Este estudo buscou avaliar o grau de qualidade da conservação de vacina nas Unidades de Atenção Primária à Saúde - UAPS da região Centro-Oeste do Estado de Minas Gerais. Para tal foi realizada uma pesquisa avaliativa em duas etapas. Na primeira foram utilizados critérios das dimensões, estrutura e processo para mensurar o grau de qualidade das 261 salas de vacina distribuídas nos 55 municípios da região e analisar a relação com o porte populacional e a adesão ao Sistema Único de Saúde. O grau de qualidade foi definido por meio de um sistema de escores, com pesos diferenciados para indicadores em cada dimensão avaliada. Foram definidas as categorias para o grau de qualidade: \"adequado\", \"não adequado\" e \"crítico\". Para verificar a relação entre o grau de qualidade e o porte populacional e adesão ao SUS utilizou-se o teste do qui-quadrado de Pearson. Na segunda etapa do trabalho foram selecionadas as salas de vacina que obtiveram 100% dos critérios selecionados na dimensão estrutura. Assim, foram eleitas 12 salas de vacina para a realização de entrevista semiestruturada com o enfermeiro, técnico/auxiliar de enfermagem e referência técnica em imunização com o propósito de compreender os fatores que dificultam o processo de conservação de vacinas nas UAPS. Na análise dos resultados observou-se que o grau de qualidade de conservação de vacina não está adequado em 59,3% e 26,9% apresentaram grau crítico de qualidade. Os municípios de pequeno porte habilitados na Gestão Plena da Atenção Básica concentraram as piores salas de vacina. A inexistência de profissional atualizado em sala de vacina foi um dos principais achados do estudo na dimensão estrutura o que compromete uma assistência de qualidade em sala de vacina. Na dimensão do processo de conservação de vacinas, o componente organização do refrigerador, principalmente na organização das vacinas quanto à termoestabilidade, apresentou pior escore de qualidade. O estudo apontou um desconhecimento dos enfermeiros e técnicos/auxiliares de enfermagem sobre os efeitos da baixa temperatura sobre as vacinas. O componente condutas frente à alteração de temperatura não foi bem avaliado, grande parte dos trabalhadores em sala de vacina não cumpre as orientações em caso do imunobiológico sofrer alterações de temperatura. Limitações também foram encontradas em relação à supervisão das atividades nas salas de vacina. O excesso de demanda para o enfermeiro e a deficiência na organização do processo de trabalho acabam prejudicando o cumprimento da função primeira do enfermeiro que é o gerenciamento do cuidar, aqui representado pelo cuidar em sala de vacina. O cuidado com a conservação de vacinas, que perpassa por uma série de atividades presente na práxis da enfermagem, aponta para a necessidade de capacitação dos recursos humanos, de monitoramento e avaliação do processo de trabalho e de novos estudos na área. / This study sought to assess the quality of vaccine storage in Primary Healthcare Centers - PHC in the mid-west area of the state of Minas Gerais. To this end a two- stage assessment study was carried out. In the first stage, dimensions, structures and processes were the criteria used to measure quality grades in 261 vaccine rooms distributed over 55 municipalities in the area and to analyze its relation to population size and adherence to the Unified Health System. Quality grades were defined by means of a scoring system, with different weighted scores attributed to indicators for each dimension being rated. Categories for quality grades were then defined as: \"adequate\", \"inadequate\" and \"critical\". Pearson\'s chi-square test was used to verify the correlation between quality grade and population size and adherence to the UHS. In the second stage of the investigation, vaccine rooms meeting 100% of the selected criteria in the structure dimension were selected. Thus, 12 vaccine rooms were selected for the conduction of semi-structured interviews with nurses, nursing assistants and technical immunization coordinators with the aim of shedding light on the factors which render vaccine storage in PHCs difficult. On analysis of the results, it was observed that vaccine storage quality grades are inadequate in 59.3% of these centers, and critical in 26.9%. Small-sized municipalities qualified for Full Basic Healthcare Management aggregated the worst vaccine rooms. With respect to the structure dimension, one of the main findings was absence of professionals with up-to-date knowledge on immunization in the vaccine rooms, which jeopardizes the delivery of quality healthcare assistance in vaccine rooms. With reference to the vaccine storage process dimension, the refrigerator organization component achieved the worst quality evaluation, chiefly concerning the organization of the vaccines in a manner in which they are maintained at stabilized temperatures. The study points to an absence of knowledge on the parts of the nurses and nursing assistants as to the effects of low temperatures on vaccines. Additionally, breached cold chains did not score well; most vaccine room staff fail to follow guidelines when the immunobiologicals are subjected to temperature breaks. Limitations were also encountered in relation to vaccine-room task supervision. Excessive demands on the nurse\'s time and inadequate organization of work processes ultimately hamper the nurse\'s ability to exercise his/her primary role of healthcare management, represented here by vaccine room supervision. Vaccine storage supervision, which spans a series of activities present in nursing praxis, indicates the need to train human resources, monitor and assess work processes and conduct new studies in the field.

