The knowledge of the proteins that are present in the spermatozoa is an essential step towards the comprehension of their normal function and their potential alterations associated to infertility. Although many studies have been performed in human male infertility, many of the causes still remain unknown, partly due to the fact that the proteins and the mechanisms involved in spermiogenesis and in sperm function are not known in detail. Therefore, the proteomic study of the human spermatozoa through mass spectrometry is relevant both, towards improving our fundamental knowledge and the mechanisms involved in the normal sperm physiology, as well as towards a better understanding of the male infertility. This doctoral thesis has contributed to the identification of the human sperm proteome through two-dimensional gels and mass spectrometry. Moreover, it has identified new correlations between the abundance of certain proteins and the seminal parameters related to male infertility such as the protamine content, DNA damage and sperm motility giving rise to the identification of potential diagnostic markers. In addition, the potential correlations between the protamine content and the presence of the protamine 2 precursors in the sperm cell from patients and the assisted reproductive outcomes have also been studied. Another point studied in the present thesis has been the determination, through immunofluorescent techniques, of the presence of nucleosomes and other proteins with a potential epigenetic function present in spermatozoon fractions selected through density gradients. Moreover, a protocol for the isolation of human sperm nuclei has been implemented to further identify, through mass spectrometry, minor nuclear proteins that may be important for normal sperm functioning or the embryo development.KEYWORDS: Spermatozoon, Protamines, Proteome, Male infertility, Epigenetics / El coneixement de les proteïnes que formen part de l'espermatozoide és un aspecte clau per comprendre el seu funcionament normal i les seves possibles alteracions associades a la infertilitat. Tot i la gran quantitat d'estudis sobre la infertilitat humana masculina, moltes de les seves causes es troben encara desconegudes degut, en part, a que les proteïnes i els mecanismes implicats en l'espermatogènesi i la funció de la cèl·lula espermàtica no es coneixen en detall. Per tant, l'estudi proteòmic de l'espermatozoide humà a través de l'espectrometria de masses és rellevant tant pel coneixement d'aspectes fonamentals com pel millor enteniment de la infertilitat masculina. Aquesta tesi doctoral ha contribuït a la identificació del proteoma de l'espermatozoide humà a través de gels bidimensionals i espectrometria de masses. Addicionalment s'han identificat relacions entre la abundància de certes proteïnes i paràmetres seminals relacionats amb la infertilitat masculina tals com el contingut de protamines, el dany al DNA o la motilitat dels espermatozoides donant lloc a la identificació de potencials marcadors diagnòstics. A més, s'han buscat les possibles correlacions entre el contingut de protamines i la presència de precursor de protamina 2 als espermatozoides de pacients amb els resultats de reproducció assistida. Un altre aspecte tractat ha estat la determinació, mitjançant tècniques immunofluorescents, de la presència de nucleosomes i altres proteïnes presents a fraccions d'espermatozoides seleccionades a través de gradients de densitat amb una funció potencial epigenètica. A més, s'ha implementat un protocol per aïllar nuclis d'espermatozoides humans per tal de poder identificar a través d'espectrometria de masses proteïnes nuclears minoritàries possiblement importants pel desenvolupament embrionari i el funcionament de l'espermatozoide no patològic. / RESUMEN EN CASTELLANO:El conocimiento de las proteínas que forman parte del espermatozoide es un aspecto clave para la comprensión de su funcionamiento normal i de sus posibles alteraciones asociadas a la infertilidad. A pesar de la gran cantidad de estudios sobre la infertilidad humana masculina, muchas de sus causas se encuentran aún desconocidas. Esto es debido, en parte, a que las proteínas y los mecanismos implicados en la espermatogénesis i la función de la célula espermática no se conocen en detalle. Por lo tanto, el estudio proteómico del espermatozoide humano a través de la espectrometría de masas es relevante tanto para el conocimiento de aspectos fundamentales como para el mejor entendimiento de la infertilidad masculina. Esta tesis doctoral ha contribuido en la identificación del proteoma del espermatozoide humano a través de geles bidimensionales i espectrometría de masas. Adicionalmente se han identificado relaciones entre la abundancia de ciertas proteínas i parámetros seminales relacionados con la infertilidad masculina tales como el contenido de protaminas, el daño en el DNA o la movilidad de los espermatozoides dando lugar a la identificación de potenciales marcadores