Acredita-se que as células dendríticas (DCs) sejam as mais eficientes na ativação de linfócitos T (LT) naive. Com a possibilidade de geração in vitro de DCs, muitos protocolos explorando este potencial vêm sendo desenvolvidos, principalmente em abordagens imunoterapêuticas para o câncer. Todavia, em situações fisiológicas a apresentação antigênica dificilmente ocorre por um tipo celular único. Deste modo, este trabalho investigou os padrões de reposta de LT induzidos por DCs maduras (mDCs) em combinação com diferentes APCs, incluindo linfócitos B, monócitos, macrófagos e DCs imaturas. Os padrões de resposta gerados pelos LT foram analisados por citometria de fluxo, ELISA e BIOPLEX. A estimulação dos LT pelas mDCs isoladas apresentaram o maior poder de estimulação, seguidas pelas outras APCs. Todas as combinações diminuiram a resposta induzida pelas mDCs, principalmente de LT CD4+. Deste modo, os dados confirmam o efeito das interações de APCs na estimulação de LT provendo ferramentas para o refinamento de abordagens imunoterapêuticas. / Dendritic cells (DC) are the main APC able to activate T cells (TC). Since they may be generated in vitro, many protocols based on their immunostimulatory potential are currently underway, mainly in immunotherapeutic approaches for cancer. In physiological conditions, however, other APC may participate in antigen presentation, thus influencing the immune response pattern developed. Therefore, the aim of this study was to evaluate the TC response patterns induced in vitro by mature DC (mDC) combined with different APC, including B cells, monocytes, macrophages and immature DC. The response patterns were analyzed flow cytometry, ELISA and Multiplex flow immunoassay. The TC stimulation by isolated mDC presented the highest capacity of stimulation, followed by the other APC. All combinations decreased the response induced by mDC, mainly CD4+ T cells. These data confirm the effects of APC interactions upon TC stimulation and may provide a tool for fine-tuning of immune response induction in immunotherapeutic approaches.

A hanseníase é geralmente agravada pelo aparecimento de reações, que são quadros inflamatórios de difícil tratamento e a principal causa de seqüelas. Nossa hipótese é de que deficiência e/ou perda da função das células T reguladoras (Tregs) podem estar envolvidas no desenvolvimento das reações. Além da avaliação da frequência das Tregs circulantes em pacientes com reação tipo 1 (R1) e reação tipo 2 (R2), também foi avaliada a frequência in situ de FoxP3, IL-17, IL-6 e TGFbeta. Pacientes com R2 apresentaram expressiva diminuição na frequência das Tregs circulantes e in situ em comparação com pacientes com R1 e com os controles. Paralelamente a diminuição das Tregs nas R2 foi observado aumento da expressão de IL-17 in situ e diminuição da expressão de TGFbeta. Biópsias obtidas de pacientes com R1 e R2 antes do episódio reacional mostraram números de células FoxP3+ e IL-17+ similares entre os dois grupos. Entretanto, nas biópsias obtidas durante a reação foi observado diminuição de Tregs e aumento de células IL-17+ em pacientes com R2, enquanto que pacientes com R1 apresentaram o oposto: aumento de Tregs e diminuição de células IL-17+. Além disso, foi observada diminuição da expansão das Tregs frente ao estímulo in vitro com Mycobacterium leprae e uma tendência a baixa expressão de FoxP3 e da molécula imunossupressora CTLA-4 em Tregs de pacientes com R2. Nossos resultados sugerem que nas R2, a diminuição na frequência de Tregs possa estar favorecendo o desenvolvimento de uma resposta Th17, a qual é característica deste tipo de reação. Adicionalmente, com a finalidade de obter um número suficiente de Tregs para realização de ensaios funcionais com estas células, uma vez que se trata de uma subpopulação com baixa freqüência no sangue periférico ( < 10%), foram estabelecidos e avaliados três protocolos distintos para expansão in vitro de Tregs: protocolo Rapamicina, protocolo TGFbeta e protocolo Vitamina D3. Todos os protocolos foram capazes de induzir expansão de Tregs viáveis nos grupos estudados (paucibacilares e multibacilares sem reação, R1 e R2). Em todos os grupos estudados as Tregs expandidas apresentaram capacidade de suprimir a proliferação de linfócitos TCD4+ e TCD8+. Apesar dos três protocolos testados apresentarem capacidade de expandir Tregs in vitro, selecionamos para ensaios futuros os protocolos Rapamicina e TGFbeta por apresentarem melhor custo-benefício. A expansão in vitro será utilizada para estudos funcionais das Tregs buscando melhor entendimento do envolvimento desta subpopulação na patogenia das reações hansênicas / Leprosy is frequently complicated by the appearance of reactions that are difficult to treat and are the main cause of sequelae. We speculated that disturbances in regulatory T-cells (Tregs) could play a role in leprosy reactions. We determined the frequency of circulating Tregs in patients with type 1 reaction (T1R) and type 2 reaction (T2R). The in situ frequency of FoxP3 and interleukin (IL)-17, IL-6, and transforming growth factor beta (TGF)-beta expressing cells was also determined. T2R patients showed markedly lower number of circulating and in situ Tregs than T1R patients and controls. This decrease was paralleled by increased in situ IL-17 expression but decreased TGF-beta expression. Biopsies from T1R and T2R patients before the reaction episodes showed similar number of forkhead box protein P3 + (FoxP3+) and IL-17+ cells. However, in biopsies taken during the reaction, T2R patients showed a decrease in Tregs and increase in IL-17+ cells, whereas T1R patients showed the opposite: Tregs increased but IL17+ cells decreased. We also found decreased expansion of Tregs upon in vitro stimulation with Mycobacterium leprae and a trend for lower expression of FoxP3 and the immunosuppressive molecule CTLA-4 in T2R Tregs. Our results provide some evidence to the hypothesis that, in T2R, downmodulation of Tregs may favor