702d47417018019a577 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-14T13:56:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação - Marcos Túlio da Silva - 2016.pdf: 959423 bytes, checksum: a4fe5ae93a1e4702d47417018019a577 (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-05-13 / The genus Copaifera it belongs to the family Fabaceae, this genus it has 72 species distributed in tropical regions of America and West Africa. In Brazil there are 16 endemic species, highlighting: Copaifera officinalis L., Copaifera reticulata Ducke, Copaifera multijuga Hayne, Copaifera confertiflora Benth., Copaifera langsdorffi Desf., Copaifera coriacea Mart. and Copaifera cearensis Huber ex Ducke, as the most studied. Of The trunk of Copaiferas extracted an oil-resin which is attributed anti-inflammatory actions, antimicrobial, healing ulcers and wounds in general. In the chemical composition of copaiba oil-resin stand out a volatile fraction mainly composed of sesquiterpene and sesquiterpene hydrocarbons and oxygenates a resinous fraction consisting of diterpene acids. The lack of effective parameters to characterize and therefore realize the quality control, linked to the intrinsic chemical variability of oil-resin undertake the commercialization of this raw material for pharmaceutical industry. Among the most studied species, the Copaifera multijuga Hayne, known as copaíba, mari mari, purple copaíba, is used for its anti-inflammatory properties and was the subject of this study this work. This study aimed to characterize oils-resins of C. multijuga through physical and chemical methods, aiming at quality control parameters. The Chapter 1 presents the chemical variability of the essential oil obtained from 11 specimens of oil-resin of C.multijuga collected in Santarém / Pará, analyzed by GC-MS; analysis of physical parameters (density, refractive index and viscosity) and chemical (identification and quantification of β-caryophyllene marker HPLC) in the oils-resins samples, essential oil analysis from oil-resin as well as the isolation and identification of diterpenes in a sample oil-resin of C. multijuga. The density and the refractive index remained constant while the viscosity ranged between specimens. The β-caryophyllene content identified and quantified by HPLC ranged from 22.4 to 75.1%. In the essential oil, the major compounds were β-caryophyllene, the α-humuleno and multivariate statistical analyzes grouped the 11 specimens in two clusters in relation to compounds, δ-elemene, α-copaene, β-caryophyllene, α-humuleno, trans-cadina-1(6),4-diene and trans-4-muurola(14),5-diene. Statistical analysis realized out showed a high chemical variability between individuals of the same species of C. multijuga even the samples have been collected close to each other and in the same period of year. The diterpenes isolates of oil-resin of C. multijuga were the copalic acid, 3-hydroxy-copalic, 3-acetoxy-copalic and ent-agático. / O gênero Copaifera pertence à família Fabaceae e possui 72 espécies distribuídas em regiões de clima tropical da América e África Ocidental. No Brasil existem 16 espécies endêmicas, destacando-se pela maior ocorrência: Copaifera officinalis L., Copaifera reticulata Ducke, Copaifera multijuga Hayne, Copaifera confertiflora Benth., Copaifera langsdorffi Desf., Copaifera coriacea Mart. e Copaifera cearensis Huber ex Ducke. Do tronco das Copaiferas se extrai um óleo-resina a qual se atribuí ações anti-inflamatória, antimicrobiana, cicatrizante de úlceras e feridas em geral. Na composição química do óleo-resina de copaíba destacam-se uma fração volátil composta principalmente por hidrocarbonetos sesquiterpênicos e sesquiterpenos oxigenados e uma fração resinosa composta por diterpenos ácidos. A carência de parâmetros eficazes para caracterizar e, por conseguinte realizar o controle de qualidade, atrelado à variabilidade química intrínseca do óleo-resina comprometem a comercialização dessa matéria-prima para indústria farmacêutica. Dentre as espécies mais estudadas, a Copaifera multijuga Hayne, conhecida como copaíba, mari mari, copaíba roxa, é utilizada pelas suas propriedades anti-inflamatórias e foi objeto desse estudo. Este trabalho teve como objetivos caracaterizar óleos-resinas de C. multijuga por métodos físicos e químicos, visando parâmetros que possam ser utilizados no controle de qualidade. O capítulo 1 apresenta as variabilidade química do óleo essencial obtido do óleo-resina de 11 espécimes de C. multijuga coletados em Santarém/Pará, analisados por CG-EM; a análise de parâmetros físicos (densidade, índice de refração e viscosidade) e químicos (identificação e quantificação do marcador β-cariofileno por CLAE) bem como análise do óleo essencial, o isolamento e identificação de diterpenos de uma amostra de óleo-resina de C. multijuga. A densidade e o índice de refração se mantiveram constantes enquanto que a viscosidade variou entre os espécimes. O teor de β-cariofileno identificado e quantificado por CLAE variou de 22,4 a 75,1%. No óleo essencial, os compostos majoritários foram o β-cariofileno, o α-humuleno e as análises estatísticas multivariadas agruparam os 11 espécimes em dois clusters em relação aos compostos δ-elemeno, α-copaeno, β-cariofileno, α-humuleno, trans-cadina-1(6),4-dieno, trans-muurola-4(14),5-dieno. As análises estatísticas realizadas mostraram uma alta variabilidade química entre indivíduos da mesma espécie de C. multijuga, mesmo as amostras tendo sido coletadas próximas uma das outras e na mesma época do ano. Os diterpenos isolados do óleo-resina de C. multiuga foram o ácido copálico, 3-hidróxi-copálico, o 3-acetóxi-copálico e o ent-agático.

