CD163, the receptor for haptoglobin–hemoglobin complex, is expressed on monocytes/macrophages and neutrophils. A soluble form (sCD163) has been associated with the M2 macrophage phenotype. M2 macrophages down-modulate the inflammatory response and has previously been described in the most severe, lepromatous (LL) clinical presentation of leprosy as well as tuberculosis. We hypothesized that sCD163 would correlate with severity of diseases caused by intracellular pathogens. Our general objective was to verify the presence of sCD163 in sera of Leprosy and Visceral leishmaniasis (VL) patients. Sera of patients with diferent clinical forms of leprosy (n = 47), and VL (n = 65) were tested for the presence of sCD163. The levels of sCD163 were compared in the diferent clinical forms of leprosy (Indeterminate - IL, Tuberculoid-TL, Boderline-BL and Lepromatous leprosy-LL). The levels of sCD163 were also compared in sera of VL patients before treatment (D0) (n = 46), and at D30 post treatment (n = 19), and also compared at D0, between patients with classical VL (n = 33) and severe VL (n = 13). High levels of sCD163 were detected in sera from leprosy patients as compared to contact controls, and confirmed the association of sCD163 with LL leprosy, finding it at elevated levels in this clinical form. ROC curves showed high sensitivity and specificity for the association between higher levels of this molecule with the most severe LL clinical form. VL patients also presented with high levels of sCD163 in sera at D0 as compared with healthy individuals, and even higher in sera from severe VL patients. Further stratification on infection and disease status revealed a clear association with clinical parameters of disease severity and clinical cure, with a direct correlation sCD163 concentration and liver and spleen sizes. ROC curves also demonstrated high sensitivity and specificity of this molecule to associate this molecule with disease severity of VL. Additionally, sCD163 concentrations reduces after treatment (D30). In vitro cultures indicated that Leishmania infection induced CD163 expression on the surface of monocyte/macrophages and neutrophils, suggesting these cells as possible sources of sCD163 in the sera. Interestingly, the association of sCD163 levels with disease status was not mirrored by levels of haptoglobin, heme-oxygenase, or arginase. Taken together, our data support the use of sCD163 as a biomarker of disease and severity in both leprosy and VL, and indicate a role of Leishmania infection in induce the expression of CD163 in macrophages and neutrophils. This data also suggest CD163 as a marker for M2 and N2, which down modulate inflammatory responses and interfere in the outcome of intracellular infections and the severity of their associated diseases. / O marcador CD163, receptor para o complexo Haptoglobina-Hemoglobina, é expresso em monócitos/macrófagos e neutrófilos. Sua forma solúvel (sCD163) tem sido associada com o fenótipo de macrófagos M2, que modulam negativamente a resposta inflamatória e descritos como relacionados à apresentação Virchowiana da Hanseníase bem como à Tuberculose. Este trabalho se baseou na hipótese de que sCD163 poderia se correlacionar com a gravidade de doenças provocadas por patógenos intracelulares. O objetivo geral foi verificar a presença e caracterizar a associação do marcador CD163 com apresentação clínica da Hanseníase e Leishmaniose Visceral (LV). Soros de pacientes com diferentes formas clínicas de hanseníase (n = 47), e de pacientes com LV foram testados para a presença do sCD163. Foram comparadas as concentracões do sCD163 entre as formas clínicas da hanseníase (Indeterminada - HI, Tuberculóide - HT, Dimorfa - HD e Virchowiana - HV). A presença do sCD163 foi também avaliada nos soros de pacientes com LV (n = 46) no D0 (antes do tratamento) (n = 33), D30 (pós-tratamento) (n = 19) e comparada entre os pacientes no D0 com LV grave (n = 13). Foram observados altos níveis do sCD163 nos soros dos pacientes com hanseníase em comparação com controles contactantes, e confirmou-se a associação desta molécula com a forma HV. Curvas ROC demontraram alta sensibilidade e especificidade da dosagem desta molécula para a associação com a forma mais grave HV da doença. Na LV, foram observadas concentrações elevadas do sCD163 no D0, sendo estas ainda mais elevadas nos pacientes com LV grave. Além disso, observou-se redução do sCD163 após o tratamento (D30). Análises de correlação confirmaram inter-relação entre o biomarcador e parâmetros de gravidade da LV, sendo observadas correlacões diretas entre as concentrações de sCD163 e as medidas do fígado e do baço. Curva ROC, também confirmou a associação entre o nível sérico alto desta molécula com a forma mais grave da LV. Adicionalmente, há uma redução significativa do sCD163 com cura clínica pós-tratamento. Experimentos in vitro indicaram indução da expressão de CD163 na superfície de macrófagos e neutrófilos por Leishmania amazonensis, sugerindo que estas células sejam possíveis fontes para a molécula sérica encontrada nos pacientes com LV. Não houve diferenças nos níveis de haptoglobina, heme-oxigenase-1 e arginase-1 entre os pacientes com LV clássico e LV grave. Em conjunto, esses dados um possível papel da molécula de sCD163 como biomarcador de doença e de gravidade na hanseníase e LV, e sugere um papel da leishmania na indução da expressão dessa molécula. Além disso, os achados sugerem que CD163 pode serum marcador de macrófagos e neutrófilos M2 e N2, os quais podem modular a resposta imune e contribuir para a apresentação clínica de infecções por patógenos intracelulares.

