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Comportamento de camundongos Suíços frente à infecção por Leishmania (V.) braziliensis e/ou Leishmania (L.) amazonensis. / Behavior of Swiss mice infected by Leishmania (V.) braziliensis and/or Leishmania (L.) amazonensis.Rocha, Juliana da Câmara 16 May 2014 (has links)
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Previous issue date: 2014-05-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Leishmaniasis are diseases caused by different species of parasites in the genus
Leishmania. Isogenous mice are widely used in the investigation of
immunopathological processes associated with these diseases. However, there are
few studies of experimental leishmaniasis with heterogeneous mice with a diverted
genetic makeup are few. This work evaluated the behavior of heterogeneous Swiss
mice infected with the species L. (V.) braziliensis and/or L. (L.) amazonensis. Initially,
the Swiss mice were infected in the paw with the promastigote stage of L. braziliensis
and L. amazonensis singly; the progression of the wound was monitored for nine
weeks, and the parasitic load and the levels of the cytokines IFN-γ, TFN-α, and NO
were measured. After six and seventeen weeks, the Swiss mice previously
coinfected with L. braziliensis were infected in the other paw with L. amazonensis;
The progression of the infection was analyzed. At the eighth or ninth weeks following
the double infection, the parasitic load, the levels of cytokine IFN-γ, TNF-α, and NO
in cells of the spleen and the popliteal lymph node were determined. Infected mice
with L. braziliensis developed a small wound at the site of infection (0,26 ± 0,05 mm).
However, the infection remained unaltered without traces of progression and without
detection of parasites in the spleen, but showed an increase in the levels of IFN-γ in
cells of the spleen. Conversely, the Swiss mice infected with L. amazonensis
developed wounds with continuous and progressive growth, with the presence of
parasites in the spleen in spite of a significant increase in the synthesis of IFN-γ.
With respect to doubly infected animals, the wound in the site of the infection by L.
amazonensis also presented a progressive growth. However, from the second week
the wounds in these animals were significantly smaller than the wounds in the
animals infected only with L. amazonensis. In the eighth week of assessment, a
difference in the size of the wound (2,54 ± 0,57 mm) between these last two groups
of animals was observed. This decrease in the wounds size correlated with
increased levels of IFN- γ and NO in the spleen cells in the animals doubly infected.
With the obtained results, it can be concluded that Swiss mice develop a phenotype
of susceptibility to infection by L. amazonensis. Moreover, the previous infection with
L. braziliensis confers a partial protection against L. amazonensis associated with a
large production of IFN-γ. / As leishmanioses são doenças causadas por diferentes espécies de parasitos do
gênero Leishmania. Camundongos isogênicos são amplamente utilizados na
investigação dos processos imunopatológicos associados a essas enfermidades.
Contudo, poucos são os estudos de leishmaniose experimental com camundongos
que possuem uma constituição genética variada, os denominados heterogênicos. No
presente trabalho foi investigado o comportamento de camundongos Suíços
(heterogênicos) infectados com as espécies L. (V.) braziliensis e/ou L. (L.)
amazonensis. Inicialmente, os camundongos Suíços foram infectados na pata com
formas promastigotas de L. braziliensis e L. amazonensis isoladamente; a evolução
da lesão foi monitorada por nove semanas, e foram determinadas a carga parasitária
e os níveis das citocinas IFN-γ, TNF-α e do NO. Posteriormente, camundongos
Suíços foram previamente infectados com L. braziliensis, e após seis ou dezessete
semanas de infecção, foram coinfectados na outra pata com L. amazonensis;
analisando a evolução da lesão e após oito ou nove semanas de coinfecção, foram
determinadas a carga parasitária, os níveis de IFN-γ e de NO pelas células do baço
e do linfonodo poplíteo. Os camundongos infectados com L. braziliensis
desenvolveram uma pequena lesão no sítio de infecção (0,26 ± 0,05 mm),
permanecendo de forma inalterada, sem indícios de evolução, sem a detecção de
parasitos no baço e apresentando um aumento nos níveis de IFN-γ pelas células do
baço. De modo diferente, os camundongos Suíços infectados com L. amazonensis
desenvolveram lesões com crescimento progressivo e contínuo, com a detecção de
parasitos no baço, apesar de também aumentarem significativamente a síntese de
IFN-γ. Nos animais coinfectados, a lesão no sítio de infecção por L. amazonensis
também apresentou um crescimento progressivo. Contudo, a partir da segunda
semana de infecção, as lesões nestes animais foram significativamente menores do
que as lesões dos animais infectados apenas com L. amazonensis. Na oitava
semana de avaliação foi observada uma diferença no tamanho da lesão entre esses
dois últimos grupos de animais de 2,54 ± 0,57 mm. A diminuição da lesão foi
correlacionada com o aumento dos níveis de IFN-γ e de NO por células do baço
desses animais coinfectados. Diante dos resultados obtidos, pode-se concluir que
camundongos Suíços desenvolvem um fenótipo de resistência à infecção por L.
braziliensis e um fenótipo de susceptibilidade à infecção por L. amazonensis.
Adicionalmente, a infecção prévia com L. braziliensis confere proteção parcial a uma
posterior infecção com L. amazonensis, associada a uma maior síntese de IFN-γ.
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Efeito da 1,10-fenantrolina e seus derivados complexados em metal na atividade proteolítica de Leishmania braziliensis / Effect of 1,10-phenanthroline and its derivatives complexed metal in the proteolytic activity of Leishmania braziliensisAna Karina Castro Lima 24 August 2012 (has links)
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leishmanioses são um grupo de doenças com um largo espectro de manifestações clínicas, as quais variam desde lesões cutâneas até o envolvimento visceral severo, podendo levar ao óbito. A leishmaniose é, ainda hoje, uma doença negligenciada, estando entre os agravos prioritários do programa de pesquisa sobre doenças da pobreza da Organização Mundial da Saúde (OMS). Além de não haver vacinas disponíveis, a terapia é baseada em medicamentos injetáveis que causam sérios efeitos colaterais, tornando o tratamento inviável para muitos países endêmicos. Drogas derivadas de metal representam um novo arsenal terapêutico antimicrobiano e anti-câncer. Os inibidores de peptidase/agentes quelantes tais como 1,10-fenantrolina e seus derivados, no estado livre de metal ou como ligantes com metais de transição, interferem com a função de vários sistemas biológicos. Em trabalhos anteriores, nosso grupo descreveu que o parasito L. braziliensis produziu moléculas gp63 sensíveis a 1,10-fenantrolina. No presente trabalho, demonstramos a distribuição celular da molécula gp63 em uma cepa virulenta de L. braziliensis por meio de análises bioquímicas e imuno-histoquímica. Depois disso, relatamos os efeitos inibitórios de três compostos derivados da 1,10-fenantrolina, 1,10-fenantrolina-5,6-diona (phendio), [Cu(phendio)2] e [Ag(phendio)2], nas atividades metalopeptidases celulares e extracelulares produzidas por promastigotas de L. braziliensis, bem como as suas ações sobre a viabilidade do parasita e na interação com as células de macrófagos murinos. As moléculas gp63 foram detectadas em compartimentos de parasitos, incluindo membrana citoplasmatica e bolsa flagelar. O tratamento de promastigotas de