Croton (Euphorbiaceae), é um gênero promissor para pesquisa de compostos bioativos, tanto pela variedade de compostos químicos encontrados, quanto pela diversidade de uso na medicina tradicional/popular. Estudos farmacológicos comprovaram atividades antimicrobianas, antivirais, anti-inflamatórias, antioxidantes e citotóxicas. Neste trabalho, foram obtidos extratos fracionados em Soxhlet (hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol) de folhas e caules de C. pallidulus Baill var. pallidulus (Baill.) L.B. Smith & S.F. Smith. Esses extratos foram avaliados quanto às atividades 1) antibacteriana pelo método de microdiluição em caldo, utilizando Staphylococcus aureus - cepas sensível e resistente à vancomicina, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Salmonella choleraesuis; 2) antioxidante (sequestro do radical livre DPPH); e quanto à toxicidade frente à Artemia salina. A fração mais ativa neste último ensaio foi selecionada para a avaliação da atividade citotóxica utilizando as células de sarcoma uterino humano. Os fenóis totais, e flavonóis e flavonas totais foram quantificados por métodos colorimétricos. O fracionamento dos extratos hexânico e diclorometânico foi feito por cromatografia em coluna de sílica, enquanto o dos extratos de acetato de etila e metanol, em coluna de PVPP. O isolamento das substâncias das frações ativas nos ensaios de atividade antibacteriana (S. aureus - sensível) e de toxicidade frente à A. salina foi realizado por CLAE semipreparativo. O teor de fenóis totais de C. pallidulus var. pallidulus foi de 1,95 g EAG/100g MS e de flavonóis e flavonas totais foi de 0,56 g EQ/100g MS. Todos os extratos apresentaram atividade contra S. aureus (sensível e resistente), com CBM de 2048 mg/L, exceto o extrato metanólico que apresentou atividade apenas contra S. aureus (sensível). Nenhum extrato apresentou atividade contra as demais cepas. As frações FH-5A - hexano (CBM de 256mg/L) e FA-7 - acetato de etila (CBM de 1024mg/L) foram as que apresentaram maior atividade antibacteriana. A fração FH-5A foi separada em coluna de sílica, e suas subfrações apresentaram atividades antibacterianas menores que a fração que lhe deu origem. Das sete substâncias majoritárias isoladas da fração FA-7, nenhuma apresentou atividade antibacteriana. Seis delas são flavonoides: três C-glicosídeos de apigenina, um O-glucosídeo de campferol, um O-galactosídeo de isoramnetina e um O-rutinosídeo de isoraminetina. Apenas o extrato diclorometânico apresentou atividade no ensaio de toxicidade frente à A. salina, com CL50 de 385mg/L. A fração com maior toxicidade foi a FD-4A, com CL50 de 101mg/L. As substâncias mais abundantes nesta fração foram isoladas e identificadas como 8,9-secocauranos, derivados da kongensina F. Quanto a atividade citotóxica, a atividade de FD-4A foi três vezes maior que a atividade do extrato diclorometânico. Os extratos de acetato de etila e de metanol apresentaram os maiores valores de atividade antioxidante: 12,11 e 11,77 gEQ/100g, respectivamente. Verificou-se que os flavonoides foram as substâncias fenólicas que mais influenciaram na atividade antioxidante das frações dos extratos de acetato de etila e de metanol. Com esses resultados verifica-se que C. pallidulus var. pallidulus possui ação antibacteriana, citotóxica e antioxidante, sendo uma potencial fonte para novos fármacos para tratamento de doenças infecciosas e câncer. Conseguiu-se também isolar três 8,9-secocauranos, derivados da kongensina F, que aparentemente não haviam ainda sido descritos / Croton (Euphorbiaceae), is a promising genre for investigation of bioactive compounds, both for the variety of compouds, as for the diversity of use in traditional medicine. Pharmacological studies have demonstrated antimicrobial, antiviral, anti-inflammatory, cytotoxic, and antioxidant activities. In this study, fractionated extracts of leaves and stems of C. pallidulus Baill var. pallidulus (Baill.) L.B. S.F. Smith & Smith were obtained throught Soxhlet (hexane, dichloromethane, ethyl acetate and methanol). The following activities of these extracts were tested: 1) antibacterial activity, through microbroth dilution assay using: Staphylococcus aureus - sensitive and vancomycin-resistant strains, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Salmonella choleraesuis; 2) antioxidant activity (free radical DPPH scavenging) and Artemia salina toxicity evaluation. The most active fraction in the latter test was selected to evaluate the cytotoxic activity using human uterine sarcoma cells. The total phenols, and total flavonols and flavones were quantified by colorimetric methods. The fractionation of hexane and dichloromethane