CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O metapneumovÃrus humano (MPVh) à um vÃrus que tem se destacado como um dos agentes mais freqÃentes de infecÃÃes respiratÃrias agudas (IRA) virais na infÃncia. Este estudo teve como objetivos: observar a freqÃÃncia das infecÃÃes causadas pelo MPVh em crianÃas atendidas por IRA no Hospital Infantil Albert Sabin, hospital pediÃtrico de referÃncia do estado do CearÃ, no perÃodo de janeiro de 2006 a dezembro de 2007; descrever aspectos de sazonalidade dessas infecÃÃes relacionando-as com a ocorrÃncia de chuvas e a circulaÃÃo de outros vÃrus respiratÃrios; descrever as caracterÃsticas clÃnico-epidemiolÃgicas dos pacientes infectados pelo MPVh, comparando com os pacientes negativos e com os positivos para outros vÃrus e avaliar a tÃcnica de IFI como mÃtodo de diagnÃstico para a detecÃÃo do MPVh. Amostras de secreÃÃo de nasofaringe foram coletadas de crianÃas com sintomas de IRA e submetidas à tÃcnica de imunofluorescÃncia indireta para detecÃÃo dos seguintes vÃrus respiratÃrios: MPVh, vÃrus sincicial respiratÃrio (VSR), influenza A e B, adenovÃrus e parainfluenza 1, 2 e 3. Durante os 24 meses de estudo, foram colhidas amostras de 1276 crianÃas sendo detectado algum vÃrus respiratÃrio em 380 (29,78%) amostras. O MPVh foi o segundo vÃrus respiratÃrio mais encontrado representando um total de 8,69% de todas as amostras e de 29% dentre as amostras positivas para os vÃrus pesquisados. NÃo foi observado para o MPVh um padrÃo de sazonalidade nem correlaÃÃo com perÃodo chuvoso. A maioria dos pacientes positivos para MPVh foram atendidos na emergÃncia (89,2%). A mÃdia de idade dos pacientes positivos para o MPVh foi de 27 meses sendo significativamente superior que a das crianÃas infectadas pelo VSR (15 meses), adenovÃrus (14 meses) e vÃrus parainfluenza 3 (18 meses). Dentre os pacientes infectados pelo MPVh, 53,2% tiveram o diagnÃstico de infecÃÃes das vias aÃreas superiores e 46,7% tiveram o diagnÃstico de infecÃÃes das vias aÃreas inferiores. As infecÃÃes por MPVh apresentaram o mesmo espectro de infecÃÃes causadas pelos demais vÃrus pesquisados. O MPVh associou-se mais a casos de pneumonia que levaram à hospitalizaÃÃo das crianÃas infectadas do que outros vÃrus analisados. Mais da metade dos pacientes infectados pelo MPVh utilizaram o aerossol / salbutamol no seu tratamento (68,5%). A tÃcnica de IFI mostrou-se bastante eficaz como mÃtodo de diagnÃstico para a detecÃÃo do MPVh nesse estudo / The human metapneumovÃrus (hMPV) is a newly discovered virus that has been considered as one of the most common agents of acute respiratory infections (ARI) virus in childhood. The objectives of this study were: 1) to observe the frequency of infections caused by hMPV among children attending Hospital Infantil Albert Sabin, a major pediatric hospital in CearÃ, from January 2006 to December 2007; 2) to describe aspects of seasonality of these infections relating them to the occurrence of rain and the circulation of other respiratory viruses, 3) to describe the clinical and epidemiological characteristics of patients infected by hMPV, compared with positive and negative patients for other viruses; 4) to evaluate the IFI assay as a method of diagnosis for the detection of hMPV. Nasopharyngeal aspirates were collected from children with symptoms of ARI and submitted to indirect immunofluorescence assays for the detection of the following respiratory viruses: hMPV, respiratory syncytial virus (RSV), influenza A and B, adenovirus and parainfluenza 1, 2 and 3. During the 24 months of study, samples were collected from 1276 and respiratory viruses were demonstrated in 380 (29.78%) samples. The hMPV was the second most frequently detected respiratory viruses representing a total of 8.69% of all samples and 29% among the samples positive for the virus analyzed. It was not observed for hMPV a pattern of seasonality or correlation with the rainy season. Most patients positive for hMPV were attended in the emergence (89.2%). The mean age of patients infected by hMPV was 27 months, wich is significantly older than that for VSR (15 months), adenovirus (14 months) and parainfluenza virus 3 (18 months). Among patients infected by hMPV, 53.2% had a diagnosis of infections of the upper airways and 46.7% had a diagnosis of infections of the lower airways. The hMPV infections showed the same spectrum of infections caused by other viruses analyzed. The hMPV associated to more cases of pneumonia that led to the hospitalization of children infected than other viruses analyzed. More than half of these patients used the aerosol / salbutamol as conduct therapy (68.5%). The IFI assay proved to be quite effective as a method of diagnosis for the detection of hMPV in this study