diagnósticos. Además, se han buscado posibles correlaciones entre el contenido de protaminas i la presencia de precursor de protamina 2 en los espermatozoides de pacientes con los resultados de reproducción asistida. Otro aspecto tratado ha sido la determinación, mediante técnicas inmunofluorescentes, de la presencia de nucleosomas i otras proteínas presentes en fracciones de espermatozoides seleccionadas a través de gradientes de densidad con una función potencial epigenética. Además, se ha implementado un protocolo de aislamiento de núcleos de espermatozoides humanos con el objetivo de poder identificar a través de espectrometría de masas proteínas nucleares minoritarias posiblemente importantes para el desarrollo embrionario i el funcionamiento del espermatozoide no patológico. PALABRAS CLAVE: Espermatozoide, Protaminas, Proteoma, Infertilidad masculina, Epigenética

El trasplante renal es la mejor opción disponible para el tratamiento de la enfermedad renal crónica avanzada, tanto en términos de supervivencia como de calidad de vida de los pacientes. La escasez de órganos disponibles para el procedimiento es la mayor limitación de este tipo de terapéutica y por tanto prolongar la vida útil de los injertos renales es la principal prioridad en el contexto del trasplante renal. Después del primer año de funcionamiento del trasplante, la disfunción crónica del injerto (DCI) constituye la principal causa de daño y perdida injerto renal. Esta tesis es un análisis de la correlación del estudio del proteoma urinario mediante espectrometría de masas con la severidad y subtipo histológico de la disfunción crónica del injerto. Los sujetos fueron agrupados según el resultado de la biopsia del injerto y el análisis proteómico mediante espectrometría de masas se realizó en una muestra obtenida antes de realizar la biopsia por indicación clínica. Se realizaron dos tipos de estrategias mediante espectrometría de masas: un primer abordaje, utilizando MALDI- TOF, previa extracción del muestra mediante cromatografía de fase reversa mostró diferencias en el perfil proteómico urinario entre sujetos sanos, pacientes trasplantados con buena función del injerto renal y pacientes con disfunción crónica del injerto. Un segundo estudio mediante LC-MS-MS cuantificó estas diferencias y además aportó información acerca de la secuencia de los péptidos diferenciales. Péptidos específicos derivados de uromodulina y bradiquinina son candidatos a biomarcadores de buen funcionamiento del injerto renal, ya que su presencia en la orina puede ser utilizada para discriminar entre pacientes trasplantados con disfunción del injerto renal y pacientes trasplantados con buena función del injerto. Los niveles elevados del ión 642.5 y niveles bajos del ión 638.0 derivado de uromodulina son característicos de la orina proveniente de pacientes con disfunción crónica del injerto y permiten detectar sus subtipos histológicos. Los iones de m/z 645.59 y m/z 642.61 estaban aumentados de forma significativa en pacientes con rechazo crónico activo mediado por anticuerpos respecto a pacientes con fibrosis intersticial y atrofia tubular aislada (4.4-2.7 fold change) y pacientes trasplantados con función estable del injerto (5.3-14.6 fold change) permitiendo cuantificar las diferencias entre estos dos subtipos de disfunción crónica del injerto ya demostradas en los análisis cualitativo con MALDI-TOF. Este trabajo es la primera prueba de concepto de la utilidad de la proteomica urinaria para detectar biomarcadores y el futuro diseño de una herramienta diagnóstica no invasiva en la disfunción crónica del injerto y en dos de sus subtipos histológicos: Fibrosis intersticial y atrofia tubular sin evidencias de otras lesiones y el Rechazo crónico activo mediado por anticuerpos. / Despite optimal immunosuppressive therapy, more than 50% of kidney transplants fail because of chronic allograft dysfunction. A noninvasive means to diagnose chronic allograft dysfunction may allow earlier interventions that could improve graft half-life. In this proof-of-concept study, we used mass spectrometry to analyze differences in the urinary polypeptide patterns of patients with chronic allograft dysfunction ( with pure interstitial fibrosis and tubular atrophy and with chronic active antibody-mediated rejection) and control subjects (stable recipients and healthy control subjects). Unsupervised hierarchical clustering showed good segregation of samples in groups corresponding mainly to the four biomedical conditions. Moreover, the composition of the proteome of the pure interstitial fibrosis and tubular atrophy group differed from that of the chronic active antibodymediated rejection group, and an independent validation set confirmed these results. Specific peptides derived from uromodulin and kininogen were found to be significantly more abundant in control than in CAD patients and correctly identified the two groups. These peptides are therefore potential biomarkers that might be used for the diagnosis