Orientadores: Nicola Amanda Conran Zorzetto, Fernando Ferreira Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-16T20:35:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dominical_VeninaMarcela_M.pdf: 1517777 bytes, checksum: 002cdb44469c81ccafe110267d001ff0 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A artrite reumatoide (AR) é uma doença inflamatória crônica, autoimune e sistêmica, caracterizada por ser uma poliartrite simétrica, acometendo preferencialmente os punhos, mãos e pés. O processo patológico que explique a AR ainda permanece desconhecido. A indução da resposta imune, característica da doença, resulta de uma inflamação nas articulações através da infiltração de células inflamatórias que são recrutadas para o tecido sinovial, onde elas aderem às células endoteliais e transmigram através da subcamada sinovial, formando complexos que produzirão citocinas inflamatórias, contribuindo para a hiperplasia da camada sinovial e estimulando a produção de mais citocinas e enzimas capazes de degradar a matriz óssea, provocando a destruição das articulações afetadas. No líquido sinovial, os neutrófilos são o principal tipo celular, atraídos para as articulações inflamadas por quimioatraentes como LTB4, C5a, IL-8 e TGF-?, e expostos a uma variedade de citocinas locais pró-inflamatórias como IL-1?, TNF-?, GM-CSF, IL-6 e IL-18. Estudos demonstraram que os neutrófilos têm papel indutor na geração de inflamação e esforços visando compreender os mecanismos exercidos pelos neutrófilos nesta doença podem ser um ponto chave para intervenções farmacológicas, promovendo a melhora dos sintomas e gravidade da doença. Diante disso, este estudo objetivou avaliar as propriedades adesivas e quimiotáticas de neutrófilos de pacientes com AR (com atividade e em remissão da doença) e verificar a influência das diferentes medicações utilizadas atualmente no tratamento da AR quanto a estas propriedades. Cento e vinte e três pacientes com artrite reumatoide em estado ativo ou de remissão da doença foram inclusos no estudo e divididos em três grupos: pacientes não tratados com drogas direcionadas para a AR (AR nt), pacientes tratados com drogas modificadoras da doença (AR dm) e pacientes tratados com agentes biológicos (AR ab); os indivíduos sem a doença foram nossos controles (Con). Os neutrófilos foram separados do sangue periférico e realizados ensaios de adesão estática e de quimiotaxia celular, ambos in vitro. Foi verificada a expressão gênica e de superfície de algumas proteínas envolvidas no processo adesivo. Além disso, foram quantificadas no soro e líquido sinovial destes pacientes, quimiocinas envolvidas no recrutamento de neutrófilos e a L-selectina - molécula de adesão expressa em leucócitos. Os neutrófilos da circulação periférica de pacientes com AR em atividade da doença não apresentaram alterações quanto às propriedades adesivas em relação a indivíduos saudáveis. Ainda, neutrófilos de pacientes em terapia com agentes biológicos apresentaram aumento das propriedades migratórias comparados a pacientes AR sem tratamento. Interessantemente, os neutrófilos de pacientes com AR em remissão da doença apresentaram redução da capacidade adesiva e migratória dos neutrófilos quando na ausência de estímulo por IL-8. Apesar disso, não observamos diferenças quanto à adesão e à migração destes neutrófilos quando estimulados por esta citocina. O líquido sinovial de pacientes com AR em atividade da doença possui alto potencial quimiotático frente a neutrófilos e foram encontrados níveis elevados de IL-8 e ENA-78 tanto neste fluído, como também no sangue periférico. Há aumento da expressão gênica de L-selectina em neutrófilos de pacientes com AR em atividade da doença, mas curiosamente, não encontramos diferenças quanto à expressão desta molécula na superfície dos neutrófilos ou a sua presença no soro. Em destaque, observamos redução significativa de expressão na superfície neutrofílica de L-selectina e LFA-1 em pacientes em remissão da doença. Esses resultados sugerem que a remissão do quadro inflamatório da AR parece estar associada a alterações significantes nas principais quimiocinas atraentes de neutrófilos na circulação destes indivíduos e que são acompanhadas por modificações funcionais dos neutrófilos. Especulamos se estas características podem participar na melhora do quadro clínico em pacientes com artrite reumatoide / Abstract: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease that is autoimmune and systemic, and characterized by a symmetric polyarthritis, affecting mainly the wrists, hands and feet. The pathological process that explains RA remains unknown. The induction of an immune response, characteristic of the disease, results from an inflammation of the joints through the infiltration of inflammatory cells that are recruited to the synovial tissue, where they adhere to endothelial cells and transmigrate through the synovial sublayer, forming complexes that produce inflammatory cytokines. These complexes induce hyperplasia of the synovial layer and stimulate the further production of cytokines and enzymes, leading to the degradation of the bone matrix, and resulting in the destruction of affected joints. In the synovial fluid, neutrophils are the main cell type and are attracted to the inflamed joints by chemoattractants, such as LTB4, C5a, IL-8 and TGF-?, and exposed to a variety of local pro-inflammatory cytokines such as IL-1?, TNF -?, GM-CSF, IL-6 and IL-18. Studies have shown that neutrophils play a role in inducing the generation of inflammation, and efforts to understand the mechanisms deployed by neutrophils in this disease may be a key point for the development of pharmacological interventions to ameliorate symptoms and disease severity. Thus, this study evaluated the chemotactic and adhesive properties of neutrophils in patients with RA and the influence of different drugs, currently used in the treatment of this pathology, on these properties. One hundred and twenty-three patients with active RA or in disease remission were enrolled and divided into three groups; patients not treated with drugs specifically for RA (AR nt), patients treated with disease-modifying antirheumatic drugs (AR dm) and patients treated with biological agents (AR ab); healthy individuals were used as controls (Con). Neutrophils were separated from peripheral blood and static adhesion assays and cell chemotaxis assays were performed in vitro. We verified the gene and surface expression of some proteins involved in the adhesive process. Moreover, chemokines involved in the recruitment of neutrophils and L-selectin, a cellular adhesion molecule expressed in leukocytes, were quantified in the serum and synovial fluid of these patients. Neutrophils from the peripheral blood of RA patients with active disease demonstrated no difference in adhesive properties, compared to healthy subjects. Furthermore, patients on therapy with biological agents had increased migratory properties, compared to patients without specific RA treatment. Interestingly, neutrophils from RA patients in remission of disease presented reduced adhesive and migratory capacity in the absence of stimulus. Nevertheless, no differences were observed in these properties with IL-8 stimulus. The synovial fluid of RA patients with active disease has a high chemotactic potential for neutrophils and presented significantly higher levels of IL-8 and ENA-78 in this fluid, as well as in the peripheral blood. An increased gene expression of L-selectin in RA patients with active disease was observed, but interestingly, we found no differences in surface expression or presence in the serum of this molecule. Of note, a significant decrease in the surface expression of neutrophil L-selectin and LFA-1 was observed in patients in remission of disease. Results suggest that the remission of the RA inflammatory state appears to be associated with significant alterations in major neutrophil-attracting chemokines in the circulation of individuals, contributing possibly, to neutrophils function alteration in these individuals and the consequent amelioration of the disease / Mestrado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Mestre em Fisiopatologia Médica

