A ação de fosfolipases A2 (FLA2s): miotoxinas (MTs) ?II e III, isoladas de Bothrops asper (VBa) e CB2, de Crotalus durissus terrificus (VCdt) e os venenos brutos, sobre a expressão de ciclooxigenases (COXs) e síntese de prostaglandina (PG) E2 e PGD2 foi avaliada. As MTs e VBa mas não CB2 e nem VCdt induziram a expressão de COX-2 por leucócitos. Em estudos in vitro ocorreram a liberação de PGs e expressão de COX-2, após a incubação de macrófagos (M?s) com FLA22s e, de neutrófilos (N?s) e M?s, com VBa. A CB2 induziu somente a liberação de PGs. A inibição de FLA2 citosólica (cFLA2), diminuiu os níveis de PG induzidos pelas MTs, mas não pela CB2, e não afetou a expressão de COX-2 induzida pelas MTs. O envolvimento do NF-?kB na expressão de COX-2 foi mostrado com inibidores. Em conclusão, MTs, CB2 e VBa estimulam a síntese de PGs in vivo e in vitro e MTs e VBa, mas não CB2, induzem a expressão de COX-2. O VCdt não afeta estes parâmetros. O efeito das MTs sobre a expressão de COX-2 e PGs é mediado pelo NF-kB e pela cFLA2, respectivamente. Os efeitos de CB2 na produção de PGs são independentes de cFLA2s e COX-2. O fato da MT-II ser destituída de atividade enzimática sugere que a atividade catalítica per se, não seja relevante para os efeitos observados. / Action of the phospholipase A2 (PLA22): myotoxins (MTs) -II and -III, from Bothrops asper (BaV) and CB2, from Crotalus durissus terrificus (CdtV) and these venoms on cyclooxygenases (COXs) and synthesis of prostaglandins (PGs) E2 and D2 were studied in vivo and in vitro. Intraperitoneal injection of sPLA22s and BaV but not CdtV released PGD2 and PGE2. MTs and BaV but neither CB2 nor CdtV induced expression of COX-2 by leukocytes. Release of PGs and expression of COX-2 occurred in vitro after incubation of macrophages (M?s) with PLA2 and neutrophils (N?) and M?s with BaV. CB2 induced only PGs release. Inhibition of cytosolic PLA2 (cPLA2), reduced PG levels caused by MTs, but not by CB2 while did not affect MTs-induced COX-2 expression. Involvement of NF-kB in COX-2 was showed using with inhibitors. In conclusion MTs, CB2 and BaV stimulate the synthesis of PGs in vivo and in vitro and MTs and BaV, but not CB2, induce COX-2 expression. VCdt does not affect these parameters. Effect of MTs on COX-2 is mediated by NF-kB, and on PGs by cPLA2. Effects of CB2 on PGs are independent of cPLA2 and OX-2. Since MT-II lacks catalytic activity the PLA2 activity per se is not relevant for activation of this cascade.

Biofilmes são comunidades bacterianas tridimensionais complexas, que vivem organizadas e aderidas a uma superfície, biótica ou abiótica, embebidas em uma matriz exopolimérica. Cerca de 80% das bactérias vivem organizadas na forma de biofilmes, pois dentro destas estruturas são menos sensíveis aos antibióticos e à resposta imune do hospedeiro. Dentre as principais bactérias formadoras de biofilmes têm-se Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa e enterobacteriaceas. Estas bactérias formadoras de biofilmes são importantes colonizadoras da superfície de dispositivos médicos e implantes, aumentando a morbidade e mortalidade dos pacientes que apresentam este tipo de infecção. A investigação de novas estratégias para prevenção e tratamento de infecções por biofilmes é urgentemente necessária. Dentre estas estratégias estão a pesquisa de diferentes mecanismos ou substâncias capazes de provocar a inibição da formação ou a erradicação do biofilme formado. Neste contexto, os venenos animais representam uma fonte ainda inexplorada de uma vasta quantidade de moléculas bioativas, candidatas ao desenvolvimento de novas terapias, inclusive antibiofilme. O principal objetivo deste estudo é avaliar diferentes venenos de serpentes e análogos sintéticos como fonte de moléculas contra biofilmes bacterianos patogênicos. O capítulo 1 revisa estudos que relatam a atividade antimicrobiana (contra bactérias, vírus, protozoários e fungos) de 170 peptídeos isolados de venenos de oito diferentes animais. Peptídeos antimicrobianos vêm ganhando destaque em pesquisas para o tratamento de infecções e peptídeos com atividade antibiofilme são uma nova e promissora abordagem, para o tratamento de infecções relacionadas. O capítulo 2 mostra as atividades antimicrobiana, antibiofilme e de erradicação de biofilmes pré-estabelicidos de 18 análogos de peptídeos de oriundos de venenos de serpentes. Inicialmente foram analisadas e alinhadas 170 sequências peptídeos oriundos de venenos animais. O pepptídeos 16 apresentou considerável atividade antimicrobiana contra cepas bacterianas Gram-positivas, sensíveis e resistentes. Para S. epidermidis os peptídeos 1, 2, 3, 4, 12, 13 e 16 apresentaram menos de 50% de formação de biofilme e os peptídeos 2, 3 e 16 reduziram o biofilme pré-formad. A citotoxicidade e a actividade hemolítica foram testadas e os peptídeos ativos 2 e 16 apresentaram citotoxicidade e hemólise significativas em comparação com os controles. A posição dos aminoácidos pode contribuir para as atividades, sendo que mais testes são necessários para entender a relação das posições de aminoácidos na ação. O capítulo 3 mostra as atividades antiformação e erradicação de biofilmes