of CAD. In addition, ions at m/z 645.59 and m/z 642.61 were able to differentiate between patients with different forms of CAD with specificities and sensitivities of 90% in a training set and, significantly, of 70% in an independent validation set of samples. Interestingly low expression of uromodulin at m/z 638.03 coupled with high expression of m/z 642.61 diagnosed CAD in virtually all cases. Multiple reaction monitoring experiments further validated the results, illustrating the power of our label-free quantitative LC-MS approach for obtaining quantitative profiles of urinary polypeptides in a rapid, comprehensive, and precise fashion and for biomarker discovery. In summary, this study establishes a pattern for two histologic lesions associated with distinct graft outcomes and constitutes a first step to designing a specific, noninvasive diagnostic tool for chronic allograft dysfunction.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2011 / Made available in DSpace on 2012-10-26T05:21:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 296622.pdf: 2046189 bytes, checksum: a4aa4947a2a95d0ee24588d46690cee5 (MD5) / Técnicas de análise não-alvo têm sido sugeridas como análise complementar de segurança em plantas geneticamente modificadas (GM), na detecção de efeitos inesperados. Neste contexto, proteínas apresentam interesse especial como ferramenta na avaliação de culturas alimentares geneticamente modificadas, pois podem ser toxinas, antinutrientes ou alérgenos. No presente trabalho, plantas de oito variedades brasileiras de milho, sendo quatro variedades MON810 (DKBYG 240, DKBYG 330, DKBYG 350, AGYG 6018) e quatro isolinhas não GM (DKB 240, DKB 330, DKB 350 e AG 6018), foram cultivadas lado a lado, por 10 dias, em condições ambientais controladas. O experimento foi realizado em dois anos, 2010 e 2011. Parâmetros fisiológicos (peso, comprimento das folhas, clorofila e teor de proteína total) foram comparados e não foram observadas diferenças consistentes. Os perfis proteômicos das folhas foram analisados usando gel de eletroforese bidimensional com posterior espectrometria de massas. Para cada variedade foram extraídas proteínas de um pool contendo cinco plantas, as extrações foram feitas em triplicata em 2010 e em 2011. Cada um dos extratos originou um gel 2DE, totalizando seis géis para cada cultivar. Para análise proteômica considerou-se spot exclusivo aquele presente em todos os seis géis da variedade e ausente nos seis géis da sua correspondente. A cultivar DKB 240 apresentou 6 spots exclusivos, enquanto a cultivar DKBYG 240 apresentou apenas 1 spot exclusivo, quando comparadas entre si. A cultivar DKB 350 apresentou 4 spots exclusivos, enquanto DKBYG 350 apresentou 1 spot exclusivo, quando comparadas entre si. Os 12 spots foram identificados por espectrometria de massa. As variedades AGYG 6018 e DKBYG 350 não apresentaram spots exclusivos, quando comparadas com suas isolinhas não GM. No presente estudo, as proteínas exclusivas foram observadas em duas das quatro variedades MON810, e tais proteínas são específicas para cada variedade. Neste trabalho a presença exclusiva de spots não foi constante para as quatro variedades, indicando que as diferenças encontradas nos perfis avaliados não estão relacionadas ao evento MON810.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina. Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-graduação em Recursos Genéticos Vegetais / Made available in DSpace on 2012-10-23T09:02:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 241316.pdf: 2873828 bytes, checksum: 2dea42b66b87bd60b407f3348ca09682 (MD5) / Nesta seção, estudaram-se as proteínas expressas em embriões somáticos de A. sellowiana em diferentes estádios de desenvolvimento. O objetivo foi detectar e identificar proteínas diferencialmente expressas durante os diferentes estádios de desenvolvimento do embrião somático. Usando a alta resolução do gel bidimensional de poliacrilamida (2-DE) observaram-se diferenças entre as proteínas expressas nos estádios iniciais e similaridade entre as proteínas expressas nos últimos estádios. Foram detectadas 29, 32, 51, 61 e 57 proteínas para o estádio globular, cordiforme, torpedo, pré-cotiledonar e cotiledonar, respectivamente. Das 230 proteínas visualizadas por 2-DE, 62 foram identificadas por MALDI TOF/MS. Quatro proteínas foram expressas unicamente no estádio globular, uma no estádio cordiforme, duas no estádio torpedo e quatro no estádio pré-cotiledonar. As proteínas identificadas nos diferentes estádios da embriogênese somática foram agrupadas nas seguintes categorias: metabolismo de carboidratos, biossíntese de purinas, divisão celular, metabolismo secundário, reserva, chaperonas, formação e transporte celular. Os estudos de proteoma com esta espécie são inéditos e permitem avançar no conhecimento do metabolismo embrionário desta espécie, bem como possibilitam uma adequação dos protocolos de embriogênese somática visando sua propagação massal e conservação.

