The dopaminergic neurodegeneration in the substantia nigra pars compacta (SNpc) is responsible for the marked motor impairment observed in Parkinson's disease (PD). However, the molecular mechanisms underlying this are not completely understood. Since by the time of diagnosis, 50-70% of the dopaminergic neurons of the nigrostriatal pathway have already been degenerated, it is difficult to investigate the early-stage events of disease pathogenesis. Due to inaccessibility of the human brain to study initial pathogenic mechanisms of the disease, experimental models have been developed in an attempt to elucidate PD etiology and its progression. Nevertheless, PD models are a controversial issue in neuroscience research since it is challenging to mimic human neuronal complexity. Therefore, the lack of optimal models that recreate disease pathology is one of the causes of failure of clinical trials that have attempted to find new/better PD therapies. Taking this in consideration, the development of more suitable models is necessary to improve our knowledge regarding PD etiological mechanisms. Additionally, the understanding of the advantages and disadvantages of models already established would also be beneficial for PD research, which our group addressed by reviewing this subject. Considering this, we chose SH-SY5Y cells as a PD model for our studies. To investigate the initial stages of PD-induced neurodegeneration, our work focused in the role of cofilin-1, a protein involved in mitochondrial dysfunction caused by oxidant-induced-apoptosis, which are two pathogenic processes strongly related to PD. Hence, in the thesis, we aimed to validate the use of retinoic-acid-(RA)-differentiated SH-SY5Y cells as an in vitro model and use it to investigate the potential role of cofilin-1 in the initial molecular and cellular mechanisms of PD. Although SH-SY5Y cells are widely used in PD research, their major drawback is their lack of important neuronal features, such as low levels of proliferation and stellate morphology. On the other hand, SH-SY5Y cells can acquire a neuronal phenotype when treated with differentiation agents such as RA. Since several protocols have been described, the consequence of which may be the discrepancies observed among studies regarding neuronal and dopaminergic features. In Chapter I, we aimed to validate a RA-differentiation protocol for SH-SY5Y cells previously established by our research group, focusing upon characterization of neuronal features and its subsequent response to 6-hydroxydopamine (6-OHDA), a toxin widely used to induce dopaminergic degeneration. RA-differentiated SH-SY5Y cells have low proliferative rates, a pronounced neuronal morphology and high expression of genes related to synapse vesicle cycle, dopamine synthesis/degradation, and dopamine transporter (DAT). After exploring phenotypic differences between these two models, we verified that RA-differentiated cells were more sensitive to 6-OHDA toxicity than undifferentiated cells, which could be related to an increase of DAT immunocontent. Many lines of evidence have showed that DAT is responsible for 6-OHDA uptake in vivo. Once inside the neuron, 6-OHDA underwent auto-oxidation causing a significant increase in oxidative stress. However, toxin uptake is not an essential step in undifferentiated SH-SY5Y cells, as auto-oxidation occurs extracellularly. We showed here, for the first time, that RA-differentiated SH-SY5Y cells can mimic, at least in part, an important mechanism of the 6-OHDA-induced cell death found in previous in vivo studies. Hence, the cellular model established by our research group presents essential neuronal features, being a suitable model for PD research. In Chapter II, RA-differentiated SH-SY5Y cells were used as cellular model to investigate disease molecular mechanisms, focusing upon cofilin-1. Our previous data have shown that oxidation of non-phosphorylate (activated) cofilin-1 leads to mitochondrial dysfunction and cell death induced by apoptosis in tumour cells. Here we found that cofilin-1 played a role in early stages of neuronal apoptosis induced by 6-OHDA in our cellular model since cofilin-1 mitochondrial translocation precedes organelle dysfunction. Overexpression of wild type CFL1 resulted in increased sensitivity of SH-SY5Y cells to 6-OHDA-induced neuronal cell death. Furthermore, overexpression of non-oxidizable CFL1 containing Cys-to-Ala mutations (positions 39, 80 and 139) increased neuronal resistance to this toxin, suggesting that oxidation is an important step in 6-OHDA toxicity. Follow-up experiments were performed in order to evaluate clinically whether cofilin-1 pathway proteins content is altered in PD post mortem human brain. Our findings showed a significant decrease in p-cofilin-1/cofilin-1 ratio in PD patients, which indicates an increase in the amount of activated cofilin-1 available for oxidation. Moreover, through principal component analysis, the immunodetection of cofilin-1 pathway proteins were able to discriminate controls and PD individuals during the early-stage of neuropathological changings. Hence, we demonstrated, for the first time, a possible role for cofilin-1 in PD pathogenesis and its potential use as biomarker. Taken together, our data showed that RA-differentiated SH-SY5Y cells present terminally-differentiated dopaminergic neuron features, that are essential to mimic dopaminergic neurons. By using this cellular model and post mortem brain tissue, we also demonstrated a possible role for cofilin-1 in early steps of the neurodegeneration process found in PD, which it could impact drug and biomarker discovery researches.

A Doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum. Atinge 3,3% das pessoas com mais de 64 anos. Com o envelhecimento populacional, sua prevalência deve dobrar. A doença classicamente se caracteriza por degeneração dos neurônios da substantia nigra, afetando principalmente a transmissão dopaminérgica. O tratamento mais eficaz na DP continua sendo a levodopa, um precursor dopaminérgico com excelente resposta motora. Entretanto, à medida que a doença progride, aparece uma série de complicações motoras e não motoras que limitam o tratamento. Para facilitar o reconhecimento destas complicações, foram criados questionários que aumentam a possibilidade de diagnóstico, abordando aspectos motores e não motores. O principal deles é um questionário de 19 itens. Ele consiste em 19 manifestações que o paciente deve assinalar, caso tenha determinado sintoma, e se ele melhora com a próxima dose da medicação. Quando existem pelo menos duas respostas positivas, o questionário tem ótima sensibilidade e especificidade. A Doença de Parkinson tem evolução heterogênea, sendo que uma das causas atribuídas para tal é genética. Tem se estudado muitos genes da rota de dopamina por sua relação íntima com a fisiopatologia e tratamento da doença. O transportador de dopamina (DAT), que realiza a retirada da dopamina da fenda sináptica, desempenha papel fundamental nesta rota. Existe um polimorfismo VNTR com cópias de uma unidade de repetição variando de 3 a 11 com as repetições 9 e 10 sendo os alelos mais comuns. Diversos estudos correlacionaram esse polimorfismo com transtorno do déficit de atenção e hiperatividade quando há 10 repetições e com a Doença de Parkinson quando há 9 repetições. Seria um candidato ideal para avaliação com relação às complicações do tratamento e progressão. Assim, avaliamos pacientes com Doença de Parkinson longitudinalmente para comparar a progressão da doença com polimorfismo do DAT e verificar as complicações associadas ao tratamento. Inicialmente, realizamos uma revisão sistemática das propriedades clinimétricas dos questionários de wearing off. Esta revisão mostrou que o questionário de 9 itens tem sensibilidade de 0,87-1 e especificidade de 0,1-0,69. Já o questionário de 19 itens tem sensibilidade de 0,81-0,9 e especificidade de 0,63-0,8 com ponto de corte igual a 2 itens positivos. Realizamos a validação deste último para português, com boa estabilidade no teste-reteste com correlação intraclasse de 0,87 (IC 95% 0,69-0,95 p < 0,01) e sensibilidade de 0,97 (IC 95% 0,94-1 p < 0,01) e especificidade de 0,71 (IC 95% 0,56-0,85 p < 0,01). Para progressão, foi demonstrada uma associação de sexo feminino e a presença de alelo com 9 repetições como fatores de risco para progressão mais rápida. A progressão em homens medida pelo UPDRS 3 era menor em 1,277 (IC 95% 2,18-0,38 p < 0,01) e pelo UPDRS total era menor em 1,50 (IC 95% 2,92-0,11 p = 0,031). Com presença de alelo com 9 repetições, a progressão do UPDRS 3 era menor em 1,92 (ICC 95% 0,04-1,01 p = 0,0317), e presente mesmo controlando para sexo. Não houve diferença na escala de discinesias ou questionário wearing off. Assim, os resultados obtidos mostraram que o questionário de 19 itens é uma boa ferramenta diagnóstica, sendo validado para português. Além disso, o polimorfismo DAT está associado à progressão mais rápida da DP com 9 repetições. / Parkinson’s disease (PD) is the second most common neurodegenerative disease. It affects 3.3% of people over 64 years. With population aging, its prevalence should double. The disease is classically characterized by degeneration of substantia nigra neurons, mainly affecting dopaminergic transmission. The most effective treatment for PD continues to be levodopa, a dopaminergic