L. braziliensis durante 1 hora com 1,10-fenantrolina e seus derivados resultou numa inibição significativa da viabilidade celular e mostrou um mecanismo de ação irreversível. Estes inibidores de metalopeptidases induziram apoptose em promastigotas de L. braziliensis, demonstrada através da marcação com anexina/iodeto de propídio e ensaio TUNEL. O pré-tratamento de promastigotas com os inibidores de metalopeptidases induziram uma diminuição na expressão de moléculas de superfície gp63, assim como uma redução significativa no índice de associação com macrófagos. Em paralelo, macrófagos infectados com L. braziliensis e tratados com 1,10-fenantrolina e seus derivados promoveram uma potente redução sobre o número de amastigotas intracelulares. O tratamento de macrófagos com 1,10-fenantrolina e seus derivados não induziram o aumento de óxido nítrico. A ação combinatória sobre a capacidade de crescimento entre os compostos derivados da 1,10-fenantrolina e Glucantime, quando ambos foram utilizados em concentracões sub-inibidoras, também foi observada. In vivo os compostos derivados da 1,10-fenantrolina e seus drivados foram capazes de controlar o tamanho das lesões a partir da terceira semana de tratamento em relação ao controle não tratado em hamsters infectados quando administrado por via intraperitoneal. Os animais tratados com os compostos apresentaram maior resposta intradérmica (DTH) aos antígenos de L. braziliensis. Coletivamente, a 1,10-fenantrolina e seus derivados metálicos apresentam uma nova perspectiva de estudos para o desenvolvimento de novos fármacos anti-L. braziliensis / Leishmaniasis is a group of diseases with a wide spectrum of clinical manifestations, which range from self-limited skin lesions to severe visceral involvement that can lead to death. Leishmaniasis is still a neglected disease, and it is among the priorities of the research program on diseases of poverty of World Health Organization (TDR/WHO). There is no available vaccine and the treatment is based on drugs that cause serious side effects, and are unaffordable in several endemic countries. Metal-based drugs represent a novel antimicrobial and anti-cancer therapeutics arsenal. Peptidase inhibitors/chelating agents such as 1,10-phenanthroline and its substituted derivatives, either the metal-free state or as ligands coordinated to transition metals, interfere with crucial functions of several biological systems. In previous works, our group described that L. braziliensis produced gp63 molecules sensible to 1,10-phenanthroline. Herein, we initially studied the cellular distribution of gp63 in a virulent strain of L. braziliensis by biochemical and immunocytochemical analyses. After that, we reported the inhibitory effects of three 1,10-phenanthroline derivative compounds, 1,10-phenanthroline-5,6-dione (phendio), [Cu(phendio)2]and [Ag(phendio)2], on both cellular and extracellular metallopeptidase activities produced by L. braziliensis promastigotes as well as their actions on the parasite viability and on the interaction with murine macrophage cells. The gp63 molecules were detected in several parasite compartments, including cytoplasm, membrane lining the cell body and flagellum, and flagellar pocket. The treatment of L. braziliensis promastigotes for 1 hour with 1,10-phenanthroline and its derivatives resulted in a significant inhibition of cell viability and showed an irreversible mechanism of action. These metallopeptidase inhibitors induced apoptosis in L. braziliensis promastigotes as judged by annexin/propidium iodide staining and TUNEL assays. The pre-treatment of promastigotes with metallopeptidase inhibitors induced a reduction on the expression of surface gp63 as well as a significant reduction on the association index with macrophages. In parallel, the treatment of L. braziliensis-infected macrophages with the 1,10-phenanthroline and its derivatives promoted a powerful reduction on the number of intracellular amastigotes. The treatment of macrophage cells with 1,10-phenantroline and its derivatives did not induce nitric oxide production. A synergistic inhibition on the growth ability was observed when 1,10-phenanthroline derivative compounds and Glucantime were used at sub-inhibitory concentrations. In vivos the compounds 1,10-phenanthroline derivatives and its were able to control the lesions size from the third week of treatment on, when compared to untreated control infected hamsters. The animals treated with the compounds showed greater response to the intradermal antigens of L. braziliensis. Collectively, the 1,10-phenanthroline and its metal-based drugs present a good perspective for prospective studies to the development of new anti-L. braziliensis drugs
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Leishmaniose tegumentar americana (LTA) no município de Bandeirantes - Paraná, entre 2000 e 2009 / American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) in the city of Bandeirantes - Paraná, between 2000 and 2009.Carolina Fordellone Rosa Cruz 24 September 2010 (has links)
No estado do Paraná a leishmaniose tegumentar americana (LTA) é endêmica, ocorrendo em 276 dos seus 399 municípios. Dos 12.304 casos da doença registrados no Sul do Brasil de 1980 a 2003, 12.220 (99,3 por cento) ocorreram no Estado do Paraná, sendo notificados 123 casos autóctones no município de Bandeirantes de 2000 a 2009. Objetivos. 1) Descreve a ocorrência da LTA no município de Bandeirantes entre 2000 e 2009, segundo a distribuição espacial, temporal e atributos pessoais; 2) relatar aspectos das formas clínicas e terapêuticos da LTA; identificar: 3) as espécies de Leishmania circulante na população humana e 4) as espécies de flebotomíneos capturadas em ambiente de transmissão da doença no município, de modo a 5) apontar para as espécies vetoras. Métodos. Desenvolveu-se estudo epidemiológico retrospectivo e descritivo de base de dados secundária da LTA e ecológico do grupo dos insetos vetores de Leishmania. Foram utilizados dados das fichas de investigação epidemiológica de LTA notificados à Secretaria Municipal de Saúde de Bandeirantes. Para a identificação da Leishmania sp, foram utilizadas amostras de tecidos das feridas de pacientes com suspeita de LTA e submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR). Para a análise entomológica foram realizadas capturas com armadilhas automáticas luminosas tipo CDC, durante um ano, com periodicidade quinzenal em 11 pontos peridomiciliares da zona urbana, e mensal, em 12 pontos da zona rural, a maioria deles selecionados tendo como referência a presença de casos de LTA. Além destes, foram feitas coletas com armadilha Shannon modificada nas cores branca e preta em um ponto da zona rural, nas três estações do ano (primavera, verão e outono). Resultados. No período de estudo a evolução da doença evidenciou um momento epidêmico em 2007, quando o coeficiente de incidência representou 1,038 casos/1.000 habitantes/ano. A distribuição dos casos no espaço ocorreu de forma heterogênea, com maior concentração na zona urbana. Das 123 notificações de LTA, 76 (61,79 por cento) foram do sexo feminino e 47 (38,21 por cento) do masculino. A faixa etária predominante foi a de 60 anos, em ambos os sexos. Houve predomínio da atividade doméstica (40,65 por cento), da forma clínica cutânea (95,94 por cento) e o Antimonial Pentavalente foi a droga mais utilizada a (98,37 por cento). Leishmania (Viannia) braziliensis foi identificada por meio da PCR em três pacientes de LTA. Na pesquisa do grupo de vetores, nos 24 pontos amostrados com as armadilhas CDC e Shannon, capturou-se um total de 5.652 flebotomíneos (51,66 por cento machos e 48,33 por cento