No Brasil a confirmação do primeiro caso de febre zika, resultante da infecção pelo vírus zika (ZIKV), foi no primeiro semestre de 2015, na região nordeste. Os achados característicos eram de uma doença que apresentava sintomas semelhantes aos sintomas causados pelo vírus dengue (DENV), porém mais amenos, sendo inicialmente denominada de \"Síndrome Dengue-Like\". Além desta semelhança no quadro clínico, ZIKV e os DENV são arboviroses endêmicas no Brasil e pertencem à mesma família viral, sendo muito próximos filogeneticamente, resultando em uma forte reação cruzada entre os anticorpos induzidos por estas infecções. O diagnóstico específico para o ZIKV requer cuidados uma vez que o DENV circula há muito mais tempo no Brasil e muitas pessoas já são imunes para, no mínimo, um sorotipo da doença. Desta forma, anticorpos contra os DENV nos testes sorológicos podem reagir inespecificamente contra o ZIKV, originando um resultado falso-positivo. As maneiras para diferenciar as duas doenças são o isolamento e a detecção do RNA viral durante a fase aguda da doença e dos anticorpos neutralizantes durante a fase de convalescença. Atualmente com a escassez de testes registrados pela ANVISA e a dificuldade em diferenciar as duas viroses usando testes sorológicos, amostras bem caracterizadas e confirmadas quanto à infecção pelo ZIKV foram utilizadas para o teste de comparação com vários kits comerciais aprovados ou não pela ANVISA, para detecção de anticorpos. Estas amostras também foram testadas por um ensaio soro-molecular padronizado e desenvolvido no Laboratório de Virologia Molecular. / In Brazil, the first case of zika fever, resulting from zika virus (ZIKV) infection, was confirmed in the first half of 2015, in the northeast region. The characteristic findings were of a disease that presented symptoms similar to the symptoms caused by dengue viruses (DENV), but milder, being initially called \"Dengue-Like Syndrome\". Although this similarity in the clinical presentation, ZIKV and (DENV) are arboviruses endemic in Brazil and belonging to the same viral family, being very close phylogenetically, and resulting in a strong cross-reaction between the antibodies induced by these infections. The specific diagnosis for ZIKV requires careful evaluation since DENV has been circulating much longer in Brazil and many people are already immune to at least one serotype of the disease. Thus, the antibodies against DENV may react non-specifically against ZIKV in serological tests, resulting in a false-positive result. The ways to differentiate the two diseases are the isolation and detection of viral RNA during the acute phase of the disease and the neutralizing antibodies during the convalescent phase. Actually, with the scarcity of tests registered by ANVISA and the difficulty in differentiating the two viruses using serological tests, well-characterized and confirmed samples for ZIKV infection were used for the comparison of several commercial kits for detection of antibodies approved or not by ANVISA. These samples were tested by a standardized serummolecular assay developed at the Molecular Virology Laboratory.

A dengue é uma doença que afeta milhões de pessoas e possui um número significativo de mortes. Não há nenhum tratamento vacinal legalizado para uso. As estratégias vacinais contra a dengue baseadas em proteínas não estruturais têm demonstrado serem mais seguras do que as baseadas em proteínas estruturais. A proteína não estrutural 5 (NS5) do vírus dengue é a proteína mais conservada entre os quatro sorotipos e desempenha um papel crucial na replicação viral. Neste estudo, foi gerada uma forma recombinante da NS5 expressa em E. coli com propriedades antigênicas preservados. As condições de cultura foram optimizadas, o que permitiu a expressão dessa proteína na forma solúvel. A imunização de camundongos Balb/c com a NS5 sozinha ou em combinação com um adjuvante (poli (I:C)) promoveu o aumento da sobrevida de camundongos após desafio letal com DENV2. A combinação da NS5 com poli (I:C) emulsionado em Montanide 720 levou a expansão de linfócitos T CD8+ específicos. Os resultados indicam que a proteína NS5 obtida preserva determinantes antigênicos da proteína nativa e pode ser uma ferramenta útil para estudos sobre a biologia do DENV, busca de drogas antivirais e desenvolvimento de vacinas. / Dengue fever is a disease affecting millions of people worldwide and causing a significant number of deaths. There are no effective treatments or vaccine approaches capable of preventing such infection. Anti-DENV vaccine strategies based on nonstructural proteins as antigens have been shown to be safer than those based on structural proteins. The DENV nonstructural protein 5 (NS5), plays a crucial role in viral replication. In this study, we generated a recombinant form of DENV2 NS5 expressed in E. coli in high amounts and with preserved antigenic properties with regard to the native protein. Culture conditions were optimized in order to allow expression of NS5 as a soluble protein. The immunization of Balb/c mice using this protein alone or in combination with poly (I:C) led to increased survival after intracranial challenge with the DENV2 JHA1 strain. The combination of the protein with poly (I:C) emulsified in Montanide 720 led to the activation of NS5-specific CD8+ T lymphocytes. Altogether, the results indicate that the recombinant NS5 protein preserves antigenic determinants of the native protein and may be a useful tool for studies dealing with the DENV\'s biology, search for anti-viral drugs and vaccine development.

