Streptococcus suis est un important pathogène porcin et agent zoonotique responsable de méningites et de septicémies. À ce jour, les mécanismes impliqués dans la réponse immunitaire de l’hôte lors de l’infection par S. suis sont peu connus; et il en est de même pour les stratégies utilisées par S. suis afin de déjouer cette réponse. L’augmentation de l’incidence et de la sévérité des cas humains souligne le besoin d’une meilleure compréhension des interactions entre S. suis et le système immunitaire afin de générer une réponse immunitaire efficace contre ce pathogène. Les cellules dendritiques (DCs) sont de puissantes cellules présentatrices d’antigènes qui stimulent les lymphocytes T et B, assurant la liaison entre l’immunité innée et l’immunité adaptative. L’objectif principal de ce projet était d’évaluer le rôle joué par différents facteurs de virulence de S. suis sur la modulation de la fonction des DCs et de la réponse T-dépendante. Nous avons examiné l’effet des facteurs clés pour la virulence de S. suis, dont la capsule polysaccharidique (CPS), les modifications de la paroi cellulaire (D-alanylation de l’acide lipotéichoïque et N-déacétylation du peptidoglycane) et la toxine suilysine, sur l’activation et la maturation de DCs murines dérivées de la moelle osseuse (bmDCs). Suite à l’infection par S. suis, les bmDCs sont activées et subissent un processus de maturation caractérisé par l’augmentation de l’expression de molécules de co-stimulation et la production de cytokines pro-inflammatoires. La CPS est le principal facteur interférant avec la production de cytokines, même si les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine peuvent également moduler la production de certaines cytokines. Enfin, la CPS, les modifications de la paroi cellulaire et la suilysine interfèrent avec la déposition du complément à la surface des bactéries et, en conséquence, avec le « killing » dépendant du complément. Les résultats ont été confirmés à l’aide de bmDCs porcines. Nous avons aussi voulu identifier les récepteurs cellulaires impliqués dans la reconnaissance de S. suis par les DCs. Nous avons démontré que la production de cytokines et l’expression des molécules de co-stimulation par les DCs sont fortement dépendantes de la signalisation par MyD88, suggérant que les DCs reconnaissent S. suis et deviennent activées majoritairement via la signalisation par les récepteurs de type Toll (TLRs). En effet, on remarque une diminution de la production de plusieurs cytokines ainsi que de l’expression de certaines molécules de co-stimulation chez les DCs TLR2-/- ou TLR2-/- et TLR9-/- double négatives. Finalement, le récepteur NOD2 semblait jouer un rôle partiel dans l’activation des DCs suite à une infection par S. suis.Enfin, nous avons évalué les conséquences de la modulation des fonctions des DCs sur le développement de la réponse T-dépendante. Les splénocytes totaux produisent plusieurs cytokines en réponse à S. suis. Des analyses in vivo et ex vivo ont permis d’observer l’implication des cellules T CD4+ et le développement d’une réponse de type « T helper » 1 (TH1) bien que la quantité de cytokines TH1 produites lors de l’infection in vivo par S. suis demeure assez basse. La CPS de S. suis interfère avec la production de plusieurs cytokines par les cellules T in vitro. Expérimentalement, l’infection induite par S. suis résulte en de faibles niveaux de production d’anticorps anti-S. suis, mais aussi d’anticorps dirigés contre l’ovalbumine utilisée comme antigène rapporteur. Cette interférence est corrélée avec la sévérité des signes cliniques, suggérant que S. suis interfère avec le développement d’une réponse immunitaire adaptative appropriée qui serait requise pour contrôler la progression de l’infection. Les résultats de cette étude mèneront à une meilleure compréhension de la réponse immunitaire de l’hôte lors de l’infection par S. suis. / Streptococcus suis is an important swine pathogen and an emerging zoonotic agent of septicemia and meningitis. Knowledge of host immune responses towards S. suis, and strategies used by this pathogen for subversion of these responses is scarce. Increased severity of S. suis infections in humans underscores the critical need to better understand the interactions between S. suis and the immune system to generate an effective immune response against this pathogen. Dendritic cells (DCs) are powerful antigen-presenting cells. Once activated, they stimulate T cells and B cells, linking innate and adaptive immunity. Thus, the main objective of this project was to evaluate the role of different S. suis virulence factors on the modulation of DC functions and the T cell-dependent response. Initially, we investigated the effect of S. suis key virulence factors, including the capsular polysaccharide (CPS), the cell wall modifications (D-alanylation of the lipoteichoic acid and N-deacetylation of the peptidoglycan) and the toxin suilysin, on the activation and maturation of mouse bone-marrow derived DCs (bmDCs). We observed that following S. suis infection, bmDCs are activated and go through a complex maturation process characterized by the up-regulation of the surface expression of costimulatory molecules and the production of pro-inflammatory cytokines. The CPS is the main virulence factor interfering with cytokine production, even if cell wall modifications and suilysin can also modulate the production of cytokines. Finally, CPS, cell wall modifications and suilysin were shown to interfere with complement deposition on S. suis, and consequently with complement-dependent killing. Results were confirmed using porcine bmDCs. We also aimed to identify the cellular receptors involved in S. suis recognition by DCs. Production of cytokines and expression of co-stimulatory molecules by DCs were shown to strongly rely on MyD88-dependent signaling pathways, suggesting that DCs recognize S. suis and become activated mostly through Toll-like receptor (TLR) signaling. Supporting this fact, TLR2-/- or double negative TLR2-/- and TLR9-/- DCs were severely impaired in the release of several cytokines and the surface expression of certain costimulatory molecules. In addition, NOD2 receptor also seems to play a partial role in DC activation by S. suis. Finally, we evaluated the consequences of the modulation of DC functions on T cell activation. In response to S. suis infection, total splenocytes readily produced several cytokines ex vivo. Ex vivo and in vivo analysis revealed the involvement of CD4+ T cells and development of a T helper 1 (TH1) response. Nevertheless, levels of TH1-derived cytokines during S. suis infection were very low. The bacterial CPS was shown to interfere with the release of several T cell-derived cytokines in vitro. As a consequence, a clinical infection resulted in low levels of not only anti-S. suis antibodies but also of those directed against ovalbumin, used as reported antigen. This interference was correlated with the presence of severe clinical signs of S. suis disease. These data suggest that S. suis impairs the development of an efficient adaptive immune response, which is required to control the infection progress. Overall, these results will permit a better comprehension of the host immune response during S. suis infection.

