Die Kontamination von Trinkwasser mit Arzneimitteln stellt eine ernste Gesundheitsgefahr dar. Um die Trinkwasserqualität kontinuierlich überwachen und im Falle einer Verunreinigung zeitnah reagieren zu können, sind neuartige Sensoren erforderlich. Hier können immunanalytische Methoden, die auf der Bindung des Analyten an hochselektive Antikörper beruhen, hilfreich sein. In dieser Arbeit wurden magnetpartikelbasierte Immunoassays (MBBAs) für zwei relevante Kontaminanten des Trinkwassers entwickelt: Diclofenac (DCF) und Amoxicillin (AMX). Bei letzterem erwiesen sich neben der Ausgangsverbindung auch dessen Hydrolyseprodukte (HPs) als relevant für die Gefährdungsbeurteilung. In einer umfassenden Studie wurde der Einfluss von externen Faktoren und intrinsischen Eigenschaften des Wassers auf die Hydrolysegeschwindigkeit untersucht. Da die Hydrolyse von AMX auch die Erkennung durch den Antikörper beeinflusst, wurde eine Strategie zur Analyse von Proben mit unbekanntem Hydrolysegrad von AMX unter Verwendung des Enzyms β-Lactamase in der Probenvorbereitung entwickelt. Für beide Analyten ermöglichen die MBBAs eine schnelle Quantifizierung mit Ergebnissen in weniger als einer Stunde, was eine wesentliche Verbesserung gegenüber herkömmlichen Immunoassays wie dem Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) darstellt. Im Vergleich zu den entsprechenden ELISAs mit denselben Antikörpern weisen die MBBAs zudem verbesserte analytische Parameter auf, wie einen breiteren Messbereich und niedrigere Nachweisgrenzen. Aufgrund der magnetischen Eigenschaften der Partikel, die als Plattform für die Assays dienen, eignen sie sich für den mobilen und automatisierten Einsatz vor Ort. Ein integriertes Diagnosesystem, bei dem die elektrochemische Detektion mittels Chronoamperometrie auf einem mikrofluidischen Chip eine weitere Miniaturisierung des Systems ermöglicht, wurde entworfen, um die Überwachung der Trinkwasserqualität online in Wasserwerken zu ermöglichen. / The contamination of drinking water with pharmaceuticals represents a severe health risk. In order to monitor the drinking water quality continuously and enable quick countermeasures in case of contamination, novel sensors are required. Here, immunoanalytical methods based on the binding of the analyte to highly selective antibodies can be helpful. In this work, magnetic bead-based immunoassays (MBBAs) have been developed for the detection of two relevant contaminants of drinking water: diclofenac (DCF) and amoxicillin (AMX). In case of the latter, not only the parent drug is of interest in the risk assessment but also its hydrolysis products (HPs). In a comprehensive study, the influence of external factors and intrinsic properties of the water on the rate of hydrolysis was investigated. As the hydrolysis of AMX further impacts the recognition by the antibody, a strategy to analyze samples with unknown hydrolysis degree of AMX was established employing the enzyme β-lactamase in sample preparation. For both analytes, the MBBAs enable the fast quantification with results obtained in less than one hour which represents a major improvement over conventional immunoassays like the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Compared to the respective ELISAs with the same antibodies, the MBBAs further exhibit improved analytical parameters such as a broader measurement range and lower limits of detection. Due to the magnetic properties of the beads that serve as a platform for the assays, they are suitable for the mobile and automated detection at the point-of-care. An integrated diagnostic system was designed in which electrochemical detection with chronoamperometry on a microfluidic chip allows for further miniaturization of the system to enable monitoring of the drinking water quality online in water supply pipes at waterworks.

This thesis aims to compare the relationship of physical-mechanical properties of tool materials made of WC-Co sintered carbides with their resistance to initiation and propagation of thermal cracks. The paper presents the results of testing the basic physical-mechanical properties of the three samples sintered carbides with different percentage of Co binder. Next, this thesis describes the progress and results of quench experiment and cutting tests using, which was described resistance of the tested samples to thermal and mechanical shock, depending on the values of physical-mechanical properties.