the development of T-helper-17 responses that characterize this reaction. In addition, aiming to provide sufficient number of Tregs to perform functional assays with these cells, as they correspond to a subtle subpopulation among the peripheral blood mononuclear cells ( < 10%), we established and analyzed three different protocols for in vitro Tregs: a Rapamycin protocol, a TGFbeta protocol and a Vitamina D3 protocol. All three protocols were able to induce the expansion of viable in the four types of patients of the study (paucibacillary and multibacillary patients without reaction, and R1 and R2 patients). In these four groups the tregs were able to suppress the proliferative response of TCD4+ e TCD8+ lymphocytes. Although the three protocols resulted in expansion of Tregs, we selected two of them, Rapamycin and TGFbeta for further assays since they showed better cost-benefit. The in vitro expansion will be used to perform functional assays of the Tregs aiming at a better understanding of the involvement of this subpopulation in the pathogenesis of the leprosy reaction episodes

A interação entre a imunidade inata e adaptativa acontece durante diversas fases da resposta imune. Os Toll-like receptors (TLRs) tem importante papel na ativação de macrófagos e portanto, no conjunto de moléculas secretadas por estas células. Pouco se sabe sobre o papel destas substâncias no processo de contração da população de células T ativadas (Activation-induced cell death - AICD). Portanto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar se macrófagos estimulados com diferentes agonistas de TLRs poderiam produzir fatores solúveis com capacidade modulatória da morte por AICD. Primeiramente, demonstramos que tanto a linhagem macrofágica J774, quanto os macrófagos derivados de medula óssea (BMDMs) expressam todos os TLRs, com excessão do TLR11. Comprovamos que estas proteínas são funcionais, uma vez que o estímulo com agonistas de TLRs leva à ativação de NF-<font face=\"Symbol\">&#954B nestes macrófagos. Finalmente, mostramos que os sobrenadantes gerados pelos macrófagos são capazes de proteger as células DO11.10 da AICD, via a regulação negativa de FasL, parcialmente mediada por PGE2. / The interaction between innate and adaptative immunity occurs in several phases of the immune response. The Toll-like receptors (TLRs) have an important role in the activation of macrophages directly acting on the molecules secreted by these cells. Little is known about the role of these secreted molecules on the survival control of activated T lymphocytes (Activation-induced cell death - AICD). Therefore, the objective of the present work was to evaluate the effects of soluble factors produced by macrophages activated with several TLRs agonists, on the survival of T lymphocytes. First we sought the expression of TRLs on both bone marrow-derived and J774 macrophage cell line and we could see that both cells express all TLRs, except for TLR 11. The stimulation of both cells with TLRs agonists leads to the expression of NF-<font face=\"Symbol\">&#954B and the production of soluble factors that are able to protect DO11.10 T lymphocyte cell line from AICD, via down regulation of FasL partially mediated by PGE2.

INTRODUÇÃO: O aumento na expectativa de vida da população justifica o interesse em compreender melhor o processo de envelhecimento. Uma projeção recente do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística prevê que a população de idosos vai triplicar até 2050. Esse aumento trará para o sistema de saúde do Brasil um desafio. O aumento do número de doenças, o comprometimento imunológico, a diminuição da resposta às vacinas são evidenciados na população idosa. A associação entre encurtamento do telômero e senescência celular tem sido estabelecida laboratorialmente. Neste estudo avaliamos comparativamente três grupos de indivíduos idosos quanto à atividade física na categoria de alto desempenho, moderado desempenho e sedentário. Comparamos o comprimento do telômeros em linfócitos T entre os grupos citados. Avaliamos a cognição, a qualidade de vida e incidência de depressão dos idosos dos grupos citados. MÉTODOS: Os pacientes foram selecionados no ambulatório do Instituto de Ortopedia e Traumatologia da Universidade de São Paulo. Avaliamos as características clínicas, funcionais, qualidade de vida, depressão, cognição, miniavaliação nutricional, imunidade e medida do telômeros em linfócitos T. RESULTADOS: Foi detectada correlação estatística significante entre a medida do telômeros em linfócitos e CD8CD28- e a atividade física. Foi, também, detectada diferença na mini avaliação mental e consumo de O2. CONCLUSÕES: Comprovou-se diferença estatística entre a medida do telômeros em linfócitos e CD8CD28- bem como na cognição e a atividade física / INTRODUCTION: The increase in population life expectancy justifies the interest in better understanding the aging process. A recent projection of the Brazilian Institute of Geography and Statistics predicts that the elderly population will triple by 2050. This increase will bring a challenge to the healthcare system in Brazil. The increase in the number of diseases, the immunological impairment, and the decreased response to vaccines are evident, especially in the elderly population. The association between telomere shortening and cellular senescence has been established in a laboratory setting. In this study we compared three groups of elderly individuals regarding their physical activity in the categories of high performance, moderate performance and sedentary. We compared telomere length in T cells between the aforementioned groups. We evaluated the cognition and incidence of depression in the elderly of the aforementioned groups. METHODS: Patients were selected from the clinic of the Institute of Orthopedics and Traumatology, University of São Paulo. We evaluated the clinical characteristics, functional characteristics, quality of life, depression, cognition, nutritional mini-assessment, immunity and telomere length in T cells. RESULTS: A statistically significant correlation was found between telomere length in CD8CD28- T cells and physical activity. Also, differences in the mental mini assessment and the consumption of O2 were detected. CONCLUSION: A statistically significant correlation was proven between the length of the telomeres in CD8CD28- T cells and cognition, as well as in physical activity