As infecções respiratórias agudas são responsáveis por elevados índices de morbimortalidade. Desde sua descoberta em 2005, foi relatada presença de bocavírus humano (HBoV) com prevalência variando de 1,5% a 19%. Durante o período de estudo foram detectadas 153 amostras positivas para HBoV (14%) de 1113 amostras coletadas, sendo sete HBoV positivos na unidade neonatal. O HBoV ocupou a terceira posição em frequência de vírus respiratórios detectados. As crianças positivas para HBoV eram mais velhas, utilizaram mais antibióticos e apresentaram o diagnóstico de pneumonia com maior frequência (independente da presença de outros vírus coinfectantes) do que as crianças negativas. O HBoV circulou ao longo de todos os meses, com maior prevalência entre maio a agosto. Houve uma elevada taxa de codetecção (84%) com os demais 20 vírus respiratórios pesquisados. A análise filogenética encontrou apenas HBoV1. Esse achado contribui para a consolidação do HBoV1 como causador de doença respiratória aguda. / It is well established that respiratory viruses are an important cause of hospitalizations in young children worldwide. Since its discovery in 2005, many authors have reported detection of human bocavirus (HBoV) in children with respiratory infection with prevalence varying from 1.5% to 19%. During the study period we detected HBoV in 153 samples (14%) from 1113-screened samples; seven were from the neonatal unit. HBoV was the third most frequently detected virus. Children infected with HBoV were significantly older, used more antibiotics and had pneumonia more frequently diagnosed (irrespective of presence of other virus coinfection than those negative for HBoV. Seasonality of HBoV was characterized by year-round circulation with peaks in months of May through August. There was a high rate of co-detection (84%) with the other 20 respiratory viruses. Phylogenetic analysis revealed only HBoV1. This finding contributes to consolidate HBoV1 as cause of acute respiratory infection in children.

Apesar dos esforços para controlar a infecção por HIV-1, na América do Sul, diversos recombinantes tem sido descritos, principalmente entre os subtipos B e F. Durante a tarefa coordenada de HIV-1 VGDN, foram encontrados diversos novos recombinantes BF no estado de São Paulo, sendo a maioria deles com a protease F. Técnicas filogenéticas usadas em integrases destes pacientes demonstraram que sequências recombinantes com perfis similares surgiram em diferentes eventos de recombinação. Análises filodinâmicas de amostras argentinas apontaram um crescimento contínuo de recombinantes com proteases F após a introdução da terapia intensiva, enquanto o subtipo B deixou de crescer. Dados estruturais e de interação de proteases F resistentes com o inibidor nelfinavir obtidos por dinâmica molecular sugeriram que polimorfismos do subtipo F podem atuar como restauradores de atividade ou acentuar a perda de afinidade pelo inibidor. Um vetor recombinante pNL4-3 com parte do gene gag e a protease do subtipo F foi construído, permitindo a comparação de seu efeito no fitness viral. / Despite general efforts to control HIV-1 infections, many recombinants have been described among B and F subtype in South America. During the VGDN HIV task in São Paulo state, a large number of new BF recombinants was found, most of which harbor a subtype F protease. Phylogenetic analysis of integrase genes from these patients showed distinct origins for similar recombinant regions. Phylodynamic analysis suggested that after HAART introduction in Argentina BF recombinants with F protease depicted a sustained growth, while subtype B had diminished in growth.. Moreover, structural data from proteases after HAART introduction, while subtype B had diminished growth. Subtype F proteases structure and nelfinavir interaction measured by molecular dynamics suggested that polymorphisms of this subtype may restore enzyme activity or decrease even further inhibitor affinity. A pNL4-3 recombinant vector with most of gag gene and a protease of subtype F was made, which allows the comparison of its effects on viral fitness.