pré-estabelecidos de dezessete diferentes venenos de serpentes, duas de escorpiões e três de anêmonas marinhas, bem como as secreções de pele de três espécies de sapos. Consideráveis atividades antiformação e de erradicação foram verificadas contra as cepas de S. aureus, S. epidermidis e E. cloaceae por todos os venenos de serpentes testados, em diferentes concentrações. Além disso, um fracionamento inicial foi realizado e as melhores condições foram selecionadas para um novo fracionamento, onde foram testadas 27 frações de veneno de B. diporus. As frações 8, 14 e 23 apresentaram atividades com menos de 50% de formação de biofilme e menos de 80% do biofilme remanescente. Os resultados indicam a capacidade dos venenos, especialmente da serpente de B. diporus, de serem potenciais fontes de moléculas como estratégia para combater os biofilmes patogênicos bacterianos. O presente estudo aborda o potencial de venenos animais, principalmente venenos de serpentes, como fonte de moléculas, que podem apresentar inúmeras atividades farmacológicas inéditas, incluindo àquelas relacionadas com a prevenção da formação e de erradicação de biofilmes bacterianos patogênicos. Atualmente, existem seis medicamentos aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA), oriundos de venenos, como o Captopril (Capoten®). Este estudo mostra a capacidade de venenos como fonte de novas moléculas ativas contra biofilmes patogênicos. / Biofilms are complex three-dimensional bacterial communities living organized and attached on a surface, embedded in exopolimeric matrix. About 80% of live bacteria are organized in the form of biofilms because in these structures are less sensitive to antibiotics and host immune response. Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa and enterobacteriaceas are the main biofilm forming bacteria. These forming biofilms bacteria are important colonizing surface of medical devices and implants, increasing the morbidity and mortality of patients with this kind of infection. The investigation of new strategies for prevention and treatment of infections caused by biofilms is urgently needed. Among these strategies, there are the research of different mechanisms or substances capable of inhibit the formation or to eradicate the formed biofilm. In this context, animal venoms represent an untapped source of vast amounts of bioactive molecules, candidates for the development of new therapies, including antibiofilm. The main objective of this study is to evaluate different venoms of snakes and synthetic analogs as source of molecules against pathogenic bacterial biofilms. The chapter 1 reviewed numerous studies reporting the antimicrobial activity (against bacteria, viruses, protozoa and fungi) of 170 peptides isolated from venoms of eight different animals. Antimicrobial peptides have been gaining attention in research for the treatment of infections and peptides with antibiofilm activity are a new and promising approach for the treatment of infections related. The chapter 2 shows the antimicrobial, antibiofilm and eradication of established biofilms activities of 18 analogs of peptides derived from snake venoms. Initially, 170 peptide sequences from animal venoms were analyzed and aligned. The peptide 16 showed considerable antimicrobial activity against Gram-positive bacterial strains, sensitive and resistant. For S. epidermidis, the peptides 1, 2, 3, 4, 12, 13 and 16 showed less than 50% of biofilm formation and peptides 2, 3 and 16 reduced preformed biofilm. Cytotoxicity and hemolytic activity were tested and active peptides 2 and 16 showed significant cytotoxicity and hemolysis compared with the controls. The position of the amino acids can contribute to the activities and more tests are needed to understand the relationship of the amino acid positions in the action. The chapter 3 shows the antiformation and eradication of established biofilms activities of seventeen different venoms of snakes, two of scorpions and three of marine anemones, as well as the skin secretions of three species of frogs. Significant activities were observed against strains of S. aureus, S. epidermidis and E. cloaceae for all venom of snakes tested at different concentrations. In addition, an initial fractionation was performed and the best conditions were selected for a new fractionation, where 27 fractions of B. diporus enom were tested. Fractions 8, 14 and 23 presented activities with less than 50% of biofilm formation and less than 80% of the remaining biofilm. The results indicate the ability of venoms, especially the snake B. diporus, to be potential sources of molecules as a strategy to combat bacterial pathogenic biofilms. This study addresses the potential of animal venoms, especially snake venoms, as source of molecules, which can present numerous unpublished pharmacological activities, including those related to the prevention of the formation and eradication of pathogenic bacterial biofilms. Currently, there are six drugs approved by Food and Drug Administration (FDA), derived from venoms, such as Captopril®. This study shows the ability of venoms as source of new bioactive molecules against pathogenic biofilms.