extracts was done through silica column chromatography, while PVPP column was used for the ethyl acetate and methanol extracts. The isolation of the active fractions major compounds in the antibacterial activity (S. aureus - sensitive) and A. saline toxicity assays were performed by semipreparative HPLC. The total phenolic content of C. pallidulus var. pallidulus was 1.95 g GAE/100g DM and total flavonols and flavones was 0.56 g QE/100g MS. All extracts showed activity against S. aureus (sensitive and resistant), with MBC of 2048 mg/L, except for the methanol extract, which showed activity only against S. aureus (sensitive). Extracts showed no activity against the other strains. Fractions FH-5A-hexane (MBC: 256mg/L) and FA-7-ethyl acetate (MBC: 1024mg/L) showed the highest antibacterial activity. The fraction FH-5A was separated on a silica column, and its subfractions showed smaller antibacterial activity than FH-5A. The seven major compounds isolated from the FA-7 fraction, showed no antibacterial activity. Six of them are flavonoids, three apigenin C-glycosides, one kaempferol O-glucoside, one isorhamnetin O-galactoside and one isorhamnetin O-rutinoside. Only the dichloromethane extract showed activity in the A. salina toxicity assay, LC50: 385mg/L. The fraction with the highest toxicity was the FD-4A, LC50: 101mg/L. The most abundant substances in this fraction were isolated and identified as 8,9 - secokauranes derived from kongensin F. As for the cytotoxic activity, the FD-4A activity was three times higher than the dichloromethane extract activity. The extracts of ethyl acetate and methanol showed the highest antioxidant activity: 12.11 and 11.77 gQE/100g, respectively. It was observed that flavonoids were the phenolic substances that most influenced the antioxidant activity of the fractions of the ethyl acetate and methanol extracts. With these results we suggest that C. pallidulus var. pallidulus has antibacterial activity, cytotoxic and antioxidant properties, being a potential source of new drugs for treatment of infectious diseases and cancer. We also isolated three 8,9-secokauranes derived from kongensin F, which apparently had not been described yet

Submitted by Fernando Bombarda Oda null (fer_oda@fcfar.unesp.br) on 2017-07-20T17:23:30Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_Fernando_Oda_Final.pdf: 7648101 bytes, checksum: f78680181e6caaa8a443897d877a8eae (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-07-21T18:30:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 oda_fb_me_arafcf_parc.pdf: 1138705 bytes, checksum: a9ec30f0d79f53facd0d1b055e2a1bc4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-21T18:30:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 oda_fb_me_arafcf_parc.pdf: 1138705 bytes, checksum: a9ec30f0d79f53facd0d1b055e2a1bc4 (MD5) Previous issue date: 2017-06-19 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Casearia sylvestris Swartz, conhecida como guaçatonga, está distribuída em todo Brasil e é muito utilizada na medicina popular, com registro etnofarmacológico desde 1877. Muitos desses usos, como o antiofídico, antiulcerogênico e antiinflamatório já foram comprovados em estudos farmacológicos, os quais mostraram também a baixa toxicidade aguda por via oral de seus derivados vegetais. Estudos in vivo revelaram que os diterpenos clerodânicos são os responsáveis pelas atividades antiulcerogênica e anti-inflamatória de C. sylvestris, o que valoriza ainda mais o uso medicinal desta planta. Entretanto, a constatação de que os diterpenos clerodânicos podem sofrer degradação em meio ácido levantaram dúvidas sobre quais substâncias realmente chegam aos receptores e têm atividade: diterpenos ou seus produtos de degradação? Para elucidar essa questão, os diterpenos clerodânicos isolados casearina J (cas J) e O (cas O) foram submetidos isoladamente à degradação ácida em fluido gástrico simulado sem enzimas (PDA) e, posteriormente, metabolizados com enzimas hepáticas da fração S9 (PDA-ME). A metabolização direta dos diterpenos com a fração S9 também foi realizada (PME). As respectivas casearinas remanescentes foram quantificadas em todos os produtos de metabolização. Posteriormente, foram conduzidos ensaios de síntese e/ou liberação de óxido nítrico em macrófagos RAW 267.7 estimulados por LPS in vitro. Para a determinação estrutural dos derivados formados foram utilizadas técnicas cromatográficas (CLAEDAD) e espectrométricas (CLUE-EM, RMN de 1H e 13C). Foram identificadas dez substâncias formadas após degradação ácida da cas J (PDA-J), além da casearina remanescente (5,05%) e seu epímero (PDA-J8). As estruturas propostas desses produtos resultaram da hidrólise