INTRODUÇÃO: A incidência de câncer da glândula tireoide é a que mais vem crescendo nas últimas décadas. Dentro desse grupo de diferentes neoplasias, o carcinoma papilífero, um dos carcinomas bem diferenciados, representa a maioria e tem prognóstico favorável, com sobrevida acima dos 90% em 5 anos. Embora sejam utilizadas diversas classificações de risco baseadas em diferentes fatores prognósticos, ainda não se consegue predizer quais pacientes terão maior chance de recorrência, metástases linfonodais e desfecho desfavorável, que se beneficiariam de um tratamento mais agressivo. Já foi demonstrado em diversos tipos de neoplasias que diferenças no perfil do infiltrado imune tumoral têm relação com prognóstico e resposta ao tratamento. Neste estudo caracterizou-se o microambiente imune do carcinoma papilífero através de marcadores imuno-histoquímicos de células inflamatórias e relacionou-se este perfil de infiltração com fatores prognósticos clínico-patológicos e com sobrevida livre de recorrência. MÉTODOS: Foram incluídos 151 casos selecionados com base em um banco de dados que incluiu todos os pacientes submetidos a tratamento cirúrgico para câncer de tireoide no A.C.Camargo Cancer Center entre 2008 e 2010. Casos com tireoidite significante foram excluídos. Estes tumores selecionados foram então submetidos a reação imuno-histoquímica com marcadores de células inflamatórias e foram analisados por dois patologistas experientes. As características clínicas e patológicas foram avaliadas, assim como as recorrências e sobrevida, relacionando-as com as leituras de células marcadas. As análises de sobrevida global e livre de doença foram realizadas pelo método de Kaplan-Meier, com comparação de curvas de sobrevida pelo teste de Logrank. RESULTADOS: Cento e cinquenta e um pacientes foram incluídos, sendo 130 (86,1%) mulheres e 21 (13.9%) homens. Multifocalidade foi encontrada em 41 (27.2%), extensão extratireoidiana em 43 (28.5%) e metástase linfonodal em 36 (23.8%) casos. Apenas dois pacientes apresentaram metástase a distância. O tempo de seguimento médio foi 65,1 meses e observou-se nove (6%) pacientes com recorrências de neoplasia. Os pacientes com tumores com metástase linfonodal e/ou extensão extratireoidiana apresentaram maior risco de recorrência. Dos marcadores analisados, uma maior densidade de CD8 (que marca linfócitos citotóxicos) na área peritumoral esteve associada a uma tendência a melhor sobrevida livre de recorrência: 97,1% versus 87,5% (p=0,057), além de significativos menores índices de multifocalidade tumoral e de metástase linfonodal. A maior infiltração de linfócitos T CD8+ no tumor também se relacionou com menor ocorrência de metástase linfonodal nesta amostra (18,4% versus 38,1%, p=0,011). Além disso, a densidade desta marcação, tanto no interior da lesão neoplásica como em área peritumoral foi significativamente maior nos casos de carcinomas papilíferos restritos à tireoide, ou seja, sem extensão extratireoidiana e sem metástases. Os demais marcadores analisados não apresentaram relação significativa e consistente com recorrência ou outros fatores prognósticos. CONCLUSÕES: Nas neoplasias malignas de tireoide, o microambiente imune parece ter uma relação com características patológicas de agressividade. Este estudo mostrou que em carcinoma papilífero de tireoide quando não associado à tireoidite significativa, a densidade do infiltrado tumoral e peritumoral por linfócitos T CD8+ está inversamente relacionada com chance de disseminação metastática linfonodal e, provavelmente, com recidiva da doença, sendo, portanto, um marcador de melhor prognóstico. Este dado sugere que estes linfócitos exercem efeito antitumoral no carcinoma papilífero de tireoide, corroborando a importância da resposta imune na evolução desta neoplasia / INTRODUCTION: Within the last few decades thyroid cancer has the fastest rising incidence rate among all malignancies. In this group of different neoplasms, the papillary carcinoma, one of the well-differentiated carcinomas, represents the great majority and has favorable prognosis, with overall survival rates above 90% in five years. Although several risk classifications based on different prognostic features have been used, they are not accurate to predict which patients will have higher chance of recurrence, lymphatic metastasis and worse outcome, benefiting from more aggressive treatment. It has been described in several kinds of malignancies that tumor related immune infiltration has relation with prognosis and response to treatment. In this study, we characterize the immune microenvironment in papillary thyroid carcinomas, using immunohistochemical markers to inflammatory cells, and relate it with clinical and pathological prognostic features and with recurrence free survival rates. METHODS: The 151 included cases were selected from a database that included all patients who underwent surgical treatment for thyroid cancer at A.C.Camargo Cancer Center between the years 2008 and 2010. Tumor with significant thyroiditis were excluded. The selected tumors were submitted to immunohistochemical reactions with markers of inflammatory cells and analysis in complete slides by two experienced pathologists. Clinical and pathological features were evaluated, as well as recurrence and survival, relating them with the reading of marked cells. Survival analysis were made using Kaplan-Meier method, comparing survival curves with the Logrank test. RESULTS: One hundred and fifty one patients were included, of which 130 (86.1%) were females