As alergias podem ser desencadeadas por substancias químicas, medicamentos, proteínas de origem vegetal e animal como, por exemplo, ácaros, alimentos, fungos e venenos. Reações alérgicas desenvolvidas em resposta a venenos de animais marinhos vêm sendo pouco estudadas. Este é o primeiro estudo que descreve a indução de reação anafilática em camundongos pelo veneno de um peixe brasileiro, acompanhado da caracterização detalhada dos mediadores solúveis e celulares envolvidos no processo. Nossos resultados mostram que o veneno do peixe T. nattereri possui proteínas alergênicas capazes de desencadear um processo alérgico, caracterizado por anafilaxia mediada por IgE e IgG1 e inflamação eosinofílica de fase tardia dependente de citocinas Th2. Ainda demonstramos a regulação da resposta pela positiva pela citocina IL-4 e participação da IL-12 e IFN-<font face=\"Symbol\">g na resposta. / Allergies are a significant and widespread public health problem. Anaphylaxis reactions are inducing by foods, medications and venoms and are IgE mediated. In mice, allergy can be caused also by IgG1. The results presented here describe for the first time anaphylaxis induced by Brazilian fish venom, accompanied by detailed characterization of soluble and cellular mediators involved in the process. Together our results demonstrated that the venom of T. natereri has allergenic proteins that can trigger allergic process, a phenomenon IgE-IgG1 dependent, IL-4 mediated and regulated by IFN-<font face=\"Symbol\">g. Furthermore, we observed a positive participation of the cytokines IL-12 and IFN-<font face=\"Symbol\">g in the exacerbation of the late phase reaction.

A proteólise de componentes do plasma e da matriz extracelular é um fator importante no quadro hemorrágico desencadeado pela ação de venenos de serpentes. Neste estudo, avaliamos o papel dos domínios estruturais de metaloproteinases na interação com seus alvos. Ensaios de hidrólise in vitro mostraram que as metaloproteinases HF3 e bothropasina (classe P-III), e BJ-PI (classe P-I) do veneno da Bothrops jararaca, degradaram proteínas plasmáticas (fibrinogênio, fibronectina e vitronectina), além de colágeno VI e Matrigel, mostrando diferentes perfis de hidrólise. Experimentos de N-deglicosilação das proteinases mostraram que suas porções glicosídicas são importantes para a manutenção da integridade de suas estruturas e da atividade proteolítica. E ensaios para avaliar a interação das proteinases e da proteína DC (domínios tipo disintegrina/rico em cisteínas) com alguns substratos protéicos mostraram que além de seus domínios estruturais (catalítico/tipo disintegrina/rico em cisteínas) suas cadeias de carboidratos também são importantes no reconhecimento dos mesmos. / Proteolysis of plasma and extracellular matrix proteins is a key factor in the local hemorrhage induced by snake venom metalloproteinases (SVMPs). In this work we evaluated the role of the structural domains of SVMPs in the interaction with their targets. In vitro hydrolysis assays showed that the SVMPs HF3 and bothropasin (P-III class) and BJ-PI (P-I class) from Bothrops jararaca venom degraded plasma proteins (fibrinogen, fibronectin and vitronectin), collagen VI and Matrigel resulting in different hydrolysis profiles. N-deglycosylation of these proteinases showed that their carbohydrate moieties are important for keeping their structural integrity and proteolytic activity. The assays to analyze the interaction of the proteinases and of the DC protein (composed of the disintegrin-like and cysteine-rich domains) with some proteins confirmed that not only the structural domains (catalytic, disintegrin-like and cysteine-rich) but also the sugar moieties are important in the recognition of plasma and extracellular matrix proteins.

Orientador: Tiago Rodrigues / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC. Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2013

Dados da Literatura têm demonstrado que a CTX, toxina majoritária do veneno de serpente Crotalus durissus terrificus apresenta efeitos anti-inflamatório, imunomodulatório e antitumoral. A CTX modula, particularmente, as funções de macrófagos, células fundamentais para os mecanismos da defesa inata e de importância central na gênese e progressão tumoral. No início da progressão tumoral, os macrófagos apresentam fenótipo pró-inflamatório, caracterizado pela liberação de citocinas inflamatórias, tais como IL-1, IL-6 e TNF-<font face=\"Symbol\">a, reativos intermediários do nitrogênio (RNI) e do reativos intermediários do oxigênio (ROI). No contexto tumoral, os macrófagos inflamatórios inibem o crescimento tumoral, erradicando as células tumorais e estimulando a resposta imune. Por outro lado, os