Zahlreiche pathogene „missense“-Mutation, die verhindern, dass Proteine korrekt gefaltet werden, befinden sich in geordneten Regionen von Proteinen. Andere krankheitsrelevante Mutationen befinden sich in ungeordneten Regionen und beeinflussen somit nur begrenzt die Funktionalität, zum Beispiel durch Veränderungen kurzer linearer Sequenzmotive, die Protein-Protein Interaktionen vermitteln. In dieser Arbeit wird ein peptidbasierter Interaktionsscreen präsentiert mit dem sich Veränderungen im Interaktom identifizieren lassen. Synthetische Peptide von wild-typ und zugehörigen mutierten Proteinregionen ermöglichen die gleichzeitige Untersuchung von mehr als hundert Mutationen mittels Massenspektrometrie. Mehr als ein Drittel aller getesteten Mutationen hatten veränderte Interaktionen zur Folge. Darunter befanden sich auch drei Prolin zu Leucin Mutationen in zytosolischen Regionen von Transmembranproteinen, die zusammen mit dem benachbarten Leucin einem Dileucinmotiv ergeben und dadurch verstärkt mit Clathrin interagieren. Dieses Motiv wurde bereits mit Clathrin-vermittelter Endozytose in Verbindung gebracht. Die hinzugewonnene Endozytose könnte Krankheitsmechanismen erklären, da die Mislokalisation der betroffenen Transmembranproteine zum effektiven Verlust derer Funktion führen würde. Diese Hypothese wurde hier von verschiedenen in vitro und in vivo Experimenten bezüglich der P485L Mutation im Glukose Transporter-1 (GLUT1), die das GLUT1-Defizit-Syndrom hervorruft, bestätigt. Weitere Evidenz wurde außerdem für die Funktionalität anderer mutationsbedingter Dileucinmotive gewonnen. Die systematische Analyse von pathogenen Mutationen hat gezeigt, dass Dileucinmotive signifikant und spezifisch in ungeordneten zytosolischen Regionen von Transmembranproteinen überrepräsentiert sind. Dieser Peptidescreen macht das Potenzial unvoreingenommener Analysen zur Aufklärung von Krankheitsmechanismen deutlich, die von Veränderungen in Protein-Protein Interaktionen hervorgerufen werden. / Many disease-associated missense mutations prevent proteins from folding correctly and lead to loss-of-function. These mutations are often found in ordered regions of proteins. Another class of disease-related missense mutations can be found in disordered regions. These are thought to impair only specific parts of a protein’s functions. Those mutations could modify short linear motifs that mediate protein-protein interactions. Here, we designed a peptide-based interaction screen to identify interactions that are affected by mutations in disordered regions. We used synthetic peptides corresponding to the wild type and mutated protein regions spotted on cellulose membrane to pull-down interaction partners. This setup allows for the screening of more than hundred mutations at a time via mass spectrometry. Here, we focused on mutations implicated in neurological diseases. More than one-third of tested variant pairs show differential interactions. Three disease-related proline to leucine mutations in cytosolic tails of transmembrane proteins lead to gain of a dileucine sequence. Several dileucine-containing peptide motifs are involved in clathrin-mediated endocytosis (CME). Also in the presented screen, the newly created motifs mediate interaction with the CME machinery. This could explain the disease mechanisms since mislocalization of the affected transmembrane proteins would lead to their loss of function. This hypothesis has been corroborated for glucose transporter-1 (GLUT1) P485L, causing GLUT1 deficiency syndrome. We were able to provide functional evidence also for additional gained dileucine motifs. A systematic analysis of pathogenic mutations revealed dileucine motifs to be overrepresented in structurally disordered cytosolic regions of transmembrane proteins. The data gained with the peptide screen highlights the power of differential interactome mapping as a generic approach to unravel disease mechanisms caused by changes in protein-protein interactions.