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O monitoramento da sensibilidade antifÃngica em espÃcies de Candida de origem veterinÃria à uma prÃtica recente e os mecanismos envolvidos ainda nÃo foram completamente elucidados. Considerando que o arsenal de drogas antifÃngicas à limitado e que o fenÃmeno de resistÃncia tem se tornado mais freqÃente, a compreensÃo deste fenÃmeno e a busca por alternativas terapÃuticas se fazem necessÃrias. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo monitorar a sensibilidade in vitro de Candida spp. oriundas de animais, com Ãnfase na resistÃncia aos azÃlicos mediada por bombas de efluxo e na avaliaÃÃo da atividade do imidazÃlico levamisol sobre o crescimento destas leveduras. Para tanto, em um primeiro momento, foram avaliados 126 isolados de Candida, sendo 19 C. albicans, 17 C. famata, 5 C. guilliermondii, 8 C. krusei, 29 C. parapsilosis, 48 C. tropicalis, dos quais 22 foram isolados de rapinantes, 32 de periquitos do sertÃo, 56 de papagaios, 7 de araras canindà e 3 de um ouriÃo-cacheiro. Todas as cepas foram submetidas ao teste de microdiluiÃÃo em caldo, ante a anfotericina B, itraconazol, fluconazol, segundo metodologia padronizada pelo Clinical Laboratory Standards Institute (documento M27-A3). As concentraÃÃes inibitÃrias mÃnimas (CIMs) variaram de 0,03125 a 2 Âg/mL, 0,125 a 250 Âg/mL e de 0,03125 a 125 Âg/mL para anfotericina B, fluconazol e itraconazol, respectivamente. Dos 126 isolados avaliados por microdiluiÃÃo, 33 (26,2%) foram resistentes aos azÃlicos, sendo 7 (5,6%) resistentes somente a fluconazol, 1 (0.8%) resistente somente ao itraconazol e 24 (19%) resistentes a ambas as drogas. Em um segundo momento, todas estas cepas resistentes aos derivados azÃlicos, mais 20 C. albicans e 3 C. tropicalis resgatadas da nossa coleÃÃo de leveduras resistentes de origem veterinÃria, foram submetidas ao teste de inibiÃÃo de bomba de efluxo com prometazina, perfazendo um total de 56 cepas resistentes a azÃlicos. Dessa forma, as CIMs de fluconazol e itraconazol sofreram reduÃÃes significativas de 2 a 250 e de 16 a 4000 vezes, respectivamente. Investigou-se, ainda, a atividade antifÃngica do levamisol contra 12 C. albicans, 12 C. krusei, 12 C. parapsilosis e 12 C. tropicalis, sendo obtidas CIMs e concentraÃÃes fungicidas mÃnimas que variaram de 0,58 a 2,34 mg/mL e de 2,34 a 9,37 mg/mL, respectivamente. Paralelamente, foi demonstrado que o levamisol inibe a formaÃÃo do biofilme de C. albicans e C. tropicalis, bem como interfere na manutenÃÃo do biofilme maduro. Os dados apontam que a resistÃncia aos derivados azÃlicos Ã, pelo menos em parte, mediada por bombas de efluxo, bem como demonstram o potencial antifÃngico do imidazÃlico levamisol e sua capacidade de inibir o biofilme de cepas de Candida spp. oriundas de animais. / Monitoring of the antifungal susceptibility of Candida species from veterinary sources is a recent practice and the mechanisms involved in antifungal resistance have not been completely elucidated. Considering that the antifungal arsenal is limited and that antifungal resistance has become more frequent, the comprehension of this phenomenon and the pursuit for therapeutic alternatives are necessary. Thus, the present work aimed at monitoring the in vitro susceptibility of Candida spp. isolated from animals, with emphasis on efflux pump-mediated azole resistance and on the evaluation of the effect of the imidazole levamisole on the growth of these yeasts. For such, in a first approach, 126 Candida isolates (19 C. albicans, 17 C. famata, 5 C. guilliermondii, 8 C. krusei, 29 C. parapsilosis, 48 C. tropicalis), out of which 22 were recovered from raptors, 32 from cactus parakeets, 56 from Amazon parrots, 7 from blue-and-gold macaws and 3 from a Brazilian porcupine. All isolates were submitted to broth microdilution test against amphotericin B, itraconazole and fluconazole, according to the methodology recommended by the Clinical Laboratory Standards Institute (document M27-A3). The MICs ranged from 0.03125 to 2 Âg/mL, 0.125 to 250 Âg/mL and 0.03125 to 125 Âg/mL for amphotericin B, fluconazole and itraconazole, respectively. Out of 126 evaluated isolates, 33 (26.2%) were resistant to azoles, with 7 (5.6%) isolates resistant to fluconazole, 1 (0.8%) isolate resistant to itraconazole and 24 (19%) resistant to both drugs. In a second approach, all these azole resistant isolates, plus 20 C. albicans and 3 C. tropicalis that were recovered from our collection of resistant yeasts from veterinary sources, were submitted to the efflux pump inhibition assay with promethazine, with a total of 56 azole resistant isolates. Thus, MICs for fluconazole and itraconazole significantly reduced from 2 to 250 times for fluconazole and from 16 to 4000 times for itraconazole. The antifungal activity of levamisole against 12 C. albicans, 12 C. krusei, 12 C. parapsilosis and 12 C. tropicalis, was also evaluated, and MICs and minimum fungicidal concentrations varying from 0.58 to 2.34 mg/mL and from 2.34 to 9.37 mg/mL were obtained, respectively. Parallelly, it was demonstrated that levamisole significantly inhibits biofilm formation and interferes with the maintenance of mature biofilms. These data show that azole resistance is partially mediated by efflux-pumps and demonstrate the antifungal potential of the imidazole levamisole and its capacity of inhibiting the biofilm of strains of Candida spp. from animals.