do grupamento éster em C-18 (PDA-J1), hidrólise do grupamento éster em C-19 (PDA-J3), formação de dialdeído após quebra do anel diacetálico C (PDA-J2, majoritário), e adições nos grupos aldeídos do PDA-J2 de uma molécula de água (PDJ-7), uma (PDA-J4 e PDA-J4.1) ou duas de etanol (PDJ-5) e hidrólise do éster em C-18 do PDA-J2 (PDJ-6). Foram identificadas nove substâncias formadas após degradação ácida da cas O, além da casearina remanescente (13,1%). Suas estruturas resultaram da hidrólise dos grupos ésteres em C-18 (PDA-O1) e C-19 (PDA-O3), formação do dialdeído após quebra do anel C (PDA-O2, majoritário), adições nos grupos aldeídos do PDA-O2 de uma (PDA-O4 e PDA-O 4.1) ou duas moléculas de etanol (PDA-O5) e hidrólise do éster em C-7 do PDA-O2 (PDA-O5), além da hidrólise do grupamento esterificado em C-6 do PDA-O5 (PDA-O6 ou PDA-O6.1). A metabolização da cas J pela fração S9 gerou duas substâncias correspondentes à quebra do butanoato em C-18 (PME-J1) e formação do seu epímero (PME-J2), permanecendo 36,8% íntegra. Em relação à metabolização da cas O, 36,5% permaneceu íntegra, e ocorreu a formação de uma molécula após quebra dos substituintes esterificados em C-18 e C-19 (PME-O1) e de outra após a formação do dialdeído no anel C (PME-O2). As análises indicaram que as metabolizações enzimáticas dos PDA resultaram nas mesmas substâncias. Os ensaios em macrófagos estimulados por LPS in vitro mostraram que os produtos de degradação ácida e/ou metabolização enzimática das casearinas não têm atividade antiinflamatória in vitro na inibição da liberação e/ou produção de NO, igualmente às casearinas J e O íntegras. / Casearia sylvestris Swartz known as guaçatonga is distributed throughout Brazil and has been widely used in folk medicine since 1877. Many of these uses, such as anti-fungal, antiulcerogenic and anti-inflammatory, have already been proven in pharmacological studies, also demonstrating low acute oral toxicity. In vivo studies have shown that clerodane diterpenes are responsible for the antiulcerogenic and antiinflammatory activities of C. sylvestris, which further enhances the medicinal use of this plant or its derivatives. However, the finding that clerodane diterpenes may suffer degradation in acid medium have raised doubts about the actual substances reached the receptors and carry out activity: diterpenes or their degradation products? In order to elucidate this issue, purified clerodane diterpenes casearin J (cas J) and O (cas O) were subjected to acid degradation in simulated gastric fluid without enzymes (PDA) alone and subsequently metabolized with S9 fraction (PDAME) liver enzymes. A direct metabolization of diterpenes with a S9 fraction (PME) was also performed. Respective remaining casearins were quantified in all the metabolizing products. In the end, macrophage stimulated by LPS in vitro assays of nitric oxide synthesis were conducted using as sample the purified cas J and O, PDA, PME and PDAME. Chromatographic (HPLC-PDA) and spectrometric techniques (UPLC-PDA-MS, 1H and and 13C NMR) were used for the structural determination of the generated derivatives. Ten substances were identified after the acid degradation of cas J (PDA-J), in addition to the remaining casearin (5.05%) and its epimer. Proposed structures of these compounds result of ester group hydrolysis in C-18 (PDA-J1), and in C-19 (PDA-J7), dialdehyde formation after diacetal C ring breaking (PDA-J2, majority), and additions in the aldehyde groups of the PDA-J2 of a water molecule (PDJ-3), one (PDA-J4 and PDA-J4.1) or two ethanol molecules (PDJ-5) and ester hydrolysis in C-7 of PDA-J2 (PDJ-6). Besides the remaining cas O (13.1%), nine compounds were identified after acid degradation. Their structures result of hydrolysis of the esterified groups in C-18 and C-19 (PDA-O1), dialdehyde formation after C-ring rupture (PDA-O2, majority), additions in the PDA-O2 aldehyde groups of one (PDA-O3 and PDA -O3.1) or two ethanol molecules (PDA-O4) and ester hydrolysis at C-6 (PDA-O5). Metabolization of casearin J by the S9 fraction generated two substances corresponding to the breakdown of n-butanoate in C-18 (PME-J1) and formation of cas J epimer (PME-J2), remaining 36.8% intact. In relation to the metabolization of casearin O, 36.5% remained intact and one molecule was formed after breaking the esterified substituents in C-6 and C-7 (PME-O1) and the other after the formation of dialdehyde at C ring (PME-O2). The analyzes indicated that the enzymatic metabolism of the PDA resulted in the same substances. In vitro LPS stimulated macrophage assays have shown that PDA and PME do not have in vitro anti-inflammatory activity of NO inhibition, as well as intact J and O casearins. / CNPq: 130329/2015-0