Orientador: Maeli Dal Pai / Resumo: A musculatura esquelética em peixes corresponde mais de 70% do peso corporal total desses animais e o desenvolvimento, crescimento e manutenção do fenótipo muscular envolvem o balanço dinâmico entre as vias de anabolismo e catabolismo muscular, sendo influenciado por diversos fatores, como a disponibilidade alimentar. Períodos com baixa ou nenhuma disponibilidade de alimento é frequentemente observado na natureza e talvez, por isso, garantem aos peixes uma alta capacidade adaptativa para enfrentar períodos de jejum prolongado. Com a realimentação e os níveis metabólicos restabelecidos, o animal pode apresentar um processo de crescimento acelerado, chamado crescimento compensatório. Existe um grande interesse da aquicultura nos processos de crescimento compensatório após jejum, uma vez que bem estabelecido pode gerar diminuição do custo com a alimentação e aumento dos níveis de produção. Uma ferramenta para o estudo do músculo de peixes durante períodos de jejum e realimentação é a proteômica. A proteômica permite identificar o conjunto de proteínas expressas por uma célula ou tecido em determinadas situações e modificações ambientais e possui a vantagem de caracterizar eventos pós-traducionais, algo impossibilitado pela genômica e transcriptoma. Dessa forma, nós testamos a hipótese de que juvenis de pacu (Piaractus mesopotamicus) submetidos a 30 dias de jejum e 30 e 60 dias de realimentação apresentam crescimento compensatório e alterações no perfil de expressão proteico da m... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The skeletal muscle in fish corresponds more than 70% of the total body weight and the development, growth and maintenance of the muscle phenotype involves the dynamic balance between muscle anabolism and catabolism pathways, being influenced by several factors, such as food availability. Periods with low or no food availability are often observed in nature and may therefore, ensure a high adaptive capacity in fish to deal with prolonged fasting periods. With refeeding and metabolic levels restored, the animal may exhibit accelerated growth, called compensatory growth. There is a great interest of aquaculture in the processes of fasting/refeeding, once well-established can generates decrease of the feeding costs and increase of the production levels. An important tool to analyze muscle fish during fasting/refeeding is Proteomics. The proteomics allows to identify a set of proteins expressed by a cell or tissue in some situations and environmental changes and has the advantage of characterizing post-translational events, something impossible to detect by genomic and transcriptome analysis. This way, we tested the hypothesis that juveniles pacu (Piaractus mesopotamicus) submitted to 30 days of fasting and 30 and 60 days of refeeding present compensatory growth and alterations in the protein expression profile of the skeletal muscle. For this, we used two animals groups: Control group (C) fed continuously for 90 days and experimental group (E), submitted to 30 days of fasting fo... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-02-20T16:04:48Z No. of bitstreams: 1 Tese_Leonardo N Santos_2015.pdf: 2984020 bytes, checksum: 9d50efbbf3adc016e9e13dce54e5a3d2 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-07T13:34:06Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Tese_Leonardo N Santos_2015.pdf: 2984020 bytes, checksum: 9d50efbbf3adc016e9e13dce54e5a3d2 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-07T13:34:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_Leonardo N Santos_2015.pdf: 2984020 bytes, checksum: 9d50efbbf3adc016e9e13dce54e5a3d2 (MD5) / FAPESB / Helmintos modulam a resposta imune do hospedeiro e, consequentemente, protegem contra doenças inflamatórias. Diferentes classes de proteínas recombinantes derivadas destes parasitos, produzidas em sistemas de expressão procarióticos e eucarióticos, têm sido capazes de inibir respostas inflamatórias em modelos experimentais de doenças imunomediadas. A identificação do conteúdo proteico de frações do extrato somático de Trichuris trichiura com efeitos imunomodulatórios foi alcançada através de análises em sistema de cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas em uma abordagem proteômica que indicou proteínas candidatas a serem responsáveis por esta atividade biológica. Os resultados desta abordagem foram confirmados e expandidos pela análise transcriptômica do estágio adulto de T. trichiura usando tecnologia de sequenciamento de nova geração e uma estratégia de montagem de novo, onde vinte transcritos que codificam para as proteínas previamente detectadas foram identificados, sendo que cinco desses estão entre as sequências codificadoras de proteínas mais expressas no verme adulto. Estas análises contribuirão para a anotação funcional da sequência genômica de T. trichiurarecém disponibilizada e viabilizarão a produção de proteínas recombinantes codificadas por estes transcritos que poderãolevar ao desenvolvimento de novos medicamentos para a terapia de doenças alérgicas e autoimunes. / Helminths modulate the host immune response and, consequently, protect it against inflammatory diseases. Different classes of recombinant proteins derived from these parasites, produced in prokaryotic and eukaryotic expression systems, were able to inhibit inflammatory responses in experimental models of immune mediated diseases. The identification of the protein content of Trichuris trichiura somatic extract fractions with immunomodulatory effects was achieved by liquid chromatography coupled to mass spectrometry in a proteomics approach that indicated candidate proteins to be responsible for this biological activity. The results of this approach were confirmed and expanded by transcriptomic analysis of T. trichiura adult worm using next-generation sequencing technology and a de novo assembly strategy, where twenty transcripts that code for previously detected proteins were identified, and five of whom were among the most expressed protein-encoding sequences in the adult worm. These analyses will contribute to the functional annotation of the recently released draft genomic sequence of this nematode and will enable the production of recombinant proteins, encoded by these transcripts, that may lead to the development of new drugs for the treatment of allergy, autoimmune and other inflammatory diseases.