Streptococcus suis est un important pathogène porcin et humain, causant méningites et septicémies. Des études suggèrent que S. suis dispose de facteurs de virulence, notamment sa capsule polysaccharidique (CPS), qui lui permettent de moduler les fonctions des cellules dendritiques (DCs), situées à l’interface entre l’immunité innée et adaptative. Les difficultés à développer un vaccin efficace suggèrent aussi une altération de la voie T dépendante. L’objectif général du projet était d’évaluer l’effet de S. suis sur l’activation des cellules T CD4+ ainsi que sur la capacité de présentation antigénique des DCs. Nous avons étudié dans un modèle murin in vivo la réponse T CD4+ mémoire lors d’infections primaire et secondaire. Une faible réponse mémoire centrale a été obtenue, suggérant que la réponse adaptative générée contre S. suis est limitée. Étant donné l’importance du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) de classe II dans la présentation antigénique, nous avons évalué in vitro et in vivo l’expression de ces molécules chez les DCs. Une modulation de l’expression du MHC-II par S. suis a été observée. L’analyse de la transcription de gènes impliqués dans la régulation transcriptionnelle et post-transcriptionnelle du MHC-II nous permet de suggérer que S. suis régule à la baisse la synthèse de nouvelles molécules et favorise leur dégradation lysosomale. Cette stratégie, dans laquelle la CPS ne jouerait qu’un rôle partiel, permettrait à S. suis d’échapper à la réponse adaptative T dépendante. Les résultats de cette étude fourniront de nouvelles perspectives dans la compréhension de la réponse adaptative lors de l’infection par S. suis. / Streptococcus suis is an important swine and human pathogen causing meningitis and septicemia. Recent studies suggest that S. suis possesses several virulence factors, including the capsular polysaccharide, which enable this pathogen to modulate dendritic cell (DCs) functions. DCs are key immune cells that bridge innate and adaptive immunity. Moreover, the difficulties in developing an effective vaccine suggest that S. suis interferes with the T-cell dependent response. The main objective of the project was to evaluate the effect of S. suis on CD4+ T-cell activation, as well as on the antigen presentation ability of DCs. We investigated the CD4+ T-cell memory response in an in vivo mouse model. A poor central memory response was obtained following primary and secondary infections with S. suis, thus suggesting that the adaptive immune response against this pathogen is limited. The major histocompatibility complex (MHC) class II is central to the antigen presentation pathway. We thus investigated in vitro and in vivo the expression of these molecules on DCs. We observed a modulation in the expression of MHC-II by S. suis. Transcriptional analysis of genes involved in transcriptional and post-transcriptional regulation of MHC-II suggests that S. suis downregulates synthesis of MHC-II molecules and promotes their lysosomal degradation. This strategy, in which the CPS would play only a partial role, might allow S. suis to evade the T-cell dependent adaptive response. Overall, these results provide new insights into the comprehension of the adaptive immune response during the infection by S. suis.

Lors de l’infection par un pathogène intracellulaire, l’organisme déclenche une réponse immunitaire spécifique dont les acteurs principaux sont les lymphocytes T-CD8. Ces cellules sont responsables de l’éradication de ce type d’infections et de la constitution du répertoire immunitaire de l’individu. Les processus qui composent la réponse immunitaire se répartissent sur plusieurs échelles physiques inter-connectées (échelle intracellulaire, échelle d’une cellule, échelle de la population de cellules). La réponse immunitaire est donc un processus complexe, pour lequel il est difficile d’observer ou de mesurer les liens entre les différents phénomènes mis en jeu. Nous proposons trois modèles mathématiques multi-échelles de la réponse immunitaire, construits avec des formalismes différents mais liés par une même idée : faire dépendre le comportement des cellules TCD8 de leur contenu intracellulaire. Pour chaque modèle, nous présentons, si possible, sa construction à partir des hypothèses biologiques sélectionnées, son étude mathématique et la capacité du modèle à reproduire la réponse immunitaire au travers de simulations numériques. Les modèles que nous proposons reproduisent qualitativement et quantitativement la réponse immunitaire T-CD8 et constituent ainsi de bons outils préliminaires pour la compréhension de ce phénomène biologique. / Upon infection by an intracellular pathogen, the organism triggers a specific immune response,mainly driven by the CD8 T cells. These cells are responsible for the eradication of this type of infections and the constitution of the immune repertoire of the individual. The immune response is constituted by many processes which act over several interconnected physical scales (intracellular scale, single cell scale, cell population scale). This biological phenomenon is therefore a complex process, for which it is difficult to observe or measure the links between the different processes involved. We propose three multiscale mathematical models of the CD8 immune response, built with different formalisms but related by the same idea : to make the behavior of the CD8 T cells depend on their intracellular content. For each model, we present, if possible, its construction process based on selected biological hypothesis, its mathematical study and its ability to reproduce the immune response using numerical simulations. The models we propose succesfully reproduce qualitatively and quantitatively the CD8 immune response and thus constitute useful tools to further investigate this biological phenomenon.