and 21 (13.9%) males. Multifocal disease was found in 41 cases (27.2%), extrathyroidal extension in 43 (28.5%) and lymph node metastasis in 36 (23.8%). Only two patients had distant metastasis. The mean follow-up time was 65.1 months and we observed nine (6%) tumor recurrences. Tumors with lymph node metastasis and/or extrathyroidal extension showed significantly higher recurrence rates. Of the analyzed markers, the cases with a higher density of CD8 (which marks cytotoxic T lymphocytes) in peritumoral areas presented a trend to better recurrence-free survival: 97.1% versus 87.5% (p=0.057), in addition to lower rates of mutifocal tumors and lymph node metastasis. A higher infiltration rate of CD8+ T lymphocytes in the tumor also correlated with less risk of lymph node metastasis in this sample (18.4% versus 38.1%, p=0.011). Besides that, the density of this marking both in the tumor and in peritumoral areas, was significantly higher in the papillary carcinomas limited to the thyroid gland (without extrathyroidal extension or metastasis). The other markers analyzed did not presented significant or consistent relation with recurrence or other prognostic factors. CONCLUSIONS: In thyroid cancer, the immune microenvironment seems to relate with pathological features of aggressiveness. This study showed that in papillary thyroid carcinomas without significant thyroiditis, the density of tumoral and peritumoral infiltration by CD8+ T lymphocytes is inversely related with lymph node metastasis rate and probably with recurrence, being therefore a marker of better prognosis. These data suggest that these lymphocytes play an anti-tumoral role in papillary thyroid carcinoma, supporting the implication of immune response in the progression of this neoplasm

O objetivo deste estudo foi analisar a expressão e o padrão de distribuição de linfócitos citotóxicos (LCs) e linfócitos T regulatórios (LTregs) no tecido gengival de pacientes com doença periodontal através de análise imunoistoquímica. Foram selecionados 30 pacientes (10 por grupo) com diagnóstico de periodontite agressiva (PA), periodontite crônica (PC) e gengiva clinicamente saudável (controle); dos quais foi colhida uma amostra de tecido gengival. A distribuição das células (epitélio e córion) foi identificada usando os imunomarcadores CD56, CD57, Granzima B e Perforina (LCs); CD4, CD25, FOXP3 (LTregs). A imunoexpressão foi avaliada, utilizando representação de imagem por meio de um sistema computadorizado, constituído por microscópio de luz, adaptado a uma câmera de alta resolução. Contagens independentes de 10 campos separados para cada caso foram feitas. Two-way ANOVA e posterior teste de Fisher foram utilizados para observar diferenças entre os diagnósticos e os marcadores; e teste t de Student para observar diferenças entre epitélio e córion (p<0.05). Os resultados indicaram que pacientes com PA e PC apresentaram um número significantemente maior de células CD56+ e CD57+, em relação ao grupo controle, porém sem diferenças entre si; um número significantemente maior de células CD56+ e CD57+ foi observado em relação às células Granzima B+ e Perforina+ em todos os pacientes. Em relação aos LTregs, o número de células CD25+ e FOXP3+, foi significativamente diferente entre PA, PC e controle, aparecendo em maior número na PC. Células CD4+ foram observadas em número similar em pacientes com PA e PC, diferindo significantemente do grupo controle; em pacientes com PA e PC, foi observado um número significantemente maior de CD4+, em relação às células CD25+ e FOXP3+. Pacientes com PA e PC tem maior número de LCs no tecido gengival em relação ao grupo controle sugerindo a participação destas células na patogênese da PA e PC. Pacientes com PA apresentaram menor número de LTregs no tecido gengival em comparação aos pacientes com PC, sugerindo que estas células podem estar envolvidas no mecanismo de regulação do processo inflamatório e reabsorção óssea. / This project aims to observe the expression and distribution of cytotoxic lymphocytes (LCs) and regulatory T lymphocytes (LTregs) in gingival tissue from periodontal disease affected patients through immunohistochemical analysis. 30 patients (10 per group) diagnosed with aggressive periodontitis (PA), chronic periodontitis (PC) and clinically healthy gingiva (control) were selected; from which a sample of gingival tissue was collected. The distribution of cells (epithelium and chorion) was identified using the immunomarkers CD56, CD57, Granzyme B, Perforin (LCs); CD4, CD25, FOXP3 (LTregs). The immunoexpression was assessed using image representation by a computer system, comprising a light microscope adapted to a high resolution camera. Independent counts of 10 separate fields for each case were done. Two-way ANOVA and posterior Fisher´s Test were used to observe differences between diagnostics and immunomarkers; and unpaired Student t test to observe differences between epithelium and chorium (p<0.05). The results indicates that patients with PA and PC presented a significantly higher number of CD56+ and CD57+ cells, in relation to control, but without differences between each other; a significantly higher number of CD56+ and CD57+ cells was observed in relation to Granzyme B and Perforine cells in all patients. Related to the LTregs, the number of CD25+ and FOXP3+ cells was significantly different between PA, PC and control, appearing in greater number in PC. CD4+ cells were observed in similar number in patients with PA and PC, it was observed a significantly higher number of CD4+, in relation to CD25+ and FOXP3+ cells. Patients with PA and PC have a greater number of LCs in gingival tissue in relation to control group - suggesting the participation of this cells in the pathogenesis of PA and PC. Patients with PA presented less LTregs in gingival tissue when compared to PC patients, suggesting that this cells may be involved in the regulatory mechanism of the inflammatory process and bone resorption.