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Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Corynebacterium diphtheriae é um importante patógeno humano e agente causal da difteria. Embora seja observada uma redução mundial no número de casos da doença, a difteria permanece endêmica em muitos países e surtos são esporadicamente notificados. No Brasil, o último surto ocorreu no estado no Maranhão e revelou mudanças em aspectos clínico-epidemiológicos da doença. Diferentemente da maioria das cepas de difteria brasileiras, que pertencem ao biovar mitis, nesse surto dois diferentes pulsotipos de C. diphtheriae biovar intermedius foram isolados. Além disso, sinais patognomônicos da doença não foram relatados em parte dos casos. C. diphtheriae também vem sendo relacionado com quadros de infecções invasivas, apesar de ser reconhecido como patógeno tipicamente extracelular. Em conjunto, estas mudanças no perfil das infecções por C. diphtheriae sugerem a existência de outros fatores de virulência além da produção da toxina diftérica. Neste sentindo, foram realizadas análises de tipagem molecular e de genômica comparativa para avaliar a diversidade genética e o potencial de virulência de cepas de C. diphtheriae isoladas de difteria clássica e infecções invasivas. Os resultados obtidos demonstram a circulação de diferentes clones invasores no Brasil. Além disso, revelaram diferenças marcantes na presença e na composição de ilhas de patogenicidade entre as amostras, bem como nos genes sob regulação do DtxR e nas sequências dos corinefagos integradas ao cromossomo bacteriano. Uma vez que o potencial invasor bacteriano e a persistência no ambiente podem estar relacionados à tolerância ao estresse oxidativo, foram procurados nos genomas sequenciados, genes possivelmente envolvidos neste processo. Dentre estes, os genes DIP0906, predito como gene de resistência ao oxidante telurito (TeO32-), e DIP1421, codificador do regulador transcricional OxyR, foram caracterizados funcionalmente e tiveram seus papéis na patogenicidade investigados. Ensaios in vivo utilizando o nematódeo Caenorhabditis elegans demonstraram que ambos são importantes para a virulência de C. diphtheriae. Além da resistência ao TeO32, DIP0906 parece contribuir para a resistência ao peróxido de hidrogênio (H2O2) e para a viabilidade no interior de células respiratórias humanas. Já OxyR, além de controlar negativamente a resposta ao H2O2, parece estar envolvido com a ligação de C. diphtheriae a proteínas plasmáticas e de matriz extracelular. Adicionalmente, foi investigada resistência e a capacidade de adaptação de C. diphtheriae frente a agentes oxidantes, através da indução de resposta adaptativa e/ou resistência cruzada e da formação de biofilme. As cepas de C. diphtheriae apresentaram diferentes níveis de resistência e um comportamento heterogêneo na presença dos agentes oxidantes, o que sugere a existência de diferentes estratégias de sobrevivência e adaptação de C. diphtheriae nas condições de estresse oxidativo. / Corynebacterium diphtheriae is an important human pathogen and the main causal agent of diphtheria. Although a reduction in the number of diphtheria cases is observed worldwide, diphtheria remains endemic in many countries and outbreaks are still reported sporadically. In Brazil, the last outbreak occurred in Maranhão and revealed changes in clinical and epidemiological diphtheria aspects. Despite most Brazilian C. diphtheriae belong to mitis biovar, in this outbreak were isolated two different pulsotypes of C. diphtheriae biovar intermedius. Furthermore, diphtheria pathognomonic features were absent in some cases. C. diphtheriae has also been associated with invasive infections, although typically recognized as extracellular pathogen. Together, these changes in profile of C. diphtheriae infections suggest the existence of other virulence factors besides the diphtheria toxin. In order to access the genetic diversity and the potential virulence of C. diphtheriae strains isolated from classical diphtheria and invasive infections, molecular typing and comparative genomics analyzes were conducted. The results demonstrated the circulation of different invasive clones in Brazil. Furthermore, they revealed differences in the presence and in the gene content of pathogenicity islands among C. diphtheriae strains. Differences were also found in DtxR regulon and in corynephages sequences. Once the bacterial invasiveness and persistence in the environment may be related to the tolerance to oxidative stress, determinants involved in this process were searched in C. diphtheriae genomes. Among these, the genes DIP0906, predicted as tellurite (TeO32-) resistance gene and DIP1421, an oxyR homolog, were characterized. Moreover, their roles in diphtheria bacilli pathogenesis were investigated. In vivo assays, using the nematode Caenorhabditis elegans, showed that both genes are important for C. diphtheriae virulence. DIP0906 seems to contribute to the resistance to hydrogen peroxide (H2O2) and to intracellular survival in human respiratory cells, besides involved in resistance to TeO32-. OxyR negatively controls the H2O2 response and appears to be involved with C. diphtheriae binding to plasma and extracellular matrix proteins. Additionally, bacterial resistance and adaptation, through the induction of adaptive response and / or cross-resistance and biofilm formation, of C. diphtheriae strains against oxidative agents were investigated. C. diphtheriae strains showed different oxidative resistance levels and a heterogeneous behavior in the presence of the agents, which suggest the existence of different strategies for adaptation of diphtheria bacilli under oxidative stress conditions.