A leishmaniose tegumentar é uma doença infecciosa, amplamente disseminada, sendo L. (V.) braziliensis e L. (L.) amazonensis, no Brasil, as espécies de maior importância médico-epidemiológica. Devido ao impacto epidemiológico da leishmaniose, medidas profiláticas devem ser desenvolvidas para o controle da doença, tal como vacinas. Portanto, o presente trabalho objetivou avaliar a imunogenicidade e potencial protetor de dois imunógenos denominados como ferro superóxido dismutase (FSD) e serino peptidase (SP). Os genes codificadores dos antígenos foram sintetizados e clonados no plasmídeo pVAX1 (pVAX1-FSD e pVAX1-SP). Camundongos BALB/c foram imunizados com ambos os alvos na concentração de 1,0 ug/uL, por três vezes, a intervalos regulares de 15 dias, e desafiados ou não com formas promastigotas de L. (L.) amazonensis. Os animais foram avaliados clínica, parasitológica e imunologicamente nos estudos de imunogenicidade e proteção. Os resultados obtidos demonstraram que ambas os imunógenos foram pouco imunogênicos, não apresentando alterações em linfócito T CD4; por outro lado, detectaram-se frequências diminuídas de linfócito TCD8 produtores de IFN-y e TNF-alfa. Entretanto, nos experimentos de desafio, verificou-se que os animais imunizados com pVAX1-FSD apresentaram uma resposta mista Th1 e Th2, devido ao aumento de linfócitos T produtores de IFN-y e IL-4, o que se associou a níveis altos de IgG1 e IgG2a, levando a uma diminuição da carga parasitária. O alvo pVAX1-SP também induziu resposta imunológica mista nos animais, todavia foi detectado frequências elevadas de linfócitos T CD8 produtores IL-10, e esta resposta foi associada a ausência de proteção nesses animais / American tegumentar leishmaniasis is an infectious disease, widespread, and in Brazil the species L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis are the most relevant in medical-epidemiological studies. Due to the epidemiological impact of leishmaniasis, prophylactic measures should be developed to control this disease, such as vaccines. Therefore, the present study aimed to evaluate the immunogenicity and the protective potential of two vaccine candidates known as iron superoxide dismutase (FSD) and serine peptidase (SP). FSD- and SP-coding genes were synthesized and cloned into plasmid pVAX1 (pVAX1-FSD and pVAX1-SP). BALB/c mice were immunized with both candidates at a concentration of 1.0 ug/uL, three times at intervals of 15 days and challenged or not with L. (L.) amazonensis promastigotes. Animals were evaluated clinically, immunologically and parasitologically in the studies of immunogenicity and protection. The results showed that both vaccines presented low immunogenicity, and after immunization BALB/c mice did not show significant changes in CD4 T lymphocytes, by the other side, the frequency of IFN-y and TNF-alfa producing cells were low. However, after challenge pVAX1-FSD-immunized mice presented a mixed Th1 and Th2 immune response, due to the high frequencies of IFN-ye IL-4-producing T lymphocytes, with association to high levels of IgG1 and IgG2a isotypes, leading to parasite burden decreasing. pVAX1-SP vaccine candidate also induced mixed immune response in animals, however high frequencies of IL-10-producing CD8 T lymphocytes was found, justifying the absence of protection in these animals

Vigilância Epidemiológica, é a forma através do qual o SUS busca produzir impacto em termos de controle, eliminação e até erradicação de um conjunto definido de doenças imunopreveníveis. O PNI tem conseguindo bons resultados em termos de cobertura vacinais e controle de importantes doenças, embora ainda com importantes desigualdades regionais e locais. Este estudo busca conhecer os fatores que determinam a efetividade deste programa no município de São Paulo a partir de uma análise mutinível. MÉTODO: Em 2002 o Depto. de Medicina Social da FCMSCSP realizou o Inquérito de Cobertura Vacinal no primeiro ano de vida para a coorte de nascidos entre 1º de novembro de 1999 e 31 de outubro de 2000 residentes no município de São Paulo. Este inquérito domiciliar se baseou no processo de amostragem por conglomerado preconizado pela OPAS. Em cada um dos 41 Distritos de Saúde (DS) foi calculada uma amostra de 210 crianças, num total de 8610 crianças. A importância de variáveis grupais e individuais em relação a cobertura vacinal para esquema completo em crianças com um ano de idade e a participação no Dia Nacional de Vacinação (25/08/2001) foi investigada através de um modelo multinível logístico. Foram estabelecidos nesta análise três níveis: individual, conglomerado, compostos pelos setores censitários e decorrentes do processo de análise e o DS. O modelo multinível foi construído através do software MLWin 2.0. RESULTADOS: O modelo multinível para cobertura com esquema completo em crianças com um ano de idade evidenciou um efeito do DS de 0,15 com um p <0,01; um efeito do conglomerado de 0,07 e p=0,051.A inclusão das variáveis individuais quase não alterou os efeitos aleatórios dos dois níveis. No modelo final as seguintes variáveis mostraram-se associadas ao desfecho: uso de serviço privado OR de 0,64 (IC95%0,50-0,82), pessoas por cômodo um OR de 0,93 (IC95%;0,88-0,98), mãe trabalhar fora e escolaridade da mãe estiveram associadas ao desfecho e apresentaram uma interação.Os dados sugerem uma tendência de aumento da cobertura vacinal conforme aumenta a escolaridade da mãe até a categoria de 9 a 11 anos, voltando a ser menor em crianças com mães um nível de estudo maior. Em relação a participação em campanha de vacinação, o nível do DS apresentou um efeito de 0,32, e nível do conglomerado de 0,18 (p<0,001). Em relação as variáveis individuais, uso de serviço privado para vacinar apresentou um OR de 0,26 (IC95%: 0,21-0,36), mãe trabalha fora de casa um OR de 0,82 (IC95%:0,73-0,92) A escolaridade da mãe, usando a faixa de 9 a 11 anos de escolaridade da mãe por referência, apresentou até a terceira série OR de 0,97 (IC95%: 0,76-1,23), de 4 a 8 anos um OR de 0,86 (IC95%:0,75-0,98) e mais 12 anos de estudo um OR de 0,54 (IC95%:0,44-0,66). A participação em campanha foi maior conglomerados com menor renda média do chefe e no DS com maior proporção de pobres. CONCLUSÕES: Existem diferenças em relação à cobertura vacinal no município de São Paulo que não são totalmente explicadas pelas características individuais e familiares. O DS de moradia destas famílias possui um efeito de contexto sobre a cobertura vacinal. A participação em campanhas de vacinação se revela uma importante estratégia para o acesso dos segmentos menos favorecidos às vacinas. É necessário também aprofundar o conhecimento sobre a cobertura vacinal nos segmentos mais abastados do município / INTRODUCTION: In Brazil, the National Immunization Program (PNI), a branch of the National Surveillance System, is the standard approach of the Brazilian Unified Health System to control, eliminate and even eradicate a set of vaccine-preventable diseases. The PNI has attained good results in terms of vaccine coverage and controlling important diseases, although local and regional inequalities persist. This study aimed to identify which factors were influencing the effectiveness of immunization program in São Paulo City, using multilevel analysis. METHODS: In 2002 the Social Medicine Department of Santa Casa School of Medical Sciences (FCMSC) carried out a vaccine coverage survey, among residents of São Paulo City, addressing the vaccines recommended for the first year of life, among children born between November 1 of 1999 and October 31 of 2000. This household survey was done using the cluster sample technique advocated by the PAHO. In each one of the 41 Health Districts (DS) a sample of 210 infants, in a gross one of 8610, was obtained. The role of group and individuals variable levels in the vaccine coverage for the complete schedule among infants of one year of age and the participation in the National Vaccination Day (25/08/2001) were investigated through a logistic multilevel model. The analysis was performed including three levels: individual, cluster and health districts (DS). The cluster was based on the census tracts, defined by the sampling procedures. The multilevel model was performed using MLWin 2.0. software. RESULTS: The multilevel model for complete coverage with the recommended vaccines for the age group (children aged up to one year), identified