Introdução: Uma proporção significante de pacientes infectados por HIV-1 (pacientes HIV-1+) tratados com inibidores de protease (IPs) desenvolve mutações de resistência. Estudos recentes têm mostrado que células T CD8+ de pacientes HIV- 1+ reconhecem epitopos de Pol incluindo mutações selecionadas por drogas. Nenhum epitopo CD4+ da protease foi descrito na base de dados de Los Alamos. Objetivo: Considerando que a protease de HIV-1 é alvo de terapia antiretroviral e que essa pressão pode selecionar mutações, nós investigamos se mutações selecionadas por IPs afetariam o reconhecimento de epitopos da protease de HIV-1 por células T CD4+ em pacientes tratados com IPs. Nós investigamos o reconhecimento de três regiões da protease preditas de conter epitopos de células T CD4+ bem como mutações induzidas por IPs por células T CD4+ em pacientes HIV- 1+ tratados com IPs. Materiais e Métodos: Quarenta pacientes HIV-1+ tratados com IPs foram incluídos (30 em uso de Lopinavir/ritonavir, 9 em uso de Atazanavir/Ritonavir e 1 em uso exclusivo de Atazanavir). Para cada paciente determinou-se a seqüência endógena da protease de HIV-1, genotipagem viral e tipagem HLA classe II. Utilizamos o algoritmo TEPITOPE para selecionar peptídeos promíscuos, ligadores de múltiplas moléculas HLA-DR, codificando as três regiões da protease de HIV-1 cepa HXB2 (HXB2 4-23, 45-64, e 76-95) e 32 peptídeos adicionais contidos nas mesmas regiões incorporando as mutações induzidas por IPs mais freqüentes no Brasil. Os 35 peptídeos foram sintetizados. Respostas proliferativas de células T CD4+ e CD8+ aos peptídeos foram determinadas por ensaios de proliferação com diluição do corante CFSE. Ensaios de ligação a alelos HLA classe II foram realizados para confirmar a promiscuidade desses peptídeos e avaliar a habilidade de se ligarem a moléculas HLA presentes em cada paciente. Resultados: Todos os peptídeos foram reconhecidos por pelo menos um paciente e respostas proliferativas de células T CD4+ e CD8+ a pelo menos um peptídeo da protease de HIV-1 foram encontradas em 78% e 75% dos pacientes, respectivamente. A terceira região (Protease 76 95) foi a mais freqüentemente reconhecida. Ao compararmos as respostas de células T às seqüências da protease do HIV-1 endógeno, observamos que a maioria dos pacientes não foi capaz de reconhecer peptídeos idênticos às essas seqüências, porém reconheceram peptídeos variantes diferentes das mesmas regiões. Apenas sete pacientes responderam às seqüências endógenas. Verificamos que diversos peptídeos endógenos que não foram reconhecidos apresentaram ausência de ligação a alelos HLA portados por estes pacientes, sugerindo que mutações selecionadas por pressão imune tenham levado ao escape de apresentação de antígeno e evasão de resposta de linfócitos T CD4+. Alternativamente, isso poderia ser explicado pela presença de um vírus replicante distinto presente no plasma uma vez que somente foram obtidas seqüências provirais. Conclusão: Epitopos selvagens e mutantes da protease do HIV-1 reconhecidos por células T CD4+ foram identificados. Também verificamos que a maior parte dos pacientes não reconheceu as seqüências da protease endógena enquanto que reconheceram seqüências variantes. O reconhecimento de seqüências não-endógenas poderia ser hipoteticamente conseqüência de alvo de populações HIV-1 minoritárias; protease de HERV que contém regiões de similaridade com a protease do HIV-1; ou seqüências de HIV-1 presentes apenas em parceiros virêmicos. A falha de reconhecimento de seqüências endógenas seria mais provável devido ao escape imune, do que ao nível de apresentação ou reconhecimento por células T. Isso implica em uma conseqüência patofisiológica na evasão de respostas de células T contra a protease de HIV-1 e no fato de ser tradicionalmente considerada uma proteína pouco antigênica / Introduction: A significant proportion of protease inhibitor (PI)-treated HIV-1 infected (HIV-1+) patients develop resistance mutations. Recent studies have shown that CD8+ T cells from HIV-1 patients can recognize antiretroviral drug-induced mutant Pol epitopes. No HIV-1 protease CD4 epitopes are described in the Los Alamos database. Aims: Given that the protease of HIV-1 is a target of antiretroviral therapy and this pressure may lead to the selection of mutations, we investigated whether PI-induced mutations affect the recognition of HIV-1 protease epitopes by CD4 + T cells in PI-treated patients. We investigated the recognition of three protease regions predicted to harbor CD4+ T cell epitopes as well as PI-induced mutations by CD4+ T cells of PI-treated HIV-1+ patients. Methods: Forty PI-treated HIV-1+ patients were included (30 undergoing Lopinavir/ritonavir, 9 undergoing Atazanavir/ritonavir and 1 undergoing exclusively Atazanavir treatment). For each patients, the endogenous HIV-1 protease sequence, viral genotype and HLA class II typing were determined. We used the TEPITOPE algorithm to select promiscuous, multiple HLA-DR-binding peptides encoding 3 regions of HIV-1 HXB2 strain protease (HXB2 4-23, 45-64, and 76-95) and 32 additional peptides contained in the same regions, but