Depuis 2013, le traitement « universel » est recommandé en France. Le moment de l’initiation thérapeutique est une question qui reste cependant d’actualité pour les patients se présentant en primo-infection. Cette thèse s’attache à étudier la prise en charge thérapeutique du VIH au stade de la primo-infection (PIV) sous différents angles :1) le suivi par les cliniciens des recommandations d’initiation des traitements antirétroviraux depuis 1996 en fonction de l’évolution de ces recommandations; 2) l’impact d’un traitement ARV transitoire en PIV sur la réponse immuno-virologique lors de la reprise du traitement et 3) l’identification de nouveaux biomarqueurs comme facteurs pronostiques de progression de l’infection VIH. La majorité des travaux présentés dans cette thèse repose sur les données de la cohorte ANRS PRIMO qui comporte environ 1 500 patients infectés par le VIH inclus en PIV entre juin 1996 et décembre 2013, dans 94 hôpitaux français. Tous les patients étaient naïfs de traitement antirétroviral à l'inclusion.La première partie de la thèse analyse la mise en œuvre des recommandations d’initiation du traitement ARV entre 1996 et 2010 par les médecins en France, dans deux situations distinctes : au stade chronique et lors de la primo-infection par le VIH-1. Nous avons montré que les recommandations d’initiation du traitement ARV étaient largement suivies. Néanmoins, il existe un effet d’inertie dans leurs applications lors des changements de recommandation. Il reste à améliorer le délai de mise sous traitement lorsque le taux de CD4 atteint le seuil recommandé. Au stade chronique, le traitement était plus fréquemment initié chez les patients présentant un critère d’initiation dès le diagnostic d’infection par le VIH (96%), que chez les patients qui atteignaient un critère d’initiation au cours du suivi (78%, p<0.001). Nous avons identifié comme facteurs de risque de ne pas être traité en phase chronique malgré une indication de traitement : une charge virale < 5log (versus >5), un plus faible niveau d’éducation et des conditions de vie précaires.L’impact de l’interruption d’un traitement antirétroviral initié en PIV sur la restauration des CD4 après reprise du traitement a été exploré en modélisant l’évolution des CD4 avec des modèles linéaires à effets mixtes avec intercept et pente aléatoires. Les patients qui avaient initié un traitement ARV pendant la phase chronique avaient une meilleure réponse immunologique que les patients reprenant un 2ème traitement après un traitement transitoire en PIV : à 36 mois, les gains en √CD4 cellules/mm3 et en pourcentage de CD4 étaient significativement plus élevés. Cependant, il s’agissait de différences modestes en termes cliniques, qui ne conduisent pas à recommander d’arrêter la recherche clinique sur les arrêts de traitement cherchant à induire des contrôleurs post traitement. Après un état des lieux des mécanismes complexes d’activation/inflammation du système immunitaire pendant la primo-infection nous avons cherché à identifier de nouveaux biomarqueurs prédictifs de l’évolution de l’infection. Le taux de sCD14 (marqueur d’activation monocyte/macrophage et marqueur indirect de translocation microbienne) au moment de la PIV a été identifié comme marqueur potentiel de prédiction du déclin des CD4 et du risque de mortalité d’origine cardio-vasculaire. En conclusion, bien que des progrès considérables aient été réalisés dans la prise en charge du VIH, d'autres études sont nécessaires pour optimiser et adapter le traitement au profil du patient dès les premiers stades de l’infection VIH. / In France, since 2013, HIV treatment has been recommended for all HIV-infected patients independently of their CD4 count. However, when to start anti-retroviral (ARV) treatment is still an issue. This thesis aims to explore the therapeutic management of HIV at the stage of PHI in different aspects: 1) we explored how physicians in France have applied the evolving guidelines for ART initiation since 1996 2) the impact of a transient ARV treatment at PHI on immuno-virological response during 2nd treatment and 3) identification of new biomarkers prognostic of HIV progression.Most of the work presented in this thesis is based on data from the ongoing ANRS PRIMO cohort that enrolled more than 1 500 HIV infected patients enrolled at PHI since June 1996 in 94 French hospitals. All patients were antiretroviral therapy naive at baseline.The first part of the thesis analyzes the implementation of the recommendations of ARV treatment initiation between 1996 and 2010 by physicians in France, in two distinct situations: in the chronic HIV-1 infection and during primary HIV-1 infection. We have shown that the recommendations of ARV treatment initiation were widely followed. Nevertheless, there was inertia in guidelines application when changes in the recommendations took place. The time to treatment when CD4 cell counts reach the threshold to treat can be improved. 96% of the patients initiated ART when they had a CD4 cell count below the threshold to treat at entry, while treatment was less timely initiated when the CD4 threshold was reached during active follow-up (78%, p <0.001).We identified as risk factors for not being timely treated in chronic phase despite an indication for treatment: a viral load <5log (versus> 5), a lower education level and poor living conditions.The impact of ARV interruption after a first treatment initiated at PHI on the CD4 count restoration after resumption was explored by modeling the evolution of CD4 cells with linear mixed effects models with random intercept and slope. Patients who initiated ARV treatment during the chronic phase had a better immune response than patients who initiated a second course treatment after a transient ART at PHI: at 36 months, the gains in √CD4 cells / mm3 and CD4 percentage were significantly higher. However, this difference was clinically modest and further research on treatment interruptions seeking to induce post-treatment controllers is still an issue but only in research settings and under close medical surveillance. After an overview of the complex mechanisms of activation / inflammation of the immune system during primary infection we sought to identify new predictive biomarkers of disease progression. The level of sCD14 (marker of monocyte/macrophage activation and an indirect marker of microbial translocation) at the time of PHI was identified as predictive marker of CD4 decline and of risk of cardio-vascular mortality. In conclusion, although considerable progress has been made in the management of HIV, further studies are needed to optimize and adapt the treatment to the patient profile in the early stages of HIV infection.