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Visceral Leishmaniasis (VL) is a disease of systemic infectious and the most severe clinical form is associated with an intense inflammatory response. Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 1 (TREM-1) is a cell surface receptor constitutively expressed in neutrophils and monocytes and plays a key role in the innate immune response, being able to amplify and regulate the inflammatory response. Its activation and expression is synergistic to the activation of TLR 2 and 4, which culminates in the activation of microbicidal mechanisms. Its soluble serum form, sTREM-1, has been described in inflammatory diseases such as sepsis and rheumatoid arthritis, acting as TREM-1 pathway inhibitor. Since TREM-1 pathway is associated with neutrophils activation, cells that constitute the first host’s line of defense and a major source of TREM-1, the aim of the present study was to evaluate serum levels of sTREM-1 in patients with VL and investigate the effect of Leishmania infantum on the modulation of TREM-1 in neutrophils. Thereby, sera from patients with different clinical forms of VL were collected before and after treatment to measure serum levels of sTREM-1 by ELISA. In addition, neutrophils from healthy human donors were purified from peripheral blood and exposed to L. infantum at a rate of 1, 5 and 10 parasites per neutrophil to evaluate the release of sTREM-1 in the supernatant. Ultimately, the expression of surface TREM-1 in neutrophils exposed to L. infantum, as well as the gene expression of TREM-1, DAP12 and IL-8 by Real-time PCR was evaluated. Patients with severe VL presented elevated serum levels of sTREM-1 compared to serum levels of other clinical forms. Comparing the patients with severe VL with the other groups (classic VL D0, D30 and D180; DTH+; CTR), an AUC above 0.8 was observed with a value of p≤0.01 in all ROC curves. The best discriminating power of the ROC curve was between severe VL of classic VL D30 with a sensitivity of 93.75% and specificity of 87.50%. Serum levels of sTREM-1 were positively correlated with liver size and negatively correlated with the number of leukocytes from VL patients. In vitro experiments with neutrophils from healthy donors demonstrated that the release of sTREM-1 into the culture supernatant was associated with an increased parasite rate of L. infantum, and the time of exposure. In addition, flow cytometry has demonstrated that exposure by L. infantum reduces the frequency, MFI and iMFI of TREM-1 on the surface of infected neutrophils, and increases the gene expression of TREM-1, DAP12 and IL-8. In this work, it was described for the first time that TREM-1 is modulated by the presence of L. infantum, its soluble form being elevated in the severe form of VL and modulated in neutrophils. / A Leishmaniose Visceral (LV) é uma doença de infecção sistêmica e a forma clínica mais grave está associada a uma intensa resposta inflamatória. O Triggering Receptor Expressed on Myeloid Cells 1 (TREM-1) é um receptor de superfície celular constitutivamente expresso em neutrófilos e monócitos e desempenha um papel fundamental na resposta imune inata, sendo capaz de amplificar e regular a resposta inflamatória. Sua ativação e expressão é sinérgica a ativação de TLR 2 e 4, que culmina na ativação de mecanismos microbicidas. Sua forma sérica solúvel, sTREM- 1, tem sido descrita em doenças inflamatórias como sepse e artrite reumatoide e atua como um inibidor da via TREM-1. Uma vez que a via TREM-1 está associada a ativação de neutrófilos, células que constituem a primeira linha de defesa e uma fonte principal de TREM-1, o objetivo do presente trabalho foi avaliar os níveis séricos de sTREM-1 nos pacientes com leishmaniose visceral e investigar o efeito da Leishmania infantum na modulação de TREM-1 em neutrófilos. Para isso, soros de pacientes com diferentes formas clínicas da LV foram coletados antes e após o tratamento para mensurar os níveis séricos de sTREM-1 por ELISA. Além disso, neutrófilos de doadores humanos sadios foram purificados a partir de sangue periférico e expostos à L. infantum com uma taxa de 1, 5 e 10 parasitos por neutrófilo, para avaliar a liberação do sTREM-1 no sobrenadante. Por fim, foi avaliada a expressão de TREM-1 de superfície em neutrófilos expostos à L. infantum, bem como a expressão gênica de TREM-1, DAP12 e IL-8 por PCR em Tempo Real. Pacientes com a forma grave da LV apresentaram níveis séricos elevados de sTREM-1 comparados aos níveis séricos das outras formas clínicas. Comparando os pacientes com LV grave com os demais grupos (LV clássica D0, D30 e D180; DTH+; CTR) foi observada uma AUC acima de 0,8 com valor de p≤0,01 em todas as curvas ROC. O melhor poder de discriminação da curva ROC foi entre LV grave de LV clássica D30 com uma sensibilidade de 93,75% e especificidade de 87,50%. Os níveis séricos de sTREM-1 foram correlacionados positivamente com o tamanho do fígado e negativamente com o número de leucócitos dos pacientes com LV. Experimentos in vitro com neutrófilos de doadores saudáveis demonstraram que a liberação de sTREM-1 no sobrenadante da cultura estava associada à um aumento da taxa de parasitos de L. infantum, e ao tempo de exposição. Além disso, através da citometria de fluxo foi demonstrado que a exposição por L. infantum reduz a frequência, MFI e iMFI de TREM-1 na superfície de neutrófilos infectados, e aumenta a expressão gênica de TREM-1, DAP12 e IL-8. Nesse trabalho foi descrito, pela primeira vez, que o TREM-1 é modulado pela presença da L. infantum, sendo sua forma solúvel elevada na forma grave da LV e modulada em neutrófilos.

Orientador: Mario Mantovani / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T08:05:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hirano_ElcioShiyoiti_D.pdf: 1576822 bytes, checksum: a84a83fa8cd17ee274ad522665f99470 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: No Brasil, o trauma é uma das principais causas de mortalidade do adulto jovem e o choque hemorrágico é uma das situações críticas que está presente na maioria dos traumatizados graves. Dependendo da duração e intensidade, o choque hemorrágico torna-se responsável pela instalação da síndrome da resposta inflamatória sistêmica , ativando os neutrófilos que aderem ao endotélio e, por diapedese, seqüestram-se no interstício dos órgãos, onde iniciam a produção de radicais livres (O2-) estabelecendo lesão tecidual local. O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar o seqüestro de neutrófilos no rim de rato, como efeito da isquemia e reperfusão hepática total após estado de choque hemorrágico controlado, com uso de diferentes soluções eletrolíticas. Utilizou-se 18 ratos Wistar, machos, adultos, divididos em três grupos conforme a solução utilizada para reanimação: Grupo SF: solução fisiológica; Grupo SH: solução hipertônica de NaCl a 7,5% seguido pela solução de Ringer com lactato; Grupo RL: solução de Ringer com lactato. Todos os animais foram submetidos à sangria controlada até a pressão arterial média (PAM) atingir 40 mmHg, permanecendo assim por 20 minutos. Realizou-se reanimação volêmica até PAM=80 mmHg com a solução conforme o grupo estudado. Em seguida realizou-se uma laparotomia e a manobra de Pringle por 15 minutos. Os animais foram acompanhados até duas horas. A eutanásia dos animais foi realizada com exsanguinação pelo cateter posicionado na artéria femoral esquerda. Os parâmetros hemodinâmicos e metabólicos foram avaliados para caracterização do estado de choque controlado: pressão arterial média, freqüência cardíaca, índice cardíaco, índice de resistência vascular sistêmica, pH, bicarbonato, reserva de base, lactato e eletrólitos. Para comparações estatísticas entre as contagens de neutrófilos, no interstício do córtex renal, foram efetuados os testes ANOVA e a análise de covariância, ajustando-se para o tempo de sobrevida. O volume de reanimação utilizado no tratamento do choque hemorrágico foi menor no GSH em comparação ao GRL, entretanto sem diferença estatística com GSF. O GSH apresentou maior nível de lactato em 60 minutos de reperfusão em relação ao GSF, entretanto sem diferença estatística com GRL. Os valores médios de tempo de sobrevida, em minutos, por grupo foram: Grupo SF: 79,0±12,0; Grupo RL: 97,0±11,0; Grupo SH: 67,0±10. Os valores médios da contagem de neutrófilos/campo no córtex renal foram: Grupo SF: 0,55±0,68; Grupo RL: 1,68±0,53; Grupo SH: 1,33±0,43. E, quando são ajustados para o tempo de sobrevida, encontraram-se: Grupo SF: 0,55; Grupo RL: 1,62; Grupo SH: 1,39. O GSF apresentou diferença estatística na contagem de neutrófilos com os demais, usando-se ou não o ajuste pelo tempo de sobrevida (p=0,016 e p=0,0128) / Abstract: In Brazil, the trauma is the main cause of death in young adults and hemorrhagic shock is one of