encompassing the most frequent PI-induced mutations in Brazil. The 35 peptides were thus synthesized. Proliferative responses of CD4+ and CD8+ T cells against peptides were determined by the CFSE dilution assay. HLA class II binding assays were made to confirm the promiscuity of these peptides and evaluate their ability to bind the HLA molecules carried by each patient. Results: All tested peptides were recognized by at least one patient and proliferative responses of CD4+ and CD8+ T cells against at least one HIV-1 protease peptide were found in 78% and 75% patients, respectively. The third region (Protease 76-95) was the most frequently recognized. By comparing T-cell responses to HIV-1 endogenous protease sequences, we found that most patients failed to recognize identical peptides of those sequences, but recognized different variant peptides of the same region. Only seven patients responded to endogenous sequences. We found that several endogenous peptides that failed to be recognized showed no binding to the HLA alleles carried by that given patient, suggesting that mutations selected by immune pressure have led to escape of antigen presentation, as well as direct escape of the CD4+ T cell response. Alternatively, it could have been due to the presence of a different replicating virus in the plasma-since we only obtained proviral sequences. Conclusion: Wild-type and mutant HIV-1 protease epitopes recognized by CD4+ T cells were identified. We also found that most patients failed to recognize their endogenous protease sequences, while they recognized variant sequences. The recognition of non-endogenous sequences could hypothetically be a consequence of targeting a minor HIV-1 population; HERV protease, that contains regions of similarity with HIV-1 protease; or HIV-1 sequences present only in viremic partners. The failure to recognize endogenous sequences is most likely due to immune escape, either at the level of presentation or direct T cell recognition. This may have a pathophysiological consequence on evasion of T cell responses against protease and the fact that it has been considered traditionally a poorly antigenic HIV-1 protein.

A angiotensina (Ang) II e aldosterona induzem hipertensão arterial por mecanismos em parte mediados pela imunidade adaptativa, envolvendo linfócitos T auxiliares respondedores (Tresp). Os linfócitos T reguladores (Treg) são capazes de suprimir os efeitos próinflamatórios do sistema imune. O presente estudo avaliou se a transferência adotiva de Treg é capaz de prevenir a hipertensão e a lesão vascular induzidas pela Ang II ou pela aldosterona, em dois protocolos distintos. No protocolo com Ang II, camundongos machos C57BL/6 sofreram a injeção endovenosa de Treg ou Tresp, sendo depois infundidos com Ang II (1&#956;g/kg/min), ou salina (grupo controle) por 14 dias. No protocolo com aldosterona, um outro conjunto de animais sofreu injeções de Treg ou Tresp, sendo depois infundido com aldosterona (600&#956;g/kg/d) ou salina (grupo controle), pelo mesmo intervalo de tempo. O grupo tratado com aldosterona recebeu salina 1% na água. Tanto o grupo Ang II como aldosterona apresentaram elevação da pressão arterial sistólica (43% e 31% respectivamente), da atividade da NADPH oxidase na aorta (1,5 e 1,9 vezes, respectivamente) e no coração (1,8 e 2,4 vezes, respectivamente) e uma redução da resposta vasodilatadora à acetilcolina (de 70% e 56%, respectivamente), quando comparados com os respectivos controles (P<0,05). Adicionalmente, a administração de Ang II proporcionou um aumento rigidez vascular (P<0,001), na expressão de VCAM-1 nas artérias mesentéricas (P<0,05), na infiltração aórtica de macrófagos e linfócitos T (P<0,001) e nos níveis plasmáticos das citocinas inflamatórias interferon (INF)-&#947;, interleucina (IL)-6, Tumor necrosis factor (TNF)-&#945; e IL-10 (P<0,05). Ang II causou uma queda de 43% no número de células Foxp3+ no córtex renal, enquanto que a transferência adotiva de Treg aumentou as células Foxp3+ em duas vezes em comparação com o controle. A administração de Treg preveniu o remodelamento vascular induzido pela aldosterona, observado na relação média/lúmen e na área transversal da média das artérias mesentéricas (P<0,05). Todos os parâmetros acima foram prevenidos com a administração de Treg, mas não de Tresp. Estes resultados demonstram que Treg são capazes de impedir a lesão vascular e a hipertensão mediadas por Ang II ou por aldosterona, em parte através de ações antiinflamatórias. Em conclusão, uma abordagem imuno-modulatória pode prevenir o aumento da pressão arterial, o estresse oxidativo vascular, a inflamação e a disfunção endotelial induzidos por Ang II ou aldosterona. / Angiotensin (Ang) II and aldosterone (aldo) induce hypertension through mechanisms in part mediated by adaptive immunity and T responder lymphocytes. T regulatory (Treg) lymphocytes suppress pro-inflammatory mediators of the immune system. We questioned whether Treg adoptive transfer will blunt Ang II or aldo-induced hypertension and vascular injury, by evaluating two distinct protocols. In the Ang II protocol, male C57BL/6 mice