at the health district (DS) an effect of 0,15 (p-value <0,01) and at the cluster level an effect of 0,07 (p=0,051). Adding individual level variables did not change the random effects of the two other levels. The final model included the following variables associated to the outcome: use of private service , (OR= 0,64, 95%CI: 0,50-0,82), number of persons by room (agglomerate), (OR= 0,93, 95%CI: 0,88-0,98). The employment status of the mother and mother\'s level of education, were both associated to the outcome and presented an interaction. Our data suggests the immunization uptake increases as the mother\'s years of education increases up to 9 to 11 years, decreasing among children whose mothers have greater level than 11 years of schooling. Regarding participation in vaccination campaign, at the DS level, the effect was 0,32, and at the cluster level the effect was 0,18 (p<0,001). At the individual level, the following characteristics were associated to the outcome: use of private clinic for vaccination (OR=0,26, 95% CI: 0,21-0,36), a working mother (OR=0,82, 95% CI:0,73-0,92). To examine the effect of mother\'s education, we used 9 to 11 years of education as the reference category. For children whose mothers had up to 3 years of education the OR was 0,97 (95% CI: 0,76-1,23); from 4 to 8 years of education the OR was 0,86 (95% CI:0,75-0,98) and for more than 12 years of study an OR of 0,54 (95% CI:0,44-0,66). The participation in campaign was bigger in clusters with lower head of household income, and bigger proportion of poor population. CONCLUSIONS: There are differences in the immunization uptake in São Paulo City that cannot be fully explained by the family and individual characteristics. The Health District, a geographic area where the household is located, poses a context effect on the vaccine coverage. Vaccine campaigns have an important role in increasing the access to vaccines for the poorest population. It is necessary further studies to a better understanding of the vaccine coverage in the wealthier segments of the town

O Vírus Respiratório Sincicial Humano (HRSV) é um dos patógenos mais importantes do trato respiratório. Analisamos as interações das proteínas virais nucleoproteína (N), fosfoproteína (P) e matriz (M) em células HEK-293T. N interage com as proteínas celulares Hsp70, PRMT5 e WDR77; P com Hsp70 e Tropomiosina; e M com Nucleofosmina e Tropomiosina. Cada gene celular foi co-expresso em bactérias com um gene viral possibilitando a co-precipitação das proteínas. Analisamos a interação entre Hsp70 e N ou P, confirmando sua ocorrência em bactérias. Com um conjunto de proteínas mutantes, definimos que as interações são através dos amino terminais de N e P, ou do carboxi terminal de P, e do domínio amino terminal de Hsp70. Superexpressão de Hsp70 por transfecção provocou efeito de estímulo sobre a replicação de HRSV. Imunizações em camundongos com vacinas de DNA para N e P mostraram a indução de resposta celular e humoral. Ensaios de desafio resultaram em redução da carga viral após imunização com N, indicando potencial para sua aplicação em formulação vacinal. / Human respiratory syncytial virus (HRSV) is one of the most important pathogens of the respiratory tract. We analyzed the interactions of viral nucleoprotein (N), phosphoprotein (P) and matrix (M) in HEK-293T. N interacts with the cellular proteins Hsp70, PRMT5 and WDR77; P interacts with Hsp70 and Tropomyosin; and M with Nucleophosmin and Tropomyosin. Each cellular gene was co-expressed with a viral gene in bacteria allowing co-precipitation of proteins. Hsp70 co-expression with N or P proteins confirmed that these interactions also occur in bacteria. Using a set of mutants we found that the N and P amino terminus, P carboxy terminus, and Hsp70 amino terminal domain participate in the interactions. The overexpression of Hsp70 by transfection resulted in stimulation of HRSV replication. Mice immunization with N and P showed that DNA vaccines were capable of inducing humoral and cellular response. In challenge assays it was possible to detect significant virus titer reduction in animals immunized with N, indicating its potential for a vaccine formulation.