The object of this work is to obtain a fundamentalunderstanding of the principal issues concerning the handlingof an aqueous WC-Co powder suspension. The WO3 surface layer on the oxidised tungsten carbidepowder dissolves at pH&gt;3 with the tungsten concentrationincreasing linearly with time. Adding cobalt powder to thetungsten carbide suspension resulted in a significant reductionof the dissolution rate at pH&lt;10. Electrokinetic studiesindicated that the reduced dissolution rate may be related tothe formation of surface complexes; the experiments showed thatCo species in solution adsorb on the oxidised tungsten carbidepowder. The surface forces of oxidised tungsten and cobalt surfaceswere investigated using the atomic force microscope (AFM)colloidal probe technique. The interactions at various ionicstrengths and pH values are well described by DLVO theory. Theadsorption of cobalt ions to tungsten oxide surfaces resultedin an additional non-DLVO force and a reduced absolute value ofthe surface potential. It was shown that the adsorption ofpoly(ethylene imine) (PEI) to the WO3 surfaces induces anelectrosteric repulsion. The properties of spray-dried WC-Co granules were related tothe WC primary particle size, and the poly(ethylene glycol)(PEG) binder and PEI dispersant content in aqueous WC-Cosuspensions. The granule characterisation includes a new methodfor measuring the density of single granules. The increase inthe fracture strength of granules produced from suspensionsthat were stabilised with PEI was related to a more densepacking of the WC-Co particles. The AFM was used to study the friction and adhesion ofsingle spray-dried WC-Co granules containing various amounts ofPEG binder. The adhesion and friction force between two singlegranules (intergranular friction) and between a granule and ahard metal substrate (die-wall friction) have been determinedas a function of relative humidity. The granule-wall frictionincreases with binder content and relative humidity, whereasthe granule-granule friction is essentially independent of therelative humidity and substantially lower than the granule-wallfriction at all PEG contents. Key words:Hard Metal, Cemented Carbide, WC-Co, TungstenCarbide, Cobalt, Oxidation, Dissolution, Surface Complexation,XPS, AFM, Colloidal Probe, Hamaker Constant, Cauchy, WO3,CoOOH, ESCA, Zeta-Potential, Surface Potential, Poly(ethyleneimine), PEI, Suspension, van der Waals, Steric, Spray-Dried,Poly(ethylene glycol), Strength, Density, Friction, Adhesion,Granule, PEG, Pressing, FFM. / <p>QC 20161027</p>

Seit mehr als 10 Jahren kann biologische Aktivität durch eine Vielzahl photosensorischer Proteine beeinflusst werden. In diesem als Optogenetik bezeichneten Forschungsgebiet, werden Kationen leitende Kanalrhodopsine (CCRs) als lichtinduzierte neuronale Aktivatoren eingesetzt. Diese Arbeit soll zur Vervollständigung von optogenetischen Werkzeugen durch die Entwicklung Anionen leitender Kanalrhodopsine (ACRs) dienen, um die bestehenden Nachteile mikrobieller lichtgetriebener Ionenpumpen zu überwinden, die bislang zur neuronale Inhibition genutzt wurden. Der Austausch von E90 in C. reinhardtii Kanalrhodopsin 2 (CrChR2) durch positiv geladene Aminosäuren führte zu Entwicklung Chlorid leitender ChRs (ChloCs), die