the critical situations present in the major traumatism. Depending on duration and intensity, the hemorrhagic shock becomes responsible for the beginning of the systemic inflammatory response syndrome, activating neutrophils, which adhere to endothelium and for diapedesis sequestration on interstitium of the organs, where they initiate the production of free radicals (O2-), and promoting local lesion. The goal in this present study was to evaluate and compare neutrophils sequestration in the renal cortex of rats resultanting from total hepatic ischemia and reperfusion after controlled hemorrhagic shock, with use of different electrolytic solutions. Eighteen male adult rats Wista were divided into three equal groups according to the solution used to reanimation: Group PSS: physiologic saline solution; Group HSS: hypertonic saline hypertonic (7,5%) followed by lactated ringer¿s solution; Group LRS: lactated Ringer¿s solution. All animals were submitted to controlled bleeding maintaining mean arterial pressure (MAP) around 40 mmHg for 20 minutes. Volume infusion was performed to obtain and maintain a MAP=80 mmHg with the specific solution according to the studied group, followed by laparotomy and Pringle's maneuver for 15 minutes. The animals were observed until for two hours. The euthanasia of animals was perfomed by exsanguination via left femoral artery. The hemodynamic parameters were: MAP, heat rate, cardiac index, systemic vascular resistance index. The analyzed serum metabolic variables were: pH, bicarbonate, base deficit, lactato and electrolytes. For statistical comparisons between mean of neutrophils sequestration in interstitium of the renal cortex, One-way ANOVA and covariance analysis were used, adjusting itself for time of supervened. The mean total volume replacement for hemorrhagic shock was lesser in Group HSS than in Group LRS, and these values were not statiscally significant different from Group PSS. The Group HSS demonstrated greather lactate mean values at 60 minutes of reperfusion compared with Group PSS (p=NS in relation to Group LRS. The mean values of supervened, in minutes, for group were: Group PSS 79.0±12.0; Group 97,0±11,0; Group HSS 67.0±10. The mean values of neutrophils/field in the renal cortex : Group PSS 0.55±0.68; Group LRS 1.68±0.53; Group HSS 1.33±0.43. When adjusted for time of supervened: Group PSS 0.55; Group LRS 1.62; Group HSS 1.39. There was significant difference in neutrophils sequestration between Group PSS regarding the other groups, using itself or not the adjustment by time of supervened (p=0,016 and p=0,0128) / Doutorado / Cirurgia / Doutor em Cirurgia

Com o objetivo de avaliar a evolução clínica, a persistência da infecção e a resposta imune humoral e celular, sete cães adultos desprovidos de anticorpos anti-Ehrlichia canis foram inoculados com E. canis e acompanhados durante vinte semanas. Três cães permaneceram como controle. Exame físico diário e avaliação laboratorial (hemograma, bioquímica sanguínea, fragilidade osmótica eritrocitária, teste de Coombs, teste de redução de tetrazólio nitroazul), reação em cadeia da polimerase (PCR), pesquisa de anticorpos anti-E. canis (IFI) e quantificação dos linfócitos T CD4+ e CD8+ por citometria de fluxo foram realizados, em diferentes momentos, durante o período de observação. A infecção foi comprovada pela presença de mórulas em linfócitos/monócitos no sangue circulante, soroconversão, com títulos de anticorpos entre 1.280 a 20.480 e a reação positiva ao PCR. Febre, esplenomegalia, linfadenomegalia, trombocitopenia, anemia não regenerativa, aumento das atividades séricas de ALT, AST e FA, foram as principais alterações clínicas e de patologia clínica observadas, com pico máximo entre 21 e 28 dias. Também nesses momentos foram observados o aumento de linfócitos T CD8+ e a diminuição dos linfócitos T CD4+. O aumento do metabolismo oxidativo dos neutrófilos, quando estimulados, entre o 28º e 35º dia p.i., o aumento de reticulócitos na circulação sanguínea nessa ocasião, a redução dos linfócitos T CD4+ e o aumento de linfócitos T CD8+ indicaram a resposta do hospedeiro, na tentativa de eliminar a infecção. No auge da infecção entre o 21º e 49º dia p.i., houve a inversão da relação CD4:CD8, principalmente o aumento dos linfócitos T CD8+. A fragilidade osmótica eritrocitária manteve-se inalterada, bem como o teste de Coombs, comprovando não ter ocorrido a hemólise imunomediada. Nos cães infectados não foram detectados a presença de anticorpos IgM anti-E. canis em nenhum momento de observação. O aumento de reticulócitos na circulação sanguínea a partir do 28º dia p.i. sugere ser temporária a supressão da atividade eritropoética. O baixo número de linfócitos T CD4+, coincidindo com a esplenomegalia e a PCR positiva até a vigésima semana p.i., sugere a relação entre a persistência da infecção, com a localização esplênica de E. canis e ativação de um mecanismo de escape pelo microrganismo, representado pelo baixo limiar de ativação de linfócitos T CD4+. Por outro lado, o aumento de linfócitos T CD8+ no auge da infecção coincidindo com a melhora clínica, sugere o envolvimento do mecanimo de citotoxicidade na patogenia da erliquiose canina. O bloqueio parcial da atividade dos linfócitos T CD4+, constitui-se provavelmente em um dos mecanismos de escape da E. canis, enquanto a contínua liberação de TNF-α pelas células citotóxicas, como parte do mecanismo do hospedeiro para a eliminação do parasita pode resultar na pancitopenia terminal observado freqüentemente nos cães cronicamente infectados por E. canis. / The clinical evolution, the persistence of infection and humoral and cellular immune response were evaluated on seven adult naïve dogs experimentally inoculated with an E. canis strain and followed during 20 weeks. Three dogs were remained as control. Daily clinical evaluation and laboratorial exams (hematological, biochemistry, erythrocyte osmotic fragility, Coombs´ test, neutrophils oxidative metabolism by nitroblue tetrazolium reduction test), polymerase chain reaction assay (PCR), anti-E. canis antibodies detection by indirect immunofluorescence assay (IFA) and quantification of CD4+ and CD8+ T lymphocytes by flow cytometry technique were evaluated, at different moments during all the experimental period. The presence of E. canis morulae, seroconversion with high antibodies titers (1,280 to 20,480) and positive PCR had confirmed the infection in all the inoculated animals. Fever, splenomegaly, lymphadenomegaly, thrombocytopenia, non-regenerative anemia and increase on liver´s enzymes serum activity (ALT, AST and ALP) were the main clinical and laboratorial changes observed, with the highest point between days 21 and 28 post-infection (p.i.). Also at these moments were observed increase of CD8+ T lymphocytes and reduction of the CD4+ T lymphocytes. The increase in the stimulated neutrophils oxidative metabolism between days 28 and 35 p.i., and the increase of reticulocytes in the same period, allied to the reduction of the CD4+ T lymphocytes and the increase of CD8+ T lymphocytes, indicated the host´s immune response in the attempt to eliminate the infection. On the peak of the infection, from the 21st to the 49th post-infection day, there was an inversion in the CD4:CD8 ratio of blood lymphocytes, mainly caused by increase of the CD8+ T lymphocytes. There was no variation on erythrocyte osmotic fragility and Coombs? test results, which suggested the absence of immune-mediated hemolysis. It wasn´t detected any anti-E. canis IgM antibodies in the infected group of dogs. The increase of reticulocytes only from the 28th post-infection day suggests a temporary erythropoietic suppression. The low number of CD4+ T lymphocytes, coinciding with the splenomegaly and the positive PCR until the twentieth week p.i., suggest that there is a relation between the persistent infection, the splenic localization of E. canis and an evasion mechanism, represented for the low threshold of activation of CD4+ T lymphocytes. On the other hand, the increase of CD8+ T lymphocytes in the peak of infection, coinciding with clinical improvement, suggests the involvement of the cytotoxicity mechanism on canine ehrlichiosis pathogenesis. The partial blockage of CD4+ T lymphocytes activity could probably be one of the E. canis escape mechanisms, while the continue TNF-α release by host´s cytotoxic cells, as a mechanism to eliminate the parasite, could result in terminal pancytopenia commonly observed in dogs chronically infected with E. canis.