were injected i.v. with Treg or T responder cells, and then infused with Ang II (1&#956;g/kg/min) or saline, for 14 days. In the aldosterone protocol, another set of animals was injected with Treg or T responder cells, and then infused with aldosterone (600&#956;g/kg/d) or saline, for the same period. The aldosterone group received saline 1% in drinking water. Both Ang II and aldosterone treated mice presented an increase in systolic blood pressure (43% and 31% respectively), of NADPH oxidase activity in aorta (1.5 and 1.9 fold, respectively) and heart (1.8 and 2.4 fold respectively) and an impaired vasodilatory response do acetylcholine (by 70% and 56% respectively), when compared to their controls (P<0.05). In addition, Ang II administration resulted in increased vascular stiffness (P<0.001), mesenteric artery vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) expression (P<0.05), aortic macrophage and T cell infiltration (P<0.001), and the plasma levels of the inflammatory cytokines INF-&#947;, IL-6, TNF-&#945;, and IL-10 (P<0,05). AngII caused a 43% decrease in the number of Foxp3+ cells in the renal cortex, while Treg adoptive transfer increased Foxp3+ cells 2-fold compared to control. Treg administration prevented aldosterone-induced vascular remodelling, as observed by media to lumen ratio and media cross sectional area analysis of mesenteric arteries (P<0,05). All the above were prevented by Treg but not by T responder cell adoptive transfer. These results demonstrate that Treg suppress Ang II or aldo-mediated vascular injury and BP elevation, in part through anti-inflammatory actions. These findings suggest that an immunomodulatory approach can prevent Ang II or aldosterone-induced blood pressure elevation, vascular oxidative stress, inflammation and endothelial dysfunction.

A Enfuvirtida(ENF), único inibidor de fusão disponível, representa uma opção interessante aos pacientes com infecção pelo HIV quando utilizada em combinação com outros antirretrovirais, principalmente no tratamento de multiexperimentados com falha virológica e poucas opções terapêuticas. Sua eficácia já comprovada em ensaios clínicos esbarra nas barreiras impostas por sua administração parenteral. Impulsionado por estes dados, avaliamos durante 48 semanas a resposta virológica, a evolução de células T CD4 a possível resistência primária a ENF e o impacto para a adesão do uso subcutâneo da droga em dez pacientes que fazem acompanhamento ambulatorial no Hospital Universitário Pedro Ernesto e que tinham história de mais de dez anos de infecção pelo HIV e uso de ENF no seu esquema terapêutico sugerido por teste de resistência. Todos os pacientes alcançaram ao final do seguimento sucesso terapêutico, mantendo carga viral não detectada, e um incremento médio significativo de linfócitos T CD4. Em relação a uma possível resistência primária, em nenhum dos testes, genotipagem da glicoproteína 41, foi visualizado mutações naturais que pudessem diminuir a ação da ENF. Sobre o manejo do medicamento, preparo e aplicação, observamos que é imprescindível um apoio multidisciplinar para que não haja descontinuação na sua utilização / Enfuvirtide (ENF) is the only fusion inhibitor available. It is an interesting option for patients with HIV infection when used in combination with other antiretroviral drugs, especially in the treatment of multi-experienced patients with virological failure and few therapeutic options. Its effectiveness confirmed in clinical trials finds the barriers in its parenteral administration. Using these data, we evaluated, for 48 weeks, the virological response, evolution of CD4 T cells, the possible primary resistance to ENF and the impact to the subcutaneous use of the drug in ten patients undergoing outpatient monitoring at Hospital Universitário Pedro Ernesto with a history of more than ten years of HIV infection and use of ENF in their therapy, as suggested by resistance testing. All patients have successfully completed the therapy by the end of follow-up with an undetected viral load and a significant average increase of CD4 T lymphocytes. As for a possible primary resistance, neither the genotyping nor the glycoprotein 41 revealed natural mutations that could diminish the effect of ENF. Concerning the management, preparation and application of the drug, we found that a multidisciplinary support is essential to avoid that the drug be discontinued