fêmeas) pertencentes a 17 espécies. Nyssomyia neivai predominou (47,36 por cento), seguida de Nyssomyia whitmani (35,77 por cento), Pintomyia pessoai (6,51 por cento), Brumptomyia brumpti (5,54 por cento) e Expapillata firmatoi (2,30 por cento). Na zona urbana foram capturados apenas 22 flebotomíneos pertencentes a seis espécies: Br. brumpti, Evandromyia cortelezzii, Ny. neivai, Ny. whitmani, Pi. pessoai e Sciopemyia sordellii. Na zona rural capturou-se com as CDC, 3.843 flebotomíneos pertencentes a 15 espécies: Ny. neivai, Ny. whitmani, Pi. pessoai, Pi. fischeri, Br. brumpti, Br. cunhai, Br. nitzulescui, Br. sp., Ev. correalimai, Ev. cortelezzii, Ex. firmatoi, Mg. migonei, Mi. ferreirana, Mi. longipennis e Sc. sordellii. A espécie mais abundante foi Ny. neivai, cujo valor do índice de abundância padronizado foi de 0,89, seguida por Ny. whitmani (0,85) e Pi. pessoai (0,69). Os maiores índices de diversidade (H) ocorreram em uma margem de mata (1,45) e chiqueiro (1,42) de um bairro rural, e num outro, a maior equitabilidade entre o número de exemplares coletados em domicílio (0,96) e galinheiro (0,92). No total de espécimes capturados, as médias mensais mais elevadas ocorreram nos meses de março (6,92) e dezembro (6,45), Ny. neivai apresentou a maior média nos meses de dezembro (4,28 insetos/ armadilha) e Ny. whitmani em março (4,34). Na armadilha Shannon modificada foram capturados 1.787 espécimes, destacando-se Ny. neivai (56,86 por cento) e Ny. whitmani (32,79 por cento). A média horária mais elevada para Ny. neivai ocorreu das 23:0024:00 horas e Ny. whitmani entre 20:00 e 21:00 horas. Conclusão. Os dados sócio-econômicos apresentados mostram a LTA afetando predominantemente mulheres, porém crianças também foram atingidas, sugerindo que a transmissão da Leishmania pelos principais prováveis vetores, Ny. neivai e Ny. whitmani, esteja ocorrendo em área domiciliar e peridomiciliar. Áreas estas, cuja atração aos flebotomíneos pode aumentar o risco de aquisição da doença pelos moradores / In the state of Paraná, American cutaneous leishmaniasis (ACL) is endemic, occurring in 276 of its 399 municipalities. Of the 12,304 cases of ACL registered in the Southern Region of Brazil between 1980 and 2003, 12,220 (99.3 per cent) of them occurred in the State of Paraná. In this state, 123 autochthonous cases were registered in the Bandeirantes municipality between 2000 and 2009. Objectives. To describe: 1) the occurrence of ACL in the municipality of Bandeirantes between 2000 and 2009, in terms of its spatial and temporal distribution and the personal characteristics of the population affected and 2) the clinical and therapeutic aspects of ACL; to identify: 3) the Leishmania species infecting the human population and 4) the phlebotomine species captured in the environments where the disease may be transmitted, so as 5) to indicate the possible vectors. Methods. A retrospective and descriptive epidemiological study was undertaken based on a secondary database together with an identification of the Leishmania sp. and ecological study of the vectors. The secondary data used were derived from the ACL epidemiological investigation cards of the Municipal Health Service of Bandeirantes. For the identification of the Leishmania spp., samples of tissue taken from the wounds of suspected ACL patients were submitted to the polymerase chain reaction (PCR). For the entomological analysis, captures with automatic light traps (CDC type) were carried out during one year: fortnightly at 11 urban peridomiciliary sites and monthly at three sites, including domestic animal shelters, peridomiciles and forest edge, in each of four rural localities. Cases of ACL had occurred at the majority of the urban sites and rural localities. Captures were also undertaken (one in each season, spring, summer and fall) with modified black and white Shannon traps at one of the rural sites. Results. The progression of the disease reached an epidemic peak in 2007, when the incidence coefficient attained 1.038 cases/1,000 inhabitants per year. The spatial distribution of the cases presented its highest concentration in the urban zone. Of the 123 notifications of ACL, 76 (61.79 per cent) occurred in females and 47 (38.21 per cent) in males. The age group 60 years predominated in both sexes as also did domestic activity (40.65 per cent). The cutaneous form accounted for 95.94 per cent of the cases, the drug most utilized being Antimony Pentavalent (98.37 per cent). Leishmania (Viannia) braziliensis was identified by PCR in three patients. At the 24 sites sampled with CDC and Shannon traps, 5,652 sand flies (51.66 per cent males and 48.33 per cent females) belonging to 17 species were captured, with the predominance of Nyssomyia neivai (47.36 per cent), Nyssomyia whitmani (35.77 per cent), Pintomyia pessoai (6.51 per cent), Brumptomyia brumpti (5.54 per cent) and Expapillata firmatoi (2.30 per cent). Only 22 specimens belonging to 6 species (Br. brumpti, Ev. cortelezzii, Ny. neivai, Ny. whitmani, Pi. pessoai, Sciopemyia sordellii) were captured in the urban zone. In the rural zone 3,843 sand flies belonging to 15 species (Ny. neivai, Ny. whitmani, Pi. pessoai, Pi. fischeri, Br. brumpti, Br. cunhai, Br. nitzulescui, Br, sp., Ev. correalimai, Ev. cortelezzii, Ex. firmatoi, Migonemyia migonei, Micropygomyia ferreirana, Mi. longipennis and Sc. sordellii) were captured, with CDC. Ny. neivai presented the highest standardized abundance index (0.89), followed by Ny. whitmani (0.85) and Pi. pessoai (0.69). The highest diversity indices (H) observed were on the forest edge (1.45), and in a pigsty (1.42). As regards evenness, there was a greater balance between the number collected in a house (0.96) and poultry coop (0.92). Considering all the specimens captured, the highest monthly average occurred in March (6.92) and December (6.45), Ny. neivai showed the highest average in December (4.28 specimens/trap) and Ny. whitmani in March (4.34). With the modified Shannon traps, 1,787 specimens were captured, Ny. neivai (56.86 per cent) and Ny. whitmani (32.79 per cent) predominating. The highest hourly average of Ny. neivai occurred between 23.00 and 24.00 hours and that of Ny. whitmani between 20.00 and 21.00 hours. Conclusions. The socio-economic data presented show that ACL affects women predominantly; however, infants were also affected, suggesting that the transmission of Leishmania by the principal probable vectors (Ny. neivai and Ny. whitmani) is occurring in domiciliary and peridomiciliary environments, whose attractiveness to sand flies may increase the risk of the transmission of the disease to the residents
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Identificação e avaliação imunológica de potenciais epítopos de linfócitos T CD4+ e T CD8+ no proteoma de Leishmania (Viannia) braziliensisSILVA, Rafael de Freitas e 06 September 2016 (has links)
Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2017-03-10T13:11:37Z
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Previous issue date: 2016-09-06 / As leishmanioses são doenças causadas por protozoários do gênero Leishmania e
estão presentes em 98 países e territórios e possuem incidência anual de 2
milhões de casos. A Leishmania (Viannia) braziliensis (L.V. braziliensis) é uma das
principais espécies causadoras da leishmaniose cutânea (LC) no Brasil. Apesar
disso, ainda não há uma vacina segura e eficaz para ser utilizada em seres
humanos. Nesse sentido, o objetivo deste trabalho foi identificar no proteoma
predito de L.V. braziliensis, potenciais epítopos de linfócitos T e avaliá-los por meio
de ensaios imunológicos. No primeiro capítulo, o proteoma predito de L.