Les méthodes de vaccination actuelles contre l’influenza, axées sur la réponse à anticorps dirigée contre des antigènes hautement variables, nécessitent la production d’un vaccin pour chaque nouvelle souche. Le défi est maintenant de stimuler simultanément une réponse cellulaire pan-spécifique ciblant des antigènes conservés du virus, tel que la protéine de la matrice (M1) ou la nucléoprotéine (NP). Or, la présentation antigénique de ces protéines est peu définie chez l’humain. Nous avons analysé la présentation endogène par les complexes majeurs d’histocompatibilité de classes (CMH)-I et -II de M1 et de NP. Ainsi, les protéines M1 et NP ont été exprimées dans des cellules présentatrices d’antigènes (CPAs). Notamment, des épitopes de M1 et de NP endogènes peuvent être présentées par CMH-I et -II, ce qui résulte en une activation respectivement de lymphocytes T CD8+ et CD4+ précédemment isolés. Étant donné l’importance des lymphocytes T CD4+ dans la réponse cellulaire, nous avons cloné M1 ou NP en fusion avec des séquences de la protéine gp100 permettant la mobilisation vers les compartiments du CMH-II sans affecter la présentation par CMH-I. Des CPAs exprimant de façon endogène ces constructions modifiées ou sauvages ont ensuite été utilisées pour stimuler in vitro des lymphocytes T humains dont la qualité a été évaluée selon la production de cytokines et la présence de molécules de surface (ELISA ou marquage de cytokines intracellulaire). Nous avons observé une expansion de lymphocytes T CD8+ et CD4+ effecteurs spécifiques sécrétant diverses cytokines pro-inflammatoires (IFN-γ, TNF, MIP-1β) dans des proportions comparables avec une présentation par CMH-II basale ou améliorée. Cette qualité indépendante du niveau de présentation endogène par CMH-II de M1 et de NP des lymphocytes T CD4+ et CD8+ suggère que cette présentation est suffisante à court terme. En outre, la présentation endogène de M1 et NP a permis de stimuler des lymphocytes T spécifiques à des épitopes conservés du virus, tel qu’identifié à l’aide une méthode d’identification originale basée sur des segments d’ARNm, « mRNA PCR-based epitope chase (mPEC) ». Ensemble, ces nouvelles connaissances sur la présentation antigénique de M1 et de NP pourraient servir à établir de nouvelles stratégies vaccinales pan-spécifiques contre l’influenza. / New vaccines targeting hyper-variable influenza determinants must be prepared against every new strain. The challenge is now to develop influenza vaccines also eliciting a strong and sustained cytotoxic response against highly-conserved determinants such as the matrix (M1) and nuclear (NP) proteins. However, their antigenic presentation properties in humans are less defined. We, therefore, analyzed major histocompatibility complex class (MHC)-I and -II presentation of endogenously processed M1 and NP in human antigen presenting cells (APCs). To do so, we used APCs endogenously-expressing the M1 and NP proteins. M1 and NP epitopes can be presented by MHC-I and -II, which results in the activation of previously-isolated antigen-specific CD8+ and CD4+ T lymphocytes. Considering the importance of CD4+ T lymphocytes in the cellular immune response, we cloned M1 and NP proteins in fusion with gp100 MHC-II enhancing sequences, which do not disrupt MHC-I presentation. APCs expressing MHC-II-enhanced or wild type constructs were used to stimulate human T lymphocytes in vitro and quality of antigen presentation was evaluated on the basis of cytokine production and cell surface molecule expression (ELISA or intracellular cytokine staining). We expanded antigen-specific effector CD8+ and CD4+ T lymphocytes which secreted pro-inflammatory cytokines (IFN-γ, TNF and MIP-1β) to similar extents both with and without MHC-II enhancement. The quality of CD4+ and CD8+ T lymphocytes generated independent of the level of M1 and NP endogenous MHCII presentation suggests that this presentation is sufficient for short-term T lymphocyte stimulation. Thus, endogenous expression of M1 and NP have stimulated T lymphocytes specific to conserved influenza epitopes, as determined by an original identification technique based on mRNA segments called mRNA PCR-based epitope chase (mPEC). Overall, these new insights about T lymphocytes expanded following MHC-I and -II presentation of endogenous M1 and NP could prove useful for new complementary heterosubtypic vaccination strategies.