macrófagos anti-inflamatórios encontrados quando o tumor está estabelecido, ou seja, quando atinge o tamanho de 1 cm3, contribuem para a progressão do tumor por produzir mediadores pró-angiogênicos por expressarem baixos níveis das citocinas inflamatórias, perda da capacidade de liberação e de produção de ROI e RNI, importantes para ação tumoricida. Estudos realizados pelo nosso grupo demonstraram que a CTX, após 14 dias de uma única administração, estimula a liberação de peróxido de hidrogênio e produção de óxido nítrico, além de modular a secreção de citocinas por macrófagos obtidos da cavidade peritoneal de ratos normais. Desta forma, considerando que esses mediadores são fundamentais no controle de progressão tumoral, é relevante investigar se a CTX estimula a produção desses mediadores pelos macrófagos obtidos de animais portadores de tumor. Portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar os efeitos da CTX sobre a função e o metabolismo de macrófagos peritoneais obtidos de ratos portadores de tumor de Walker 256. Para tanto, ratos machos da linhagem Wistar foram injetados, por via s.c., no flanco posterior direito, o volume de 1 mL de salina estéril contendo 2x107 de células tumorais. Numa primeira abordagem, a CTX (18<font face=\"Symbol\">mg/animal) foi administrada no subcutâneo dos animais no 5º dia após a inoculação das células tumorais. Após 14 dias da inoculação das células tumorais, macrófagos peritoneais foram obtidos e os seguintes parâmetros foram avaliados: a) liberação de H2O2 e, produção de NO e citocinas pró-inflamatórias (IL-1<font face=\"Symbol\">b, TNF-<font face=\"Symbol\">a e IL-6) e b) a atividade máxima da hexoquinase, glicose-6-fosfato desidrogenase, citrato sintase e a produção de 14CO2 de glicose [U-14C] e glutamina [U-14C]. O tratamento com a CTX estimulou a produção de H2O2 e de NO, a secreção das citocinas IL-1<font face=\"Symbol\">b e do TNF-<font face=\"Symbol\">a e a atividade do metabolismo de glicose e glutamina. Em outra abordagem, a administração da CTX foi concomitante à inoculação das células tumorais. Após 14 dias, os macrófagos apresentaram as atividades secretórias e metabólicas estimuladas. Esses dados colocam a CTX não apenas como ferramenta científica para investigar as funções e o metabolismo de macrófagos, como também para a melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na progressão tumoral. / Crotoxin (CTX), the major toxin of Crotalus durissus terrificus venom induces an inhibitory effect on tumoral growth and modulates, particularly, the functions of macrophages, fundamental cells to provide a defense mechanism against tumor cell. In early tumor progression, macrophages are avidly phagocytic (inflammatory cell) releasing reactive nitrogen intermediates-RNI/ROI and cytokines TNF-<font face=\"Symbol\">a, IL-1<font face=\"Symbol\">b and IL-6. However, when the tumor is installed, tumor-associated macrophage (angiogenic cell) presents a decrease in these abilities. Our group demonstrates that CTX stimulates the H2O2 release and NO production and the secretion of the cytokines by peritoneal M<font face=\"Symbol\">&#198; obtained from non-tumor-bearing rats. Thus, considering that these are key mediators in the control of tumor progression, it is important to investigate whether CTX stimulates the production of these mediators by macrophages obtained from tumor-bearing animals. The aim of this work was to evaluate the CTX effect on macrophage functions and metabolism of peritoneal macrophage obtained of Walker 256 tumor-bearing rats. For this purpose, male Wistar rats were inoculated subcutaneously in the right flank with 1 ml of sterile suspension of 2×107 Walker 256 tumor cells. In a first approach, CTX (18<font face=\"Symbol\">mg/animal) was administered subcutaneously animals on day 5 after inoculation of tumor cells. After 14 days of tumor cell inoculation, peritoneal macrophages were obtained and the following parameters were evaluated: a) release of H2O2 and NO production and pro-inflammatory cytokines (IL-1<font face=\"Symbol\">b, TNF-<font face=\"Symbol\">a and IL-6) and b) maximal activity of hexokinase, glucose-6-phosphate dehydrogenase, citrate synthase and 14CO2 production from [U-14C]-glucose and [U-14C]-glutamine. The treatment with CTX stimulated NO or H2O2 production, cytokine secretion and glucose and glutamine metabolism. In another set of experiments, CTX injected concomitant with tumor cell inoculation. After 14 days macrophages presented metabolism and secretory activity stimulated. These data CTX not only as a scientific tool to investigate the functions and metabolism of macrophages, but also for better understanding of the mechanisms involved in tumor progression.