Apesar de mais de 20 anos de esforço, o design de uma vacina anti-HIV eficaz ainda constitui um enorme desafio. Neste cenário, novas abordagens imunológicas devem ser consideradas. Monócitos de pares discordantes e de indivíduos sadios não expostos ao HIV foram diferenciados in vitro em células dendríticas (DCs), pulsadas com diferentes antígenos do HIV e co-cultivadas com linfócitos autólogos. A resposta imunológica desenvolvida pelos linfócitos T e o perfil fenotípico e funcional das DCs foram avaliados. Todas as DCs utilizadas no co cultivo apresentavam-se maduras e ativadas. Linfócitos estimulados por DC pulsadas com HIV inativado ou proteína p55Gag apresentaram maior ativação, proliferação e produção de IFN<font face=\"Symbol\">&#947 em comparação a linfócitos estimulados por DCs não pulsadas. Entretanto, as células T do grupo controle apresentaram o mesmo padrão de resposta imunológica, com exceção da produção de IFN<font face=\"Symbol\">&#947. Este modelo vacinal pode representar uma alternativa viável e promissora de vacinação terapêutica contra o HIV. / Despite more than 20 years of effort, the design of an effective HIV-1 vaccine remains an enormous challenge. In this scenario, new immunological approaches must be considered. Monocytes from HIV-serodiscordant couples and non HIV exposed controls were differentiated in vitro into dendritic cells (MoDC), pulsed with different virus antigens and cultured with autologous lymphocytes. The T lymphocyte immunological response and the MoDC phenotype and function were determined. MoDCs were shown to be fully matured and activated in all antigen-pulsing protocols. Lymphocytes stimulated by DC pulsed with inactivated HIV or p55Gag protein showed greater activation, proliferation and IFN<font face=\"Symbol\">&#947 production in comparison to those stimulated by non pulsed MoDC. Nonetheless, T cells from non-exposed controls elicited the same response, except for the IFN<font face=\"Symbol\">&#947 production. This MoDC vaccine model may represent a viable and promising alternative of therapeutic vaccination against HIV.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:28:15Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3057_1.pdf: 2351767 bytes, checksum: 0146e352a67eae7ad6ea475576cd8851 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / O vírus linfotrópico de células T humanas do tipo 1 (HTLV-1) é um retrovírus humano que está associado à leucemia/linfoma de células T do adulto (LLTA) e a uma síndrome neurológica denominada paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1 (PET/MAH). Fatores como a genética, o sistema imune do hospedeiro, a presença de deleções ou variações em determinadas regiões do genoma do vírus podem influenciar as etapas que levam ao desencadeamento das doenças associadas ao HTLV-1. O vírus pode apresentar-se na forma defectiva, isto é, exibindo deleção em alguma região do seu genoma. Dois subgrupos A e B da seqüência tax do HTLV-1 foram descritos baseados em quatro mutações em regiões específicas desta seqüência. Adicionalmente, foi identificada uma associação entre a presença do subgrupo A com o desenvolvimento de PET/MAH. Os objetivos deste trabalho foram verificar a presença de provírus defectivo pela detecção das seqüências env-tax, tax e 5 LTR do HTLV-1 em pacientes com PET/MAH e portadores do HTLV-1 assintomáticos (PHA), classificar os subgrupos da seqüência tax, quantificar a carga proviral e verificar a associação destes marcadores com a presença da PET/MAH. Participaram do estudo 247 indivíduo, desses, 52 pacientes com PET/MAH atendidos no Serviço de Neurologia do Hospital da Restauração e três grupos de doadores de sangue da Fundação de Hematologia e Hemoterapia de Pernambuco (HEMOPE), sendo 72 indívíduos PHA, 100 doadores soronegativos e 23 doadores com sorologia indeterminada para o HTLV-1/2. O período da coleta foi de março de 2008 a outubro de 2009. Todas as amostras foram submetidos ao ELISA, Western Blotting, PCR para a detecção das seqüências env-tax, tax, 5 LTR e a