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O diterpeno, lactona do Ãcido hawtriwaico (LAHT) isolado dos capÃtulos florais de Egletes viscosa Less. (Asteraceae) foi avaliado nos modelos de edema de orelha e nocicepÃÃo induzida por capsaicina em camundongos. A LAHT (12,5; 25 e 50 mg/kg, v.o.) atenuou significativamente a resposta ao edema de orelha induzido pela aplicaÃÃo tÃpica de capsaicina (250 Âg), de maneira dose dependente (45,7; 86,9 e 100 % respectivamente). A resposta ao edema de orelha induzido pela capsaicina foi tambÃm significativamente inibida em 74,8 % pelo vermelho de rutÃnio (VR; 3mg/kg, s.c.), um antagonista nÃo competitivo do receptor da capsaicina (TRPV1). A LAHT (50 mg/kg, v.o.) nÃo modificou a resposta ao edema de pata induzido por composto 48/80 (10 Âg), histamina (10 Âg) ou serotonina (10 Âg), demonstrando que a LAHT nÃo bloqueia a desgranulaÃÃo de cÃlulas mastocitÃrias ou os receptores de histamina e serotonina. No entanto, o edema de pata induzido por substÃncia P (SP) foi significativamente suprimido pela LAHT (25 e 50 mg/kg, v.o.), em 29,4 e 53,3 % respectivamente, bem como o aumento da permeabilidade capilar induzido pela injeÃÃo intraperitoneal de Ãcido acÃtico. No modelo de nocicepÃÃo, a LAHT (12,5; 25 e 50 mg/kg, v.o.) suprimiu de forma significativa o comportamento nociceptivo de lamber a pata induzido pela injeÃÃo intraplantar de 1,6 Âg de capsaicina (27,1; 32,3 e 52 % respectivamente). A resposta à nocicepÃÃo induzida pela capsaicina foi significativamente inibida pelo VR (3 mg/kg, s.c.) em 64,9 %. O efeito antinociceptivo da LAHT (50 mg/kg, v.o.) nÃo foi afetado pelo prÃ-tratamento por naloxona, mas foi significativamente antagonizado pela teofilina e glibenclamida, respectivos bloqueadores de adenosina e canais de KATP dependentes. A LAHT (50 mg/kg, v.o.) nÃo alterou o tempo de sono, nÃo prejudicou a atividade locomotora e nÃo alterou a coordenaÃÃo motora dos camundongos como evidenciado nos testes do tempo de sono induzido por pentobarbital, do campo aberto e rota-rod respectivamente. Esses dados sugerem que a LAHT inibe a inflamaÃÃo neurogÃnica aguda, possivelmente pela inibiÃÃo da liberaÃÃo de SP ou bloqueio de seus receptores, e a nocicepÃÃo possivelmente pelo envolvimento de adenosina endÃgena e canais de KATP dependentes / The diterpene, 12-acetoxy-hawtriwaic acid lactone (AHAL) isolated from the flower buds of Egletes viscosa Less. (Asteraceae), a popular medicinal plant largely encountered in Cearà State was evaluated in mice for its anti-inflammatory and antinociceptive potential, using capsaicin-induced ear edema and hindpaw nociception as experimental models. AHAL (12.5, 25 and 50 mg/kg, p.o.) significantly attenuated the ear edema response to topically applied capsaicin (250Âg), in a dose-related manner (45.7, 86.9 and 100 % respectively). This response to capsaicin was also greatly inhibited by ruthenium red (3 mg/kg, s.c.), a non-competitive capsaicin receptor (TRPV1) antagonist by 74.8%. The anti-edema effect of AHAL (50 mg/kg, p.o.) seems unrelated either to inhibition of mast cell degranulation or to antagonism at histamine and serotonin receptor since AHAL did not modify the paw edema response-induced by intraplantar injections of compound 48/80 (10 Âg), histamine (10 Âg) or serotonin (10 Âg). However the substance P (SP) induced hindpaw edema was significantily inhibited by AHAL (25 and 50 mg/kg, p.o.) by 29.4 and 53.3 % respectively, as well as the increase in capillary permeability induced by intra-peritoneal acetic acid. In the hindpaw nociceptive model, AHAL suppressed the nocifensive paw-licking behavior induced by intraplantar injection of capsaicin (1.6 Âg). This response to capsaicin was also greatly inhibited by ruthenium red (3 mg/kg, s.c.) by 64.9 %. The antinociceptive effect of AHAL (50 mg/kg, p.o.) was unaffected by naloxone pre-treatment but was significantly antagonized by theophylline and glibenclamide, the respective blockers of adenosine receptor and KATP-sensitive channels. AHAL (50 mg/kg, p.o.) did not impair the ambulation or motor coordination of mice in open-field and rota-rod tests. These data allow us to conclude that AHAL possesses anti-inflammatory and antinociceptive properties. It possibly inhibits acute neurogenic inflammation by the inhibition of SP release or its receptor blockade and the nociception through mechanisms that involve the endogenous adenosine and opening of ATP-sensitive potassium channels