jedoch eine Restkationen-permeabilität aufwiesen. Durch Substitution zweier weiterer negativen Ladungen innerhalb des Ionenpermeationsweges, konnte die Kationenleitung vollständig aufgehoben werden. Parallel wurde durch A. Berndt et al. ein inhibitorisches C1C2 (iC1C2), basierend auf der CrChR1/2 Chimäre entwickelt. Wie auch bei den ChloCs, zeigte iC1C2 verbesserungswürdige biophysikalische Eigenschaften. Mutagenesestudien des Ionenpermeationsweges führten zur Entwicklung der verbesserten Nachfolgervariante iC++. Um ausgehend von weiteren CCRs neuartige ACRs zu entwickeln (eACRs), wurden die zuvor angewandten Mutagenesestrategien auf weitere CCRs übertragen. Zwei neue eACRs, Phobos und Aurora, mit jeweils blau- und rotverschobenen Aktionsspektrum konnten generiert werden. Bistabile eACRs wurden erzeugt, die ein lichtgesteuertes Schalten zwischen offenen und geschlossenen Zuständen ermöglichen. Schlussendlich wurde ein natürlich vorkommendes ACR (nACR) aus Proteomonas sulcata (PsACR1) identifiziert und charakterisiert. Die Maximalaktivität von PsACR1 zählt mit 540 nm zu den am stärksten rotverschobenen unter den nACRs. Elektrophysiologische und spektroskopische Untersuchungen ergaben, dass sich der Photozyklus von PsACR1 signifikant von jenen der CCRs unterscheidet. / For more than 10 years, photosensory proteins have developed as powerful tools to manipulate biological activity. In this research field termed optogenetics, cation-conducting channelrhodopsins (CCRs) mainly are utilized as light-induced neural activators. This study aimed at a complementation of the optogenetic tool box by engineering anion-conducting channelrhodopsins (ACRs) to overcome the existing drawbacks of microbial light-driven ion pumps utilized for neural inhibition so far. Replacement of E90 in the cation-conducting C. reinhardtii channelrhodopsin 2 (CrChR2) with positively charged residues reversed the ion selectivity and yielded chloride-conducting ChRs (ChloCs). Applied in neuronal cell culture, ChloCs showed residual cation permeability occasionally leading to excitation instead of the desired inhibition. Further charge elimination within the ion permeation pathway completely abolished cation conduction. In parallel, an inhibitory C1C2 (iC1C2) was developed by A. Berndt et al. based on a CrChR1/2 chimera. Though, iC1C2 displayed unsatisfactory biophysical properties as well. Further mutational modifications of the ion permeation pathway led to the development of the improved successor variant iC++. A systematic transfer of both conversion strategies to other CCRs was conducted to create engineered ACRs (eACRs) with distinct biophysical properties. Two novel eACRs, Phobos and Aurora, with blue- and red-shifted action were obtained. Additionally, step-function mutations greatly enhanced the operational light sensitivity and enabled temporally precise toggling between open and closed states using two different light colors. Finally, a natural ACR (nACR) originating from Proteomonas sulcata (PsACR1) was identified and characterized. With a maximum activation at 540 nm it is one of most red-shifted nACRs. Single turnover electrophysiological measurements and spectroscopic investigations revealed an unusual photocycle compared to that of CCRs.