braziliensis foi comparado ao de outras espécies e analisado quanto a presença de
epítopos. Nessa etapa foram encontrados epítopos derivados de mais de 8 mil
proteínas conservadas entre diferentes espécies de Leishmania. Os epítopos
foram clusterizados e então utilizados para etapa de docagem molecular com
estruturas de MHC I e MHC II depositadas no Protein Data Bank. A docagem
molecular resultou em epítopos peptídicos de 15 aminoácidos com alta afinidade
de ligação às moléculas de MHC I e MHC II. Os 10 melhores resultados foram
então sintetizados e avaliados, in vitro, quanto à capacidade de estimular a
proliferação de células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de indivíduos
com LC após o tratamento (PT). Os resultados indicaram que 50% das moléculas
testadas apresentaram capacidade de estimular, significativamente (p<0,05), a
proliferação celular quando comparado às células de indivíduos saudáveis que não
vivem em região endêmica para LC. No segundo capítulo, os peptídeos foram
avaliados quanto à capacidade de estimular a proliferação de PBMC de indivíduos
com LC em sua fase ativa (AD) e indivíduos moradores de área endêmica para LC
resistentes à infecção (RT). Em paralelo, quantificou-se a expressão do fator de
transcrição T-bet em PBMC de indivíduos PT, e citocinas dos perfis Th1, Th2 e
Th17 foram mensuradas no sobrenadante de cultura das células de indivíduos PT
e AD. Os resultados demonstraram altos níveis de proliferação nas células do
grupo RT para todos os peptídeos testados. Além disso, níveis significativos de Tbet
foram observados em linfócitos T CD4+ e CD8+ após estímulo com seis
peptídeos. Níveis significativos de IFN-γ, TNF e IL-6 foram observados no
sobrenadante das células do grupo PT com quatro dos peptídeos testados. Altos
níveis dessas citocinas também foram encontrados no sobrenadante do grupo AD.
No terceiro capítulo, avaliou-se o efeito dos peptídeos sobre células dendríticas de
medula (BMDC) murinas, produção de citocinas de sobrenadante, e células
dendríticas esplênicas murinas após estímulo com os peptídeos. Verificou-se altos
níveis de MHC II e CD40 em uma subpopulação de BMDC estimuladas com as
moléculas e altos níves de TNF e IL-6 após 48h de estímulo. Para as células
esplênicas, foram observados altos níveis de subpopulações celulares
expressando CD11b+, IL-12p70+, CD205+ e CD11b+ após estímulo com o peptídeo
que teve o melhor resultado in silico. Por fim, os resultados indicam o grande
potencial imunogênico que os epítopos identificados apresentam, o que dá suporte
ao desenvolvimento futuro de abordagens vacinais. / The leishmaniasis are diseases caused by protozoans from the genus
Leishmania which are present in 98 countries and territories, with an annual
incidence of 2 million cases. Among the other species, Leishmania (Viannia)
braziliensis is the main specie implicated with cutaneous leishmaniasis (CL) in
Brazil. Besides that, there is no safe and effective vaccine against leishmaniasis
to be applied in humans. In this context, the aim of this work was to identify in
the predicted proteome of L. braziliensis potential CD4+ and CD8+ T cell
epitopes and evaluate them by immunological assays. In the first chapter, the
predicted proteome of L. braziliensis was compared with other species and
analyzed for the presence of epitopes. In this step, epitopes from more than
8,000 conserved proteins were found among other species of Leishmania. The
epitopes were clustered and then used for the molecular docking with MHC I
and MHC II structures deposited in the Protein Data Bank. This approach
resulted in 15 aminoacids peptide epitopes with high binding affinity for MHC I
and MHC II. The 10 best results were synthesized and evaluated in vitro for
their capacity to stimulate the proliferation of peripheral blood mononuclear cells
(PBMC) of individuals with CL post treatment (PT). The results have shown that
50% of the tested molecules had the capacity to stimulate, significantly
(p<0.05), cell proliferation when compared with cells of healthy individuals living
in non-endemic regions. For the second chapter, the peptides were evaluated
for their capacity to stimulate the proliferation of PBMC from CL individuals with
active disease (AD) and of individuals resistant to infection (RT) living in
endemic region. In parallel, the T-bet transcription factor expression was
quantified in PBMC of PT individuals, and cytokines from the Th1, Th2 and
Th17 profiles were measured in culture supernatant of PT and AD groups. High
levels of cell proliferation in the RT group were demonstrated for all peptides
tested. Moreover, significant levels of T-bet in CD4+ and CD8+ T cells were
verified after stimulation with six peptides. For IFN-γ, TNF and IL-6, significant
levels were detected in the supernatant of cultures from the PT group with four
peptides tested. High levels of these same cytokines were also present in the
supernatant of AD group. In the third chapter, the peptide effects over murine
bone marrow dendritic cells (BMDC), the production of cytokines in the
supernatant and murine spleen dendritic cell subsets were evaluated after
peptide stimuli. High levels of MHC II and CD40 were verified for stimulated
BMDC and high levels of TNF and IL-6 after 48h of stimuli. For spleen cells,
high levels of cells expressing CD11b+, IL-12p70+, CD205+ e CD11b+ were
observed after stimulation with the peptide which showed the best in silico
result. In conclusion, the results indicate the great immunogenic potential of the
identified peptides and support the further development of vaccine approaches
using those molecules.
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Análise da expressão das proteínas META2, LRR17, STI1 e TSA em isolados de Leishmania (Viannia) braziliensis obtidos de pacientes com lesão cutânea ou mucosa / Analysis of protein expression of META2, LRR17, TSA and STI1 in isolates of Leishmania (Viannia) braziliensis obtained from patients with cutaneous or mucosal lesionsÁvila, Lucilla Ribeiro 17 February 2012 (has links)
Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-05-22T11:12:34Z
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Previous issue date: 2012-02-17 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Introduction: Leishmania (Viannia) braziliensis is the most common etiologic agent of cutaneous leishmaniasis in Brazil. About 1 to 10% of patients infected with this species of parasite develop the mucosal leishmaniasis, whose lesions are progressive, destructive and are characterized by a strong specific immune response. The mechanisms for the development of mucosal leishmaniasis are poorly known, but it is possible that proteins associated with virulence of the parasite, such as META2 LRR17 and/or related with the induction of a strong immune response, such as STI and TSA, participate in the pathogenesis disease, causing the appearance of metastases in the mucosa.
Objective: To evaluate the expression of proteins META2, LRR17, STI1 and TSA in promastigotes and amastigotes of Leishmania (Viannia) braziliensis derived from cutaneous or mucosal lesions.
Methods: It was used three isolates from cutaneous lesions of patients (JCJ8c, and RPL5c SMB7c) and three isolates from mucosal lesions (ASL9m, and JBC8m PPS6m). Amastigotes of the isolates were obtained after inoculation of biopsies in mice knockout in interferon gamma and promastigotes in logarithmic or stationary phase obtained in culture in Grace's medium. The kinetics of growth in culture of isolates was performed by counting daily over ten days in the flow cytometer. The expression of proteins of each isolate was assessed by immunoblotting technique and by flow cytometry, the latter being used only to evaluate the expression of proteins whose expression was significant difference between isolates from cutaneous or mucosal lesions.
Results: Promastigotes in stationary phase of the isolates SMB7c and JBC8m were the most expressed the protein META2. The greatest expression of this protein in parasites coincided with more severe lesions, since despite of isolated SMB7c being of cutaneous origin, the patient also presented mucosal lesion, and in the isolated JBC8m the patient presented return of lesions. Proteins LRR17 and STI1 were not expressed in significant amount in both promastigotes and amastigotes of different isolates. TSA protein was expressed at higher levels in promastigotes stationary phase and amastigotes of the
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isolates from patients with mucosal lesions, and this difference was also observed in flow cytometric analysis.