Streptococcus mutans é o principal agente etiológico da cárie dental humana, uma doença infecciosa para a qual não há vacina disponível. A influência dos sistemas de transporte ABC na virulência bacteriana suporta seu uso como alvos vacinais. Em S. mutans a proteína ligadora de fosfato (PstS) influencia a expressão de fatores de virulência. A proposta deste trabalho foi caracterizar uma estratégia vacinal de mucosa anti-cárie baseada na proteína PstS como antígeno alvo. Inicialmente, a forma recombinante da proteína foi obtida em E. coli. A caracterização biofísica revelou uma estrutura secundária estável, semelhante a outras proteínas ligadoras e capaz de interagir com seu ligante. Epítopos antigênicos conservados foram identificados na proteína recombinante pela reatividade com soro anti-S. mutans. A proteína rPstS foi imunogênica por via sublingual, combinada ou não à LTK4R e anticorpos rPstS-específicos interferiram na colonização oral in vivo por S. mutans. Os resultados indicam que a proteína rPstS pode ser explorada em estratégias vacinais contra a cárie. / Streptococcus mutans is the main etiological agent of human dental caries, an infectious disease for which there is no vaccine available. The influence of ABC transport systems in bacterial virulence supports its use as vaccine targets. In S. mutans the phosphate binding protein (PstS) influences the expression of virulence traits. The purpose of this work was characterizing an anti-caries mucosal vaccine based on the PstS protein as target antigen. First, a recombinant form of the protein was obtained in E. coli. The biophysical characterization showed a stable secondary structure, similar to other binding proteins and able to interact with its ligand. Conserved antigenic epitopes were identified in the recombinant protein by reactivity with anti- S. mutans serum. The rPstS protein was immunogenic by the sublingual route in combination or not with LTK4R and rPstS-specific antibodies interfered with S. mutans oral colonization in vivo. The results indicated that the recombinant PstS protein can be exploited in vaccine strategies against dental caries.

Bacillus subtilis é uma bactéria gram positiva de solo, não patogênica, não colonizadora de tecidos, naturalmente transformável e formadora de esporos utilizada como modelo de estudo de bactérias gram-positivas. Essas características acarretam em vantagens para a produção de proteases de interesse industrial e para utilização como veículo de antígenos vacinais, porém a falta de vetores induzíveis torna sua utilização como ferramenta biológica pouco explorada. No presente trabalho descrevemos a construção de diferentes vetores capazes de expressar os antígenos subunidade B da toxina termo-lábil (LTB) e subunidade estrutural da fímbria CFA/I (CFAB) de Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) e avaliamos seu potencial vacinal. Foi avaliada a imunogenicidade de linhagens capazes de expressar LTB sob o controle de diferentes promotores: PgsiB (induzido em condições de estresse), PlepA (promotor constitutivo) e Pspac (induzido pela adição de IPTG) e em diferentes locais da célula (ancorada à parede celular ou secretada para o meio externo). Avaliamos ainda a imunogenicidade de linhagens capazes de co-expressar LTB e a listeriolisina O (LLO) de Listeria monocytogenes. O antígeno CFAB foi produzido no citoplasma ou ancorado à parede celular de B. subtilis em condições de estresse e as linhagens bacterianas administradas sozinhas ou conjuntamente com a toxina termo-lábil (LT) como adjuvante de mucosa. Camundongos imunizados com células ou esporos de B. subtilis recombinantes desencadearam respostas de anticorpos sistêmicos e secretados específicos para os antígenos (LTB e CFAB), não alterados pela adição do adjuvante. A expressão de LLO causou a supressão da resposta de anticorpos específicos para o antígeno LTB. Os resultados obtidos demonstram a viabilidade do uso de B. subtilis como veículo vacinal. / Bacillus subtilis is a gram positive, generally regarded as safe and spore forming soil bacteria used as a model for genetic and phisiological studies. This safety status allow its use as host for production of industrial protases and its application as vaccine vehicles, however the lack of epissomal inducible expression systems disable the exploration of this organism as a biotechnologic tool. In this work we describe the construction of epissomal vectors able to express the B subunit of the heat-labile toxin (LTB) and the structural subunit of the CFA/I fimbrae (CFAB) from the enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). We evaluate strains able to express LTB under the control of three promoters: PgsiB (stress inducible), PlepA (constitutive) e Pspac (IPTG inducible) and allowing the expression of LTB secreted or anchored to the cell wall We also evaluate the immunogenicity of strains able to co-express LTB and the listeriolysin O (LLO) from Listeria monocytogenes. CFAB was expressed in the cytoplasm or anchored to the cell wall and administred alone or with the mucosal adjuvant LT. Mice immunized both with cells or spores elicited secreted and systemic specific antibodies responses, which were not altered by the addition of the adjuvant LT. LLO expression suppressed the antibodies responses against LTB. The data shows the ability of B. subtilis to be used as vaccine vehicle.