Orientador: Marcos Roberto de Mattos Fontes / Banca: Pedro de Magalhães Padilha / Banca: Leonardo de Castro Palmieri / Resumo: As fosfolipases A2 (PLA2s) de veneno de serpente são uma das principais toxinas responsavéis pela miotoxicidade e necrose muscular observadas nos acidentes ofídicos. Essas toxinas podem ser separadas em Asp49-PLA2s, cujo mecanismo é catalítico e dependente de cálcio, e as PLA2s homólogas, cuja estrutura é semelhante, porém atividade em mecanismo não catalítico e independente de cálcio. Apesar de os detalhes deste mecanismo não serem bem conhecidos, estudos funcionais ressaltam importância da região do C-terminal e estudos cristalográficos propõem, mais especificamente, um sítio miotóxico composto por resíduos básicos e um hydrophobic knuckle composto por hidrofóbicos, ambos situados na região C-terminal da toxina. O presente trabalho tem objetivo de oferecer mais detalhes acerca do mecanismo de ação miotóxico independente de cálcio. Para tanto, realizamos estudos cristalográficos com miotoxinas botrópicas BthTX-II (uma Asp- PLA2s), BthTX-I e PrTX-I (duas PLA2s homólogas), em presença de íons relevantes para suas atividades. Recentemente, foi demonstrado que íons, tal como manganês, cálcio, zinco entre outros, interferem na atividade biológica de PLA2s e PLA2s homólogas. Assim, estudo cristalográfico da PrTX-I e BthTX-I com íons manganês e zinco foram elucidados no estado nativo e complexado. Experimentos in vivo indicam que tais íons promoveriam efeito inibitório da miotoxicidade. Enquanto os íons manganês não foram localizados no modelo cristalográfico, os íons zinco foram identificados interagindo apenas no modelo nativo com uma His48 e com as His120 de ambos monômeros. Estudos comparativos destas estruturas com a PrTX-II (PLA2s homóloga) com ácidos graxos foi desenvolvido e guiaram para elaboração de nova hipótese do mecanismo de ação independente de... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Phospholipases A2 (PLA2s) from snake venom are among the main toxins responsibles for miotoxicity and muscular necrosis observed in offidic accidents. These toxins can be separated in Asp49-PLA2s, whose catalytic mechanism of action is dependent of calcium, and in homologue PLA2s or PLA2s-like, whose terciary structure is similar, although its activity is not catalytic in a calcium independent mechanism of action. Despite the fact that this calcium independent mechanism is not well known, functional studies highlight the C-terminal region and structural studies points to a myotoxic site, composed by basic residues, and a hydrophobic knuckle, composed by aromatic and hydrophobic, in the C-terminal region. The present study aims to gather more knowledge about this myotoxic calcium independent mechanism of action. For this purpose, the botropic myotoxins BthTX-II (an Asp49- PLA2), BthTX-I and PrTX-I (homologue PLA2s) were studied in the presence of divalent ions by Xray crystallography. Recently, it was demonstrated divalent ions, such as manganese, zinc and calcium, interfere with the biological activity of these toxins. The crystallographic structure of PrTX-I and BthTX-I with manganese and zinc ions in a native and complexed form were elucidated. In vivo studies demonstrated that these ions inhibit the myotoxic activity of these proteins. Although manganese ions were not found in the structures, zinc ions were found interacting with His48 and the C-terminal residue His120. Comparative studies of this structure and PrTX-II (a homologue PLA2) complexed with stearic acid were performed and support a new hypothesis for the myotoxic mechanism of action for homologue PLA2s which includes both myotoxic site and hydrophobic knuckle and, for the first time, His120. Differently from most PLA2s of snake venom... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-19T20:38:05Z No. of bitstreams: 1 Gisele Graça Leite dos Santos Caracterização farmacológica do efeito....pdf: 994611 bytes, checksum: 83e98f6a9587974ce37d04473a121969 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-19T20:38:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gisele Graça Leite dos Santos Caracterização farmacológica do efeito....pdf: 994611 bytes, checksum: 83e98f6a9587974ce37d04473a121969 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / Os componentes dos venenos das serpentes constituem ferramentas farmacológicas e biotecnológicas relevantes. Recentemente, seu potencial terapêutico tem sido demonstrado; podendo representar a base para o desenvolvimento de medicamentos para o controle da dor. A ausência de dor local, mesmo na presença de edema e inflamação, sugere a presença de componente analgésico no veneno de serpentes do gênero Micrurus. Para investigar essa hipótese, no presente trabalho investigamos a atividade antinociceptiva do veneno de Micrurus lemniscatus em modelos experimentais de dor. Em um teste de triagem para antinocicepção, no teste de contorções abdominais, a administração oral do veneno (19,7 - 1600 μg/kg) produziu efeito antinociceptivo significativo. Confirmando essa atividade, o veneno (1600 μg/kg) inibiu as duas fases do teste de formalina, indicando que um mecanismo central pode estar envolvido na antinocicepção. A participação de um componente central foi confirmada no teste de retirada da cauda no qual o veneno (59 - 1600 μg/kg) produziu efeito antinociceptivo dose-dependente. Neste teste, a dose de 1600 μg/kg produziu efeito antinociceptivo mais potente e duradouro que o efeito da morfina, analgésico considerado padrão ouro. Validando essa antinocicepção, a administração do veneno (1600 μg/kg) não provocou comprometimento motor nos testes de rota-rod e campo aberto. Em outra série de experimentos, os mecanismos envolvidos na atividade antinociceptiva do veneno foram investigados com a utilização de antagonistas farmacológicos de receptores opióides. O efeito antinociceptivo do veneno foi prevenido