In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Verfahren untersucht, die eine erfolgreiche Protektion vor hepatischer Ischämie/Reperfusionsschädigung versprachen: ischämische Präkonditionierung (IP) und pharmakologische Konditionierung mit Methylprednisolon (MP). Dabei wurde zunächst das Ausmaß der hepatozellulären Schädigung nach warmer Leberischämie durch Abklemmen der blutzuführenden Gefäße im Ligamentum hepatoduodenale (Pringle-Manöver) analysiert, wobei beide Behandlungsstrategien eine vergleichbar starke Gewebsprotektion erzielten. Nach 70%-iger Leberteilresektion mit Pringle-Manöver war jedoch trotz reduzierter Ischämie/Reperfusionsschädigung die Leberregeneration nach IP-Behandlung nachhaltig eingeschränkt. Im Gegensatz dazu waren die regenerativen Vorgänge nach MP-Behandlung nicht schneller, aber doch mit einer vergleichbaren Kinetik zu unbehandelten, ischämischen Kontrollen abgelaufen. Zusammenfassend gilt, daß sowohl IP- als auch MP-Behandlung die Ischämie/Reperfusionsschädigung deutlich reduzieren. Dies hat jedoch keinen positiven Einfluß auf die nachfolgende Regeneration nach Leberteilresektion mit Pringle-Manöver. / The present study analyses two strategies to protect from hepatic ischemia-reperfusion injury: ischemic preconditioning (IP) and pharmacologic administration of methylprednisolone (MP). First, the extent of hepatocellular damage after warm liver ischemia induced by cross clamping of the hepatic vessels in the hepatoduodenal ligament (Pringle manöver) was analysed demonstrating comparable tissue protection by both treatment modalities. After 70% partial hepatectomy including Pringle manöver however, the hepatocellular regerneration was markedly decreased after IP treatment, despite reduced ischemia-reperfusion injury. Moreover, MP treatment did not improve hepatic regeneration since it showed a comparable timing to untreated, ischemic controls. In conclusion, both IP and MP significantly reduced hepatic ischemia-reperfusion injury. However, no beneficial effects on hepatocellular regeneration after partial hepatectomy including pringle manöver were observed.

Diese Studie untersucht die Bedeutung von Angiotensin II- und Endothelin-1-vermittelten Mechanismen, die im Rahmen von hämodynamischen, hormonellen und renalen Reaktionen bei einen akuten Blutverlust einsetzen. Es wurden wache Hunde mit und ohne Vorbehandlung mit Angiotensin II Typ 1 (AT1) und/oder Endothelin-A (ETA) Rezeptorblockern untersucht. Protokoll 1: Nach einer 60-minütigen Kontrollstunde wurde den Hunden 25% ihres Blutes zügig entzogen. Nach einer Stunde wurde das Blut retransfundiert und die Datenaufzeichnung für eine weitere Stunde fortgesetzt. Protokoll 2: Wie Protokoll 1, aber mit AT1 Blockade durch Losartan i.v. Protokoll 3: Wie Protokoll 1, aber mit ETA Blockade durch ABT-627 i.v. Protokoll 4: Wie Protokoll 1, aber mit kombinierter AT1 plus ETA Blockade. In der Kontrolle sinkt der arterielle Mitteldruck (MAP) nach dem Blutentzug um ~25%, das Herzzeitvolumen (HZV) um ~40%, das Urinvolumen um ~60%, während die Plasmakonzentrationen von Angiotensin II (3.1-fach), Endothelin-1 (1.13-fach), Vasopressin (116-fach) und Adrenalin (3.2-fach) ansteigen. Unter AT1 Blockade kommt es zu einem überproportionalen Abfall des arteriellen Mitteldrucks und die glomeruläre Filtrationsrate (GFR) sinkt. Beim Blutentzug unter ETA Blockade steigt Noradrenalin und nicht Adrenalin an, und der Wiederanstieg des MAP infolge Retransfusion ist unvollständig. In allen Protokollen sinkt das HZV um den gleichen Betrag. Schlussfolgerungen: Für die kurzfristige Regulation des Blutdrucks und die renale Autoregulation der GFR nach Blutverlust spielt Angiotensin II eine wichtigere Rolle als Endothelin-1. Andererseits ist ein intaktes Endothelinsystem eine wichtige Voraussetzung für die vollständige Restitution des arteriellen Mitteldrucks in der Retransfusionsphase. Darüber hinaus scheint Endothelin-1 nach dem Blutentzug die Freisetzung von Adrenalin zu erleichtern, die Freisetzung von Noradrenalin jedoch zu mildern. Die bei einem akuten Blutverlust einsetzenden Kompensationsmechanismen scheinen den Blutfluss (HZV) viel effektiver aufrecht zu erhalten als den Blutdruck (MAP), denn das HZV, nicht aber der arterielle Mitteldruck, sank in allen Protokollen um den gleichen Betrag. / This study investigates angiotensin II and endothelin-1 mediated mechanisms involved in the hemodynamic, hormonal, and renal response towards acute hypotensive hemorrhage. Conscious dogs were pretreated with angiotensin II type 1 (AT1) and/or endothelin-A (ETA) receptor blockers or not. Protocol 1. After a 60 min baseline period, 25% of the dog's blood was rapidly withdrawn. The blood was retransfused 60 min later and data recorded for another hour. Protocol 2. Likewise, but preceded by AT1 