L’asthme chez l’homme et le souffle chez le cheval sont des maladies inflammatoires chroniques des voies respiratoires partageant plusieurs caractéristiques physiopathologiques dont la bronchoconstriction réversible, l’inflammation des voies respiratoires inférieures, l’hyperréactivité bronchique et le remodelage tissulaire. Les phénotypes cliniques d’asthme se caractérisent en partie selon le type d’inflammation affectant les voies respiratoires et la présence ou non d’allergie. Le souffle chez le cheval s’avère être un modèle adapté pour l’étude des mécanismes impliqués dans l’asthme neutrophilique, lesquels demeurent particulièrement mal compris, en contraste avec ceux associés avec l’asthme éosinophilique. La réponse immunologique sous-jacente au souffle implique entre autres l’expression de cytokines de type Th2, suggestives d’une réponse allergique (immunité acquise). La poussière environnementale qui provoque les symptômes du souffle contient également des agents non-spécifiques dérivés de bactéries, champignons et moisissures, susceptibles d’activer des mécanismes immunitaires innés chez les chevaux atteints du souffle. Nous avons étudié le rôle des neutrophiles dans l’inflammation associée à la réponse innée et acquise chez le cheval atteint du souffle. Dans un premier temps, l’effet de produits dérivés de bactéries sur l’activation des neutrophiles sanguins provenant de chevaux normaux et atteints de souffle a été étudié dans le but d’évaluer la contribution de la réponse innée dans la physiopathologie du souffle. Nous avons évalué l’effet de l’IL-4, une cytokine de type Th2, sur les neutrophiles des deux groupes de chevaux afin d’évaluer de quelle manière le neutrophile peut participer à la réponse acquise associée à la réponse allergique. Finalement, nous avons étudié l’expression des isoformes de l'arginase par les neutrophiles équins car cette enzyme métabolise la L-arginine et est potentiellement impliquée dans le bronchospasme et le remodelage tissulaire associés à l’asthme. Nos résultats suggèrent que les neutrophiles et les mononucléaires sanguins isolés des chevaux atteints du souffle possèdent une réponse inflammatoire exagérée en réponse aux lipopolyssacharides et peptides formylés et surexpriment les cytokines pro-inflammatoires IL-1β, TNF et IL-8. Cette réponse innée aberrante est associée à une inflammation systémique caractérisée par des concentrations sériques élevées de TNF chez les chevaux atteints du souffle en période de rémission clinique. De plus, nos résultats montrent que l’IL-4 active le neutrophile équin et favorise son chimiotactisme de manière autocrine. L’IL-4 induit un phénotype d’activation typique dans le neutrophile équin, caractérisé par l’expression accrue des cytokines pro-inflammatoires (IL-8 et TNF) ainsi que de récepteurs potentiellement impliqués dans la réponse allergique (IL-4Rα et CD23). Enfin, nous montrons que que l’arginase 1 n’est pas un marqueur de l’activation des neutrophiles équins par l’IL-4, mais que ces cellules expriment constitutivement l’isoforme 2 fonctionnelle de l’arginase. La surrégulation des deux isoformes au niveau des poumons périphériques semble être associée à la pathologie du souffle, ce qui est en accord avec les modèles d’asthme chez la souris, le rat et le cobaye. L'ensemble de ces travaux suggère que les neutrophiles sont des cellules effectrices importantes de la réponse innée et acquise dans la pathophysiologie du souffle, un modèle naturel d’asthme neutrophilique. / Human asthma and equine heaves are chronic pulmonary diseases sharing several pathophysiological properties including lower airway inflammation, reversible bronchoconstriction, bronchial hyperresponsiveness, and tissue remodeling. Clinical phenotypes of asthma are characterized in part by the inflammatory cell populations infiltrating the airways, and the presence or absence of allergy. Heaves is a suitable animal model for the study of the poorly defined pathophysiological processes leading to airway neutrophilia. The immune response in heaves involves Th2 cytokine expression, which is, among other features, associated to allergic inflammation (acquired immunity). Environmental dust exposure leading to clinical exacerbation of heaves contains non-specific agents derived from bacteria, molds or fungi which could also activate innate immune responses in heaves affected horses. We studied the role of neutrophils in innate and acquired immune responses in heaves affected-horse. First, innate immune responses of neutrophils isolated from normal and heaves-affected horses to bacterial-derived products were studied. We also assessed the effect of IL-4, a Th2 cytokine, on equine neutrophils isolated from both groups of horses. Finally, we evaluated the arginase isoforms expressed by equine neutrophils as this enzyme that takes part to the L-arginine metabolism and is thought to contribute to bronchospasm and tissue remodeling associated with asthma. Our results suggest that both neutrophils and mononuclear cells from heaves-affected horses, when compared to healthy horses, have an excessive inflammatory response to lipopolyssacharides and formylated peptides characterized by increased IL-1β, IL-8 and TNF expression. This altered innate response was associated with systemic inflammation in asymptomatic susceptible horses as high serum TNF concentrations were detected. Furthermore, we found that equine neutrophils are activated by IL-4 and release neutrophil chemotactic factors in response to this cytokine. IL-4 also induces a distinctive activation phenotype in neutrophils that is characterized by increased expression of the pro-inflammatory cytokines (IL-8 and TNF) and receptors (IL-4Rα and CD23) potentially involved in the allergic response. Finally, we showed that arginase 1 is not a marker of IL-4-activated equine neutrophils although they constitutively express a functionally active isoform 2 of the enzyme. The up-regulation of arginase isoforms in the peripheral lungs of horses with heaves suggests a role for arginase in this model, as it is described in the mouse, rat and guinea pig models. Taken together, this work suggest that neutrophils could play an important role in both innate and acquired immune responses associated with heaves pathophysiology, a natural model of neutrophilic asthma. / Réalisé en cotutelle avec le Dr James G Martin de l'Université McGill (Meakins-Christie laboratories)