pela naloxona, antagonista opióide não-seletivo, sugerindo a mediação pelo sistema opióide. Em adição, o pré-tratamento com o antagonista de receptor  opióide (CTOP; 1 mg/kg) preveniu completamente o efeito antinociceptivo do veneno. O pré-tratamento com antagonista de receptor k opióide (nor-BNI; 0,5 mg/kg) ou δ opióide (naltrindole; 3 mg/kg) reduziu parcialmente o efeito antinociceptivo desse veneno. Os resultados obtidos demonstram que o veneno de M. lemniscatus apresenta potente efeito antinociceptivo mediado pelo sistema opióide, sobretudo por receptores do tipo . Estudos complementares devem ser realizados para melhor elucidar o mecanismo de ação e o(s) constituinte(s) do veneno envolvido(s) em sua ação antinociceptiva. / The components of snake venom are important pharmacological and biotechnology tools. Recently, their therapeutic potential has been demonstrated; which may represent the basis for the development of drugs for pain control. The absence of local pain, even in the presence of edema and inflammation, suggests the presence of an analgesic component in the snake venom of the genus Micrurus. In order to investigate this hypothesis, we studied the antinociceptive activity of Micrurus lemniscatus venom in experimental models of pain. In a screening test for antinociception, the writhing test, oral administration of venom (19,7 - 1600 μg/kg) produced significant antinociceptive effect. Confirming this activity, the venom (1600 μg/kg) inhibited both phases of the formalin test, indicating that a central mechanism may be involved in antinociception. The participation of a central component was confirmed in the tail-flick test, in which the venom (59 - 1600 μg/kg) produced dose-dependent antinociceptive effect. In this test, the dose of 1600 μg/kg produced a more potent and long lasting antinociceptive effect than the one related to morphine, an analgesic considered the gold standard. Corroborating these results, administration of venom (1600 μg/kg) did not cause motor impairment in the rota-rod and open field tests. In another series of experiments, the mechanisms involved in the venom antinociceptive activity were investigated through the use of pharmacological antagonists of opioid receptors. The venom antinociceptive effect was prevented by naloxone, a non-selective opioid receptor antagonist, suggesting mediation by the opioid system. In addition, pretreatment with a  opioid receptor antagonist (CTOP, 1 mg/kg) completely prevented the venom antinociceptive effect. On the other hand, pretreatment with k opioid receptor antagonist (nor-BNI, 0,5 mg/kg) or δ opioid receptor antagonist (naltrindole; 3 mg/kg) partially reduced the venom antinociception. The present results show that the venom of M. lemniscatus has potent antinociceptive effect mediated by the opioid system, especially by the receptor . Further studies should be conducted to better elucidate the mechanism of action of this venom and its component(s), which are involved in its antinociception.

SOUSA, Paulo Cesar Pereira de. Estudos das alterações renais e vasculares induzidos pelo veneno e frações isoladas de abelha Apis mellifera.2012. 176 f. : Tese (doutorado) - Universidade Federal do Ceará, Centro de Ciências, Faculdade de Medicina, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, Programa de Pós-Graduação de Biotecnologia, Fortaleza-CE, 2012 / Submitted by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-27T14:44:54Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_pcpsousa.pdf: 7871361 bytes, checksum: c08e421b0e8f5a30a3d35df159ea6a7d (MD5) / Approved for entry into archive by demia Maia (demiamlm@gmail.com) on 2016-05-27T14:49:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_pcpsousa.pdf: 7871361 bytes, checksum: c08e421b0e8f5a30a3d35df159ea6a7d (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T14:49:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_pcpsousa.pdf: 7871361 bytes, checksum: c08e421b0e8f5a30a3d35df159ea6a7d (MD5) Previous issue date: 2012 / The increase in accidents involving Africanized bees in Brazil and throughout Latin America in recent decades has become the object of surveillance by the health authorities, because of accidents with hundreds of bees to be associated with frames of poisoning. The venom of the honeybee Apis mellifera is a mixture of toxic peptides with various local and systemic actions. The objective of this study was to evaluate the renal and vascular changes promoted by the whole venom of the bee A. mellifera and its fractions PLA2 and melittin. Male Wistar rats (250-300g) whose kidneys were isolated and perfused with Krebs-Henseleit solution containing modified 6g% bovine albumin previously dialyzed. The evaluation of the vascular effects of the venom of Apis mellifera in pots was carried out using conductance tests ring of isolated rat aorta. The results showed that the whole venom of A. mellifera and the complexed fraction (PLA2+melittin) promoted significant changes in all renal parameters studied, producing an increase in renal perfusion pressure (PP), renal vascular resistance (RVR), urinary flow (FU) and the glomerular filtration rate (GFR), all these changes were seen at concentrations of 3μg/mL and 10μg/mL. However, the lower concentration (1μg/mL) had no effect on the evaluated parameters. It was observed a significant reduction in the percentage of tubular transport of sodium (Na+), potassium (K+) and chloride (Cl-), suggesting that the whole venom and the fraction complexed (PLA2+melittin) engaged on the renal tubular injury. Were also observed in protein deposition in the renal tubules histological focal regions with necrosis/apoptosis, and was found reduced the viability of the MDCK cells and an increased of the enzyme lactate dehydrogenase (LDH), whose concentration dependent cytotoxic effect with a value IC50 47.84μg/mL. In this sense, the results suggest that the renal