precursor with excellent motor response. However, as the disease progresses, there is a number of motor and non-motor complications that limits the treatment. To facilitate the recognition of these complications, questionnaires were created to increase the possibility of diagnosis, addressing motor and non-motor aspects. The main one is a questionnaire of 19 items. It consists of 19 symptoms that the patients should indicate, if they feel particular symptom, and if they get better with the next dose of medication. When there are at least two positive responses, the questionnaire has optimal sensitivity and specificity. Parkinson’s disease has a heterogeneous evolution, and one of the reasons attributed for that is genetic. Many genes of the dopamine route have been studied for their intimate relationship with the pathophysiology and treatment of the disease. The dopamine transporter, with synaptic cleft reuptake, plays a key role in this route. It has a VNTR polymorphism with copies of a repeating unit ranging from 3 to 11 with repetitions 9 and 10 being the most common alleles. Several studies correlated this polymorphism with Attention Deficit Hyperactivity Disorder with 10 repetition allele and Parkinson’s disease with 9 repetition alleles. It would be an ideal candidate for evaluation regarding treatment complications and progression. Thus, we evaluated patients with Parkinson’s disease longitudinally to compare disease progression with DAT polymorphism and to verify treatment-related complications. Initially we performed a systematic review of the clinimetric properties of the wearing off questionnaires. That showed that the questionnaire of 9 items has sensitivity of 0.87-1 and specificity of 01-0.69. The questionnaire of 19 items has a sensitivity of 0.81-0.9 and a specificity of 0.63-0.8 with a cut-off point of 2 items. We performed the validation of the latter for Portuguese, with good stability in the testretest with intraclass correlation of 0.87 (95% CI 0.69-0.95 p < 0.01) and sensitivity of 0.97 (CI 95% 0.94-1 p < 0.01) and specificity of 0.71 (95% CI 0.56-0.85 p < 0.01). We demonstrated a female association and presence of 9 DAT allele repetition as risk factors for faster progression. The progression in men ofwith UPDRS 3 was lower in 1.277 (95% CI 2.18-0.38 p < 0.01) and total UPDRS was lower in 1.50 (95% CI 2.92-0.11 p = 0.031). With the presence of allele with 9 repetitions the progression of UPDRS 3 was lower in 1.92 (ICC 95% 0.04-1.01 p = 0.0317), and present even correcting sex. There was no difference in the dyskinesia scale or wearing off questionnaire. Thus, the results obtained showed wearing off questionnaire is a good tool for clinical and research, and it is validated to Portuguese. Also, DAT polymorphism is associated with faster PD progression with 9 repetition allele.

INTRODUÇÃO: A Estimulação cerebral profunda (ECP) do núcleo subtalâmico (NST) é uma técnica neurocirúrgica utilizada para tratamento de indivíduos com Doença de Parkinson (DP) idiopática quando a terapia farmacológica não atinge mais a sua finalidade. Entretanto, a ECP provoca deterioração nos sintomas fonoarticulatórios e fluência verbal. Durante as testagens vocais estudos mostram grande variação do intervalo entre a desativação da ECP e o início das tarefas vocais sendo inconclusivo seu efeito. Este estudo teve o objetivo de verificar as modificações acústicas da voz, fala, fluência verbal fonológica e motoras durante a ECP do NST ligado e desligado em pacientes com DP. MÉTODOS: Foram avaliados 16 pacientes com DP submetidos ao implante de ECP do NST, em tratamento estabilizado e sob efeito da medicação antiparkinsoniana. As avaliações acústicas da voz e da fluência verbal