This work describes the isolation and structural elucidation of some chemical constituents as well as antioxidant, anticholinesterasic and skin anti-inflammatory activities of extracts and some of the isolated compounds from Coutarea hexandra (Jacq.) K. Schum. (Rubiaceae). In the antioxidant assays, extracts from roots and leaves, when compared to positive controls used, free scavenger radical and inhibited the formation of peroxide of the linoleic acid. In the anticholinesterase and anti-inflammatory assays, at 0.6 mg/ear, some extracts from roots were effective in inhibiting the effects of the anticholinesterase enzyme and the formation of ear edema. The phytochemical investigation of some active extracts from roots resulted in the isolation of three phytosteroids (sitosterol, stigmasterol and sitostenone), a diterpene (2β,3α-dihydroxy-11-oxo-ros-5-ene), two triterpenes (2β,3α-dihydroxy-11,16-dioxo- 5-ene-octanor-cucurbitacin and 23,24-diidrocucurbitacin F 25-acetate) and five 4-phenylcoumarin derivatives [5,7,8-trimethoxy-4-(3,4-dihydroxyphenyl)coumarin, 5-hydroxy-7-methoxy-4-(p-hydroxyphenyl)-coumarin, 5,7,8-trimethoxy-4-(p-methoxyphenyl)coumarin, 5,7-dimethoxy-4-(3-hydroxy-4-methoxyphenyl)coumarin,and 5,7-dimethoxy-4-(p-methoxyphenyl) coumarin]. These compounds had their structures elucidated based on their NMR spectral data and by comparison with literature data. Among isolated compounds, 2β,3α-dihydroxy-11,16-dioxo-5-ene-octanorcucurbitacin and 2β,3α-dihydroxy-11-oxo-ros-5-ene are being reported for the first time; 5-hydroxy-7-methoxy-4-(p-hydroxyphenyl)coumarin are being described for the first time as natural product and 5,7,8-trimethoxy-4-(3,4-dihydroxy-phenyl)coumarin occur for the first time in the Coutarea genus. In the anti-inflammatory assays, 5,7-dimethoxy-4-(pmethoxyphenyl) coumarin, 5-hydroxy-7-methoxy-4-(p-hydroxyphenyl) coumarin, 5,7-dimethoxy-4-(3-hydroxy-4-methoxy-phenyl)coumarin and 23,24-dihydro-cucurbitacin F 25-acetate, at 0.6 mg/ear, inhibited the edema by 35, 67, 19 and 30%, respectively. In the DPPH assays, 5-hydroxy-7-methoxy-4-(p-hydroxyphenyl)coumarin (43.70 0.21 μg/mL) and 5,7,8-trimethoxy- 4-(3,4-dihydroxyphenyl)coumarin (20.85 0.53 μg/mL) free scavenger radical with IC50 values comparable to ascorbic acid and gallic acid, respectively. In the anticholinesterase assays, 2β,3α-dihydroxy-11-oxo-ros-5-ene showed inhibition of this enzyme. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O presente trabalho descreve o isolamento e a elucidação estrutural de alguns constituintes químicos, bem como das atividades antioxidante, anticolinesterásica e antiinflamatória cutânea de extratos das raízes, folhas e cascas do caule de Coutarea hexandra (Jacq.) K. Schum. (Rubiaceae), bem como de algumas das substâncias isoladas. Nos ensaios para avaliar atividade antioxidante, extratos das raízes e folhas forneceram os melhores resultados e alguns dos extratos das raízes foram eficazes em inibir o efeito da enzima acetilcolinesterase e a formação do edema de orelha induzido pelo óleo de cróton, na concentração de 0,6 mg/orelha. A investigação fitoquímica efetuada com extratos das raízes resultou na obtenção de três fitoesteróides (sitosterol, estigmasterol e sitostenona), dois triterpenos (2β,3α-dihidroxi-11,16-dioxo-5-eno-octanorcucurbitacina e 25-acetato da 23,24-diidrocucurbitacina F), um diterpeno (2β,3α-diidroxi-11-oxo-ros-5-eno) e cinco derivados 4-fenilcumarínicos [5-hidroxi-7-metoxi-4-(p-hidroxifenil)cumarina, 5,7,8-trimetoxi-4-(pmetoxifenil) cumarina, 5,7-dimetoxi-4-(3-hidroxi-4-metoxifenil)cumarina, 5,7-dimetoxi-4-(pmetoxifenil) cumarina e 5,7,8-trimetoxi-4-(3,4-dihidroxifenil) cumarina]. Estes compostos tiveram suas estruturas elucidadas com base na análise dos dados de RMN e pela comparação com dados da literatura. Dentre as substâncias isoladas, o triterpeno 2β,3α-diidroxi-11,16-dioxo-5-eno-octanorcucurbitacina e o diterpeno 2β,3α-diidroxi-11-oxo-ros-5-eno estão sendo relatados pela primeira vez; a 5-hidroxi-7-metoxi-4-(p-hidroxifenil)cumarina está sendo descrita pela primeira vez como produto natural e a 5,7,8-trimetoxi-4-(3,4-diidroxifenil) cumarina ocorre pela primeira vez no gênero Coutarea. Nos ensaios antiinflamatórios, as substâncias 5,7-dimetoxi-4-(p-metoxifenil)cumarina, 5-hidroxi-7-metoxi-4-(p-hidroxifenil)cumarina e 25-acetato de 23,24-diidrocucurbitacina F inibiram o edema por cerca de 35, 67 e 30%, respectivamente. Nos ensaios frente ao DPPH, tanto a 5-hidroxi-7-metoxi-4-(p-hidroxifenil)cumarina (43,70 0,21 μg/mL) quanto a 5,7,8-trimetoxi-4-(3,4-diidroxifenil)cumarina (20,85 0,53 μg/mL) seqüestraram radicais livres com valores de CI50 comparáveis aos do ácido ascórbico e do ácido gálico, respectivamente. Nos ensaios anticolinesterásicos, o diterpeno 2β,3α-diidroxi-11-oxo-ros-5-eno inibiu a ação da enzima acetilcolinesterase.