lesions were necrosis in the tested conditions. It had been shown in the protocol of aortic ring an increase in contractility. In conclusion, the whole venom and the fraction complexed (PLA2+melittin) of bee Apis mellifera caused nephrotoxicity, suggesting a direct action on cell death in renal tubule cells by necrosis. The contractile effect of bee venom involves the opening of calcium channels operated by voltage and suggest a role of alpha adrenergic receptors via activation of phospholipase C. This finding confirms the results found in the isolated rat kidney and there was an increase in pressure due to renal perfussão possible vasoconstriction of the vessels supplying the kidney. Studies of the venom and its fractions in different systems provide a greater understanding of the pathophysiology and an elucidation of the mechanisms observed. Thus, it can lead to the discovery of pharmacological tools and bioprospecting in the components present in the venom. / O aumento dos acidentes envolvendo abelhas africanizadas no Brasil e em toda a América, nas últimas décadas, passou a ser objeto de vigilância das autoridades sanitárias, devido ao fato dos acidentes com centenas de abelhas estarem associadas a quadros de envenenamento. O veneno da abelha Apis mellifera é uma mistura de peptídeos tóxicos com diversas ações locais e sistêmicas. O objetivo do presente trabalho foi avaliar as alterações renais e vasculares promovidas pelo veneno total da abelha A. mellifera e de suas frações PLA2 e melitina. Foram utilizados ratos Wistar machos (250-300g), cujos rins foram isolados e perfundidos com solução de Krebs-Henseleit modificado contendo 6g% de albumina bovina previamente dialisada. A avaliação dos efeitos vasculares do veneno de Apis mellifera em vasos de condutância foi realizada através dos ensaios em anel de aorta isolado de rato. Os resultados encontrados demonstraram que o veneno total de A. mellifera e da fração complexada (PLA2 + melitina) promoveram alterações significativas em todos os parâmetros renais estudados, produzindo um aumento na pressão de perfusão renal (PP), na resistência vascular renal (RVR), no fluxo urinário (FU) e no ritmo de filtração glomerular (RFG), todas essas alterações foram verificadas nas concentrações de 3µg/mL e 10µg/mL. Porém, a menor concentração (1µg/mL) não apresentou efeito nos parâmetros avaliados. Foi verificada uma redução significativa no percentual de transporte tubular de sódio (Na+), potássio (K+) e cloreto (Cl-), sugerindo que o veneno total e a fração complexada (PLA2 + melitina) exerçam injúria sobre os túbulos renais. Também foram observadas depósito de proteínas nos túbulos renais nas análises histológicas com regiões focais de necrose/apoptose, bem como foi constatada redução da viabilidade das células MDCK e do aumento da enzima lactato desidrogenase (LDH), cujo efeito citotóxico dependente de concentração com um valor de IC50 47.84µg/mL. Nesse sentido, os resultados sugerem que as lesões renais foram por necrose nas condições testadas. Foi demonstrado no protocolo de anel de aorta um aumento na contratilidade. Em conclusão, o veneno total e a fração complexada (PLA2 + melitina) da abelha Apis mellifera causaram nefrotoxicidade, sugestivo de uma ação direta com morte celular em células do túbulo renal por necrose. O efeito contrátil do veneno de abelha envolve a abertura de canais de cálcio operados por voltagem e sugerem a participação dos receptores alfa adrenérgicos via ativação da enzima fosfolipase C. Esse achado corrobora com os resultados encontrados em rim isolado de rato, verificando-se um aumento da pressão de perfusão renal devido a uma possível vasoconstricção dos vasos que irrigam o rim. Os estudos do veneno e suas frações em diferentes sistemas propiciam um maior conhecimento da fisiopatologia e uma elucidação dos mecanismos observados. Desta forma, pode levar à descoberta e bioprospecção de ferramentas farmacológicas em componentes presentes no veneno.

Biofilmes são comunidades bacterianas tridimensionais complexas, que vivem organizadas e aderidas a uma superfície, biótica ou abiótica, embebidas em uma matriz exopolimérica. Cerca de 80% das bactérias vivem organizadas na forma de biofilmes, pois dentro destas estruturas são menos sensíveis aos antibióticos e à resposta imune do hospedeiro. Dentre as principais bactérias formadoras de biofilmes têm-se Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa e enterobacteriaceas. Estas bactérias formadoras de biofilmes são importantes colonizadoras da superfície de dispositivos médicos e implantes, aumentando a morbidade e mortalidade dos pacientes que apresentam este tipo de infecção. A investigação de novas estratégias para prevenção e tratamento de infecções por biofilmes é urgentemente necessária. Dentre estas estratégias estão a pesquisa de diferentes mecanismos ou substâncias capazes de provocar a inibição da formação ou a erradicação do biofilme formado. Neste contexto, os venenos animais representam uma fonte ainda inexplorada de uma vasta quantidade de moléculas bioativas, candidatas ao desenvolvimento de novas terapias, inclusive antibiofilme. O principal objetivo deste estudo é avaliar diferentes venenos de serpentes e análogos sintéticos como fonte de moléculas contra biofilmes bacterianos patogênicos. O capítulo 1 revisa estudos que relatam a atividade antimicrobiana (contra bactérias, vírus, protozoários e fungos) de 170 peptídeos isolados de venenos de oito diferentes animais. Peptídeos antimicrobianos vêm ganhando destaque em pesquisas para o tratamento de infecções e peptídeos com atividade antibiofilme são uma nova e promissora abordagem, para o tratamento de infecções relacionadas. O capítulo 2 mostra as atividades antimicrobiana, antibiofilme e de erradicação de biofilmes pré-estabelicidos de 18 análogos de peptídeos de oriundos de venenos de serpentes. Inicialmente foram analisadas e alinhadas 170 