PCR-restriction fragment length polymorfism (PCR-RFLP) para classificação dos subgrupos da seqüência tax. Houve maior freqüência do sexo feminino no grupo PET/MAH, quando comparado ao grupo PHA (p=0,000). A média de idade e da densidade ótica do ELISA para HTLV-1/2 foram superiores no grupo PET/MAH (p=0,000). Para os pacientes com PET/MAH, 04 mostraram ausência para a seqüência 5 LTR. Para os PHA, 11 indivíduos do grupo mostraram ausência para a seguència 5 LTR, três ausência para a seqüência env-tax e sete indivíduos do grupo PHA não possuíam a seqüência tax. Dos 247, 49 pacientes com PET/MAH e 38 PHA apresentaram vírus classificados como subgrupo tax A, exceto dois doadores de sangue que possuíam o subgrupo tax B, embora não tenha sido encontrada a associação dos subgrupos da seqüência tax com a presença de PET/MAH (p=0,108). A quantificação da carga proviral foi realizada em 21 pacientes do grupo PET/MAH e 15 doadores de sangue do grupo PHA, em razão da contagem de linfócitos inferior a 1x106 células/ml nas demais amostras analisadas. A mediana de carga proviral foi estatisticamente mais elevada no grupo PET/MAH (p=0,001). Em conclusão, identificou-se o provírus defectivo em pacientes com PET/MAH e em indivíduos do grupo PHA, demonstrou-se associação entre a presença da seqüência tax e a PET/MAH, mas não houve associação desta síndrome com os subgrupos desta seqüência em nossa casuística e uma maior carga proviral foi detectada em pacientes no grupo PET/MAH

O vírus influenza A (IAV) é um agente zoonótico de grande relevância tanto para saúde humana como animal. A influenza suína teve seu primeiro reconhecimento clínico em 1918, em suínos do Meio Oeste dos EUA, coincidindo com a pandemia de influenza em humanos. Desde então, o IAV permanece como um importante patógeno para a indústria suinícola em todo o mundo. A grande variabilidade genética destes vírus é causada por dois principais mecanismos genéticos: mutações pontuais e recombinações genéticas. A influenza é endêmica em muitos países e a emergências de recombinantes tem desafiado o controle e o diagnóstico desta enfermidade. No Brasil, a infecção pelo IAV em suínos (swIAV) não está bem caracterizada; poucos relatos evidenciam a prevalência deste agente antes do ano de 2009, especialmente no Estado do Rio Grande do Sul, que alberga um dos maiores rebanhos de suínos do Brasil. Em vista disso, este trabalho teve como objetivo investigar ocorrência de swIAV em alguns rebanhos suínos comerciais do Estado do Rio Grande do Sul, Brasil, no período de 2013-2014, e determinar os tipos e subtipos de vírus circulantes naquelas propriedades. O primeiro capítulo deste estudo reporta os aspectos clínicos, patológicos e virológicos da ocorrência de influenza suína e co-infecções identificadas em seis propriedades suinícolas selecionadas na região do Vale do Taquari. Neste estudo foram analisados suabes nasais coletados de 66 animais e 6 amostras de tecido pulmonar de suínos com sinais de infecção respiratória. A detecção viral foi feita através de uma PCR de triagem e confirmada através do isolamento viral em células MDCK. A identificação dos subtipos virais foi feita através de uma PCR em Tempo Real (rRT-PCR) para o subtipo A(H1N1)pdm09 ou através de uma PCR multiplex (RT-PCR) para outros subtipos de swIAV. A detecção de agentes bacterianos foi realizada apenas nas amostras de tecido pulmonar, através da pesquisa de genomas bacterianos por PCR. O subtipo A(H1N1)pdm09 foi identificado em 4/6 granjas e o subtipo H1N2 em 2/6 granjas. Além disso, agentes envolvidos no complexo respiratório dos suínos foram identificados em todas as granjas; Pasteurella multocida foi identificada em 5/6 granjas e Mycoplasma hyopneumoniae em 3/6 granjas. Actinobacillus pleuropneumoniae (1/6), Haemophilus parasuis (1/6) e PCV2 (1/6) também foram detectados. O segundo capítulo deste estudo teve como objetivo o sequenciamento do genoma completo de um novo recombinante H1N2 de origem humana, detectado em suínos. O genoma completo foi gerado através de uma RT-PCR. Os