O objetivo geral deste trabalho foi avaliar a influência dos leucócitos do colostro bovino na imunidade inata, desenvolvimento da microbiota intestinal e ocorrência de diarreias em bezerras Holandesas recém-nascidas. Para isso, 20 bezerras Holandesas foram acompanhadas nos seguintes momentos: antes da mamada do colostro (D0); 1-2 (D2); 7 (D7); 14 (D14); 21 (D21) e 28 (D28) dias após nascimento e foram distribuídas em dois grupos experimentais: grupo COL+ recebeu colostro fresco (4L) proveniente de suas respectivas mães; e grupo COL- recebeu colostro congelado e acelular (4L) de vacas doadoras. Capítulo 1 O objetivo deste capítulo foi avaliar a presença e influência dos leucócitos do colostro na colonização do trato gastrintestinal. Para isso, amostras de colostro foram semeadas em TSA e MacConkey para CBT e CCT; e amostras de fezes em agar sangue, MacConkey e Salmonella-Shiguella. Bezerras apresentaram maior frequência de diarreia no D14 (COL+=78%; COL-=60%). O grupo COL- apresentou maior CBT e CCT/mL (3,93x106 ufc/mL e 3,01x105 ufc/mL) em relação ao COL+ (0,94x106 ufc/mL e 0,78x105ufc/mL). Sobre as espécies bacterianas isoladas, as que foram mais frequentes no COL+ foram Proteus mirabilis (29,91%), Escherichia coli (28,04%), Citrobacter freundii (5,61%) e Staphylococcus spp (5,61%), no COL- foram Escherichia coli (28,70%), Proteus mirabilis (27,78%), Klebsiella pneumoniae (11,32%) e Morganella morganii (5,66%). O momento com maior isolamento em ambos os grupos foi o D2 (COL+ = 26 cepas; COL- = 27 cepas), período em que iniciou a diarreia nas bezerras. Não foi possível detectar diferenças entre as frequências de microrganismos entre os grupos COL+ e COL-. A administração de colostro COL+ e COL- não influenciou na proporção de bactérias aeróbias presentes nas fezes e na ocorrência de diarreia das bezerras durante o período neonatal. Capítulo 2 O objetivo deste capítulo foi avaliar a influência dos leucócitos do colostro na resposta imune inata em bezerras Holandesas. Os animais foram submetidos ao exame clínico, seguido da colheita das amostras sanguíneas para realização das provas laboratoriais. As concentrações de cortisol sérico e haptoglobina não apresentaram diferenças estatísticas, enquanto a concentração de ferro foi diferente entre os grupos no D7. No leucograma não foi detectada diferença para os leucócitos totais e neutrófilos absolutos, mas houve tendência entre os grupos no D7 para os valores de neutrófilos relativos. O marcador CH138+CD62L+ não apresentou diferença entre os grupos, apesar da maior expressão ter sido detectada no COL-. A expressão de CH138+CD62L- foi maior no COL+ no D14. A fagocitose e produção de H2O2 pelos neutrófilos sanguíneos apresentou perfil semelhante em relação ao S. aureus e E. coli entre os grupos, apesar do COL- apresentar maior intensidade de fagocitose do D7 ao D14. Houve tendência para o aumento da proporção de granulócitos liberando H2O2 basal no D14 para o COL-, entretanto o COL + apresentou tendência para maior intensidade da fagocitose no D21. A proporção de granulócitos (%), estimulados com S. aureus, liberando H2O2 foi maior no COL+ em D7, enquanto o estímulo com a E. coli não resultou em diferenças entre os grupos. A intensidade de fluorescência foi maior e gradual no COL+ quando as células foram estimuladas, porém não foram encontradas diferenças estatísticas. As células do colostro influenciaram no perfil sanitário apresentado pelas bezerras, observando-se maior intensidade de diarreias, menores teores de ferro sérico e anemias no grupo que recebeu colostro congelado. A migração dos granulócitos sanguíneos foi mais rápida e intensa no COL+ em relação ao COL-, após exposição natural aos patógenos causadores de diarreia. O índice de fagocitose (%) dos granulócitos apresentou semelhança entre os grupos, entretanto a intensidade da fluorescência foi mais intensa no COL-. Em contrapartida, o COL+ demonstrou maior habilidade em produzir H2O2 / The aim of this study was to evaluate the influence of bovine colostrum leukocytes in innate immunity, in the development of the intestinal microbiota and the occurrence of diarrhea in newborn Holstein calves. For this, 20 Holstein calves were followed in the following moments: before colostrum intake (D0); 1-2 (D2); 7 (D7); 14 (D14); 21 (D21) and 28 (D28) days after birth. They were divided into two experimental groups: COL+ group, which received fresh colostrum (4L) from their mothers; and COL-group which received frozen and acellular colostrum (4L) of donor cows. Chapter 1 -The aim of this chapter was to evaluate the presence and influence of colostrum leukocytes in the colonization of the gastrointestinal tract. For this, colostrum samples were seeded in TSA and MacConkey for TPC and TCC; and stool samples on blood agar, MacConkey and Salmonella-Shiguella. Calves presented higher frequency of diarrhea in D14 (COL+ = 78%; COL- = 60%). The COL- group showed higher TPC and TCC/mL (3,93x106 cfu/mL and 3,01x105 cfu/mL) compared to COL+ (0,94x106 cfu/mL and 0,78x105 cfu/mL). Regarding the isolated bacterial species, those that were more frequent in the COL+ were Proteus mirabilis (29.91%), Escherichia coli (28.04%), Citrobacter freundii (5.61%) and Staphylococcus spp (5.61%); in the COL-were Escherichia coli (28.70%), Proteus mirabilis (27.78%), Klebsiella pneumoniae (11.32%) and Morganella morganii (5.66%). The moment with more insolation in both groups was the D2 (COL+ = 26 strains; COL- = 27 strains), period in which started the diarrhea in calves. It was not possible to detect differences between the frequencies of microorganisms between the COL+ and COL- groups. The COL+ and COL- colostrum management did not influence the proportion of aerobic bacteria present in feces and the occurrence of diarrhea in calves during the neonatal period. Chapter 2 The aim of this chapter was to evaluate the influence of colostrum leukocytes in the innate immune response in Holstein calves. The animals were submitted to clinical examination, followed by blood samples collection to perform laboratory tests. The serum cortisol and haptoglobin concentrations did not show statistical differences while the iron concentration was different between groups at D7. The leukogram did not show difference to total leukocytes and absolute neutrophils, but there was a trend between groups at D7 for relative values of neutrophils. The CH138+CD62L+ marker showed no difference between groups, despite an increased expression was detected in COL-. The expression of CH138+CD62L- was greater in COL+ at D14. The phagocytosis and production of H2O2 