Submitted by Nuzia Santos (nuzia@cpqrr.fiocruz.br) on 2014-05-13T13:07:56Z No. of bitstreams: 1 Dissertação-AnaCordeiro.pdf: 12658622 bytes, checksum: 9be8042ba2e3e6e3bf8746875ee265ca (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-13T13:07:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação-AnaCordeiro.pdf: 12658622 bytes, checksum: 9be8042ba2e3e6e3bf8746875ee265ca (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas René Rachou / Meningite é a inflamação das meninges em resposta a infecções ou exposição a agentes químicos. As meningites são classificadas como asséptica (MA) ou bacteriana (MB). Enquanto as MA, mais frequentemente causadas por enterovírus, geralmente são benignas e de curso autolimitado, as MB estão associadas a altas taxas de mortalidade e morbidade que permanecem inalteradas apesar dos avanços nas terapias antimicrobianas e cuidados intensivos para a manutenção dos sistemas vitais dos pacientes. O diagnóstico preciso e rápido das meningites é fundamental para a tomada de decisão em tempo hábil pela abordagem terapêutica adequada para cada forma de meningite. Neste trabalho, a associação de 2D-PAGE com espectrometria de massas permitiu a identificação de proteínas da resposta do hospedeiro para as meningites bacterianas – pneumocócica e meningocócica e para a meningite viral. Dentre estas proteínas, quatro são potenciais candidatos a biomarcadores para o diagnóstico diferencial das meningites e foram utilizadas para a construção de um modelo preditivo qualitativo com essa finalidade. Com a classificação de ausência/ presença de proteínas específicas da resposta do hospedeiro em cada condição patológica, foi possível diferenciar os pacientes com meningite pneumocócica, meningocócica, viral e os indivíduos sem infecção no sistema nervoso central. A descoberta desse modelo preditivo qualitativo proteico é o passo inicial para a construção de um kit rápido para o diagnóstico diferencial das meningites. A utilização deste kit poderá auxiliar na escolha da terapia adequada, de acordo com o agente etiológico, uma vez que o tratamento eficaz continua sendo a melhor alternativa para a redução das sequelas permanentes e de óbito associados à meningite bacteriana. Além disso, foram identificadas, por bioinformática, as principais vias metabólicas e de sinalização mais afetadas por cada uma das formas da doença, o que possibilitou a seleção de novos candidatos a alvos terapêuticos para as meningites. / Meningitis is the inflammation of the meninges in response to infection or chemical agents. The meningitis is classified as aseptic (MA) or bacterial (MB). While MA, most frequently caused by enteroviruses, is usually benign and self-limiting course, MB remains associated with high morbidity and mortality rates, despite advances in antimicrobial therapy and intensive care for the maintenance of patient’s vital systems. The fast and accurate diagnosis of meningitis is crucial for decision making to the appropriate therapeutic approach for each meningitis form. In this work, the association of 2D-PAGE with mass spectrometry allowed the identification of host response proteins to bacterial meningitis – pneumococcal and meningococcal, and viral meningitis. Among these proteins, four are potential candidate biomarkers for the differential diagnosis of meningitis and were used to build a qualitative predictive model for this purpose. Sorting absence / presence of specific proteins in the host response in each pathological condition became possible to differentiate pneumococcal, meningococcal, viral meningitis those individuals without central nervous system infection. The discovery of this novel qualitative predictive model is the beginning step for generation of a fast kit for differential meningitis diagnosis. It could provide individualized therapy according to the causative etiological agent of illness, once the effective treatment remains the best choice for lower permanent sequelae and mortality due to bacterial meningitis. Furthermore, were identified, by bioinformatics, the main metabolic and signaling pathways most affected by each meningitis form, which enabled the selection of novel candidate therapeutic targets for meningitis.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:19Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-12-31 / O rim é responsável pela maior parte da excreção de substâncias, tornando-se alvo de componentes tóxicos, tais como os meios de contrastes (MCTR). Os MCTR a base de iodo são substâncias utilizadas na angiografia, urologia ou tomografia computadorizada. Essas substâncias não deveriam interagir com o organismo, porém, na prática clínica, demonstram certo grau de interação orgânica onde são filtradas e metabolizadas livremente pelos rins, podendo ocasionar insuficiência renal aguda (IRA) devido a vasoconstrição e a isquemia medular O objetivo do presente estudo foi identificar, por meio de análise bidimensional, proteínas da célula mesangial imortalizada (CMI), que poderiam eStar sub ou supra expressas quando em contato com o MCTRH e, por conseqOência desta alteração, estejam envolvidas no processo de nefrotoxicidade Essas células foram divididas em 3 grupos" controle (Ct), manitol (Man) e tratado com HexabrixR (Hx), as quais foram tratadas e em seguida, aplicou-se a análise por gel de eletroforese bidimensional (2-DE). O método inicia-se pela focalização isoelétrica (1. dimensão), onde as proteínas são separadas de acordo com seu pl. Em seguida, essas proteínas são submetidas a uma separação de acordo com sua massa molecular (2. dimensão). Como os parâmetros usados anteriormente são independentes, uma