Conclusion: The results suggest an association of META2 protein, which is related to the virulence of the parasite, with the generation of more severe lesions in the mucosal, since the highest expression of the protein was isolate from patients with mucocutaneous lesions and patients whose treatment was not effective. TSA, which is associated with antigenicity and virulence of the parasite was also expressed in greater amount in isolates from patients with mucosal lesions. The hypothesis is that, despite TSA protein to induce a protective immune response could be conferring protection in the Leishmania after entering the phagolysosomes by being an antioxidant protein. This protection favored the persistence of parasites and later generation of mucosal lesions. / Introdução: A Leishmania (Viannia) braziliensis é o agente etiológico mais frequente da leishmaniose tegumentar no Brasil. Cerca de 1 a 10% dos pacientes infectados com essa espécie de parasito desenvolvem a leishmaniose mucosa, cujas lesões são progressivas, destrutivas e caracteriza-se por uma forte resposta imune específica. Os mecanismos para o desenvolvimento da leishmaniose mucosa são pouco conhecidos, porém é possível que proteínas associadas à virulência do parasito, como a META2 e o LRR17 e /ou relacionadas com a indução de uma forte resposta imune, como a STI e a TSA, participem da patogênese da doença, ocasionando o aparecimento de metástase na mucosa.
Objetivo: Avaliar a expressão das proteínas META2, LRR17, STI1 e TSA em formas promastigotas e amastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis oriundas de lesões cutâneas ou mucosas.
Métodos: Foram utilizados três isolados oriundos de lesões cutâneas de pacientes (JCJ8c, RPL5c e SMB7c) e três isolados oriundos de lesões mucosas (ASL9m, JBC8m e PPS6m). Formas amastigotas dos isolados foram obtidas após o inóculo das biópsias em camundongos deficientes em interferon gama e as formas promastigotas em fase estacionária ou logarítmicas obtidas em cultura em meio de Grace. A cinética do crescimento dos isolados em cultura foi realizada através de contagem diária durante dez dias em citômetro de fluxo. A expressão das proteínas de cada isolado foi avaliada através da técnica de immunoblotting e por citometria de fluxo, sendo esta última utilizada somente para avaliar a expressão de proteínas cuja diferença na expressão foi significante entre os isolados de lesões cutâneas ou mucosas.
Resultados: Promastigotas em fase estacionária dos isolados SMB7c e JBC8m foram as que mais expressaram a proteína META2. A maior expressão desta proteína nos parasitos coincidiu com lesões mais graves, visto que o isolado SMB7c apesar de ser de origem cutânea, o paciente apresentou também lesão na mucosa e no isolado JBC8m o paciente teve o retorno das lesões. As proteínas LRR17 e STI1 não foram expressas em quantidades significativamente diferentes tanto em promastigotas quanto em amastigotas dos diferentes isolados. A proteína TSA foi expressa em maior quantidade nas formas promastigotas em fase estacionária e em amastigotas dos isolados oriundos de pacientes com lesão mucosa, sendo que essa diferença também foi observada na análise citométrica.
Conclusão: Os resultados sugerem uma associação da proteína META2, que está relacionada com a virulência do parasito, com a geração de lesões mais graves nas mucosas, visto que a maior expressão da proteína foi em isolados de pacientes com lesão mucocutânea e de pacientes que o tratamento não foi eficaz. A TSA, que está associada à antigenicidade e também virulência do parasito foi mais expressa em isolados oriundos de pacientes com lesão mucosa. A hipótese é que, a proteína TSA apesar de induzir uma resposta imune protetora, estaria conferindo proteção da leishmânia após a entrada no fagolisossomo por ser uma proteína antioxidante. Esta proteção favorecia a persistência dos parasitos e mais tarde a geração de lesões na mucosa.
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Correlação do perfil das células dendríticas com a resposta imune celular T CD4+ e T CD8+ na infecção experimental do camundongo BALB/c por Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis / Correlation to the profile of dendritic cells and CD4+ and CD8+ T cellular immune response in experimental infection of BALB/c mice by Leishmania (Leishmania) amazonensis and Leishmania (Viannia) braziliensisAna Kely de Carvalho 30 November 2012 (has links)
L. (L.) amazonensis (La) e L. (V.) braziliensis (Lb) podem causar um espectro de manifestações clínicas e imunopatológicas no homem, sendo La responsável pela forma anérgica difusa e Lb pela forma mucocutânea da doença, formas polares e de elevada gravidade. Neste sentido, o objetivo do presente estudo foi avaliar os aspectos da resposta imune celular no ponto de inoculação e no linfonodo de drenagem de camundongos BALB/c inoculados no coxim plantar com 106 promastigotas de La e Lb. A evolução da lesão foi avaliada semanalmente sendo que na 4ª e 8ª semana PI biópsias do ponto de inoculação foram coletadas para determinação da densidade de células dendríticas (CD207+ e CD11c+), linfócitos T CD4+ e CD8+ e células iNOS+ por imunoistoquímica, e o linfonodo de drenagem para caracterização de subpopulações de células dendríticas e de linfócitos T CD4 e CD8 por citometria de fluxo. Células de linfonodo de drenagem foram cultivadas, com estímulo homólogo, para quantificação de citocinas (IL-4, IL- 10 e IFN-g) e nitrito nos sobrenadantes. A infecção por La levou à progressão da doença, com aumento do tamanho da lesão e da carga parasitária tanto na pele quanto no linfonodo de drenagem, enquanto que a infecção por Lb mostrou um discreto aumento da lesão entre a 6ª e 7ª semana PI com posterior regressão e redução da carga parasitária na pele e no linfonodo de drenagem. Aumento do número de células dendríticas dérmicas e de Langerhans foi observado na pele de camundongos inoculados com La na 4ª semana PI, juntamente com o aumento no número de células de Langerhans nos linfonodos de drenagem. Resposta imune celular preferencial de células T CD4+ foi observada tanto na pele quanto no linfonodo de camundongos inoculados com La, que mostrou ser predominantemente do tipo Th2 com a produção aumentada de IL-10 e IL-4. Já a infecção por Lb levou ao aumento na expressão de células dendríticas dérmicas e Langerhans na pele dos animais inoculados com Lb somente na 8ª semana PI, assim como aumento do número de células dendríticas dérmicas no linfonodo. A resposta imune celular foi caracterizada por células T CD4+ e CD8+ em pele e linfonodo dos animais infectados com Lb, vinculada a um perfil Th1 com a produção preferencial de IFN-g e altos níveis de NO. Aumento no número de células T regulatórias foi observado na infecção por Lb, que mostrou correlação direta com o número de linfócitos T CD4+ produtores de IL-10. Assim, a infecção por La foi relacionada à suscetibilidade, enquanto que a infecção por Lb foi relacionada à resistência do hospedeiro vertebrado. Estes resultados evidenciam não só o papel do parasita na modulação da resposta imune do hospedeiro como também das células dendríticas à infecção por Leishmania / L. (L.) amazonensis (La) and L. (V.) braziliensis (Lb) are responsible for a spectrum of clinical and immunopathological manifestations in humans, La is able to cause anergic diffuse leishmaniasis and Lb mucocutaneous leishmaniasis, polar forms with high severity. In this way, the aim of the present study was to evaluate aspects