by blood neutrophils showed similar profile in relation to S. aureus and E. coli between groups, although COL- presented greater phagocytosis intensity from D7 to D14. There was a trend for the increase of granulocyte proportion, releasing basal H2O2 at D14 for COL-, however COL+ presented trend to a higher intensity of phagocytosis at D21. The proportion of granulocytes (%) stimulated with S. aureus releasing H2O2 was greater in COL+ at D7, while stimulation with E. coli resulted in no differences between the groups. The fluorescence intensity was higher and gradual in COL+ when cells were stimulated; however, it was not detected statistical differences. The colostrum cells influenced in the health profile presented by the calves, with a higher intensity of diarrhea, lower levels of serum iron and anemia in the group that received frozen colostrum. The migration of blood granulocytes was faster and more intense in COL+ in relation to COL- after natural exposure to pathogens that cause diarrhea. The phagocytosis rate (%) of granulocytes showed similarity between groups, although the fluorescence intensity of COL- was more intense. In contrast, the COL+ demonstrated greater ability in producing H2O2

Microcistinas (MCs) são heptapeptídeos cíclicos produzidos por cianobactérias e possuem potente hepatotoxicidade e atividade promotora de tumor. Em intoxicações agudas induzidas por MCs ocorre infiltração leucocitária no foco inflamatório. Embora os mecanismos de hepatotoxicidade não são claros, o recrutamento de neutrófilos no fígado pode contribuir ao dano tecidual e desenvolvimento tumoral causados por xenobióticos. O objetivo dessa tese foi investigar os efeitos de três estruturalmente distintas MCs (MC-LA, MC-YR e MC-LR) nas seguintes funções de neutrófilos: síntese e expressão de moléculas de adesão, rolamento, adesão, migração e liberação de citocinas e de ROS. Nos ensaios de migração em bolsa de ar, as três MCs induziram similarmente a migração de leucócitos in vivo em tecido subcutâneo de ratos e diferencialmente a secreção de citocinas pró-inflamatórias (CINC, IL-1β, TNF-α, VEGF-α e MIP) no exsudato. Concentrações elevadas de CINC-2αβ foram encontradas nos exsudatos inflamatórios de animais após injeção de MC-LA, MC-LR ou MC-YR. MIP-2 elevou-se apenas em exsudatos de animais expostos a MC-LR. Não foram observadas alterações em secreção de IL-1β, TNF-α e VEGF-α. Estudos de microscopia intravital mostraram que apenas a aplicação tópica de MC-LR reforçou o rolamento e a adesão de leucócitos no endotélio de vênulas mesentéricas pós-capilares. Esses últimos resultados podem ser dependentes de aumento e expressão da síntese da L-selectina e β2-integrina nos neutrófilos, tal como avaliado por FACS e PCR-RT, respectivamente. Adicionalmente, em ensaios em câmara de Boyden in vitro, as três MCs promoveram locomoção direta de neutrófilos e aumentaram a migração dessas células em resposta ao fMLP, além do aumento de cálcio intracelular observado por microscopia confocal. Os efeitos das MC-LA, MC-YR e MC-LR em neutrófilos humanos e de ratos tiveram o mesmo padrão de resposta. A análise de viabilidade celular, fragmentação de DNA, despolarização de membrana mitocondrial e liberação de ROS intracelulares foram avaliadas pela técnica de FACS. A concentração de ROS extracelular foi medida por quimiluminescência amplificada por lucigenina. A produção de citocinas em células tratadas foram determinadas por ELISA. Observamos aumento da liberação de IL-8, CINC-2α β e da concentração de ROS extracelular por neutrófilos humanos e de ratos pela exposição dessas células com as MCs. Os resultados aqui obtidos mostram o efeito pró-inflamatório direto das MC-LA, MC-YR e MC-LR. A possibilidade de os neutrófilos migrarem e responderem localmente a MCs contribui para a toxicidade destas toxinas. / Microcystins (MCs) are a family of heptapeptide toxins produced by some genera of Cyanobacteria. MCs have potent hepatotoxicity and tumor-promoting activity. Leukocyte infiltration in the liver was observed in MC-induced acute intoxication. Although the mechanisms of hepatotoxicity induced by MCs are still unclear, neutrophil infiltration in the liver may play an important role in triggering toxic injury and tumor development. The purpose of this thesis was to investigate the effects of three structurally distinct MCs (MC-LA, MC-YR and MC-LR) in the neutrophil functions: synthesis and expression of adhesion molecules, rolling, adhesion, migration and release of cytokines and ROS. In migration assays of the air pouch, the three MCs similarly induced the migration of leukocytes in vivo in subcutaneous tissue of rats and differentially the secretion of pro-inflammatory cytokines (CINC-2αβ, IL-1-β, TNF--α, VEGF- α and MIP-2) in exudates. Elevated concentrations of CINC-2αβ were found in the inflamed exudates from animals injected with MC-LA, MC-LR or MC-YR, although MIP-2 was only detected in the exudates from animals injected with MC-LR. There were no changes in the secretion of IL-1-β, TNF-α and VEGF--α. Intravital microscopic studies showed that topical application of MC-LR enhanced the numbers of rolling and adhered leukocytes in the endothelium of postcapillary mesenteric venules. The latter effects may be dependent upon induction of the synthesis and expression of L-selectin and -α2-integrin in neutrophils, as assessed by flow cytometry and RT-PCR, respectively. Conversely, the three toxins promoted direct locomotion of neutrophils and enhanced their migration in response to fMLP, as measured by Boyden chamber assays, and increased intracellular calcium, a messenger in the chemotaxic process. The effects of MC-LA, MC-YR and MC-LR in human neutrophils and mice had the same pattern of response. The analyses of cell viability, DNA fragmentation, mitochondrial membrane depolarization of and release of intracellular ROS were evaluated by the technique of FACS. Extracellular ROS content was measured by lucigenin-amplified chemiluminescence, and cytokines were determined by ELISA. We found that these MCs increased interleukin-8 (IL-8), cytokine-induced neutrophil chemoattractant-2αβ (CINC-2αβ) and extracellular ROS levels in human and rat neutrophils. In conclusion, our results showed that MCs act on specific pathways of neutrophil recruitment, indicating their potential effect on neutrophils activation. This process can significantly contribute to the pathogenesis of hepatic damage due to generation of ROS by neutrophils as well as act on hepatocytes under such conditions and potentially increase injury processes induced by MCs.