fonológica foram realizadas no início e 5, 15, 30, 45 e 60 minutos após o ECP ser desligado. Após religar o neuroestimulador estas avaliações foram repetidas aos 5 e 15 minutos. Já as avaliações motora global através do UPDRS III e perceptiva da fala (item 18 da UPDRS III) foram realizadas no início e 5, 30 e 60 minutos após o ECP ser desligado, após religar o neuroestimulador estas avaliações foram repetidas aos 5 minutos. RESULTADOS: Um padrão sequencial de retorno dos sinais parkinsonianos foi observado, com agravamento do tremor e da bradicinesia logo nos primeiros 5 minutos após o ECP desligado, já a rigidez retornou de forma significativa após 30 minutos do aparelho desligado. Os sintomas se estabeleceram quando o ECP foi religado. A fala apresentou melhora significativa após 5 minutos do ECP desligado, apresentando escores semelhantes ao baseline após o aparelho ser religado. O parâmetro acústico Shimmer apresentou melhora significativa nos momentos 30, 45 e 60 minutos após o ECP desligado e também aos 5 minutos após religar o ECP, a proporção ruído-harmônico apresentou piora significativa nos momentos 15, 30, 45 e 60 minutos após o ECP desligado. Os demais parâmetros não apresentaram alteração significativa. Os resultados da fluência verbal não apresentou alteração significativa em nenhum dos momentos testados. CONCLUSÃO: A descontinuação da ECP do NST acarreta um agravamento dos sintomas motores, sendo o tremor o primeiro sintoma a reaparecer seguido da bradicinesia e rigidez. Em contrapartida, pacientes submetidos a este procedimento sofrem de alterações da fala e voz que pioram com estimulador ligado. / INTRODUCTION: Deep brain stimulation (DBS) of subthalamic nucleus (STN) is a technique used for neurosurgical treatment of patients with Parkinson's disease (PD) idiopathic when drug therapy does not achieve its purpose more. However, DBS causes deterioration symptoms phonoarticulatory and verbal fluency. During testing vocal studies showed wide variation in the interval between the deactivation of the DBS and the beginning of the tasks being inconclusive vocal effect. This study aimed to check the voice acoustic, speech, phonologic verbal fluency and motor changes during the on and off states of the subthalamic nucleus (SNT) deep brain stimulation (DBS) in patients with Parkinson’s disease (PD). METHODS: Sixteen PD patients with a STN DBS and stable antiparkinsonian medication were evaluated. Voice acoustics and verbal fluency were assessed with DBS on and after 5, 15, 30, 45, 60 minutes after the device was turned off and after 5 and 15 minutes of DBS was on again. Motor assessment was done using the UPDRS III and speech perception with the DBS on and after 15, 30, 60 minutes of DBS off and 5 minutes after DBS on again. RESULTS: A sequence pattern was identified for the return of the parkinsonian signs. There is an aggravation of the tremor and bradykinesia after 5 minutes of DBS off while rigidity aggravates after 30 minutes. Speech showed a significant improvement after 5 minutes of DBS off. Symptoms approached baseline 5 minutes after the DBS was turned on. The Shimmer acoustic parameters showed significant improvement after 30 minutes of DBS off and after 5 minutes of DBS on, the noise-harmonic ratio showed significant worsening after 15 minutes of DBS off. The results of verbal fluency did not 13 change significantly in any of the times tested. CONCLUSION: Discontinuation of the DBS of the subthalamic nucleus carries a worsening of motor symptoms, the tremor being the first symptom to reappear followed by bradykinesia and rigidity. In contrast, patients undergoing this procedure suffer from speech and voice changes that worsen with stimulator is turned on.