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A coccidioidomicose e a histoplasmose sÃo micoses sistÃmicas que acometem o homem e animais, causadas por espÃcies de fungos dimÃrficos, com Ãnfase para Coccidioides posadasii e Histoplasma capsulatum var. capsulatum, respectivamente. SÃo consideradas doenÃas profundas importantes, podendo culminar em diversas complicaÃÃes secundÃrias. Nos Ãltimos anos, a melhoria dos mÃtodos de diagnÃstico micolÃgico e o aumento da ocorrÃncia de doenÃas imunossupressoras causaram grande impacto na incidÃncia das micoses profundas e oportunistas no mundo. Apesar da existÃncia de terapias eficazes com antifÃngicos contra a coccidioidomicose e a histoplasmose, a busca por novas drogas para o tratamento destas doenÃas se faz necessÃria. Ciprofloxacina à uma droga antibacteriana clÃssica do grupo das fluoroquinolonas, que inibe a atividade catalÃtica da DNA girase e topoisomerase IV, essenciais na replicaÃÃo e transcriÃÃo do DNA bacteriano. Estudos verificaram que ciprofloxacina pode atuar na DNA girase dos fungos. Assim, o presente estudo visou avaliar o efeito inibitÃrio in vitro de ciprofloxacina (CIP) isolada e em combinaÃÃo com os antifÃngicos anfotericina B (AMB), itraconazol (ITC), voriconazol (VRC) e caspofungina (CAS) frente à C. posadasii e Histoplasma capsulatum var. capsulatum. Foram utilizados 16 cepas de C. posadasii na fase filamentosa, 16 cepas de H. capsulatum var. capsulatum na fase filamentosa e 9 cepas de H. capsulatum var. capsulatum na fase leveduriforme. O estudo foi conduzido em ensaio de macrodiluiÃÃo e microdiluiÃÃo em caldo, descritos nos documentos M-38A e M-27A2, padronizados pelo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI), sendo utilizados para C. posadasii e Histoplasma capsulatum var. capsulatum, respectivamente. A interaÃÃo das drogas foi analisada atravÃs do cÃlculo do Ãndice da ConcentraÃÃo InibitÃria FracionÃria (FICI), definido como a soma das relaÃÃes entre a concentraÃÃo inibitÃria mÃnima (CIM) de cada droga em combinaÃÃo e a CIM da mesma droga isolada, considerando os valores menores ou iguais a 0,5 indicativos de sinergismo. Com relaÃÃo Ãs cepas de C. posadasii, foram observadas interaÃÃes sinÃrgicas em todas as combinaÃÃes, com destaque para as associaÃÃes de CIP (3,125≤CIM≤12,5 ug mL-1) com ITC (0,0078≤CIM≤0,125 ug mL-1) (n=13/16), CIP (3,125≤CIM≤12,5 ug mL-1) com VRC (0,0078≤CIM≤0,0312 ug mL-1) (n=13/16) e CIP (3,125≤CIM≤12,5 ug mL-1) com CAS (2≤CIM≤8 ug mL-1) (n=14/16). Para as cepas de H. capsulatum na fase filamentosa, tambÃm foram observadas interaÃÃes sinÃrgicas em todas as combinaÃÃes, com destaque para as associaÃÃes de CIP (3,906≤CIM≤62,5 ug mL-1) com ITC (0,00006≤CIM≤0,0078 ug mL-1) (n=14/16) e CIP (31,25≤CIM≤125 ug mL-1) com VRC (0,0156≤CIM≤0,125 ug mL-1) (n=16/16). No tocante Ãs cepas de H. capsulatum na fase leveduriforme, foram observadas poucas interaÃÃes sinÃrgicas nas combinaÃÃes de drogas testadas. Nenhuma das associaÃÃes de drogas testadas apresentou antagonismo. Os dados obtidos apontam uma nova alternativa para o tratamento da coccidioidomicose e da histoplasmose, sendo necessÃrios novos estudos que visem investigar os mecanismos de aÃÃo dessas combinaÃÃes de drogas no metabolismo celular fÃngico, bem como o delineamento de experimentos in vivo para confirmar a significÃncia desses achados. / Coccidioidomycosis and histoplasmosis are systemic mycoses that occur in humans and other animals and are caused by the dimorphic fungi Coccidioides posadasii and Histoplasma capsulatum var. capsulatum, respectively. They are considered important deep mycoses that can lead to several secondary complications. In the past years, the improvement of the techniques applied in mycological diagnosis and the increase in the occurrence of immunocompromising diseases have caused a great impact in the incidence of deep and opportunistic mycoses in the world. In spite of the existence of effective antifungal therapy against coccidioidomycosis and histoplasmosis, the pursue of new drugs to treat theses diseases is necessary. Ciprofloxacin is a classic antibacterial drug that belongs to the group of fluoroquinolones, which inhibit the catalytic activity of DNA gyrase and topoisomerase IV, which are essential in bacterial DNA replication and transcription. Some studies have shown that ciprofloxacin can act on fungal DNA gyrase. Thus, the present study aimed at evaluating the in vitro inhibitory effect of ciprofloxacin (CIP), when associated with amphotericin B (AMB), itraconazole (ITC), voriconazole (VRC) or caspofungina (CAS), on C. posadasii and H. capsulatum var. capsulatum. Sixteen strains of C. posadasii in the filamentous phase and 16 and 9 strains of H. capsulatum in the filamentous and yeast-like phase, respectively, were used. Broth macrodilution and microdilution assays were performed, as described in the documents M38-A and M27-A2, respectively, of the Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). Drug interaction was analyzed by calculating the fractional inhibitory concentration index (FICI), which is defined as the sum of the ratios between the minimal inhibitory concentration (MIC) of each combined drug and the MIC of the same drug isolatedly. Values of FICI smaller or equal to 0.5 indicate the occurrence of synergy. Concerning the isolates of C. posadasii, synergistic interactions were observed for all combinations, especially for the associations of CIP (3.125≤CIM≤12.5 ug mL-1) with ITC (0.0078≤CIM≤0.125 ug mL-1) (n=13/16), CIP (3.125≤CIM≤12.5 ug mL-1) with VRC (0.0078≤CIM≤0.0312 ug mL-1) (n=13/16) and CIP (3.125≤CIM≤12.5 ug mL-1) with CAS (2≤CIM≤8 ug mL-1) (n=14/16). For the isolates of H. capsulatum in the filamentous phase synergistic interactions were also observed for all combinations, with emphasis to the associations of CIP (3.906≤CIM≤62.5 ug mL-1) with ITC (0.00006≤CIM≤0.0078 ug mL-1) (n=14/16) and CIP (31.25≤CIM≤125 ug mL-1) with VRC (0.0156≤CIM≤0.125 ug mL-1) (n=16/16). For H. capsulatum in yeast-like phase, few synergistic interactions were observed for the tested drug combinations. None of the tested combinations presented antagonism. The obtained data may point at a new alternative for the treatment of coccidioidomycosis and histoplasmosis. Thus, it is necessary to investigate the mechanisms of action of these drug combinations on the fungal cellular metabolism and to perform in vivo experiments to confirm the relevance of these findings.