A formação de complexos antígeno-anticorpo ou imunocomplexos (ICs) na circulação e sua eliminação faz parte dos mecanismos de defesa imune humoral do ser humano. Em algumas patologias, como lupus eritematoso sistêmico, artrite reumatóide e vasculite auto-imune, ocorre um desequilíbrio nesse processo, que leva à deposição dos ICs nos tecidos e ao desencadeamento de uma reação inflamatória. Esta, por sua vez, envolve o recrutamento e ativação de neutrófilos, que têm importante participação na patogênese dessas doenças. A ativação dos neutrófilos pelos ICs, via receptores para a porção Fc de IgG (FcR) e receptores de complemento (CR), desencadeia diversas funções efetoras, tais como fagocitose, desgranulação e o metabolismo oxidativo, com a produção de espécies reativas de oxigênio (EROs). Estas funções estão envolvidas na digestão dos ICs, na morte de microorganismos, e na regulação do processo inflamatório. Entretanto, nas doenças mediadas por ICs, os neutrófilos ativados liberam grandes quantidades de enzimas e EROs para o meio extracelular, contribuindo para a lesão dos tecidos do hospedeiro e a amplificação do processo inflamatório. Neste trabalho foi avaliado o efeito modulatório de vinte derivados de 3-fenilcumarina nas funções de neutrófilos estimulados por ICs de ovalbumina (OVA) e IgG anti-OVA. Além disso, foi feita a investigação mecanismos de ação dessas substâncias e a análise da relação estrutura-atividade. O metabolismo oxidativo dos neutrófilos ativados por ICs foi medido por ensaio de quimioluminescência dependente de lucigenina ou de luminol (QLlucPMN e QLlumPMN, respectivamente). Observou-se que as 3-fenilcumarinas contendo o grupo substituinte 3,4-metilenodioxi e o grupo substituinte 6,7-orto-diidroxi (C13) ou 6,7-orto-diacetoxi (C13a), bem como a 3-fenilcumarina 6,7,3,4-tetraacetoxilada (C24a), apresentaram atividade inibitória maior que a quercetina (QUER) sobre a QLlucPMN e a QLlumPMN. Para as demais substâncias avaliadas, que foram tão ou menos ativas que a QUER, as características estruturais relacionadas à inibição da QLlucPMN foram um pouco diferentes daquelas relacionadas à inibição da QLlumPMN. Além disso, as 3-fenilcumarinas estudadas e a QUER não apresentaram efeito tóxico sobre os neutrófilos, avaliado pela liberação de lactato desidrogenase e pelo ensaio de exclusão ao corante Azul de Tripan, nas condições empregadas. Para as três 3-fenilcumarinas que apresentaram maior efeito inibitório sobre o metabolismo oxidativo dos neutrófilos (C13, C13a e C24a), o aumento do tempo de pré-tratamento levou a uma tendência de redução do efeito inibitório da substância C24a, mas não influenciou na atividade biológica das substâncias C13 e C13a. Essas três substâncias não interferiram na capacidade fagocítica das células, avaliada por microscopia eletrônica de transmissão. Para todas as 3-fenilcumarinas foi avaliada também a capacidade antioxidante frente ao radical livre 2,2-difenil-1-picril-hidrazil e o efeito inibitório dessas substâncias sobre a quimioluminescência produzida pela reação horseradish peroxidase-H2O2-luminol (QLHRP). Foi observado que a QUER e as 3-fenilcumarinas contendo o grupo substituinte orto-diidroxi (C13, C23, C24) tiveram atividade antioxidante e inibiram a QLHRP, mas suas análogas acetoxiladas (C13a, C23a, C24a), bem como as demais substâncias avaliadas, foram significativamente menos ativas nesses modelos experimentais não celulares. O conjunto de resultados deste trabalho sugere que as atividades biológicas das 3-fenilcumarinas estudadas foram dependentes de suas estruturas químicas, e pequenas modificações nestas podem levar a alterações significativas na magnitude de seus efeitos biológicos. Além disso, tanto a lipofilicidade das substâncias quanto a sua capacidade antioxidante parecem ser relevantes para a modulação eficiente do metabolismo oxidativo dos neutrófilos e da conseqüente lesão tecidual. / Formation and clearance of circulating antigen-antibody complexes or immune complexes (ICs) take part in the humoral immune defense mechanisms. In some diseases, as systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis and auto-immune vasculitis, an imbalance of this process occurs, leading to the ICs deposition within tissues and triggering an inflammatory reaction. The last one involves the recruitment and activation of neutrophils, which have an important role in the pathogenesis of such diseases. Neutrophil activation by ICs, via receptors for the Fc portion of IgG (FcgR) and complement receptors (CR), triggers a sort of effector functions, such phagocytosis, degranulation and the oxidative metabolism, which produces reactive oxygen species (ROS). These functions are involved in the ICs digestion, microbial killing and the inflammatory process regulation. However, the activated neutrophils release large amounts of enzymes and ROS to the extracellular milieu, contributing to the tissue damage and amplification of the inflammatory process in the IC-mediated diseases. In this work, we evaluated the modulatory effect of twenty 3-phenylcoumarin derivatives in the neutrophil functions stimulated by ICs of ovalbumin (OVA) and IgG anti-OVA. In addition, the mechanisms of action of these compounds were investigated, and the structure-activity relationship was analyzed. The IC-activated neutrophil oxidative metabolism was measured by lucigeninor luminol-dependent chemiluminescence assay (CLlucPMN and CLlumPMN, respectively).It was observed that the 3-phenylcoumarins bearing a 3,4-methylenodioxy and the 6,7-orto-dihydroxy (C13) or the 6,7-orto-diacetoxy (C13a) group, as well as the 6,7,3,4-tetraacetoxylated 3-phenylcoumarin (C24a), inhibited CLlucPMN and CLlumPMN more than quercetin (QUER). Regarding the other evaluated compounds, whose inhibitory effects were similar to or lower than QUER, the structural features related to the CLlucPMN inhibition were different from those related to the CLlumPMN inhibition. Moreover, the studied 3-phenylcoumarins and QUER had no toxic effects on neutrophils, as evaluated by lactate dehydrogenase release and Trypan Blue exclusion, under the assessed conditions. With respect to the three 3-phenylcoumarins that had the highest inhibitory effects on the neutrophil oxidative metabolism (C13, C13a and C24a), the increase of the cell pre-treatment period showed a tendency to decrease the inhibitory ability of compound C24a, but did not influence the biological activity of compounds C13 and C13a. These three compounds did not interfere in the neutrophil phagocytic ability, as evaluated by transmission electron microscopy. The antioxidant activity against the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl free radical and the inhibitory effect in the chemiluminescence generated by the horseradish peroxidase-H2O2-luminol reaction (CLHRP) were evaluated for all 3-phenylcoumarins. It was found that QUER and those 3-phenylcoumarins bearing the orto-dihydroxy group (C13, C23, C24) had antioxidant activity and inhibited the CLHRP. However, their acetoxylated analogues (C13a, C23a, C24a) and the other evaluated compounds were significantly less active on these cell-free experimental models. Taken together, the results of the present work suggest that the biological activities of the 3-phenylcounarins here investigated were dependent on their chemical structures, and small changes on the molecule can lead to significant changes on the magnitude of their biological effects. Moreover, both lipophilicity and antioxidant capacity of these compounds seem to be relevant to an efficient modulation of the neutrophil functions and the consequent tissue damage.