blockade with i.v. Losartan. Protocol 3. Likewise, but preceded by ETA blockade with i.v. ABT-627. Protocol 4. Likewise, but with combined AT1 plus ETA blockade. In Controls, hemorrhage decreased mean arterial pressure (MAP) by ~25%, cardiac output by ~40%, and urine volume by ~60%, increased angiotensin II (3.1-fold), endothelin-1 (1.13-fold), vasopressin (116-fold), and adrenaline concentrations (3.2-fold). Glomerular filtration rate and noradrenaline concentrations remained unchanged. During AT1 blockade, the MAP decrease was exaggerated (-40%) and glomerular filtration rate fell. During ETA blockade, noradrenaline increased after hemorrhage instead of adrenaline, and the MAP recovery after retransfusion was blunted. The decrease in cardiac output was similar in all protocols. Conclusions: Angiotensin II is more important than endothelin-1 for the short-term regulation of MAP and glomerular filtration rate after hemorrhage, whereas endothelin-1 seems necessary for complete MAP recovery after retransfusion. After hemorrhage, endothelin-1 seems to facilitate adrenaline release and to blunt noradrenaline release. Hemorrhage-induced compensatory mechanisms maintain blood flow more effectively than blood pressure, since the decrease in cardiac output - but not MAP - was similar in all protocols.

In dieser Arbeit konnte ein humaner IgG1-Antikörper mittels verschiedener massenspektrometrischer Methoden erfolgreich untersucht und charakterisiert werden. Neben der Bestimmung der molekularen Massen des betrachteten Anti-Interleukin-8-Antikörpers und dessen Fragmenten konnte auch die Bildung von Oligomeren untersucht werden. Es wurden verschiedene Oligomere, bis hin zum Pentamer, massenspektrometrisch gemessen und es konnten auch Erkenntnisse gewonnen werden, dass Konzentrationseffekte maßgeblich zur Oligomerbildung bei diesem Antikörper beitragen. Die Antikörperglykosylierung, eine sehr prominente und hoch diverse Modifikation, wurde bei diesem Antikörper ebenfalls gefunden und neben dem intakten Antikörper auch in dessen Fragmenten und im Dimer gemessen. Neben dieser natürlichen Modifikation wurden auch Derivatisierungen des Antikörpers analysiert, dabei wurden unterschiedliche Metallmarkierungen analysiert. Es konnten verschiedene Markierungsgrade bestimmt werden, auch wenn diese nebeneinander als Mischung vorlagen. Der Nachweis, dass der Antikörper auch weiterhin intakt und bindungsfähig ist, konnte erbracht werden. Die Bildung von Komplexen des Antikörpers mit verschiedenen Proteinen konnte ebenfalls mittels Massenspektrometrie gezeigt werden. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es möglich war, eine Quantifizierungsstrategie für Antikörper zu entwickeln. Mit dieser können absolute Quantifizierungen durchgeführt werden, während diese gleichzeitig unabhängig von Art und Struktur des einzusetzenden Standards sind. Damit ist es möglich, die Probleme des Bradford-Assays zu umgehen. Des Weiteren sind nur minimale Kenntnisse über den zu analysierenden Antikörper notwendig, sodass dieses Verfahren auch hervorragend auf bisher nicht charakterisierte Antikörper angewendet werden kann. / The aim of this work is the characterization of an antibody. The used human IgG1-antibody was successfully investigated with various mass spectrometric methods. In addition to the determination of the molecular masses of the analyzed Anti-Interleukin-8 antibody itself and its fragments the formation of oligomers was examined. Different oligomers up to pentamers could be mass spectromatrically measured. Resulting from this, it was possible to find that concentration effects are the main factors for the oligomer formation of this particular antibody. The glycosylation of antibodies, a prominent and high diverse modification, was also found in this antibody and was measured in the intact molecule, in its fragments and also the dimer. Next to this native modification, also a derivatization of the antibody was investigated. Different metal containing modifications were analyzed. Thereby it was possible to determine various tagging degrees, even in a mixture of these metal containing modifications. The important question, whether the tagged antibody is still active and capable for binding, can be answered positively. Furthermore the formation of antibody-protein complexes could be shown via mass spectrometry. It was also successful to develop a quantification strategy for this antibody. With this an absolute quantification was possible, which was independent from the type and the structure of the used standard. With this method it is possible to overcome the problems of the Bradford assay. In addition to this only very little information about the antibody is needed for the quantification, which allows to use this method for non characterized antibodies.