grande resolução de spots (marcações protéicas) foi atingida. Os géis bidimensionais foram corados com Coomassie. Após a identificação dos spots nos géis 2-DE, extração das proteínas e análise por espectrometria de massa, constatamos o aparecimento de algumas proteínas com expressões variadas entre os géis Ct, Man e Hx. Dentre as proteínas identifica das localizamos algumas apenas nos géis submetidos à Hx, como. Canal de tropomiosina-1alfa (TPMA), e antígeno de proliferação de núcleo celular (PCNA). Outras localizadas nos géis Man e H x estavam supra expressas em relação ao gel Ct, como a proteína de controle da translação tumoral. Em contrapartida, houve proteínas que foram apenas expressas nos géis Ct e Man, evidenciando que provavelmente o iodo contido no HexabrixR tenha ocasionado uma sub expressão dessas proteínas, tais como anexina3 e Dna ligase. Finalmente houve a identificação de proteínas que estavam expressas nos três géis (Ct, Man e Hx) embora em concentrações variáveis, como Hsp27, Erp57 e Beta actina-1. De maneira geral, fatos relevantes foram analisados, um deles é de que todas as proteínas que foram expressas nos géis Ct e Hx, também foram detectadas nos géis Man, permitindo- nos enfatizar a possibilidade de descartar o papel da osmolaridade no aumento da expressão das proteínas que foram identificadas somente no gel Hx, sugerindo, portanto, ser o iodo e não a osmolaridade o fator desencadeador das alterações da expressão protéica. Em contrapartida supõe- se ainda que a osmolaridade tenha sido a causadora do aumento da expressão de algumas proteínas apenas nos géis Man e Hx, e não no CT. Sendo assim sugerimos que o MCTR, tanto pela sua osmolaridade como por outros fatores entre eles a influência da molécula do iodo, pode regular a síntese e/ou expressão das proteínas nas células mesangiais. / The kidney is a common target organ for toxic agents, like contrast media (CM). The CM with iodine is normally used in angiography, urography and tomography. CM is filtrated and metabolized in the kidney, being the major cause of acute renal failure (ARF). Nowadays, proteome is actually a powerful tool in the Nephrology Research, mainly in the identification of protein modifications when in contact with toxic agents. This technique also gives the possibility of biomarkers identification to help the physicians in the patient treatments. The aim of this study was to separate by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2D-PAGE) and to identify by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry the proteins that were up- or down-regulated in immortalized mesangial cell in culture (IMC) in the presence of CM. We evaluated three groups of IMC: control (CT), manitol (Man) and HexabrixTM (Hx). The samples were treated and submitted to the 2D-PAGE analysis, where the proteins were separated according to their isoelectric points and molecular weights. We identified by MALDI-TOF around 11 proteins. Some proteins were expressed only in the Hx group (Proliferating Cell Nuclear Antigen and Masp 1); others were more expressed in the Man group when compared with Hx and Ct groups (Translationally Controlled Tumor Protein). On the other hand, some proteins were expressed only in the Ct and Man groups (Annexin A3 and DNA ligase), suggesting that probably the Hx caused injury in these cells and it was responsible for the down-regulation of these proteins. Finally, we identified proteins that were expressed in the three cell groups (Heat Shock Protein 27, Heat Shock Protein 84), but with different levels. We concluded that the osmolarity of manitol and Hx could influenciate the alterations in the concentration of a specific protein. We believe that osmolarity and other factors of the CM could be responsible for the nephrotoxicity observed in this model. Proteomic analysis is a promising tool to study the renal pathophysiology making possible in the future the identification of biomarkers of renal diseases that can constitute therapeutically targets, minimizing the actual damages for the ARF. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2015-11-04T13:39:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 geovane_lopes_ioc_mest_2014.pdf: 4146940 bytes, checksum: 332c9cbd56d1a1690235d637c48eaeef (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2015-10-29 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O objetivo geral do presente trabalho foi caracterizar e identificar peptidases ativas presentes nos intestinos de machos e fêmeas de Anopheles aquasalis bem como identificar as proteínas expressas no intestino e gônadas de fêmeas dessa espécie. Para a caracterização proteolítica foram usadas distintas abordagens bioquímicas que permitiram reunir um grupo importante de informações sobre a expressão de enzimas proteolíticas nesta espécie de mosquito. Usando o substrato fluorogênico Z-Phe-Arg-AMC em solução e a técnica de enzimografia por SDS-PAGE co-polimerizado com gelatina foi possível observar um perfil proteolítico composto por serina peptidases do tipo tripsina no intestino de machos e fêmeas de An. aquasalis. Estas enzimas apresentam maior atividade proteolítica na faixa de pH alcalino e ampla estabilidade térmica, sendo ativas entre 25 °C \2013 80 °C, com maior atividade entre 37 °C \2013 50 °C. Diferenças qualitativas e quantitativas na expressão das peptidases também foram detectadas. Foi observado que o perfil proteolítico difere entre macho e fêmea, sugerindo com isso que a expressão de algumas dessas enzimas é sexo-específica Para análise proteômica do intestino e gônadas de fêmeas alimentadas com açúcar usou-se uma abordagem \201Cbottom-up\201D acoplada à análise bioinformática de dados para identificação das proteínas expressas. A análise do intestino foi feita através de um procedimento de digestão em solução sem pré-fracionamento das proteínas, ao passo que a análise das gônadas foi feita usando um protocolo de digestão em gel após fracionamento das proteínas por SDS-PAGE. Usando estas estratégias, um total de 137 e 995 proteínas foram identificadas no intestino e gônadas, respectivamente. As proteínas foram identificadas usando os programas ProLuCID e/ou PEAKS, e uma base de dados \201Ccustomizada\201D incluindo todas as sequencias de Culicídeos depositadas na base de dados UniProt (81,000 sequencias, em outubro de 2013). As identificações foram posteriormente analisadas com relação ao enriquecimento de termos de ontologia gênica e foram classificadas de acordo com seu processo biológico e função molecular, usando o módulo GeneOntology da plataforma PatternLab. A caracterização proteômica revelou para o intestino (i) a presença de várias serina peptidases do tipo tripsina, corroborando a expressão e atividade das enzimas observadas na enzimografia; (ii) a expressão de vários genes codificantes para quimiotripsina, embora a sua atividade não tenha sido detectada pela enzimografia; e para as gônadas (iii) proteínas associadas à vitelogênese; e (iv) a expressão massiva de proteínas implicadas na preparação do tecido para reprodução Finalmente, até o presente, esta é a primeira caracterização abrangente da atividade proteolítica de machos e fêmeas de An. aquasalis bem como a primeira caracterização proteômica do intestino e gônadas de fêmeas desta espécie alimentadas com açúcar. Os resultados obtidos neste trabalho além de fornecerem informações sobre a localização tecidual de proteínas no mosquito e abrirem diversas vias de estudo da biologia e fisiologia deste vetor, contribuem também para a anotação funcional do genoma desta espécie, visto tratar-se de uma espécie com genoma ainda não concluído / The aim of this study was to characterize and identify active peptidases from the midgut of males and females of Anopheles aquasalis and to identify protein expressed in the midgut and gonads of females of this species. The different bioche mical approaches used for the proteolytic characterization allowed gather ing a group of important information about the expression of proteolytic enzymes in this mosquito species. Using the fluorogenic substrate Z - Phe - Arg - AMC for in - solution enzymatic assays and by zymographic analyses (SDS - PAGE co - polymerized with gelatin) it was possible to observe a proteolytic profile composed of trypsin - like serine peptidases in the midgut of male and female A n . aquasalis . These pepti dases exhibit high proteolytic activity at a w ide range of alkaline pH and thermal stability, being active between 25° C - 80 ° C, with more activity between 37° C - 50° C. Qualitative and quantitative differences in the expression of peptidases were also detected. It was observed that proteolytic profile differs between males and females, thereby suggesting that the expression of some of these enzymes is sex - specific. For proteomic analysis of the midgut and gonads of females fed on sugar it was used a "bo ttom - up" proteomic approach coupled with bioinformatic s data analysis to identify tissue - specific expressed protein s . The midgut analysis was taken through an in - solution digestion procedure without pre - fractionation of the proteins, while the analysis of gonads was made using an in - gel digestion protocol after fractionation of proteins by SDS - PAGE. Using these strategies, a total of 137 and 995 proteins were identified in the midgut and gonads, respectively. Proteins were identified using the ProLuCID and/ or PEAKS software , and a customized database including all Culicidae protein sequences deposited at the UniProt database (81,000 sequences, in October 2013). Protein identifications were further analyzed for the enrichment of gene ontology terms and were c lassified according to their biological process and molecular function using the GeneOntology module of the PatternLab platform. The proteomic characterization of midgut revealed (i) the presence of various t rypsin - like serine peptidases , confirming the ex pression and activity of these enzymes observed by zymography, (ii) the expression of several chymotrypsin coding genes, although its activity was not detected by zymography . Proteomics of gonads from female fed with sugar revealed (iii) the expression of proteins associated with vitellogenesis and (iv) the massive expression of proteins involved in tissue preparation for reproduction process. F inally, to the present , t his is the first characterization of the proteolytic activity of males and females midgut s of An. aquasalis well as the first proteomic characterization of the midgut and gonads of A n . aquasalis females fed with sugar. The results obtained in this work in addition to providing information about the cellular localization of proteins in the mosq uito , open several avenues of study of the biology and physiology of this vector, and also contribute to the functional annotation of the genome of this species with genome not yet completed