O sistema imune inato é organizado por processos complexos que envolvem os diversos tipos celulares que culminam na eliminação de uma variedade de microorganismos a fim de proteger o organismo de infecções. Os neutrófilos são células importantes neste sistema, sendo capazes de migrar rapidamente ao foco da infecção. Estas células reconhecem e fagocitam partículas estranhas e atuam no sentido de elimina-los através da produção de espécies reativas de oxigênio (EROs), proteínas antimicrobianas e enzimas proteolíticas dos grânulos, que são liberadas no fagossomo e no espaço extracelular. Entretanto, em algumas doenças inflamatórias e autoimunes têm sido encontradas lesões nos tecidos envolvendo a produção excessiva de EROs pelos neutrófilos, desencadeada por imunocomplexos (ICs) via receptores Fc gama (Fc) e de complemento (CR). Assim, a modulação da ativação destes receptores e da produção de EROs é importante na manutenção da homeostasia. Nas últimas décadas, flavonóides são considerados como metabólitos secundários promissores mostrando atividade antioxidante e imunomodulatória. Neste trabalho foi avaliado o efeito modulatório dos flavonóides galangina, kaempferol, quercetina e miricetina em algumas funções efetoras de neutrófilos humanos, como o metabolismo oxidativo estimulado via receptores de membrana Fc e/ou CR, fagocitose e atividade microbicida, além do efeito citotóxico, antioxidante e inibitório dessas substâncias sobre a atividade das enzimas mieloperoxidase (MPO) e NADPH oxidase. Os flavonóides analisados mostraram um efeito modulatório negativo no metabolismo oxidativo dos neutrófilos humanos na seguinte ordem: galangina> kaempferol> quercetina > miricetina. Embora a galangina tenha exercido maior atividade, sua ação antioxidante e inibitória na atividade das enzimas MPO e NADPH oxidase foi a menos efetiva dentre os flavonóides avaliados. Além disso, esta substância inibiu de maneira mais acentuada a resposta celular mediada por ambos os receptores Fc e CR quando comparado a estimulação destes receptores individualmente. As substâncias contendo o grupo catecol, quercetina e miricetina mostraram elevada eficiência na inibição da atividade das enzimas NADPH oxidase e MPO, e na redução do radical livre 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). De maneira geral, os flavonóides não interferiram no processo fagocítico e no mecanismo microbicida, e não induziram toxicidade e morte celular por apoptose ou necrose. Os resultados apresentados neste trabalho mostram uma possível aplicação destes flavonóides como fármacos de origem natural em doenças inflamatórias que apresentem acúmulo de neutrófilos, sendo uma ferramenta promissora para o tratamento efetivo destas doenças. / The innate immune system is composed of complex biological processes involving a variety of cell types that eliminate invading microorganisms to protect the host against infection. Neutrophils are key effector cells of this system, being able to migrate rapidly to infection sites. These cells recognize and engulf foreign particles by phagocytosis, and act to destroy them through production and release of reactive oxygen species (ROS), antimicrobial proteins and proteolytic granule enzymes, which are delivered to the phagossomes and to the extracellular environment. However, tissue damage related to excessive neutrophil ROS production triggered by immune complexes (ICs) via Fc-gamma (FcR) and complement receptors (CR) has been found in some inflammatory and autoimmune diseases. So, modulation of both the activation of these receptors and ROS generation are important to the maintenance of body homeostasis. In the last decades, flavonoids have been considered promising plant secondary metabolites with antioxidant and immunomodulatory activity. This study evaluated the modulator effect of four flavonoids (galangin, kaempferol, quercetin and myricetin) in some human neutrophil effector functions, such as the oxidative metabolism stimulated via FcR and CR classes of membrane receptors, phagocytosis and microbicidal activity, as well as the cytotoxic, antioxidant and inhibitory effect of these compounds in the MPO and NADPH oxidase activity. The flavonoids studied showed a negative modulator effect in the human neutrophils oxidative metabolism in the following ranking order: galangin > kaempferol > quercetin > myricetin. Although galangin had shown the highest activity, it was the least effective antioxidant and inhibitor of MPO and NADPH oxidase activity among the flavonoids tested herein. Furthermore, this compound inhibited more the cellular response mediated by both Fc and CR receptors than by each one of them individually. The flavonoids bearing the catechol group, quercetin and myricetin, had a high efficiency to inhibit NADPH oxidase and MPO activity, as well as to reduce the 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazil (DPPH) free radical. In general, the flavonoids did not interfere in the phagocytic process and microbicidal mechanism, and also did not induce toxicity and cell death by apoptosis or necrosis. The group of results presented here provides a possible application of these flavonoids as drugs of natural source in inflammatory diseases with excessive neutrophil infiltration, being a promising tool for an effective treatment of these illnesses.

Melatonina, indolamina amplamente distribuída entre os seres vivos, é o hormônio da glândula pineal e também é produzida de forma parácrina por células imunocompetentes estimuladas. A produção de melatonina pela glândula pineal ocorre apenas no escuro e este hormônio serve para marcar a existência e a duração da noite. A monocamada de células endoteliais que reveste os vasos sanguíneos forma uma interface entre o sangue e os tecidos sendo, portanto, um sensor da presença de melatonina circulante. Essas células participam de diversos processos fisiológicos e fisiopatológicos, como na migração dos leucócitos durante a montagem de uma resposta inflamatória. Neste caso as células endoteliais são capazes de responder a padrões moleculares associados a patógenos tais como, lipopolissacarídeos (LPS) de bactérias Gram negativas. Melatonina circulante modula a interação leucócito endotélio em ratos e a expressão de moléculas de adesão em células endoteliais cultivadas. Este trabalho foi planejado com o objetivo de entender o efeito da melatonina sobre células endoteliais. Para tanto, todos os estudos foram feitos em células cultivadas ativadas ou não com LPS. Todos os ligantes foram administrados diretamente às culturas de células. Verificamos que LPS (1&um;g/mL, 2h) promove a expressão de moléculas de adesão (PECAM-1 e ICAM-1) e aumenta a adesão de neutrófilos. Melatonina (10-9 e 10-4M, 2h) inibe ambas as respostas. Um bloqueador dos receptores de melatonina, luzindol, não reverteu o efeito da melatonina. Um tratamento crônico com melatonina (20 dias) não dessensibiliza a resposta. Portanto, nossos dados mostram que o efeito da melatonina se dá diretamente sobre as células endoteliais, abrindo a perspectiva de um estudo direto dos mecanismos de ação envolvidos nos efeitos gerados pela melatonina / Melatonin, an indoleamine widely distributed among living beings, is the hormone of the pineal gland and is also produced by stimulated immunocompetent cells. Melatonin, which is konwn as the darkness hormone, is produced at night by the pineal gland. In blood vessels, a monolayer of endothelial cells forms the interface between blood and tissue. This monolayer, which participates in several physiological and pathophysiological processes, is a sensor of circulating substances, including melatonin. Regarding the migration of leukocytes during the initiation of an inflammatory response, endothelial cells are able to respond to molecular patterns associated with pathogens such as lipopolysaccharide (LPS) of Gram-negative bacteria. Circulating melatonin modulates the interaction between leukocytes and endotelial cells and the expression of adhesion molecules. This work was planned in order to understand the effect of melatonin on endothelial cells. All studies were performed in cultured cells activated or not with LPS. All ligands were administered directly to cell cultures. We found that LPS promotes the expression of adhesion molecules (PECAM-1 and ICAM-1) and increases the adhesion of neutrophils to endotelial cells. Melatonin (10-9 and 10-4M, 2 hours) inhibits both responses. A chronic treatment with melatonin (20 days) did not desensitize the response. Therefore, our data clearly show that the effect of melatonin occurs directly on endothelial cells, opening the prospect of a direct study of the mechanisms involved in the effects produced by melatonin