of the cellular immune response in the site of infection and in the draining lymph node of BALB/c mice inoculated in the hind footpad with 106 promastigotes of La and Lb. The evolution of the lesion size was evaluated weekly and in the 4th and 8th week PI biopsies from the site of infection were collected to determine the density of dendritic cells (CD207+ and CD11c+), CD4+ and CD8+ T cells and iNOS+ cells by immunohistochemistry, and the draining lymph node to characterize subsets of dendritic cells and CD4+ and CD8+ T cells by flow citometry. The draining lymph nodes cells were cultured with specific antigen to determine the cytokines (IL-4, IL-10 e IFN-g), and the nitric oxide in the supernatants. The infection caused by La led to the progression of disease with increase on lesion size and parasite load in the skin and draining lymph node, while Lb infection showed a discrete increase on the lesion size between 6th and 7th week PI with late regression and reduction in the skin as well as lymph node parasite load. An increase on the number of dermal dendritic and Langerhans cells were observed in the skin of BALB/c mice infected with La at 4th week PI together with an increase of Langerhans cells in the draining lymph node. The preferential CD4+ T cell immune response was observed in skin and lymph node of mice infected with La, which showed to be rather Th2 with an increase on the levels of IL-4 and IL-10. However, Lb infection led an increase of dermal dendritic cells and Langerhans cells in the skin only at 8th week PI, as well as an increase in the dermal dendritic cells in lymph node. The cellular immune response were characterized by CD4+ and CD8+ T cells in the skin and draining lymph node of mice infected with Lb, which was related to a Th1 immune response with production of high levels of IFN-g and nitric oxide. An increase of Regulatory T cells was observed in Lb infection, which showed the positive correlation with the IL-10 producing CD4+ T cells. So, the La infection was related to the susceptibility, while Lb infection was related to the resistance in the vertebrate host. These results emphasize the role of the parasite in the modulation of the host immune response to Leishmania infection
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Expressão de Foxp3, IL-17 e IL-23 na Leishmaniose Tegumentar Americana causada por Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) braziliensis / Expression of Foxp3, IL-17 and IL-23 in American cutaneous leishmaniasis due Leishmania (Leishmania) amazonensis and Leishmania (Viannia) braziliensisJoyce Prieto Bezerra de Menezes 13 September 2013 (has links)
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) apresenta um amplo espectro de manifestações clínicas e imunopatológicas resultante da interação entre as diferentes espécies de Leishmania e os mecanismos de resposta imune do hospedeiro. Leishmania (Viannia) braziliensis e Leishmania (Leishmania) amazonensis são as espécies de maior potencial patogênico para o homem e de importância médica no Brasil. As células TCD4, quando ativadas por antígenos via MHC II podem se diferenciar em linhagens de células efetoras como Th1, Th2, Th17 e células T reguladoras (Treg). IL-23 é indispensável para as funções efetoras e manutenção de células Th17. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão de Foxp3, IL-17 e IL-23 em lesões cutâneas de pacientes com diferentes formas clínicas da LTA. Biópsias parafinadas de 44 pacientes foram submetidas à imunoistoquímica, sendo 6 casos de leishmaniose cutânea anérgica difusa (LCADIDRM-) e leishmaniose cutânea disseminada borderline (LCDBIDRM-), ambas causadas por L.(L) amazonensis e 16 casos de leishmaniose cutânea localizada (LCLIDRM+) também causada por L.(L.) amazonensis; 9 casos de LCLIDRM+, 2 casos de LCDBIDRM- e 5 casos de leishmaniose cutâneo-mucosa (LCMIDRM+), todos causados por L.(V.) braziliensis. A densidade de células Tregs Foxp3+ no espectro clínico da LTA mostrou um aumento progressivo partindo das formas centrais LCL causadas por L.(V.) braziliensis (170mm2) e L.(L) amazonensis (140mm2) para as formas polares, LCADIDRM- (289mm2) e LCDBIDRM- (183mm2) causada por L.(L) amazonensis, LCDBIDRM- (189mm2) e LCMIDRM+, causadas por L.(V.) braziliensis (158mm2). A comparação entre as densidades de células IL-17+ nas diferentes formas clínicas da LTA mostrou um perfil semelhante também com um aumento progressivo da expressão de IL-17 partindo das formas centrais LCLIDRM+ causadas por L.(V.) braziliensis (232mm2) e L.(L) amazonensis (197mm2) em direção as formas polares, LCADIDRM- (470mm2) e LCDBIDRM- (340mm2) causada por L.(L.) amazonensis, LCDBIDRM- (431mm2) e LCMIDRM+ (372mm2) causada por L.(V.) braziliensis. A densidade de células IL-23+ mostrou perfil similar ao de IL-17 como no espectro de doença causada por L. (V.) braziliensis ou L. (L.) amazonensis: LCADIDRM- (687mm2), LCDBIDRM- (518mm2) e LCLIDRM+ (348mm2) por L.(L.) amazonensis, LCLIDRM+ (457mm2), LCDBIDRM- (609mm2) e LCMIDRM+ (568mm2) L. (V.) braziliensis. Diante dos nossos achados, observa-se que as células Foxp3+, IL-17+ e IL-23+ desempenham um papel importante na imunopatogênese das diferentes formas clínicas da LTA causadas por L. (V.) braziliensis ou L. (L.) amazonensis, caracterizada por uma resposta imune polarizada de diferente expressão patológica / The American cutaneous leishmaniasis (ACL) presents a wide spectrum of clinical and immunopathological manifestations resulting from the interaction between the different species of Leishmania and the mechanisms of the host immune response. Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Leishmania) amazonensis are the species with the largest pathogenic potential for humans and medical importance in Brazil. The CD4+ T cells can be differentiated into effector cell lines as Th1, Th2, Th17 and regulatory T cells (Treg). IL-23 is essential for effector functions and maintenance of Th17 cells, that produces IL-17. The aim of this study was to evaluate the expression of Foxp3, IL-17 and IL-23 in cutaneous lesions of patients with different clinical forms of ACL. Paraffin embedded biopsies from 44 patients were submitted to immunohistochemistry, there were 6 cases of anergic diffuse cutaneous leishmaniasis (ADCLDTH-) and borderline disseminated cutaneous leishmaniasis (BDCLDTH-) both caused by L. (L.) amazonensis 16 cases of cutaneous leishmaniasis (LCLDTH+) caused by L. (L.) amazonensis, 9 cases of LCLDTH+, 2 cases of BDCLDTH- and 5 cases of mucocutaneous leishmaniasis (MCLDTH+) all caused by L. (V.) braziliensis. The density of Treg Foxp3+ cells in the clinical spectrum of ACL showed a progressive increase starting from the central forms LCLDTH+ caused by L. (V.) braziliensis (170mm2) and L. (L) amazonensis (140mm2) towards the polar forms ADCLDTH- (289mm2). The intermediate clinical forms BDCLDTH- (183mm2) caused by L. (L) amazonensis and BDCLDTH-(189mm2) by L. (V.) braziliensis as well as, MCLDTH+(158mm2) did not present any significant differences. The comparison between the densities of IL-17+ cells in different clinical forms of ACL showed progressive increasing starting from the central forms LCLDTH+ caused by L. (V.) braziliensis (232mm2) and L. (L) amazonensis (197mm2) towards the polar forms, ADCLDTH-(470mm2) and BDCLDTH-(340mm2) caused by L. (L.) amazonensis BDCLDTH- (431mm2) and MCLDTH+ (372mm2) caused by L. (V.) braziliensis. The density of IL-23+ cells showed a similar profile to that of IL-17 at the disease spectrum caused by L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis: ADCLDTH-(687mm2) BDCLDTH-(518mm2) and LCLDTH+ (348mm2) by L. (L.) amazonensis; LCLDTH+ (457mm2) LCDBDTH-(609mm2) and MCLDTH+ (568mm2) L. (V.) braziliensis. In view of our findings, we notice that the Foxp3+, IL-17+ and IL-23+ cells play an important role in the immunopathogenesis of different clinical forms of ACL caused by L. (V.) braziliensis and L. (L.) amazonensis, characterized by an immune polarized response with different pathological expression