Made available in DSpace on 2016-04-04T12:35:27Z (GMT). No. of bitstreams: 2 fernanda_silva_ioc_mest_2014.pdf: 3910647 bytes, checksum: 4b04c7f0b0d2eaf5ff868421bef619ec (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-01-13 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A leishmaniose ainda é uma das doenças mais negligenciadas do mundo. Ela está presente nos cinco continentes e é endêmica em 98 países, com 350 milhões de pessoas vivendo em zonas de risco e mais de 12 milhões de pessoas infectadas. Compreende um complexo de doenças causadas por mais de 20 espécies do gênero Leishmania. No Brasil, a Leishmania amazonensis é uma espécie dermotrópica importante. Apesar do progresso na compreensão da bioquímica e biologia deste parasito, este conhecimento ainda não tem refletido na descoberta de novos e eficazes agentes quimioterápicos contra a doença. O tratamento atual é insatisfatório, com altas taxas de toxidez e ineficácia, e não há vacina humana licenciada. A pesquisa de novos medicamentos, a partir de fontes naturais, é amplamente utilizada como uma abordagem bem sucedida na detecção de compostos para o tratamento de doenças parasitárias. Compostos puros obtidos de plantas, como certos flavonoides, exibem atividade antiprotozoária. A apigenina é uma flavona bioativa, abundantemente presente em frutas, ervas e legumes, que mostrou atividade leishmanicida. A apigenina inibiu o crescimento celular de ambas as formas evolutivas de L. amazonensis de maneira dose-dependente. Este efeito inibitório, em promastigotas, foi igual a 74% após 24 h de tratamento com 96 \03BCM de apigenina e, em amastigotas intracelulares, foi igual a 71% após 72 h de tratamento com 12 \03BCM do composto. O IC50/24 h em promastigotas foi 23,68 \03BCM e o IC50/72 h em amastigotas foi 4,33 \03BCM. Observou-se que a apigenina foi capaz de induzir o aumento nos níveis de ERO nos promastigotas e nos macrófagos infectados com L. amazonensis A incubação com os antioxidantes NAC e GSH reduziu a morte induzida pela apigenina nesses parasitos. A apigenina também foi capaz de causar a diminuição no potencial de membrana mitocondrial, a parada do ciclo celular, a diminuição do potencial proliferativo e alterações ultraestruturais mitocondriais e golgienses nos promastigotas tratados, também de maneira dose-dependente. Além disso, os macrófagos infectados mostraram que o tratamento com apigenina induziu um aumento no número de autofagossomos próximo das amastigotas, sugerindo também a contribuição da autofagia no mecanismo de ação do composto. Na avaliação in silico, a apigenina exibiu propriedades ADMET favoráveis e preencheu a "Regra dos 5\201D de Lipinski, mostrando ser bem absorvida, permeável e oralmente viável. O tratamento oral com apigenina (1 e 2 mg/Kg/dia) em camundongos BALB/c infectados com L. amazonensis mostrou controlar o desenvolvimento da lesão na orelha destes animais e reduzir a carga parasitária de maneira dose-dependente. Os resultados in vitro contribuíram para elucidar a atividade leishmanicida da apigenina e, juntamente como os resultados in vivo, entusiasmam em propor essa flavona como um composto suplementar no tratamento da leishmaniose / Leishmaniasis is still one of the most neglected diseases in the world. It is present on five continents and is endemic in 98 countries, with 350 million people living in areas at risk and more than 12 million people infected. Comprises a complex of diseases caused by over 20 species of the genus Leishmania . In Brazil, Leishmania amazonensis is an important dermotropic specie. Despite progress in understanding the biochemistry and biology of this parasite, this knowledge has not been refle cted in the discovery of new and effective chemotherapeutic agents against the disease. The current treatment is unsatisfactory, with high toxicity and ineffectiveness, and there is no licensed human vaccine. The research of new drugs from natural sources is widely used as a successful approach in detecting compounds for the treatment of parasitic diseases. Pure compounds obtained from plants, such as certain flavonoids, exhibit antiprotozoal activity. Apigenin is a bioactive flavone, abundantly present in fruits, herbs and vegetables, which showed leishmanicidal activity. Apigenin inhibited cell growth of both forms of L. amazonensis in dose - dependent manner. This inhibitory effect on promastigotes was equal to 74% after 24 h of treatment with 96 μM apigenin and on intracellular amastigotes was equal to 71% after 72 h of treatment with 1 2 μM of the compound. The IC 50 / 24 h) in promastigotes was 23.68 μM and the IC 50 /72 h in amastigotes was 4.33 μM. It was observed that apigenin was able to induce increased lev els of ROS in treated promastigotes and L. amazonensis - infected macrophages. Pre - incubation with antioxidants, such as NAC and GSH, reduced apigenin - induced death in these parasites. Apigenin was also able to cause a decrease in mitochondrial membrane pote ntial, the cell cycle arrest, the decrease of proliferative potential, and mitochondrial and golgiense’s ultrastructural changes in treated promastigotes, also in dose - dependent manner. In addition, macrophages have shown that apigenin treatment induced an increase in the number of autophagosomes close to the amastigotes, suggesting the involvement of autophagy in the mechanism of action of the compound. When evaluated in silico , apigenin exhibited favorable ADMET properties and filled the Lipinski ’s "R ule of 5" , showing to be well absorbed, permeable and orally viable . In murine cutaneous leishmaniasis model, the oral t reatment with apigenin (1 and 2 mg/K g/day) in BALB/c infected mice showed to control the lesion development on ear of these animals and to r educe the parasite burden in dose - dependent manner. In vitro studies have contributed to elucidate the leishmanicidal activity of apigenin and, together with the in vivo results, enthusiastic in proposing this flavone as an additional compound in the treat ment of leishmaniasis