O sistema imunológico materno desempenha um papel importante no estabelecimento da gestação e desenvolvimento de concepto até início do parto. A hipótese deste projeto é que há um recrutamento de células T&#947;&#948 para o endométrio ao longo da gestação que expressam citocinas que favorecem o estabelecimento e manutenção da tolerância materna a antígenos fetais durante a gestação em bovinos. Experimento I Para estudar a dinâmica populacional das células do sistema imune no sangue periférico de não lactantes não prenhes (NLNP), vacas lactantes no 1º trimestre e vacas no 3º trimestre da gestação, as PBMCs foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll, seguido por protocolo de imunocitoquímica e analisadas em citômetro de fluxo para os anticorpos CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD25+ e WC1+. As células analisadas tanto na região de linfócitos quanto na região de monócitos, não apresentaram diferença significativa entre os grupos analisados. Experimento II Para análise do perfil de expressão gênica das células T&#947;&#948, foram coletadas amostras de sangue de vacas no 1º trimestre da gestação, vacas lactantes não prenhes (LNP) e vacas não lactantes não prenhes (NLNP). As células mononucleares foram separadas por gradiente de densidade de Ficoll e células T&#947;&#948 foram analisadas quanto ao perfil de citocinas por qRT-PCR para os genes IFNG; IL10; IL15; IL17; IL18; IL1B; IL4; IL-6; ISG15; PFR; TGFB2 e TNFA. A análise de expressão gênica mostrou tendência no aumento na expressão de IL1B, IL6 e TGFB2 em células PBMC em vacas NLNP quando comparado com vacas LNP e no 1º trimestre da gestação, enquanto que os outros genes analisados não apresentaram diferença significativa. Experimento III Fragmentos de endométrio, provenientes de abatedouro, foram coletados de vacas em 1º trimestre (33 a 35 dias de gestação), 2º trimestre (143 a 182 dias de gestação) e 3º trimestre de gestação (228 a 247 dias de gestação). Cortes congelados foram imunolocalizados e quantificados para as células do sistema imune CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD18+, CD25+, CD62L+ e WC1+ por imunofluorescência. Nossos estudos mostraram aumento das células CD25+ e CD62L+ no endométrio no início da gestação. No meio da gestação, há um aumento das células WC1+ e CD14+. No final da gestação, observamos o aumento de CD14+, CD25+, CD18+ e CD62L+. Em suma, nossos dados sugerem que a modulação do sistema imune materno é específica para cada estágio da gestação, sendo que no início da gestação há um envolvimento de células T ativadas (CD25+) provavelmente para o estabelecimento de uma resposta ativa para tolerância dos antígenos fetais. Já no meio da gestação, há um recrutamento massivo de células T&#947;&#948 para o endométrio gravídico provavelmente para manter um microambiente de tolerância para o desenvolvimento fetal e no final da gestação células efetoras como macrófagos são recrutadas para o endométrio para auxiliar no processo do parto e involução uterina. / The maternal immune system plays an important role on the establishment and maintenance of pregnancy until the onset of parturition in mammals. Our hypothesis is that there is a recruitment of &#947;&#948T-cell to the endometrium during pregnancy. These cells express a particular cytokine profile that is important to the establishment and maintenance of maternal toleranceto fetal antigens in cattle. Experiment I - To study the population dynamics of immune cells in the peripheral blood of NLNP, 1st and 3rd trimester of pregnancy, PBMCs were separated by Ficoll density gradient and the abundance of CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD25+ and WC1+ was analyzed by single-color flow cytometry. There was no statistical difference of the abundance of CD3+, CD4+, CD8+ and CD25+ among groups of cows. Experiment II To analyze the gene expression profile of 1st trimester, LNP and NLNP. PBMCs were isolated by Ficoll density gradient and &#947;&#948T-cells (WC1+) were enriched by magnetic cell sorting. Both PBMC and WC1+ cells gene expression was analyzed for IFNG; IL10; IL15; IL17; IL18; IL1B; IL4; IL-6; ISG15; PFR; TGFB2 and TNFA by qRT-PCR. Gene expression analysis showed increased expression of the IL1B, IL6 and TGFB2 in PBMC in NLNP compared with 1st trimester of pregnancy and LNP cows, while other genes analyzed showed no significant difference. Experiment III fragments of endometrium were collected from cows at the early (33 to 35 days of pregnancy), mid (143 to 182 days of pregnancy) and late pregnancy (228 to 247 days of pregnancy). Endometrial immune cells were quantified (CD3+, CD4+, CD8+, CD14+, CD18+, CD25+, CD62L+, and WC1+) by single-color immunofluorescence. There was an increase CD25+ and CD62L+ cells in the endometrium in early pregnancy. In the mid of pregnancy, there was an increase of WC1+ and CD14+ cells. At the end of pregnancy, there was an increase of CD14+, CD25+, CD18+ and CD62L+. In conclusion, our data suggest that the maternal immune system is modulated according to the stage of pregnancy in the cow. In early pregnancy, there is an increased number of endometrial CD25+ cells that may reflect the activation of local immune response and recruitment of putative T-reg cells to the endometrium for an active establishment of maternal tolerance to fetal antigens. While, in mid pregnancy there is a massive recruitment of &#947;&#948T-cells and CD14+ to the pregnant endometrium perhaps to maintain an tolerogenic microenvironment and to promote tissue remodeling for proper fetal development and growth. Finally, in late pregnancy, there is a recruitment of effector immune cells such as CD62L+, CD18 and CD14+ cells associated with an increased expression of proinflammatory cytokines (i.e. IFNG, IL-6) to play a role on induction of parturition and uterine involution in the cow