Croton (Euphorbiaceae), é um gênero promissor para pesquisa de compostos bioativos, tanto pela variedade de compostos químicos encontrados, quanto pela diversidade de uso na medicina tradicional/popular. Estudos farmacológicos comprovaram atividades antimicrobianas, antivirais, anti-inflamatórias, antioxidantes e citotóxicas. Neste trabalho, foram obtidos extratos fracionados em Soxhlet (hexano, diclorometano, acetato de etila e metanol) de folhas e caules de C. pallidulus Baill var. pallidulus (Baill.) L.B. Smith & S.F. Smith. Esses extratos foram avaliados quanto às atividades 1) antibacteriana pelo método de microdiluição em caldo, utilizando Staphylococcus aureus - cepas sensível e resistente à vancomicina, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli e Salmonella choleraesuis; 2) antioxidante (sequestro do radical livre DPPH); e quanto à toxicidade frente à Artemia salina. A fração mais ativa neste último ensaio foi selecionada para a avaliação da atividade citotóxica utilizando as células de sarcoma uterino humano. Os fenóis totais, e flavonóis e flavonas totais foram quantificados por métodos colorimétricos. O fracionamento dos extratos hexânico e diclorometânico foi feito por cromatografia em coluna de sílica, enquanto o dos extratos de acetato de etila e metanol, em coluna de PVPP. O isolamento das substâncias das frações ativas nos ensaios de atividade antibacteriana (S. aureus - sensível) e de toxicidade frente à A. salina foi realizado por CLAE semipreparativo. O teor de fenóis totais de C. pallidulus var. pallidulus foi de 1,95 g EAG/100g MS e de flavonóis e flavonas totais foi de 0,56 g EQ/100g MS. Todos os extratos apresentaram atividade contra S. aureus (sensível e resistente), com CBM de 2048 mg/L, exceto o extrato metanólico que apresentou atividade apenas contra S. aureus (sensível). Nenhum extrato apresentou atividade contra as demais cepas. As frações FH-5A - hexano (CBM de 256mg/L) e FA-7 - acetato de etila (CBM de 1024mg/L) foram as que apresentaram maior atividade antibacteriana. A fração FH-5A foi separada em coluna de sílica, e suas subfrações apresentaram atividades antibacterianas menores que a fração que lhe deu origem. Das sete substâncias majoritárias isoladas da fração FA-7, nenhuma apresentou atividade antibacteriana. Seis delas são flavonoides: três C-glicosídeos de apigenina, um O-glucosídeo de campferol, um O-galactosídeo de isoramnetina e um O-rutinosídeo de isoraminetina. Apenas o extrato diclorometânico apresentou atividade no ensaio de toxicidade frente à A. salina, com CL50 de 385mg/L. A fração com maior toxicidade foi a FD-4A, com CL50 de 101mg/L. As substâncias mais abundantes nesta fração foram isoladas e identificadas como 8,9-secocauranos, derivados da kongensina F. Quanto a atividade citotóxica, a atividade de FD-4A foi três vezes maior que a atividade do extrato diclorometânico. Os extratos de acetato de etila e de metanol apresentaram os maiores valores de atividade antioxidante: 12,11 e 11,77 gEQ/100g, respectivamente. Verificou-se que os flavonoides foram as substâncias fenólicas que mais influenciaram na atividade antioxidante das frações dos extratos de acetato de etila e de metanol. Com esses resultados verifica-se que C. pallidulus var. pallidulus possui ação antibacteriana, citotóxica e antioxidante, sendo uma potencial fonte para novos fármacos para tratamento de doenças infecciosas e câncer. Conseguiu-se também isolar três 8,9-secocauranos, derivados da kongensina F, que aparentemente não haviam ainda sido descritos / Croton (Euphorbiaceae), is a promising genre for investigation of bioactive compounds, both for the variety of compouds, as for the diversity of use in traditional medicine. Pharmacological studies have demonstrated antimicrobial, antiviral, anti-inflammatory, cytotoxic, and antioxidant activities. In this study, fractionated extracts of leaves and stems of C. pallidulus Baill var. pallidulus (Baill.) L.B. S.F. Smith & Smith were obtained throught Soxhlet (hexane, dichloromethane, ethyl acetate and methanol). The following activities of these extracts were tested: 1) antibacterial activity, through microbroth dilution assay using: Staphylococcus aureus - sensitive and vancomycin-resistant strains, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli and Salmonella choleraesuis; 2) antioxidant activity (free radical DPPH scavenging) and Artemia salina toxicity evaluation. The most active fraction in the latter test was selected to evaluate the cytotoxic activity using human uterine sarcoma cells. The total phenols, and total flavonols and flavones were quantified by colorimetric methods. The fractionation of hexane and dichloromethane extracts was done through silica column chromatography, while PVPP column was used for the ethyl acetate and methanol extracts. The isolation of the active fractions major compounds in the antibacterial activity (S. aureus - sensitive) and A. saline toxicity assays were performed by semipreparative HPLC. The total phenolic content of C. pallidulus var. pallidulus was 1.95 g GAE/100g DM and total flavonols and flavones was 0.56 g QE/100g MS. All extracts showed activity against S. aureus (sensitive and resistant), with MBC of 2048 mg/L, except for the methanol extract, which showed activity only against S. aureus (sensitive). Extracts showed no activity against the other strains. Fractions FH-5A-hexane (MBC: 256mg/L) and FA-7-ethyl acetate (MBC: 1024mg/L) showed the highest antibacterial activity. The fraction FH-5A was separated on a silica column, and its subfractions showed smaller antibacterial activity than FH-5A. The seven major compounds isolated from the FA-7 fraction, showed no antibacterial activity. Six of them are flavonoids, three apigenin C-glycosides, one kaempferol O-glucoside, one isorhamnetin O-galactoside