produtos foram purificados e submetidos ao sequenciamento utilizando a plataforma MiSeq (illumina). A análise filogenética revelou que as sequencias dos genes HA e NA correspondem a genes de IAV de origem humana, enquanto que as sequencias dos genes que codificam as proteínas internas do vírus (PB1, PB2, PA, NP, M e NS) correspondem a genes de amostras do vírus A(H1N1)pdm09. O terceiro capítulo reporta o sequenciamento completo dos genomas de 8 amostras de vírus influenza identificados nas populações de suínos amostradas. Foram identificados dois subtipos virais de origem humana (H1N2 e H3N2), além do vírus A(H1N1)pdm09. Os subtipos de origem humana possuem os genes HA e NA similares a vírus sazonais de humanos e os genes internos são estreitamente relacionados com o vírus A(H1N1)pdm09. / Influenza A virus (IAV) is a zoonotic agent of great relevance to human and animal health. Swine influenza was first recognized clinically in pigs in the Midwestern U.S., in 1918, coinciding with the human influenza pandemic. Since that time swine influenza has remained of importance to the swine industry throughout the world. The great genetic variability of influenza viruses is caused by two main genetic mechanisms: point mutations (antigenic drift) and gene reassortment (antigenic shift). Influenza is endemic in pigs in many countries and the emergence of new viruses has been challenging its control and diagnostics. Influenza virus (swIAV) infection in Brazilian swine population is not well characterized, and little evidence existed of swIAV circulation before 2009, especially in Rio Grande do Sul State, which hosts one of the largest swine populations in Brazil. Thus, this study aimed to investigate the occurrence of IAV in commercial swine herds in the state of Rio Grande do Sul, Brazil, between 2013-2014 and to know the types and subtypes of swine influenza viruses that are circulating in these herd. The first chapter of this study reports the clinical, pathological and virological aspects of the occurrence of swine influenza and related co-infections in six pig properties of the Taquari Valley region. In this study were analyzed nasal swabs collected from 66 animals and six lung tissue samples from pigs showing clinical signs of respiratory disease. IAV detection was performed by PCR screening and confirmed by virus isolation in MDCK cells and hemagglutination (HA). Influenza A subtyping was performed by real-time reverse transcription PCR (rRT-PCR) to detect the 2009 H1N1pandemic A(H1N1)pdm09; other swIAV subtypes were identifieded by multiplex RT-PCR. Bacterial infections were identified through detection of bacterial genomes by PCR, only in lung samples. Influenza A was detected by screening PCR in 46/66 swab samples and from 5/6 lungs. Virus was recovered from pigs of the six herds. Subtype A(H1N1)pdm09 was detected in 4/6 herds and H1N2 in the other 2/6 herds. In lung tissues, further agents involved in porcine respiratory disease complex were detected in all cases; Pasteurella multocida was identified in 5/6 samples and Mycoplasma hyopneumoniae in 3/6. Actinobacillus pleuropneumoniae (1/6), Haemophilus parasuis (1/6) and PCV2 (1/6) were also detected. The aim of the second chapter was to sequence the whole-genome of a novel human-like H1N2 swine influenza virus. Wholegenome sequences were generated by RT-PCR. Amplicons were purified followed by sequencing in the MiSeq sequencing platform (Illumina). Phylogenetic analyses revealed that the HA and NA genes clustered with influenza viruses of human lineage, whereas the internal genes (PB1, PB2, PA, NP, M and NS) clustered with the A(H1N1)pdm09. The third chapter reports the genetic sequencing of the full genomes of eight swine influenza viruses circulating in the sampled pig population. Two swine human-like subtypes (H1N2 and H3N2) and the A(H1N1)pdm09 virus were identified. The human-like subtypes have the HA and NA genes similar to the human seasonal strains and the internal genes are closely related to the virus A(H1N1)pdm09.