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Les mycotoxines sont des métabolites secondaires de moisissures contaminant de façon naturelle de nombreuses denrées alimentaires, notamment les céréales. Le déoxynivalénol (DON), produit par Fusarium sp., est la mycotoxine la plus répandue dans le monde. Du fait de sa grande stabilité chimique, le DON est difficile à éliminer, et se retrouve dans les céréales et les produits finis ou il induit des effets toxiques pour l'homme et l'animal. De nouvelles stratégies de lutte sont mises en places, telle la transformation biologique utilisant des bactéries ou des plantes. En effet certaines bactéries possèdent des enzymes capables de transformer le DON en de nouveaux composés, le déepoxy-déoxynivalénol (DOM-1) et le 3-épi-déoxynivalénol (3-epi-DON). De plus, certaines plantes sont naturellement capables de transformer le DON dans le but de l'éliminer et de le détoxifier, formant ainsi le deoxynivalénol-3-ß-D-glucoside (D3G). L'objectif de cette thèse était d'évaluer la toxicité de ces dérivés du DON au niveau de l'intestin et du système immunitaire par le biais d'analyses in silico, in vitro, ex vivo et in vivo. Les tests de toxicité in vitro sur la lignée humaine intestinale cellulaire Caco-2 montrent que le DOM-1, le 3-epi-DON et le D3G n'étaient pas cytotoxiques, ils ne modifiaient ni la viabilité, ni la fonction de barrière des cellules, mesurée par la résistance électrique transépithéliale. Les tests de toxicité ex vivo sur des explants jéjunum porcin ont montré que le DOM-1, le 3-epi-DON ou le D3G n'induisaient pas de modifications histomorphologiques. En revanche, les explants exposés au DON montraient des lésions morphologiques et une régulation positive de l'expression des cytokines pro-inflammatoires. L'impact de ces trois dérivés a été également analysé sur l'expression de l'ensemble des gènes du tissu, avec une analyse microarray. Ceci a montré que ces dérivés du DON n'induisaient aucun changement dans l'expression des gènes par rapport au groupe contrôle. Le DON quand a lui exprimait différentiellement 747 sondes, correspondantes à 333 gènes impliqués dans l'immunité, la réponse inflammatoire, le stress oxydatif, la mort cellulaire, le transport moléculaire et la fonction mitochondriale. L'analyse in silico a montré que le D3G, contrairement au DON était incapable de se lier au site-A du ribosome, principale cible de la toxicité pour le DON. Les deux dérivés microbiens eux, étaient capables de se fixer au site-A au sein du ribosome, mais contrairement au DON ils ne formaient que deux liaisons hydrogènes au lieu de trois. De plus, ces trois dérivés n'induisaient pas de stress ribotoxique, d'activation des MAPKs (mitogen-activated protein kinases), et de réponse pro-inflammatoire. Une étude complémentaire a été menée in vivo pour évaluer la toxicité du DOM-1 chez le porc (gavage pendant 21 jours avec .0.14mg / kg de poids vif). Les résultats ont montré que le DOM-1, contrairement au DON n'induisait pas les effets toxiques du DON au niveau des paramètres zootechniques (pas de vomissements, aucune diminution de la consommation alimentaire ou de perte de poids), sur l'intestin et le foie (pas de dommages tissulaires), ou sur la réponse immunitaire (pas de réponse inflammatoire induite). En conclusion, nos résultats montrent l'efficacité de ces transformations enzymatiques. La déepoxydation et l'épimérisation bactérienne, ainsi que la glycosylation par les plantes permettent de sensiblement diminuer la toxicité du DON, passant par une absence de toxicité sur le ribosome avec une absence d'activation des MAPKs et de réponses inflammatoires. Dans ce contexte de contamination par les mycotoxines, ces méthodes de luttes alternatives semblent être des approches prometteuses. / The Fusarium sp. mycotoxin deoxynivalenol (DON) is one of the most frequently widespread mycotoxin worldwide. Due to its high structural stability, the elimination of DON, once present in cereals or feed materials, becomes difficult. Thereby, it is present in many cereals and final feed products, inducing several toxic effects on human and animals, and causing big economic losses. New strategies of to fight against mycotoxins were developed, as biological transformation, either by the use of bacteria or plants. Indeed, some microorganisms are able to transform DON in new products, by enzymatic reaction, forming the deepoxy-deoxynivalenol (DOM-1) and the 3-epi-deoxynivalenol (3-epi-DON). Moreover, some plants naturally own the capacity to glycosylate DON in the aim to detoxify it, forming the deoxynivalenol-3-ß-D-glucoside (D3G). The aim of this thesis was to assess the toxicity of these DON derivatives, on the intestine and immune response, using several approaches such as in silico, in vitro, ex vivo and in vivo models. On the human intestinal Caco-2 cell line, DOM-1, 3-epi-DON and D3G were not cytotoxic; they did not alter its viability and barrier function, as measured by the trans epithelial electrical resistance. The expression profile of DOM-1, 3-epi-DON and D3G-treated jejunal explants was similar to that of controls and these explants did not show any histomorphology alteration. On the other hand, the treatment of intestinal explants with DON, induced morphological lesions and upregulated the expression of proinflammatory cytokines. The impact of these three derivatives was also studied on intestinal explants with a pan-genomic transcriptomic analysis. Results show that the derivatives of DON did not induce any change on the gene expression in comparison to the control-treated explants. In contrary, DON-treated explants differentially expressed 747 probes, representing 323 genes involved in immune and inflammatory responses, oxidative stress, cell death, molecular transport and mitochondrial function. In silico analysis revealed that D3G, opposing to DON, was unable to bind to the A site of the ribosome, which is the main target for DON toxicity. Both DOM-1 and 3-epi-DON were able to fit into the pockets of the A site of the ribosome but only by forming two hydrogen bonds, while in this position, DON forms three hydrogen bonds. Moreover, the three derivatives do not elicit a ribotoxic stress, MAPKinase activation, and inflammatory response. Then, an in vivo study was carried out to assess the toxicity of DOM-1 on pig (feed forced during 21 days at 0.14 mg/Kg BW). The results showed that DOM-1 does not have as much toxic effects as DON on zootechnical parameters (no emesis induced, no decrease of food consumption or weight loss observed), on intestine and liver (no tissues damages), or on the immune response (no inflammatory response induced). Our data demonstrate that bacterial de-epoxidation or epimerization of deepoxy-DON modified its interaction with the ribosome, leading to an absence of MAPKinase activation and toxicity; and that the glycosylation of DON suppresses its ability to bind to the ribosome and decreases its intestinal toxicity. The mycotoxin deoxynivalenol (DON) remains an important challenge in many regions in the world. Thus, these biological detoxifications of DON seem to represent a new promising approach helping manage the problem of its contamination.