and one isorhamnetin O-rutinoside. Only the dichloromethane extract showed activity in the A. salina toxicity assay, LC50: 385mg/L. The fraction with the highest toxicity was the FD-4A, LC50: 101mg/L. The most abundant substances in this fraction were isolated and identified as 8,9 - secokauranes derived from kongensin F. As for the cytotoxic activity, the FD-4A activity was three times higher than the dichloromethane extract activity. The extracts of ethyl acetate and methanol showed the highest antioxidant activity: 12.11 and 11.77 gQE/100g, respectively. It was observed that flavonoids were the phenolic substances that most influenced the antioxidant activity of the fractions of the ethyl acetate and methanol extracts. With these results we suggest that C. pallidulus var. pallidulus has antibacterial activity, cytotoxic and antioxidant properties, being a potential source of new drugs for treatment of infectious diseases and cancer. We also isolated three 8,9-secokauranes derived from kongensin F, which apparently had not been described yet

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Xylopia nitida and Xylopia sericea are commonly known as âembira-brancaâ and âpimenta do sertÃoâ, respectively, belonging to Annonaceae family. The chromatographic analysis of X. nitida roots allowed isolation of a trachlyobane diterpene, ent-trachlyoban-18,19-diol and its acetylated product, ent-18,19-diacetoxy-trachylobane, a kaurene diterpene, ent-kaur-16-en-18,19-diol, two aporphinic alkaloids, 5,6,6a,7-tetrahydro-1-methoxy-(6aS)-4H-benzo[de][1,3]benzodioxolo[5,6-g]quinoline e xylopine, and a glucoside, named 1-O-ethyl-β-D-glucopiranose. Also using chromatographic analysis of X. sericea fruits were obtained a kaurane diterpene, kauran-16β-ol and a diterpenes mixture, ent-kaur-16-en-19-oic acid and beyer-15-19-oic acid. The structures of these compounds were elucidated by spectroscopic studies (IR, MS and NMR). In the second part of this work, has been showed the diffusion-ordered spectroscopy (DOSY) as a powerful tool in natural product mixture analysis. The assignment of NMR signals to specific components in a mixture is a challenging task. DOSY has provided important progress in this area, allowing the signals originating from individual components of different molecular sizes to be distinguished. However, when the sizes of the compounds are similar and/or the spectra are overlapped, signal assignment can easily become intractable. The use of a co-solute in a matrix-assisted DOSY (MAD) experiment can be a useful solution, improving diffusional (and sometimes spectral) resolution by exploiting selective binding to the matrix. The challenge is to apply MAD to molecules with high structural similarity, for example in natural product mixtures. Various surfactants, including SDS, AOT and CTAB have previously been shown to be effective in MAD analysis. Here we present an important addition, the Brij family of nonionic surfactants. We demonstrate the use of Brij micelles and other systems in mixed solvents with a variety of mixtures relevant to natural products. / Xylopia nitida e X. sericea, conhecidas popularmente como embira-branca e pimenta do sertÃo, respectivamente, sÃo espÃcies pertencentes à famÃlia Annonaceae. A anÃlise cromatogrÃfica dos extratos hexÃnico e etanÃlico das raÃzes de X. nitida possibilitou o isolamento de um diterpeno de esqueleto traquilobano, ent-traquiloban-18,19-diol e seu derivado acetilado, ent-18,19-diacetÃxi-traquilobano, um diterpeno de esqueleto caureno, ent-caur-16-en-18,19-diol, dois alcalÃides aporfÃnicos, 5,6,6a,7-tetraidro-1-metoxi-(6aS)-4H-benzo[de][1,3]benzodioxolo[5,6-g]quinolina e xylopina e um glicosÃdeo, 1-O-etil-β-D-glicopiranose, todos de carÃter inÃdito na literatura, exceto os dois Ãltimos. AtravÃs da anÃlise cromatogrÃfica do extrato hexÃnico dos frutos de X. sericea foi possÃvel obter um diterpeno de esqueleto caurano denominado cauran-16β-ol e uma mistura de diterpenos, Ãcido ent-caur-16-en-19-Ãico e Ãcido beier-15-en-19-Ãico. O isolamento dos constituintes quÃmicos presentes nos extratos da raiz e frutos de X. nitida e X. sericea, respectivamente, foi realizada por mÃtodos cromatogrÃficos convencionais e a determinaÃÃo estrutural das substÃncias isoladas foi realizada a partir de mÃtodos espectromÃtricos como: IV, EM, RMN 1H, 13C e DEPT 135 incluindo tÃcnicas bidimensionais como, COSY, HSQC e HMBC. A primeira parte deste trabalho relata o estudo quÃmico das raÃzes de X. nitida e dos frutos de X. sericea. A espectroscopia ordenada por difusÃo ou DOSY (Diffusion Ordered Spectroscopy) provà um meio para uma âseparaÃÃo virtualâ de compostos, atravÃs de um mapa bidimensional onde em um eixo temos o deslocamento quÃmico e em outro observamos o coeficiente de difusÃo (D) das molÃculas na mistura. A separaÃÃo de sinais somente à possÃvel quando espÃcies difundem a diferentes velocidades. Na quÃmica de produtos naturais, frequentemente nos deparamos com misturas de compostos quimicamente semelhantes e de tamanhos muito similares, o que torna limitado o experimento DOSY tradicional. Entretanto, o coeficiente de difusÃo das substÃncias pode ser modificado pela adiÃÃo de co-solutos e/ou co-solventes, surgindo a partir daà a espectroscopia ordenada por difusÃo assistida por matriz (matrix-assisted DOSY ou MAD). VÃrios surfactantes, incluindo SDS, AOT e CTAB tÃm se mostrado efetivos em anÃlises por MAD. Neste trabalho, experimentos MAD foram realizados com algumas misturas de produtos naturais com similaridades estruturais utilizando o Ãcido perfluoro-octanÃico (PFOA), polivinilpirrolidona (PVP) e os surfactantes Brij 78 e 98, que por sua vez, ainda nÃo haviam sido utilizados para esse propÃsito. NÃs tambÃm demonstramos a formaÃÃo de micelas de Brij 78 e 98 em misturas dos solventes DMSO-d6 e D2O.