Die vorliegende Arbeit untersucht das Differenzierungsverhalten adulter muriner Knochenmarkzellen im Zentralnervensystem in vivo und in vitro. Hierzu wurden letal bestrahlte Mäuse mit Knochenmark aus transgenen Mausmutanten transplantiert, die das grün fluoreszierende Protein (GFP) unter der Kontrolle des humanen GFAP-Promoters exprimieren. Ein Teil der Rezipienten wurde vier Wochen nach Transplantation einer transienten fokalen cerebralen Ischämie unterzogen, um den Einfluss postischämischer inflammatorischer Vorgänge auf das Differenzierungsverhalten eingewanderter Zellen zu untersuchen. Eine zelluläre Koexpression von GFP und GFAP als Zeichen der Differenzierung hämatogener Zellen zu GFAP-exprimierenden Astrozyten fand sich bei keinem der analysierten Tiere. Für die in vitroVersuche wurden murine Knochenmarkzellen auf Mausastrozyten und auf organotypischen entorhinal-hippocampalen Hirnschnitten kokultiviert. Die hierzu verwendeten Knochenmarkzellen waren entweder retroviral mit GFP transfiziert oder stammten aus zwei verschiedenen transgenen Mausmutanten, von denen eine GFP nahezu ubiquitär unter dem b-Actin-Promoter, die andere GFP unter der Kon-trolle des humanen GFAP-Promoters exprimiert. Während zahlreiche Knochenmarkzellen nach wenigen Tagen der Kokultur die morphologischen Charakteristika ruhender Mikroglia annahmen und Immunoreaktivität für den Makrophagen/Mikroglia-Marker Iba1 aufwiesen, fand sich keine einzige Zelle mit Koexpression von GFP und GFAP. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass adulte murine Knochenmarkzellen bzw. ihre Abkömmlinge im zirkulierenden Blut nicht in GFAP-exprimierende Astrozyten differenzieren. / It has been postulated that adult murine bone marrow cells have the potential to differentiate into cells of neuroectodermal origin. In order to examine whether bone marrow cells can adopt an astroglial fate, various in vivo and in vitro approaches were chosen. Lethally irradiated recipient mice were transplanted with bone marrow derived from transgenic mice which express the green fluorescent protein (GFP) under the control of the human GFAP promoter. Four weeks after transplantation, several animals underwent transient focal cerebral ischemia. Although postischemic inflammatory processes may eventually have a permissive effect on cell differentiation, not a single cells coexpressing GFAP and GFP was found in the brains of all reci-pients examined. For in vitro studies, murine bone marrow cells were co-cultured on astrocytic monolayers or organotypic entorhinal-hippocampal brain slices. Bone marrow cells were either labelled by retroviral transfection with GFP or derived from two different transgenic mouse mutants expressing GFP under the control of the human GFAP-promoter or the murine b-Actin-promoter, respectively. After several days of co-culture bone marrow derived cells developed a ramified morphology and showed immunoreactivity for the monocytic/microglial marker Iba1. However, differentiation of bone marrow derived cells into GFAP-expressing astrocytes was not observed. Our results suggest that adult murine bone marrow cells cannot differentiate into GFAP-expressing astrocytes in vivo or in vitro.