sequências peptídeos oriundos de venenos animais. O pepptídeos 16 apresentou considerável atividade antimicrobiana contra cepas bacterianas Gram-positivas, sensíveis e resistentes. Para S. epidermidis os peptídeos 1, 2, 3, 4, 12, 13 e 16 apresentaram menos de 50% de formação de biofilme e os peptídeos 2, 3 e 16 reduziram o biofilme pré-formad. A citotoxicidade e a actividade hemolítica foram testadas e os peptídeos ativos 2 e 16 apresentaram citotoxicidade e hemólise significativas em comparação com os controles. A posição dos aminoácidos pode contribuir para as atividades, sendo que mais testes são necessários para entender a relação das posições de aminoácidos na ação. O capítulo 3 mostra as atividades antiformação e erradicação de biofilmes pré-estabelecidos de dezessete diferentes venenos de serpentes, duas de escorpiões e três de anêmonas marinhas, bem como as secreções de pele de três espécies de sapos. Consideráveis atividades antiformação e de erradicação foram verificadas contra as cepas de S. aureus, S. epidermidis e E. cloaceae por todos os venenos de serpentes testados, em diferentes concentrações. Além disso, um fracionamento inicial foi realizado e as melhores condições foram selecionadas para um novo fracionamento, onde foram testadas 27 frações de veneno de B. diporus. As frações 8, 14 e 23 apresentaram atividades com menos de 50% de formação de biofilme e menos de 80% do biofilme remanescente. Os resultados indicam a capacidade dos venenos, especialmente da serpente de B. diporus, de serem potenciais fontes de moléculas como estratégia para combater os biofilmes patogênicos bacterianos. O presente estudo aborda o potencial de venenos animais, principalmente venenos de serpentes, como fonte de moléculas, que podem apresentar inúmeras atividades farmacológicas inéditas, incluindo àquelas relacionadas com a prevenção da formação e de erradicação de biofilmes bacterianos patogênicos. Atualmente, existem seis medicamentos aprovados pelo Food and Drug Administration (FDA), oriundos de venenos, como o Captopril (Capoten®). Este estudo mostra a capacidade de venenos como fonte de novas moléculas ativas contra biofilmes patogênicos. / Biofilms are complex three-dimensional bacterial communities living organized and attached on a surface, embedded in exopolimeric matrix. About 80% of live bacteria are organized in the form of biofilms because in these structures are less sensitive to antibiotics and host immune response. Staphylococcus spp., Pseudomonas aeruginosa and enterobacteriaceas are the main biofilm forming bacteria. These forming biofilms bacteria are important colonizing surface of medical devices and implants, increasing the morbidity and mortality of patients with this kind of infection. The investigation of new strategies for prevention and treatment of infections caused by biofilms is urgently needed. Among these strategies, there are the research of different mechanisms or substances capable of inhibit the formation or to eradicate the formed biofilm. In this context, animal venoms represent an untapped source of vast amounts of bioactive molecules, candidates for the development of new therapies, including antibiofilm. The main objective of this study is to evaluate different venoms of snakes and synthetic analogs as source of molecules against pathogenic bacterial biofilms. The chapter 1 reviewed numerous studies reporting the antimicrobial activity (against bacteria, viruses, protozoa and fungi) of 170 peptides isolated from venoms of eight different animals. Antimicrobial peptides have been gaining attention in research for the treatment of infections and peptides with antibiofilm activity are a new and promising approach for the treatment of infections related. The chapter 2 shows the antimicrobial, antibiofilm and eradication of established biofilms activities of 18 analogs of peptides derived from snake venoms. Initially, 170 peptide sequences from animal venoms were analyzed and aligned. The peptide 16 showed considerable antimicrobial activity against Gram-positive bacterial strains, sensitive and resistant. For S. epidermidis, the peptides 1, 2, 3, 4, 12, 13 and 16 showed less than 50% of biofilm formation and peptides 2, 3 and 16 reduced preformed biofilm. Cytotoxicity and hemolytic activity were tested and active peptides 2 and 16 showed significant cytotoxicity and hemolysis compared with the controls. The position of the amino acids can contribute to the activities and more tests are needed to understand the relationship of the amino acid positions in the action. The chapter 3 shows the antiformation and eradication of established biofilms activities of seventeen different venoms of snakes, two of scorpions and three of marine anemones, as well as the skin secretions of three species of frogs. Significant activities were observed against strains of S. aureus, S. epidermidis and E. cloaceae for all venom of snakes tested at different concentrations. In addition, an initial fractionation was performed and the best conditions were selected for a new fractionation, where 27 fractions of B. diporus enom were tested. Fractions 8, 14 and 23 presented activities with less than 50% of biofilm formation and less than 80% of the remaining biofilm. The results indicate the ability of venoms, especially the snake B. diporus, to be potential sources of molecules as a strategy to combat bacterial pathogenic biofilms. This study addresses the potential of animal venoms, especially snake venoms, as source of molecules, which can present numerous unpublished pharmacological activities, including those related to the prevention of the formation and eradication of pathogenic bacterial biofilms. Currently, there are six drugs approved by Food and Drug Administration (FDA), derived from venoms, such as Captopril®. This study shows the ability of venoms as source of new bioactive molecules against pathogenic biofilms.