A sílica nanoestruturada SBA-15 é um polímero que devido à suas propriedades físico-químicas apresenta grande potencial como adjuvante de mucosas. A imunização pela via oral de camundongos com a vacina contra Hepatite A ou gama globulina humana adsorvida a SBA-15 revelou aumento nos títulos de anticorpos específicos IgG e IgA, comprovando que a sílica não interfere na polarização da resposta imunológica dos tipos TH1 ou TH2. Ensaios por citometria de fluxo indicaram que a SBA-15 atuou no recrutamento de fagócitos e no aumento dos números de linfócitos B e T nas placas de Peyer e linfonodos mesentéricos de animais imunizados, sugerindo a proliferação de células imunocompetentes. A administração subcutânea de SBA-15 em camundongos geneticamente selecionados para máxima [AIRMAX] ou mínima [AIRMIN] resposta inflamatória aguda confirmou o baixo potencial inflamatório e a não toxicidade dessa nanopartícula. Os resultados comprovam que a SBA-15 é um adjuvante seguro e eficiente, especialmente nas imunizações pela via oral. / The nanostructured SBA-15 silica is a polymer that due to its physicochemical properties shows great potential as a mucosal adjuvant. Immunization by the oral route of mice with Hepatitis A vaccine or human gama globulin adsorbed/encapsulated in SBA-15 revealed increases in the IgG e IgA specific antibody titers and showed that this silica does not interfere in the polarization of TH1 or TH2 immune responses. Flow cytometry assays demonstrated that SBA-15 was efficient in the recruitment of phagocytes and in the increasing numbers of B and T lymphocytes in Peyer´s patches and mesenteric lymph nodes of immunized mice, promoting the proliferation of immunocompetent cells. Subcutaneous administration of SBA-15 in the genetically selected mice for high [AIRMAX] or low [AIRMIN] acute inflammatory responses indicated the low inflammatory potential and the non-toxicity of this nanoparticle. Results ascertain that SBA-15 silica is an effective and safe adjuvant especially in immunizations by the oral route.

As serpentes do gênero Crotalus contribuem com 7,7% dos acidentes ofídicos anuais no Brasil e apresentam a letalidade mais elevada. O veneno crotálico apresenta como componente majoritário a crotoxina, formada pelas sub-unidades fosfolipase A2 (PLA2) e crotapotina, responsável pelos efeitos neurotóxicos e miotóxicos observados nas vítimas de acidente. Nós resolvemos investigar novas estratégias de imunização no sentido de direcionar a produção de anticorpos contra as frações de maior toxicidade do veneno. Utilizamos cavalos como animais soroprodutores, divididos em três grupos experimentais, Animais foram imunizados com veneno de C. d. terrificus, crotoxina, ou PLA2. Os plasmas obtidos foram analisados por testes padrões contra diferentes antígenos crotálicos e comparados com antivenenos produzidos pelo Instituto Butantan. Os resultados obtidos mostram o reconhecimento cruzado do veneno das diferentes Crotalus por todos os antivenenos utilizados, e uma maior especificidade dos plasmas produzidos contra crotoxina e PLA2 pelos componentes de maior toxicidade. / The serpents from Crotalus genus contribute with 7.7% of the annual ophidic accidents in Brazil, and have the highest lethality. The crotalic venom shows crotoxin, formed by the sub-units phospholipase A2 (PLA2) and crotapotin, as a major component and responsible for the neurotoxic and myotoxic effects shown by the snakebite victims. We decided to investigate new immunizations strategies focusing in orientating the immune response against the most toxic fractions of the venom. We used horses as serum producers, divided in three groups. Animals were immunized with either C. d. terrificus venom, crotoxin or PLA2. The plasmas obtained were analyzed by standart immunochemical tests against different crotalic antigens and compared with antivenoms produced by Instituto Butantan. The results show cross-recognition of all Crotalus venoms by the antivenoms, and a higher specificity from the plasmas produced against crotoxin and PLA2 for the most toxic components.