A criopreservaÃÃo à a metodologia de escolha em muitos bancos de microrganismos pois conduz a uma situaÃÃo de dormÃncia metabÃlica e em conseqÃÃncia as culturas mantÃm-se estÃveis por longos perÃodos. Ao reduzir a temperatura pode todavia ocorrer a formaÃÃo de cristais de gelo que tendem a promover lesÃo celular A lesÃo celular por sua vez pode ser evitada pelo processo de vitrificaÃÃo que ocorre, combinando uma soluÃÃo concentrada com o congelamento rÃpido A literatura relata o uso de carboidratos como agentes vitrificadores e crioprotetores TambÃm informa que a tÃcnica de imobilizaÃÃo de cÃlulas em alginato de sÃdio permite o fracionamento da cultura e favorece a preservaÃÃo de microrganismos O objetivo deste trabalho consiste em avaliar a viabilidade dos fungos dos gÃneros Malassezia spp e do grupo dos Zigomicetos imobilizados em alginato de sÃdio utilizando glicose e lactose como crioprotetores Doze cepas de espÃcies de Malassezia spp (9 M furfur 2 M globosa 1 M simpodialis) e doze cepas de Zigomicetos (7 Mucor s e 5 Rhizopus sp) pertencentes à micoteca do Centro Especializado em Micologia MÃdica da Universidade Federal do Cearà O gÃnero Malassezia abrange leveduras lipodependentes associadas a vÃrias enfermidades dermatolÃgicas compreendem na atualidade 13 espÃcies Zigomicetos, por sua vez sÃo fungos saprÃfitas e ubÃquos cujas hifas por apresentarem elevado tamanho e reduzido conteÃdo protÃico estÃo mais vulnerÃveis a danos mecÃnicos Dessa forma constituem grupos fÃngicos de preservaÃÃo difÃcil em estoque portanto uma metodologia que mantenham a viabilidade de Malassezia spp e Zigomicetos tambÃm poderia ser empregada com eficiÃncia para a estocagem de outros fungos As estruturas fÃngicas foram removidas e transferidas para duas soluÃÃes de estoque, formadas por 3% de caldo Sabouraud 15% de alginato de sÃdio e diferenciadas nas concentraÃÃes de glicose e lactose de 9% ou 23% Em seguida, foram adicionadas esferas plÃsticas, medindo 07cm de diÃmetro com orifÃcio central e 0,5cm de comprimento ApÃs a gelificaÃÃo iÃnica com cloreto de cÃlcio, cada cepa foi estocada à temperatura de -20 ÂC e -80 ÂC distribuÃdas em cinco tubos criogÃnicos de 15mL contendo cinco esferas cada uma sendo avaliados em cinco perÃodos ApÃs nove meses foi verificado que nÃo houve recuperaÃÃo de nenhuma cepa de Malassezia spp Com relaÃÃo Ãs espÃcies de Zigomicetos observou-se que apÃs nove meses de estoque quatro cepas mostraram viÃveis a -80 ÂC empregando glicose a 9%, seis cepas foram preservadas a -80 ÂC, utilizando glicose a 23% finalmente seis e sete exemplares foram recuperados a -80 ÂC utilizando lactose a 9% e 23% respectivamente. Dessa forma, o uso de carboidratos como crioprotetores em conjunto com a tÃcnica de imobilizaÃÃo de cÃlulas em alginato de sÃdio constitui alternativa à manutenÃÃo de algumas espÃcies fÃngicas / Cryopreservation is the method of choice in many banks of microorganisms because it leads to a situation of metabolic dormancy and consequently cultures are stable for long periods. By reducing the temperature may however be formed of ice crystals which tend to cause cell damage to cell damage in turn can be avoided by vitrification process which takes place by combining a solution with the quick freezing the literature reports the use of carbohydrates vitrificadores cryoprotectants agents and also advises that the technique of immobilization of cells in sodium alginate allows the fractionation of culture and promotes the preservation of microorganisms The objective of this study is to assess the viability of the fungi of the genus Malassezia spp and the Zygomycetes group of assets in sodium alginate and lactose using glucose as cryoprotectants Twelve strains of species of Malassezia spp (9 M furfur 1 M 2 M globosa simpodialis) and twelve strains of zygomycetes (seven Mucor Rhizopus sp is 5) belonging to the mycology collection of the Specialized Center for Medical Mycology Federal University of Cearà The genus Malassezia comprises yeasts lipodependent associated with various dermatologic diseases currently comprise 13 Zygomycetes species, in turn, are ubiquitous and saprophytic fungi whose hyphae because they have high protein content and reduced size are more vulnerable to mechanical damage this way are groups of fungi in stock so hard to preserve a methodology to maintain the viability of Malassezia spp and Zygomycetes could also be used effectively for the storage of other fungi fungal structures were removed and transferred to two stock solutions, formed by 3% broth Sabouraud 15% sodium alginate and different concentrations of glucose and 9% lactose and 23% were then added plastic spheres, measuring 07cm in diameter and 0.5 cm center hole length After ionic gelation with calcium chloride Each strain was stored at -20  C and -80  C cryogenic distributed in five tubes containing 15 mL each of five levels being evaluated in five periods after nine months it was found that there was no recovery of any strain of Malassezia spp Regarding Zygomycetes species showed that after nine months of inventory four strains were viable at -80  C using glucose 9%, six strains were preserved at -80  C, using 23% glucose last six seven specimens were recovered at -80  C using a 9% lactose and 23% respectively. Thus, the use of cryoprotectants such as carbohydrates in conjunction with the technique of immobilization of cells in sodium alginate is an alternative to maintaining some fungal species

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This study aimed to assess the prevalence of HTLV-1 and 2 in three selected groups: patients with tuberculosis, HIV seropositive treatment-naive individuals and patients with oncohematological diseases in Central Brazil, and also to carry out genetic characterization of respective isolates. A total of 1,252 individuals in Goiânia-GO were studied, included 402 patients with tuberculosis (group I), 505 HIV seropositive treatment-naive individuals (group II) and 345 patients with oncohematological diseases (group III). All subjects were interviewed and blood samples were tested by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the presence of HTLV antibodies. Positive samples were tested for confirmation by polymerase chain reaction (PCR) and nucleotide sequencing. Sixteen samples were positive by ELISA, including six from the group I, four from the group II and six from the group III; of these, 12 were confirmed as positive by PCR, resulting in an HTLV-1/2 prevalence of 1.24% (CI 95%: 0.46-2.01), 0.79% (CI 95%: 0.25-2.16) and 0.87% (95% CI: 