Les vaccins ont été une grande réussite en matière de santé publique au cours des dernières années. Cependant, le développement de vaccins efficaces contre les maladies infectieuses telles que le VIH ou le virus Ebola reste un défi majeur. Cela peut être attribué à notre manque de connaissances approfondies en immunologie et sur le mode d'action de la mémoire immunitaire. Les modèles mathématiques peuvent aider à comprendre les mécanismes de la réponse immunitaire, à quantifier les processus biologiques sous-jacents et à développer des vaccins fondés sur un rationnel scientifique. Nous présentons un modèle mécaniste de la dynamique de la réponse immunitaire humorale après injection d'un vaccin Ebola basé sur des équations différentielles ordinaires. Les paramètres du modèle sont estimés par maximum de vraisemblance dans une approche populationnelle qui permet de quantifier le processus de la réponse immunitaire et ses facteurs de variabilité. En particulier, le schéma vaccinal n'a d'impact que sur la réponse à court terme, alors que des différences significatives entre des sujets de différentes régions géographiques sont observées à plus long terme. Cela pourrait avoir des implications dans la conception des futurs essais cliniques. Ensuite, nous développons un outil numérique basé sur la programmation dynamique pour optimiser des schémas d'injections répétées. En particulier, nous nous intéressons à des patients infectés par le VIH sous traitement mais incapables de reconstruire leur système immunitaire. Des injections répétées d'un produit immunothérapeutique (IL-7) sont envisagées pour améliorer la santé de ces patients. Le processus est modélisé par un modèle de Markov déterministe par morceaux et des résultats récents de la théorie du contrôle impulsionnel permettent de résoudre le problème numériquement à l'aide d'une suite itérative. Nous montrons dans une preuve de concept que cette méthode peut être appliquée à un certain nombre de pseudo-patients. Dans l'ensemble, ces résultats s'intègrent dans un effort de développer des méthodes sophistiquées pour analyser les données d'essais cliniques afin de répondre à des questions cliniques concrètes. / Vaccines have been one of the most successful developments in public health in the last years. However, a major challenge still resides in developing effective vaccines against infectious diseases such as HIV or Ebola virus. This can be attributed to our lack of deep knowledge in immunology and the mode of action of immune memory. Mathematical models can help understanding the mechanisms of the immune response, quantifying the underlying biological processes and eventually developing vaccines based on a solid rationale. First, we present a mechanistic model for the dynamics of the humoral immune response following Ebola vaccine immunizations based on ordinary differential equations. The parameters of the model are estimated by likelihood maximization in a population approach, which allows to quantify the process of the immune response and its factors of variability. In particular, the vaccine regimen is found to impact only the response on a short term, while significant differences between subjects of different geographic locations are found at a longer term. This could have implications in the design of future clinical trials. Then, we develop a numerical tool based on dynamic programming for optimizing schedule of repeated injections. In particular, we focus on HIV-infected patients under treatment but unable to recover their immune system. Repeated injections of an immunotherapeutic product (IL-7) are considered for improving the health of these patients. The process is first by a piecewise deterministic Markov model and recent results of the impulse control theory allow to solve the problem numerically with an iterative sequence. We show in a proof-of-concept that this method can be applied to a number of pseudo-patients. All together, these results are part of an effort to develop sophisticated methods for analyzing data from clinical trials to answer concrete clinical questions.