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Diagnóstico molecular de Leishmaniose Tegumentar Americana: identificação de espécies de Leishmania por SSUrDNA PCR e G6PD PCR / Molecular diagnosis of American Cutaneous Leishmaniasis: identification of Leishmania species by SSUrDNA PCR and G6PD PCRAna Carolina Stocco de Lima 17 August 2010 (has links)
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) representa um sério problema de saúde pública. No Brasil muitas espécies são reconhecidas como patogênicas para o homem, portanto o diagnóstico diferencial é necessário para compreender o perfil epimemiológico da LTA em áreas endêmicas. Com o objetivo de identificar espécies de Leishmania utilizando ferramentas moleculares, cinquenta e três biópsias de pele de pacientes com LTA, fixadas em formalina e incluídas em parafina dos Estados do Pará (N=33) e Maranhão (20) foram submetidos a diferentes protocolos da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) para a identificação dos agentes causadores. Biopsias foram desparafinizadas e o DNA foi extraído usando o protocolo de fenol-clorofórmio, quantificado e submetido a reações de PCR, com base na sequência de nucleotídeos codificadora do RNA que compõe a subunidade menor do ribossomo (SSUrDNA) e da enzima Glicose 6-Fosfato Desidrogenase (G6PD). O alvo G6PD foi utilizado tanto em reações de PCR convencional (cPCR), como de PCR quantitativo (qPCR). As reações de cPCR e Nested PCR SSUrDNA apresentaram resultado positivo para o gênero Leishmania em 40 (83,3%) das amostras submetidas. Vinte e sete desses produtos de PCR foram sequenciados, sendo 17 identificados como L.(L.) amazonensis e 10 como L.(Viannia) sp. A cPCR G6PD identificou 9 amostras como L.(V.) braziliensis , sendo 7 do Maranhão (36%) e 2 do Pará (6%). O DNA de L.(Viannia) sp. foi quantificado em quatro amostras do Maranhão através da reação de qPCR G6PD, mesmo esse alvo sendo de cópia única. Esses resultados indicam que sequências especificas de Leishmania sp. presentes em múltiplas cópias devem ser escolhidas para a aplicação de cPCR em DNA provindo de amostras parafinadas,uma vez que é freqüente casos de LTA com baixo parasitismo e consequentemente, pequenas concentrações de DNA. E ainda a cPCR SSUrDNA pode ser um bom alvo para estudos diagnósticos e epidemiológicos.A qPCR G6PD permitiu a detecção, identificação e quantificação de L. (Viannia) sp. em uma única etapa de amplificação em quatro amostras que presentaram resultados positivos somente na Nested ou Semi-Nested PCR, demonstrando uma maior sensibilidade oferecida pela q PCR / American Cutaneous Leishmaniasis (ACL) presents a serious problem of public healthy. In Brazil many species are recognized as pathogenic to humans, therefore differential diagnostic is necessary to understand the epidemiological profile of ACL in endemic areas. Fifty-three paraffinembedded skin biopsies of ACL patients from Pará (N=33) and Maranhão (20) States, were submitted to different protocols of polymerase chain reaction (PCR) for identification of their causative agents. Biopsies were deparaffinized and DNA were extracted using phenol-chloroform, quantified and submitted to PCR reaction, using small subunit coding sequence (SSUrDNA) and enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD). The target of G6PD was used both in conventional PCR reactions (cPCR) and quantitative PCR (qPCR). The reactions of cPCR and Nested PCR SSUrDNA showed positive result for the genus Leishmania in 40 (83.3%) of the samples. Twenty-seven positive samples were submitted to sequencing and 10 were identified as L. (Viannia) sp. and 17 as L. (L.) amazonensis. The G6PD PCR identified 9 samples as L. (V.) braziliensis, 2 from Pará (6%) and 7 from Maranhão (35%).Four samples were quantified in G6PD qPCR, even this is a single copy. These results indicate that specific sequences from Leishmania sp. present in multiple copies should be chosen in relation to those from unique copies in paraffin-embedded tissues, once is frequent cases of ACL with low parasitism, consequently small DNA concentrations and that SSUrDNA can be a good target to diagnostic and epidemiologic studies of ACL. The qPCR allowed the detection and identification of L. (Viannia) sp. in a single round of amplification in four samples that when showed positive results only in the Nested or Semi Nested cPCR suggesting a higher sensitivity offered by qPCR
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NTPDase 1 de Leishmania braziliensis como um alvo terapêutico: imunolocalização em formas promastigotas e amastigotas e susceptibilidade à LeishmanicidasPorcino, Gabriane Nascimento 18 March 2016 (has links)
Submitted by isabela.moljf@hotmail.com (isabela.moljf@hotmail.com) on 2017-08-16T15:52:26Z
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Previous issue date: 2016-03-18 / A atividade catalítica de nucleosídeo trifosfato difosfohidrolase (NTPDase) foi recentemente caracterizada em promastigotas de Leishmania (Viannia) braziliensis (Lb), e o domínio B (r82-121) antigênico e conservado, específico da NTPDase 1 foi identificado. Neste trabalho, anticorpos policlonais de camundongos produzidos contra dois peptídeos sintéticos derivados deste domínio (LbB1LJ, r82-103; LbB2LJ, r102-121), e anticorpos produzidos contra os peptídeos potB1LJ e potB2LJ, de alta identidade com LbB1LJ e LbB2LJ respectivamente, foram usados como ferramentas de
estudo desta proteína. Os anticorpos anti-LbB1LJ ou anti-LbB2LJ, imobilizados em proteína A-Sepharose, imunoprecipitaram a NTPDase 1 de 48 kDa, e depletarem aproximadamente 40% da atividade fosfohidrolítica da preparação de Lb homogeneizada em detergente. Por imunocitoquímica e análise ultraestrutural, usando os anticorpos anti-LbB1LJ, anti-LbB2LJ ou anti-potB1LJ, a NTPDase 1 foi identificada na superfície, vesículas citoplasmáticas, mitocôndria, cinetoplasto, flagelo e bolsa
flagelar, e núcleo de promastigotas. Em adição, a NTPDase 1 foi isolada de fração mitocondrial de promastigotas por gel não desnaturante, e sua expressão e identidade foram confirmadas por medidas de atividade enzimática, “Western blots” e espectrometria de massas. As atividades ATPásica e ADPásica da preparação de Lb homogeneizada em detergente foram parcialmente inibidas por anticorpos anti-LbB1LJ ou anti-potB1LJ (43-79%), sendo mais efetivos que a inibição por anticorpos anti-LbB2LJ ou anti-potB2LJ (18-60%). Em adição, os soros imunes anti-LbB1LJ ou antipotB1LJ
(67-73%) e anti-LbB2LJ ou anti-potB2LJ (33-40%) foram citotóxicos, reduzindo significativamente o crescimento de promastigotas in vitro. Em “Western blots” e por análises em microscópio confocal de varredura a laser, os anticorpos produzidos contra o domínio B confirmaram a expressão e identidade da NTPDase 1 em amastigotas intracelulares e, também, amastigotas livres recuperadas de células Vero. Em conjunto, os resultados apontam o domínio B conservado da NTPDase 1 de Leishmania (V.)