0.22-2.73), respectively. Sequencing analysis demonstrated that all HTLV-1 isolates (four in the group I, four in the group II and three in the group III) belonged to the Cosmopolitan subtype HTLV-1a Transcontinental subgroup A. The single HTLV-2 isolate was from a patient with tuberculosis, and it was classified as subtype a (HTLV-2 a/c). Most HTLV-1 infected patients reported sexual risk behaviors, and the HTLV-2 positive individual reported in addition to sexual risk behaviors, injection drug use. The prevalence rates found in this study are higher than that found in blood donors (0.13%; CI 95%: 0.11-0.17) in Goiânia, and HTLV-1 and 2 subtypes identified in this study were consistent with those circulating in Brazil. / O vírus linfotrópico de células T humanas tipo 1 (HTLV-1) é o agente etiológico da leucemia de células T do adulto (ATL) e paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1 (HAM/TSP), além de outras doenças inflamatórias. O HTLV-2 tem sido associado com síndrome similar a HAM/TSP e aumento da incidência de infecções do trato respiratório e urinário, mas essas associações ainda são questionadas. O presente estudo tem como objetivo estimar a prevalência da infecção pelo HTLV-1 e 2 em três grupos: pacientes com tuberculose, indivíduos HIV soropositivos, virgens de tratamento e pacientes com doenças onco-hematológicas no Brasil Central, assim como caracterizar os respectivos isolados virais. Um total de 1.252 indivíduos foi estudado em Goiânia-GO, sendo 402 pacientes com tuberculose (grupo I), 505 indivíduos HIV soropositivos, virgens de tratamento (grupo II) e 345 pacientes com doenças onco-hematológicas (grupo III) em Goiânia-GO. Todos os indivíduos foram entrevistados e amostras sanguíneas testadas para detecção de anticorpos anti-HTLV-1/2 por ensaio imunoenzimático (ELISA). As amostras positivas foram confirmadas por reação em cadeia da polimerase (PCR) e sequenciamento de nucleotídeos. Dezesseis amostras foram positivas por ELISA, incluindo seis indivíduos do grupo I, quatro do grupo II e seis do grupo III; destas, 12 foram confirmadas por PCR, resultando em taxas de prevalência para o HTLV-1/2 de 1,24% (IC 95%: 0,46-2,01), 0,79% (IC 95%: 0,25-2,16) e 0,87% (IC 95%: 0,22-2,73), respectivamente. O sequenciamento demonstrou que todos os isolados do HTLV-1 (quatro do grupo I, quatro do grupo II e três do grupo III) pertenciam ao subtipo Cosmopolita HTLV-1a, subgrupo Transcontinental A. O único isolado HTLV-2 positivo, proveniente de paciente com tuberculose, foi classificado como do subtipo a (HTLV-2a/c). A maioria dos pacientes infectados pelo HTLV-1 relatou comportamentos de risco relacionados à transmissão sexual, e o indivíduo HTLV-2 positivo referiu, além desses comportamentos, uso de droga injetável. As taxas de prevalência encontradas no presente estudo são elevadas quando comparadas à observada em doadores de sangue (0,13%; IC 95%: 0,11-0,17) em Goiânia, e os subtipos do HTLV-1 e 2 identificados neste estudo corroboram a predominância desses no Brasil.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) é um patógeno relacionado ao desenvolvimento de quadros de diarréia aguda ou persistente. A resposta inflamatória induzida por EAEC está relacionada à liberação de interleucina 8, que atua estimulando a transmigração de neutrófilos através do epitélio. Os macrófagos, de forma similar aos neutrófilos, são células fagocíticas que produzem espécies reativas de oxigênio (ERO), como o peróxido de hidrogênio (H2O2). Neste trabalho, avaliamos as consequências da interação de diferentes cepas clínicas com macrófagos humanos ativados da linhagem U-937. Todas as cepas testadas apresentaram filamentos nos testes de aderência aos macrófagos, diferentemente do que ocorre na interação com outras linhagens celulares como HEp-2, T84 e Caco-2. O ferro é um microelemento essencial para bactérias, sendo utilizado como cofator de enzimas e que também pode participar da geração de ERO através da reação de Fenton. Considerando-se a possibilidade de que o H2O2 produzido pelos macrófagos possa gerar radical hidroxil através da reação de Fenton, testes de aderência foram realizados com as amostras cultivadas na presença do captador de ferro 2,2-dipiridil. Tal fato não suprimiu a formação de filamentos, entretanto diminuiu a aderência das cepas EAEC 042 e 17-2. Com o objetivo de produzir uma resposta adaptativa ao H2O2, as culturas bacterianas foram pré-tratadas com uma dose sub-letal de H2O2 por 60 minutos antes de aderirem aos macrófagos. Nossos resultados mostraram que o pré-tratamento também não inibiu o aparecimento de filamentos em relação às culturas não tratadas. Além disto, foi observado que o pré-tratamento com o H2O2 reduziu a aderência das amostras de EAEC ao tapete celular. A filamentação é uma das respostas SOS, induzida pela presença de danos e/ou bloqueio na síntese da molécula de DNA. Com o objetivo de verificar se o H2O2 produzido pelos macrófagos estaria causando danos induzindo o sistema SOS e a filamentação bacteriana, foram realizados testes de viabilidade com mutantes derivados de E. coli K12 deficientes em enzimas do reparo por excisão de bases (BW535) e na resposta SOS (DM49). Nossos resultados mostram que os mutantes apresentaram os níveis de sobrevivência semelhantes ao observado para cepa selvagem isogênica (AB1157). Todos estes resultados em conjunto indicam que o H2O2 não é o indutor da filamentação nos testes de aderência. Macrófagos ativados apresentam ação microbicida através da ação da enzima indolamina dioxigenase (IDO), associada à redução do aminoácido L-triptofano. Desta forma, realizamos testes qualitativos de aderência de EAEC aos macrófagos suplementando o meio de interação com este aminoácido. Nossos resultados mostram que a adição de triptofano ao meio de interação reduz o número de filamentos por campo. Desta forma, aventamos a hipótese de que a depleção do triptofano seja responsável pela indução de resposta SOS, tendo como conseqüência a filamentação das bactérias. / Enteroaggregative Escherichia coli is a pathogen related to cases development of acute or persistent diarrhea. The inflammatory response induced by EAEC is linked to induction of IL-8 release, which acts stimulating neutrophils diapedesis through the epithelium. Macrophages, similarly to neutrophils, are phagocytic cells that produce reactive oxygen species (ROS), such as H2O2. Iron is an essential microelement to bacteria, been used as cofactor of enzymes in fundamental cellular processes but it is involved in ROS generation through Fenton reaction. On this report we evaluated the consequences