Dans le monde, 58 millions de personnes sont chroniquement infectées par le virus de l'hépatite C (VHC). Depuis 2011, l'introduction des antiviraux à action directe a permis la guérison des infections chroniques chez la majorité des sujets traités (~95 %). Toutefois, les traitements sont coûteux et ne protègent pas contre les réinfections, d'où la nécessité de développer un vaccin prophylactique pour freiner efficacement l'épidémie du VHC. Environ 30% des primo-infections sont éliminées spontanément, représentant une occasion unique d'étudier les corrélats de l’immunité protectrice nécessaires pour le développement d’un vaccin efficace. Dans cette thèse, nous avons procédé à la définition des corrélats de l'immunité protectrice au cours des infections par le VHC primaires et subséquentes aux niveaux transcriptomique, clonotypique et fonctionnel à partir d’une cohorte d’utilisateurs de drogues par injection. Le premier objectif était de caractériser le répertoire de récepteurs des cellules T CD8 spécifique de l'épitope immunodominant et cross-réactif NS3 1073-1081 (CINGVCWTV) restreint par HLA-A2 au cours d’une primo-infection aiguë progressant vers une résolution spontanée ou une infection chronique. Nous avons identifié un ensemble de treize clonotypes publics, indépendamment de l'issue de l'infection. Plusieurs clonotypes publics avaient une longue durée de vie après résolution de l’infection et ont proliféré après réinfection par le VHC. En explorant les bases de données publiques, nous avons identifié plusieurs clonotypes partagés avec d'autres épitopes viraux restreints par HLA-A2, mais ils étaient de faible fréquence et de réactivité croisée limitée, suggérant un rôle limité des lymphocytes T CD8 cross-réactifs au cours de l'infection primaire par le VHC. Le deuxième objectif était de caractériser les signatures transcriptomiques longitudinales des cellules mononucléaires du sang périphérique totaux chez huit sujets ayant spontanément résolu deux infections consécutives par le VHC. Nous avons également comparé ces signatures avec un schéma vaccinal composé d'un vecteur à adénovirus de chimpanzé suivi d'un rappel utilisant la vaccine modifiée Ankara, exprimant tout deux les protéines non-structurales du VHC. Nous avons identifié une signature transcriptomique des plasmocytes au cours d'une réinfection aiguë, absente lors de l'infection primaire et après le rappel du vaccin. La résolution spontanée est associée à une expansion rapide des cellules B mémoires spécifiques de la glycoprotéine E2 chez 3 sujets et à une augmentation transitoire des anticorps neutralisants anti- E2 chez 6 sujets. Parallèlement, il y avait une augmentation de l'étendue et de l'ampleur des lymphocytes T spécifiques du VHC chez 7 sujets. En conclusion, nous avons identifié treize clonotypes publics uniques au VHC qui ont proliféré au cours des infections primaire et secondaire. La faible fréquence des clonotypes cross-réactifs suggère qu'ils ne sont pas des déterminants majeurs de l’issue de l’infection. De plus, nous avons observé une augmentation simultanée des réponses des lymphocytes B et T spécifiques du VHC au stade aiguë précoce, suggérant un rôle des deux bras de l’immunité adaptative dans la clairance de la réinfection du VHC. Nos résultats soutiennent l'idée de combiner deux stratégies vaccinales induisant à la fois une immunité à médiation cellulaire et une immunité humorale visant à prévenir les infections chroniques par le VHC. / Worldwide, 58 million individuals are chronically infected with hepatitis C virus (HCV). Since 2011, the introduction of direct acting antivirals enabled the cure of chronic HCV in the majority of treated subjects (~95%). However, direct-acting antivirals treatments are expensive and do not protect against reinfection, urging the need to develop a prophylactic vaccine to efficiently curb the HCV epidemic. Around 30% of acutely infected individuals will spontaneously clear the infection, representing a unique opportunity to study the correlates of immune protection needed to develop a potent vaccine. In this thesis, we proceeded to define the correlates of protective immunity during primary and sub-sequent HCV infections at the transcriptomic, clonotypic and functional levels using longitudinal peripheral blood mononuclear cells samples collected from a cohort of people who inject drugs (PWID). The first aim was to characterize the CD8 T cell receptor repertoire specific to the immunodominant and cross-reactive HLA-A2 restricted NS3 1073-1081 (CINGVCWTV) epitope during acute HCV in PWID progressing to either spontaneous resolution or chronic infection. We identified a set of thirteen public clonotypes in HCV-infected subjects irrespective of infection outcome. Several public clonotypes were long-lived in resolvers and expanded upon reinfection. By mining publicly available data, we identified several TCR clonotypes shared with other HLA-A2 restricted epitopes, but they were of low frequency and limited cross-reactivity, suggesting that they are not major determinants of infectious outcome. The second aim was to characterize longitudinal transcriptomic signatures using total peripheral blood mononuclear cells, as well as T and B cell recall responses in eight subjects who spontaneously resolved two successive episodes of HCV infection. Furthermore, we compared the transcriptomic signatures of primary and secondary resolving HCV infections, with an HCV nonstructural protein vaccine regimen of recombinant chimpanzee adenovirus 3 vector prime followed by modified vaccinia Ankara boost. We identified a plasma cell transcriptomic signature during early acute HCV reinfection that was absent in primary infection and following HCV vaccine boost. Spontaneous resolution of HCV reinfection was associated with rapid expansion of glycoprotein E2-specifc memory B cells in 3 subjects and transient increase in E2-specific neutralizing antibodies in 6 subjects. Concurrently, there was an increase in the breadth and magnitude of HCV-specific T cells in 7 subjects. In conclusion, we identified thirteen new public CD8+ TCR clonotypes unique to HCV that expanded during acute infection and reinfection. The low frequency of crossreactive TCRs suggests that they are not major determinants of infectious outcome. Moreover, we observed a concurrent increase of HCV-specific B and T cell responses early during acute HCV reinfection at the transcriptomic and functional levels, suggesting a role for both arms of the adaptive immune response in HCV reinfection clearance. Our results support the combined T and B cell-based vaccine strategy aimed at preventing chronic HCV infections.