O sistema de expressão gênica derivado do Semliki Forest Vírus (SFV) vem sendo muito utilizado nos últimos tempos para expressão em grandes quantidades de inúmeras proteínas, quando comparado com outros sistemas. O objetivo desse estudo foi otimizar a capacidade desse vetor viral de expressar proteínas em diferentes linhagens celulares de mamíferos, utilizando como alvo, a glicoproteína do vírus rábico (RVGP). Foram avaliadas formas de obtenção do vetor SFV recombinante, através de diferentes métodos de transfecção, como eletroporação e lipofecção, utilizando um lipossomo comercial chamado Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). Foi estabelecido, um método rápido e preciso de quantificação das partículas virais, através da técnica de qPCR, para padronizar a relação entre a quantidade de vírus recombinante a ser utilizada em um processo de infecção, visando aumentar os níveis de produção da proteína heteróloga. Diferentes proporções entre vírus e células foram utilizadas em cinco linhagens distintas: BHK-21, Huh-7, VERO, L929 e HEK-293T; sendo avaliados dois tempos de coleta da RVGP após a infecção (24 e 48 h). A proteína gerada foi avaliada através de diferentes métodos como Western Blot, Dot blot e imunofluorescência indireta (IFI), sendo a quantificação da proteína realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Esse trabalho contribui para o desenvolvimento de abordagens que utilizam o SFV como vetor de expressão, indicando as melhores metodologias e linhagens celulares, que podem ser utilizadas para aplicação na produção das mais variadas proteínas. / The expression system based on Semliki Forest virus (SFV) is a system which has been widely used in recent times for expression of many proteins in large quantities as compared with other systems. The aim of this study was to optimize the capacity of this vector to express viral proteins in different mammalian cell lines, using as target, the rabies virus glycoprotein (RVGP). We assessed two different methods of transfection to obtain recombinant SFV vector, such as electroporation and liposome commercial Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). It was established also a fast and accurate quantification of viral particles by qPCR technique, to improve the relation between the amount of recombinant virus to be used in a process of infection, to increase production levels of the heterologous protein. Different proportions between viruses and cells were used in five distinct lineages: BHK-21, Huh-7, Vero, L929 and HEK-293T; being evaluated two sampling times after infection of RVGP (24 e 48 h). The protein was assessed by various methods such as Western blot, Dot blot and indirect immunofluorescence (IIF), and the protein quantification performed by enzyme immunoassay (ELISA). This work contributes to the development of approaches to using the SFV expression vector indicating the best methods and cell lines that can be used for application in the production of various proteins.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2017-03-17T12:01:04Z No. of bitstreams: 1 Frank Magno da Costa.pdf: 2036897 bytes, checksum: 7498ff1cf68c11e56e2e3d7ce12c8e57 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-17T12:01:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Frank Magno da Costa.pdf: 2036897 bytes, checksum: 7498ff1cf68c11e56e2e3d7ce12c8e57 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Brevipalpus mites are vectors of several plant viruses called Brevipalpus transmitted virus –BrTV. Among these, Citrus leprosis virus C (CiLV-C) and Coffee ringspot virus (CoRSV) are important due to the damages caused in Citrus spp. and Coffea spp., respectively. The symptoms occur as localized infection on both leaves and fruits. The interactions between vector and virus are of particular interest both from the scientific perspective and on the development of control measures. However, for these and other BrTV, the mode interactions are still unknown. Preliminary study suggests that CoRSV replicates in the vector tissue, while CiLV-C is mode circulates manner. The aim of this study was to investigate the interactions established between CiLV-C and CoRSV with B. phoenicis. Adult females aviruliferous of B. phoenicis were submitted to acquisition access period of respective virus during five days. After this time they were transferred to hosts (treatments): mungbean (Canavalia ensiformis, non-host of the virus), symptomatic and healthy (citrus and coffee plants) and collected after four different periods of time: 0; 7; 14 and 21 days. The interactions were investigated by real time quantitative polymerase chain reaction (qPCR), transmission electron microscopy (TEM) and transmission assays. The qPCR revealed that there was no increase in viral load over time in all treatments for any of the virus in question. The TEM, it was not possible to