of different EAEC strains interaction with activated human macrophages (U937 lineage). All tested strains showed filaments on the adherence tests with macrophages, unlike to what occurs in the interaction with other cellular lineages as HEp-2, T84 e Caco-2. Considering the possibility of H2O2 macrophage produced generates hydroxyl radical through Fenton reaction, the strains were grown in medium containing iron chelator 2,2-dipiridil. Iron chelation did not suppress filamentation, however decreased the adherence of 042 e 17-2 strains. Strains pretreated with a H2O2 subletal dose (60 M) by 60 minutes, which resulted in a bacterial adaptative response, also did not decrease the filamentation associated to adherence beside H2O2 pretreatment decreased the adherence of EAEC strains tested. In order to verify if H2O2 induces filamentation through DNA lesions and SOS induction, we evaluated the survival of a triple mutant deficient in three enzymes involved in BER and a mutant deficient in SOS response induction, both E. coli K12 derived. Both mutants presented similar survival levels like wild strain. This result suggest that H2O2 is not involved in SOS induction and filamentation response. Activated macrophages show microbicidal action, which is related to enzymes such as IDO (indoleamine dioxygenase), associated to reduction of L-tryptophan available to microorganism. In this way, we performed adhrence macrophages assays supplementing the interaction medium with L-tryptophan. Our results showed that tryptophan addition reduced the filamentation of adhered EAEC strains. Thus, we suggested that L-tryptophan reduction could be responsible for SOS response induction and bacterial filamentation.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / Por serem organismos filtradores, os mexilhões devem ser extraídos para consumo somente de águas com padrões microbiológicos regulamentados pelo Conselho Nacional do Meio Ambiente, uma vez que intoxicações alimentares de origem bacteriana são as consequências mais comuns relacionadas ao consumo destes moluscos. Após a retirada dos costões, estes organismos passam por processos de fervura, lavagem, acondicionamento em sacos plásticos e transporte até a chegada ao mercado onde são comercializados; etapas estas, realizadas sem cuidados assépticos. Objetivando avaliar a qualidade microbiológica de mexilhões Perna perna coletados na praia de Itaipu, Niterói, RJ; após a sua fervura; e comercializados no Mercado São Pedro, foram realizadas contagens de coliformes totais e termotolerantes e pesquisa de Escherichia coli, Salmonella spp. e Vibrio spp. por metodologia convencional e molecular em amostras obtidas destes locais. Pelo teste de disco-difusão foi observado o perfil de resistência das cepas isoladas. Do total de amostras analisadas (27) apenas 3 dos mexilhões que sofreram processo de aferventação, 1 do comercializado e 3 do in natura, se encontravam dentro dos padrões aceitáveis pela legislação. Não houve diferença significativa entre as contagens de coliformes termotolerantes dos diferentes mexilhões analisados, mas sim entre os períodos seco e chuvoso. Somente uma das nove coletas de água mostrou-se própria para o cultivo de mexilhões (até 14 CF/mL). Foram isoladas e caracterizadas fisiológicamente, 77 estirpes da espécie E. coli, sendo confirmadas molecularmente por PCR os sorotipos EPEC, STEC e EAEC; 4 cepas Salmonella spp. sendo apenas uma confirmada por PCR; e das 57 cepas caracterizadas como Vibrio spp., 51 foram confirmadas por PCR, sendo 46 Vibrio spp., 2 V. cholerae, 1 V. vulnificus, 1 V. parahaemolyticus e 1 V. mimicus. Entre as estirpes de E. coli, 13% apresentaram multirresistência e 15,6% apresentaram resistência múltipla. A estirpe de Salmonella spp. se mostrou sensível a todos os antimicrobiados testados. Das estirpes de Vibrio spp. testadas, 68,6% apresentaram multirresistência e 72,5% apresentaram resistência múltipla. A partir da pesquisa de genes direto do caldo de enriquecimento foi possível detectar todos os genes pesquisados, com exceção para os sorotipos de Salmonella e V. cholerae. Baseado nos resultados do presente trabalho pode-se inferir que os mexilhões, amplamente comercializados no município de Itaipú, podem se constituir em risco para a saúde pública dos consumidores no Rio de Janeiro, necessitando dos órgãos competentes uma eficiente fiscalização nos pontos de venda e cultivo destes moluscos. / Mussels (Perna perna) feed by filtering large quantities of water, enabling the retention of environmental bacteria and virus in their bodies. For this reason bacterial foodborne intoxications associated with these bivalves are common therefore mussels used for human consumption have to come from coastal areas where the microbiological quality of the water complies with current legislation laid down by the Conselho Nacional do Meio Ambiente. Following harvest these mussels go through a process of washing, boiling, packing and then transported to the fish markets for retail. During these processes and techniques normally no food hygiene plan is followed which may enable microorganisms growth and cross-contamination. The aim of this study was to determine the microbiological quality of Perna perna growing in Itaipu beach, Niterói, RJ from direct harvest (boiled and raw) and retailed at the São Pedro fish market. By using the MPN test it was possible to determine the total and faecal coliforms and by conventional and molecular techniques it was detected and identified the Escherichia coli, Salmonella spp. and Vibrio spp. present in the samples. The antimicrobial susceptibility test was also performed to determine the antimicrobial resistance profile of the isolated strains. From all the samples studied (27) only 7 samples had results complying with the legislation, 3 which suffered boiling process in the laboratory, 3 raw samples and 1 samples from the fish market. There were no significant differences between samples regarding the faecal coliforms count, however there was significant differences between samples collected in different seasons (dry and rainy). From all the nine water samples collected only one demonstrated to be proper for the production and harvest of mussels (lower than 14 CF/mL). There were 77 E. coli strains who were isolated and physiologically characterized and those results confirmed by PCR the sorotypo EPEC, STEC and EAEC; 4 strains of Salmonella spp. only one confirmed by PCR; and from the 57 strains identified as Vibrio spp., 51 were confirmed by PCR, where 46 were Vibrio spp., 2 V. cholerae, 1 V. vulnificus, 1 V. parahaemolyticus and 1 V. mimicus. From all the E. coli strains 13% were multi-resistant and 15.6% showed multiple resistance. All the Salmonella spp. strains demonstrated sensitivity to all tested antimicrobials. In the Vibrio spp. strains 68.6% were multi-resistant and 72.5% had multiple resistance Targeted genes were all possible to detect directly from the analysis of the enrichment broth with the exception for Salmonella and V. cholera genes. The present study provided results that demonstrate the poor microbiological quality of the mussels retailed in Itaipú borough which can represent a public health risk for all local and tourist population. These outcome brings to light how inspections in all food chain of the product are paramount for public health.