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Assim, o presente estudo teve como objetivo investigar se camundongos imunizados com extrato proteico de Plasmodium berghei NK65, cepa de baixa virulência e não indutora de malária cerebral nesse modelo, são protegidos contra o desenvolvimento de malária cerebral induzida pela cepa ANKA de Plasmodium berghei (PbA). Para isto, foram realizados dois ciclos de imunização utilizando extrato proteico de Plasmodium berghei associado ao adjuvante CPG-ODN, com intervalo de 21 dias, em camundongos fêmeas C57BL/6, com idade entre 6 e 8 semanas. Após 30 dias da última imunização foi realizado o desafio experimental utilizando a cepa ANKA de P. berghei e iniciado o acompanhamento diário dos animais para avaliação do seu quadro clínico e da carga parasitária. Diante da presença de sinais neurológicos (escore clínico < 5), os animais foram pesados e eutanasiados para realização da coleta de sangue, baço e cérebro, enquanto animais sem esses sinais continuaram por ser acompanhados diariamente e, então, sacrificados a partir do 13º dia. A partir das amostras coletadas, foram determinados os níveis de anticorpos sorológicos, a frequência da população celular esplênica (células T CD4+ e CD8+, e linfócitos B), níveis de citocinas teciduais e análise histopatológica do tecido nervoso. Observouse que 46% dos animais imunizados com extrato de PbN e 69% dos animais imunizados com extrato de PbA foram protegidos do desenvolvimento de malária cerebral e tiveram sua taxa de sobrevivência prolongada, entretanto, estes animais desenvolveram hiperparasitemia sanguínea, com níveis de até 38% de parasitos circulantes. Estes animais não apresentaram sinais clínicos neurológicos, o que foi confirmado macroscopicamente pela ausência de hemorragia e reduzida inflamação no cérebro em relação aos animais que evoluíram para malária cerebral. Histopatologicamente, os animais com hiperparasitemia apresentaram poucos leucócitos aderidos ao endotélio vascular e ausência de vasos obstruídos. Em relação aos níveis de citocinas (IL-10, TNF-α, IFN-) e número de linfócitos esplênicos (T CD4+ e CD8+, e linfócitos B), estes estiveram significativamente reduzidos nos animais que desenvolveram hiperparasitemia em relação aos que desenvolveram malária cerebral. Interessantemente, os animais imunizados foram capazes de reconhecer tanto antígenos homólogos quanto heterólogos ao utilizado durante o processo de imunização, porém, esses anticorpos pareceram não influenciar o padrão clínico apresentado pelos animais. Portanto, nosso estudo demonstra que imunizações com parasitos de baixa virulência podem induzir imunidade capaz de proteger contra cepas altamente virulentas, mas os fatores que medeiam essa proteção ainda precisam ser melhor investigados. / The broad distribution of malaria around of the globe and the large number of clinical cases/deaths attributed to this disease turns the discovery of a safe and effective malaria vaccine an essential tool to halt the spread of the disease. Vaccines focused on the use of live parasites and crude parasites antigens have shown good results on the induction of antimalarial immunity, although it is still not clear if immunizations with low virulent strains are capable to prevent the development of symptoms of cerebral malaria. This research aim to investigate if immunizations with crude antigen of Plasmodium berghei NK65 (PbN), a low virulence strain noninductive of cerebral malaria in C57BL/6 mice, are able to protect the animals against the development of cerebral malaria after challenge with Plasmodium berghei ANKA (PbA). Mice were immunized twice with crude antigen associated to CPG-ODN adjuvant. Thirty days after the second immunization animals were challenged with 105 red blood cells infected with P. berghei ANKA. Animals were daily monitored to evaluate the clinical score and parasitaemia levels. If the presence of neurological signs (score < 5) were detected, animals were euthanized and blood samples, spleen and brain were collected; animals without neurological commitment were followed daily until the 14 day post-infection. Antibodies and cytokines levels, splenic cellular population (T CD4+, T CD8+ and B lymphocytes) and histopathological analysis were performed. The results showed that 46% of the animals immunized with crude antigen of PbN and 69% of the animals immunized with crude antigen of PbA were protected from the development of cerebral malaria and had their survival rate prolonged, however, these animals developed hyperparasitaemia, with levels up to 38% of circulating parasites. These animals did not present neurological signs which were confirmed macroscopically by the absence of hemorrhage and reduce brain inflammation in relation to the animals that evolved to cerebral malaria. Histopathologically, the animals with hyperparasitaemia presented few adhered leukocytes in the vascular endothelium and absence of obstructed vessels. In relation to cytokine levels and number of splenic lymphocytes, these were significantly reduced in animals that developed hyperparasitism in comparison with those who developed cerebral malaria. Interestingly, the immunized animals were able to recognize both homologous and heterologous antigens used during the immunization process, however, these antibodies did not appear to influence at the clinical condition presented by the animals. Therefore, our study demonstrates that immunizations with low virulence parasites may induce immunity capable of protecting against highly virulent strains, but the factors that mediate this protection still need to be better investigated.