detect particles of CiLV-C or CoRSV. CiLV-C transmission rate was 83, 75% and 58% for the treatments symptomatic citrus, mungbean and healthy citrus, respectively. The first symptoms of the leprosis were observed after 30±5 days after mites infestation. In the CoRSV transmission assays no symptoms of coffee ringspot were observed during a period of six months. These results suggest that a long incubation period was be necessary before CoRSV transmission by the vector. By the CiLV-C the results indicate that interaction type virus-vector is of the circulative mode. / Ácaros Brevipalpus são vetores de inúmeros vírus, comumente chamados de vírus transmitidos por Brevipalpus- VTB. Dentre esses, o vírus da leprose dos citros (Citrus leprosis virus C, CiLV-C) e o vírus da mancha anular do cafeeiro (Coffee ringspot virus - CoRSV) são importantes devido aos danos que causam em Citrus spp. e Coffea spp., respectivamente. Os sintomas ocorrem de maneira localizada em folhas e frutos. As interações entre os vírus e seus vetores apresentam particular interesse, tanto do ponto de vista científico quanto no desenvolvimento de novas abordagens para o controle das doenças por eles causadas. Entretanto, para esses e outros VTB, as interações são ainda pouco conhecidas. Estudos preliminares sugerem que o CoRSV se replica no interior do ácaro vetor, enquanto o CiLV-C apenas circula. O objetivo deste trabalho foi investigar os tipos de interações estabelecidas entre o CiLV-C e o CoRSV com B. phoenicis. Fêmeas adultas de B. phoenicis avirulíferas foram submetidas a um período de acesso para aquisição dos respectivos vírus durante cinco dias. Após esse tempo foram transferidas para hospedeiros (tratamentos): feijão-de-porco (não hospedeira dos vírus), plantas suscetíveis, sintomáticas e/ou sadias (laranja doce e cafeeiro) e coletadas após quatro diferentes períodos de tempo: 0; 7; 14 e 21 dias. As interações foram investigadas por reação em cadeia da polimerase em tempo real (qPCR), microscopia eletrônica de transmissão (MET) e testes de transmissão. A qPCR revelou que não houve aumento da carga viral ao longo do tempo em nenhum dos tratamentos avaliados para nenhum dos vírus em questão. A MET não detectou partículas de CiLV-C e CoRSV. A taxa de transmissão do CiLV-C foi de 83; 75 e 58% para os tratamentos frutos de laranja sintomáticos, feijão-de-porco e frutos de laranja sadio, respectivamente. Os primeiros sintomas de leprose dos citros foram observados após 30±5 dias após a infestação dos ácaros. Nos testes de transmissão de CoRSV nenhum sintoma da mancha anular foi observado durante um período de seis meses. Estes resultados indicam a necessidade de longo período é necessário antes da transmissão do CoRSV pelo vetor. Para o CiLV-C os resultados indicam que o tipo de interação vírus-vetor é persistente circulativa.

Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-09-20T15:56:14Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_NeuropatologiaExperimentalInduzida.pdf: 11978675 bytes, checksum: 42960f5934592c55ca43814444848b98 (MD5) / Rejected by Irvana Coutinho (irvana@ufpa.br), reason: Aguardar as orientações on 2017-10-10T16:50:18Z (GMT) / Submitted by Hellen Luz (hellencrisluz@gmail.com) on 2017-10-17T18:01:26Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_NeuropatologiaExperimentalInduzida.pdf: 11978675 bytes, checksum: 42960f5934592c55ca43814444848b98 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-11-23T16:49:31Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_NeuropatologiaExperimentalInduzida.pdf: 11978675 bytes, checksum: 42960f5934592c55ca43814444848b98 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-11-23T16:49:32Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_NeuropatologiaExperimentalInduzida.pdf: 11978675 bytes, checksum: 42960f5934592c55ca43814444848b98 (MD5) Previous issue date: 2011-04-14 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Muitos esforços têm sido dedicados para o entendimento da neuropatogênese das encefalites virais a partir de trabalhos experimentais. Porém, poucos estudos investigaram a neuropatologia experimental de rabdovírus amazônicos, como a induzida pelos vírus Itacaiunas e Curionopolis, recentemente agrupados em um novo gênero denominado Bracorhabdovirus, proposto para a família Rhabdoviridae. Esses vírus apresentam tropismo por neurônios do SNC de camundongos neonatos infectados experimentalmente, entretanto, pouco se conhece a respeito da resposta imune do SNC contra esses agentes. O presente trabalho analisou aspectos da resposta imune de células residentes do SNC de camundongos neonatos, após infecção experimental pelos vírus Itacaiunas e Curionopolis, in vivo e in vitro. Para alcançar esses objetivos, foram utilizadas técnicas histoquímica e imunohistoquímica para detecção de microglias ativadas e astrócitos, respectivamente, em secções de cérebros de camundongos