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro / A difteria é uma síndrome toxêmica causada pelo Corynebacterium diphtheriae. Embora programas de imunização mantenham a doença sob controle em países desenvolvidos, a difteria ainda permanece endêmica em diversas partes do mundo, especialmente em indivíduos parcialmente imunizados para toxina diftérica. Junto a isso, nos últimos 20 anos, tem-se observado a ocorrência crescente de quadros de infecções sistêmicas causados por cepas atoxinogênicas. A penicilina e eritromicina são as principais drogas de escolha no tratamento destas infecções, entretanto, a escassez de trabalhos reavaliando a terapia de escolha e a influência dos antibióticos no processo de interação bacteriana com células epiteliais humanas são escassos, logo compreendem aspectos que justificam o presente estudo. O objetivo principal deste projeto consiste na análise da influência do pré-tratamento de células epiteliais Hep-2 com os antimicrobianos penicilina e eritromicina na colonização e viabilidade intracelular de amostras de C. diphtheriae. As monocamadas foram submetidas ao tratamento prévio com doses séricas terapêuticas de penicilina (5g mL1) e eritromicina (1,92 g mL1) por 24 horas e os antibióticos foram removidos por lavagens com PBS antes da interação com a suspensão bacteriana (MOI de 107). Três horas após a infecção, o padrão de aderência foi investigado como também, realizada a análise das bactérias viáveis associadas e internalizadas nas monocamadas. O pré-tratamento com penicilina induziu a formação de perfil de aderência difuso (AD) pelas amostras estudadas. Microorganismos que normalmente apresentam padrão de aderência localizado (AL) passaram a expressar perfil (AD) após pré-tratamento das camadas com ambos antimicrobianos. A expressão do tipo agregativo (AA) não foi influenciada pela presença de eritromicina. A penicilina e a eritromicina reduziram o número de bactérias viáveis associadas às células HEp-2 na maioria das oportunidades. Entretanto, a penicilina interferiu em maior magnitude nesse processo. As três amostras invasoras de C. diphtheriae (HC01, HC04 e BR5015), apresentaram maior capacidade de sobrevivência no compartimento intracelular, independente do pré-tratamento. A expressão dos perfis de aderência assim como a capacidade de sobrevivência no compartimento intracelular frente aos antimicrobianos testados mostraram-se independentes da produção de toxina e dos percentuais de associação com as células HEp-2. Foi observada uma maior eficiência da eritromicina na eliminação de bactérias viáveis internalizadas reforçando a utilização clínica da eritromicina tanto no tratamento de pacientes quanto na erradicação do estado de portador. Novos estudos serão desenvolvidos para investigar alterações na expressão de fatores de virulência por amostras de C. diphtheriae na interação com células HEp-2 pré-tratadas com antimicrobianos e a influência sobre a evolução clínica das infecções por corinebactérias / Diphtheria is a syndrome caused by Toxigenic Corynebacterium diphtheriae. Although immunization programs have kept diphtheria under control in the great majority of developed countries, the disease remains endemic in many parts of the world, especially in individuals partially immunized to diphtheria toxoid. Additionally, an increase in the number of cases of systemic infections caused by non-toxigenic strains has been observed along the last 20 years. Penicillin and erythromycin have long been the drugs of choice for the treatment of C. diphtheriae infections, though the studies reviewing the choice of treatment and the influence of antibiotics in the process of bacterial interaction with human epithelial cells are scarce, and comprise the aspects that justify the present investigation. The main objective was to analyze the influence of pre-treatment of HEp-2 epithelial cells with the penicillin and erythromycin in adherence and intracellular viability of C. diphtheriae strains. HEp-2 monolayers were pre-treated for 24 hours with the serum concentration doses of penicillin (5g mL-1) and erythromycin (1.92 mg mL-1), and antibiotics were removed by washing with PBS before infection with bacterial suspension (MOI of 107). Three hours post-infection, the adherence pattern was investigated, and both percentage of viable cell-associated bacteria and intracellular bacteria was determined. Penicillin treatment induced the bacterial strains to exhibit diffuse adherence patterns (DA). Microorganisms that usually express localized adherence patterns (LA) began to express DA pattern after pre-treatment of monolayers with both antibiotics. Erythromycin did not influence the aggregative adherence pattern (AA). Penicillin and erythromycin reduced the number of viable HEp-2 cell-associated bacteria for the most of the strains. However, penicillin interfered in this process in a greater magnitude. The C. diphtheriae invasive strains (HC01, HC04 and BR5015) showed higher ability to survive within the intracellular compartment, regardless of pre-treatment. The expression of adherence patterns as well as the ability to survive in the intracellular environment of pre-treated cells, proved to be independent of toxin production and the usual percentage of association with HEp-2 cells. A higher efficiency in the reduction of intracellular viability with the use of erythromycin was observed for the majority of strains, and reinforces the clinical use of erythromycin in the treatment of patients alongside the eradication of the carrier state. Further studies will be necessary to investigate the changes in the expression of virulence factors in C. diphtheriae during the interaction with HEp-2 cells pre-treated with antimicrobials and the influence on the clinical evolution of corynebacterial infections