O presente trabalho propõe o desenvolvimento e a caracterização de uma estratégia vacinal de caráter profilático contra o vírus da dengue (VD), baseada nas proteínas NS1 e domínio III da proteína E (EIII), empregando proteínas recombinantes em ensaios de imunização por via sub-cutânea em modelo murino. Estes antígenos foram obtidos pela clonagem e expressão de suas sequências de DNA codificadoras em sistema procarioto (E. coli). Além disso, formas atóxicas da toxina termo-lábil (LTG33D e LTK63) de E. coli enterotoxigência (ETEC) foram obtidas e incorporadas como adjuvantes às formulações vacinais. As respostas celulares e humorais anti-NS1 e anti-EIII foram monitoradas por ELISA para anticorpos e citocinas, ICS (do inglês intracellular citokine staining) e atividade citotóxica in vivo. Observamos que animais imunizados com a NS1 recombinante adicionada da LTG33D foram capazes de gerar respostas imunológicas com produção de anticorpos específicos e alta afinidade pelo antígeno. Em ensaios de desafio realizados para avaliar a proteção vacinal conferida à infecção por uma linhagem referência do o VD tipo 2 (NGC) observamos que essa formulação conferiu uma proteção de 50% aos animais imunizados. Paralelamente a esses resultados, demonstramos que a EIII não é um bom antígeno vacinal e que pode induzir anticorpos capazes de acentuar a infecção do VD. Descrevemos ainda a obtenção e a caracterização genética e patológica de um isolado clínico de VD tipo 2 naturalmente letal para camundongos Balb/C. A nova cepa viral (JHA1) demonstrou ser capaz de induzir perda de peso corporal, dano tecidual geral, e distúrbios hematológicos similares aos observados em humanos infectados pelo VD, podendo ser aplicada como modelo de infecção na avaliação de candidatos vacinais. Os resultados obtidos neste trabalho representam uma importante contribuição na área de desenvolvimento de estratégias vacinais contra a dengue e representam uma base importante para futuros estudos sobre a patologia da dengue. / The present study proposes the development and characterization of a strategy for prophylactic vaccination against dengue virus (VD) based on the NS1 protein and the domain III of the envelope glycoprotein (EIII), using recombinant proteins in subcutaneous immunization in a murine model. These antigens were obtained by cloning and expression of their DNA coding sequences in prokaryotic system (E. coli). In addition, the s non-toxic forms of the heat-labile toxin from enterotoxigenic E. coli (ETEC) (LTK63 and LTG33D) were obtained and incorporated as adjuvants to vaccine formulations. Anti-NS1 and anti-EIII cellular and humoral immune responses were monitored by antibody and cytokine ELISA, , intracellular citokine staining (ICS) and in vivo cytotoxic activity. We observed that animals immunized with the recombinant NS1 and LTG33D were capable to induce immune responses including specific antibodies with high affinity for the antigen. In challenge assays performed to evaluate the immunization protective efficacy such vaccine conferred protection of 50% against infection with a reference type 2 VD (VD2) strain(NGC). Alongside to these results, we demonstrated that EIII is not a good vaccine antigen and can induce the generation of antibodies that enhance DENV infection. We also described the isolation and the genetic and pathological characterization of a VD2 clinical isolate naturally lethal to immunocompetent Balb/c mice. The new strain was shown to cause weight loss, general tissue damage, and hematological disturbances similar to those observed in VDinfected humans, and therefore, may be applied as infection model to evaluate vaccine candidates. The results obtained in this study represent an important contribution to DENV vaccine development and established an important background for future studies of the dengue pathology.