infectados. A quantificação das células ativadas foi realizada em regiões do hipocampo, utilizando técnicas estereológicas. Além disso, foi investigada a expressão de citocinas pró e antiinflamatórias produzidas por células do SNC em cultivos primários infectados com os vírus Itacaiunas e Curionopolis por ensaios imunoenzimáticos (ELISA), a partir de sobrenadantes de co-culturas enriquecidas de microglias/neurônios e de astrócitos/neurônios. Foi também analisada a expressão de óxido nítrico por citoquímica utilizando o reagente DAF-FM diacetato (4-amino-5-methylamino-2,7′-difluorofluorescein diacetate). Os resultados mostraram que cérebros de camundongos infectados com os vírus Curionopolis 2d.p.i. e Itacaiunas 4 e 7d.p.i. apresentaram discreta ativação microglial, porém, em camundongos infectados com o vírus Curionopolis 5d.p.i houve intensa ativação. A imunohistoquímica revelou marcação de poucos astrócitos em animais infectados com os vírus Curionopolis 2d.p.i e Itacaiunas 4 e 7d.p.i. no hipocampo. Por outro lado, nos camundongos infectados com Curionopolis 5d.p.i., houve aumento de astrócitos, principalmente na região da fissura hipocampal. Os resultados obtidos a partir dos ensaios imunoenzimáticos mostraram que houve grande produção de IL-12p40 nas culturas de células do SNC infectadas com os vírus, 48 e 96h.p.i. Baixos níveis de TGF-β foram detectados após 48 horas de infecção com os vírus em estudo, no entanto, observou-se aumento da expressão dessa citocina após 96h.p.i. Também foi demonstrado, com 48 horas de infecção, baixos níveis da citocina IL-10, aumentando após 96 horas para ambos os vírus, principalmente nas co-culturas enriquecidas de microglias/neurônios infectados pelo vírus Itacaiunas. Culturas de células do SNC infectadas com os vírus Itacaiunas 48 e 96h.p.i. e Curionopolis 48h.p.i. mostraram discreta produção de óxido nítrico, porém houve aumento nessa produção em culturas infectadas com o vírus Curionopolis 96h.p.i. Esses resultados sugerem que há predominância de uma resposta pró-inflamatória nos tempos iniciais da infecção para ambos os vírus e uma tentativa de modulação dessa resposta com a produção de citocinas antiinflamatórias nos tempos tardios. / Experimental studies are making many efforts to understand the neuropathogenesis of viral encephalitis. However, a few is known about the Central Nervous System (CNS) response against amazonic rhabdovirus. The virus Itacaiunas e Curionopolis were classified preliminary as members of the Rhabdoviridae family. It was suggested for these virus to be included in a new genus, Bracorhabdovirus. They are neurotropic virus and little is known about the inflammatory response of the CNS against these virus. This study examined aspects of the immune response of newborn mice CNS resident cell after experimental infection by Itacaiunas and Curionopolis virus, in vivo and in vitro. To achieve these goals, histochemical and immunohistochemical techniques were used to detect activated microglia and astrocytes, respectively, in sections of the brains of infected mice. The quantification of these cells were performed in hippocampal regions using stereological techniques. Furthermore, was investigated the expression of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines produced by CNS cells in primary cultures infected with virus Itacaiunas and Curionopolis by using enzyme immunoassay (ELISA) from supernatants co-cultures enriched of microglia/neurons and astrocytes/neurons. The expression of nitric oxide was also analyzed by using cytochemical reagent DAF-FM diacetate (4-amino-5-methylamine-2,7-difluorofluorescein-diacetate). As a result, age matched control animals of each group did not present activated microglia or astrocytosis, as well as, both Curionopolis and Itacaiunas infected subjects early after the inoculation (2d.a.i. and 4d.a.i respectively). However at 5th d.a.i., Curionopolis infections significant increase in the number of activated microglias and reactive astrocytes were detected whereas at the 7th d.a.i. after Itacaiunas infection only minimal activation of microglia and reactive astrocytosis was detected. The results from immunoassays showed great production of IL-12p40 in cultures of CNS cells infected with both virus, 48 and 96 hours after infection (h.a.i.). Low levels of TGF-β and IL-10 were detected after 48 hours of infection with both virus, however, was observed increased expression of this cytokines after 96 hours. CNS cell cultures infected with Curionopolis virus 48h.p.i. and Itacaiunas virus 48 and 96h.a.i. showed a slight production of nitric oxide, but it was increased in cultures infected with Curionopolis virus 96h.a.i. These results suggest that the proinflammatory response is dominant in both virus, however, it seems that the anti-inflammatory cytokines try to modulate the inflammatory response of the late days pos-inoculation.