In C. elegans bietet die frühe Embryogenese ein attraktives Modellsystem, um Wechselwirkungen von Proteinen in vivo zu entschlüsseln. Zur präzisen Identifizierung von spezifischen Interaktionen im C. elegans Embryo wurde ein neuer quantitativer Ansatz entwickelt, welcher die Expression von Fusionsproteinen an grün fluoreszierendes Protein in vivo mit markierungsfreier Interaktionsproteomik kombiniert. Diese Strategie wurde angewandt, um die Interaktionspartner von acht Proteinen zu untersuchen, die in essentiellen biologischen Prozessen während der frühen Embryogenese involviert sind. Diese Studie liefert als Ergebnis ein erstes embryonales in vivo Interaktionsnetzwerk bestehend aus 559 Interaktionen zwischen 472 Proteinen. Dieses Netzwerk erfasst nicht nur bekannte Bindungen, sondern auch neue Interaktionen von hoher funktioneller Relevanz. Die Netzwerkinformationen wurden mit Experimenten auf Basis der Ribonukleinsäuren-Interferenz kombiniert um neue Regulatoren der sogenannten „P granules” ausfindig zu machen. Infolgedessen wurde das fadenwurmspezifische Protein GEI-12 als neuer Interaktionspartner der DYRK-Kinase MBK-2 und als wichtiger Regler für die Dynamik der „P granules“ und für die Aufrechterhaltung der Keimbahn identifiziert. Dies führt zu einem hypothetischen Modell in welchem der Phosphorylierungszustand von GEI-12 den Auf- und Abbau der „P granules“ während der frühen Embryogenese vermittelt. Darüber hinaus veranlasst GEI-12 auch die Entstehung von „P granules“ in Säugetierzellen und bindet an PP2A-Phosphatasen, was darauf hindeutet, dass die grundlegenden biophysikalischen Eigenschaften die zur Entstehung der Ribonukleoprotein-Körperchen notwendig sind, im Laufe der Evolution zwischen Spezies konserviert geblieben sind. Zusammenfassend stellt die in vivo Interaktionskartierung ein vielseitiges Werkzeug dar, welches nicht nur die funktionelle Organisation des Proteoms aufdeckt, sondern auch Einsichten in die tierische Entwicklungsbiologie liefert. / In C. elegans, early embryogenesis provides an attractive model system for mapping in vivo protein interactions. In order to accurately identify specific interactions in C. elegans embryos, a new quantitative approach was developed combining in vivo expressed GFP fusion proteins with label-free interaction proteomics. This strategy was applied to studying the interaction partners of eight bait proteins involved in essential biological processes during early embryogenesis. As a result, this study generated a pilot embryo in vivo interaction network composed of 559 interactions among 472 proteins. Importantly, this network captures not only well-characterized bindings but also new interactions of high functional relevance. Further utility of the network is demonstrated by combining it with RNAi perturbation to search for new regulators of P granule formation in early embryos. Consequently, a worm-specific protein GEI-12 was discovered as a novel interaction partner of the DYRK kinase MBK-2 and as an important regulator of P granule dynamics and germline maintenance. This leads to a hypothetical model in which the phosphorylation state of GEI-12 mediates P granule assembly and disassembly during early embryogenesis. In addition, GEI-12 also induces granule formation in mammalian cells and interacts with PP2A phosphatases, indicating that the fundamental biophysical properties required for ribonucleoprotein granule formation are conserved across species during evolution. In summary, in vivo interactome mapping is a versatile approach that not only unravels the functional organization of the proteome but also can reveal insights into animal development.