braziliensis como um importante alvo para o desenho de inibidores e a aplicação potencial dessas biomoléculas em protocolos experimentais de controle da leishmaniose. Os ácidos N-alquilaminoalcanotiossulfúricos (AAATs), os quais não têm efeito citotóxico in vitro ou in vivo, reduziram a proliferação in vitro de amastigotas intracelulares, sendo os mais efetivos o SIPA, SSEC e IBSS com CI50 de 24-35 μM. O NPSO, SXIP e TBSO foram menos efetivos com CI50 de 54 a >100 μM. Com exceção do TBSO, todos os outros AAATs inibiram parcialmente a atividade ATPásica e/ou
ADPásica da preparação de promastigotas. O SIPA foi também um efetivo leishmanicida quando testado sobre amastigotas recuperadas de células Vero, com CI50 20 μM e, em adição, foi capaz de reduzir as atividades ATPásica e ADPásica de homogeneizado destes parasitos sugerindo um Ki de 10-100 μM. Além disso, SIPA 30 μM reduziu significativamente 28% do potencial de membrana mitocondrial, podendo ser este um dos mecanismos pelo qual os AAATs são leishmanicidas. A NTPDase 1 pode ter um papel fundamental na atividade mitocondrial, uma nova hipótese a ser
explorada, e ser o alvo dos AAATs, os quais foram testados pela primeira vez em tripanosomatídeos e caracterizados neste trabalho como novos compostos leishmanicidas. / Nucleoside triphosphate diphosphohydrolase (NTPDase) activity was recently characterized in Leishmania (Viannia) braziliensis promastigotes (Lb), and an antigenic conserved B domain (r82-121) from the specific NTPDase 1 isoform was identified. In this work, mouse polyclonal antibodies produced against two synthetic peptides belonging to this domain (LbB1LJ, r82-103; LbB2LJ, r102-121), and antibodies produced against peptides potB1LJ and potB2LJ, with high identity to the LbB1LJ and
LbB2LJ respectively, were used as tools for studies of this protein. The anti-LbB1LJ or anti-LbB2LJ antibody, immobilized on Protein A-Sepharose, immunoprecipitated the NTPDase 1 of 48 kDa and depleted approximately 40% of the phosphohydrolytic activity from detergent-homogenized Lb preparation. By ultrastructural immunocytochemical microscopy, using anti-LbB1LJ, anti-LbB2LJ or anti-potB1LJ antibody, the NTPDase 1 was identified on the surface, subcellular cytoplasmic vesicles, mitochondria, kinetoplast, flagellum and flagellar pocket, and nucleus of promastigotes. In addition, the
NTPDase 1 was isolated from the promastigotes mitochondrial fraction by nondenaturing gel, and its expression and identity were confirmed by enzyme activity measurements, Western blots and mass spectrometry. The ATPase and ADPase activities of detergent-homogenized preparation were partially inhibited by anti-LbB1LJ or anti-potB1LJ antibody (43-79%), which was more effective than that inhibition by anti-LbB2LJ or anti-potB1LJ antibody (18-60%). In addition, the immune sera anti-LbB1LJ or anti-potB1LJ (67-73%) and anti-LbB2LJ or anti-potB2LJ (33-40%) were cytotoxic, and significantly reduce the promastigotes growth in vitro. By Western blots and confocal microscopy laser scanning analyses, the antibodies produced against B domain confirmed the expression and identity of the intracellular amastigotes NTPDase 1 and, also, in free amastigotes recovered from Vero cells. All taken together, the results appoint the conserved B domain from the L. (V.) braziliensis NTPDase 1 as an important target for inhibitor design and the potential application of these biomolecules in experimental protocols of disease control. The N-alkylaminoalkanethiosulfuric acids, which did not have in vitro or in vivo cytotoxic effect, reduced in vitro intracellular amastigotes proliferation, the most effective being the SIPA, SSEC and IBSS, with IC50 24-35 μM. The NPSO, SXIP and TBSO were less effective, with IC50 54 to >100 μM. TBSO exception, all the other AAATs partially inhibited the ATPase and/or ADPase
activity from the promastigotes preparation. The SIPA also was an effective antileishmanial when tested on the amastigotes recovered from the Vero cells, with IC50 20 μM and, in addition, it was capable to reduce the ATPase and ADPase activities from the homogenized of these parasites suggesting a Ki 10-100 μM. Furthermore, SIPA 30 μM significantly reduced 28% of the mitochondrial membrane potential, and it could be one of the mechanisms by which AAATs are antileishmanial compounds. The NTPDase
1 may play a key role in the mitochondrial activity, a new hypothesis to be explored, and target of AAATs, which were tested for the first time on the trypanosomatids and characterized in this work as new antileishmanial compounds.
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Leishmania braziliensis: reanota??o estrutura??o das informa??es em modelos de dados relacionaisTorres, Felipe Guimar?es 18 December 2015 (has links)
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Previous issue date: 2015-12-18 / Funda??o de Amparo ? Pesquisa do Estado da Bahia - FAPEB / Cutaneous leishmaniasis affects 12 million people around the world. The main etiological agent in Brazil is Leishmania braziliensis. Its annotation is not very well characterized and have inaccurate regions because of the large number of hypothetical and putative genes. To solve this problem, we annotated the Leishmania braziliensis genome (MHOM / BR / 75 / M2904) with new algorithm and curated database by similarity. Initially, we downloaded these sequences of Leishmania braziliensis from NCBI and used GENSCAN and GLIMMER algorithms. We compared the predicted genes with SWISSPROT protein database. The comparison process was made by BLASTx and SWISS-PROT. We also used StructRNAFinder to predict the non-coding RNA, ncrna. We identified 25,539 ORF's, 4,916 genes, 735 ncRNA and 863 proteins. 94.75\% of predicted genes from Leishmania braziliensis were present on Leishmania panamensis genome (MHOM/PA/94/PSC-1). The comparison of ncrna number and proteins highlights a relation between chromosome and ncrna. All genes found were mapped and aligned to the Leishmania braziliensis genome and stored in a relational database model built in PHP 5.0 and MySQL. All data resulting of analyses in this work is available at www.leishdb.com. / A leishmaniose cut?nea afeta cerca 12 milh?es de pessoas ao redor do mundo. O principal agente etiol?gico dessa patologia no Brasil ? a Leishmania braziliensis. A anota??o dela n?o est? bem caracterizada e possui regi?es sem uma grande certeza devido ao grande n?mero de genes hipot?ticos e putativos. Para resolver esse problema,n?s reanotamos o genoma da Leishmania braziliensis (MHOM/BR/75/M2904) com novas vers?es de algoritmos e uma base de dados curada. Inicialmente, n?s baixamos e predizemos os genes com uma base de prote?nas. A compara??o foi feita porBLASTx e o banco de dados SWISS-PROT. Tamb?m utilizamos o preditor StructRNA Finder para predi??o de RNA?s n?o codificantes. Como resultado desse trabalho identificamos 25539 ORF?s, 4916 genes, 735 ncRNA e 863 prote?nas. Cerca de 94.75% genes preditos tamb?m estavam presentes em anota??o da Leishmania panamensis (MHOM/PA/94/PSC-1). Comparando o n?mero de rna n?o codificante e prote?nas foi evidenciado a presen?a de rela??es entre cromossomos e ncrna. Todos os genes encontrados foram mapeados no genoma da Leishmania braziliensis e armazenados em um modelo de banco de dados relacional constru?do em MySQL e PHP 5.0. Todos os dados resultantes desse trabalho est?o dispon?veis.
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