Introdução: A articulação da fala é um dos aspectos fonoaudiológicos mais comprometidos na doença de Parkinson (DP). Pacientes com DP apresentam risco de manifestar apraxia não verbal e verbal. A apraxia não verbal ocorre quando há um déficit na habilidade de sequencialização dos movimentos voluntários não verbais da língua, lábios, mandíbula e outras estruturas orofaciais associadas, e a apraxia verbal é definida como um déficit na habilidade de sequencializar os controles motores necessários para o posicionamento correto dos articuladores durante a produção voluntária da fala. A prevalência com que apraxia da fala ocorre na DP não está bem estabelecida, sendo um distúrbio pouco explorado nesses pacientes. É um estudo inédito, até onde temos conhecimento, quanto à identificação dos erros práxicos verbais na DP. Objetivo: avaliar a prevalência da praxia não verbal e verbal em pacientes com doença de Parkinson, correlacionandoas com idade, escolaridade, tempo de doença e estadiamento da DP (Hoehn e Yahr), assim como correlacionar a apraxia não verbal com a apraxia verbal e identificar os erros práxicos verbais. Método: Estudo quantitativo, observacional, descritivo e de prevalência. Foram avaliados 45 pacientes acometidos pela DP, que realizaram seguimento clínico no ambulatório de Distúrbios do Movimento do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brasil, através da aplicação do Protocolo de Avaliação da Apraxia da Fala, e o estadiamento da DP foi controlado através da escala de Hoehn e Yahr (H&Y). Resultados: A prevalência de apraxia não verbal e verbal nos pacientes com DP foi de 24,4%. Não houve significância entre apraxia não verbal com idade, escolaridade, tempo de doença, estadiamento da DP (H&Y) e gênero. A correlação entre apraxia verbal e escolaridade foi significante (p≤0,05), mas não houve significância com idade, tempo de doença, estadiamento da DP (H&Y) e gênero. Os tipos de erros práxicos verbais mais frequentes foram as omissões (70,8%). Quanto ao ponto e modo articulatório os fonemas mais alterados foram os dentoalveolares (92%) e os vibrantes (57,7%), consecutivamente. Conclusão: Os pacientes com DP apresentaram apraxia não verbal e verbal com manifestação de muitos erros práxicos verbais, estando a apraxia verbal correlacionada com a escolaridade. / Introduction: The speech articulation is one of the aspects most impaired in Parkinson's disease (PD). Patients PD present risk of expressing nonverbal and verbal apraxia. The nonverbal apraxia occurs when there is a deficit in the sequencing ability of nonverbal voluntary movements of the tongue, lips, jaw and other associated orofacial structures, while the verbal apraxia is defined as a deficit in the ability of sequencing the necessary motor controls in order to place the articulators correctly during the voluntary speech production. The predominance with which apraxia of speech occurs in PD is not well established and rarely explored in these patients. As far as we know, it is an unprecedented study regarding the identification of verbal praxic errors in PD. Objective: To assess the prevalence of nonverbal and verbal apraxia in patients with Parkinson's disease, correlating them with age, education, duration of disease and PD stage (Hoehn e Yahr), as well as to correlate nonverbal with verbal apraxia and identify the verbal praxic errors. Method: Quantitative, observational, descriptive and prevalence study. Forty-five patients with PD were evaluated. They were submitted to the clinical follow-up in the Movement Disorders Clinic of the Cinical Hospital of Porto Alegre, Brazil, through the application of the Speech Apraxia Assessment Protocol. Additionally, the PD stage was controlled through the Hoehn and Yahr scale (H&Y). Results: The prevalence of nonverbal and verbal apraxia in patients with PD was 24.4%. There was no significance between the nonverbal apraxia with age, education, duration of disease, PD stage (H&Y), and genre. The correlation between verbal apraxia and education was significant (p ≤ 0.05), but there was no significance with age, duration of disease, PD stage (H&Y) and genre. Omissions were the most frequent kinds of verbal praxic errors with (70.8 percent). Regarding the place and mode of articulation, the most changed phonemes were the dentoalveolar (92%)and the vibrants (57.7%), consecutively. Conclusion: Patients with PD presented nonverbal and verbal apraxia with manifestation of many verbal praxic errors and verbal apraxia correlated with education levels.

Os mecanismos moleculares que levam ao dano da via nigroestriatal durante a progressão da Doença de Parkinson (DP) ainda não estão totalmente elucidados. Dessa forma, existe a necessidade de desenvolver modelos experimentais adequados para o estudo desse distúrbio neurodegenerativo. A linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y tratada com neurotoxinas indutoras deste distúrbio (ex.: 6-hidroxidopamina - 6-OHDA) é amplamente utilizada como modelo in vitro da DP. Muitos estudos mostram que esta linhagem pode ser diferenciada em células dopaminérgicas através da combinação da diminuição do soro fetal bovino (SFB) em meio de cultura e da adição de neurotrofinas como o ácido retinóico (AR). No entanto, há poucos estudos mostrando as diferenças entre células proliferativas e diferenciadas da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y, além do efeito do tratamento com 6-OHDA. Ainda, não há um consenso nos protocolos de diferenciação. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi estabelecer um protocolo de diferenciação dopaminérgica da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y, bem como avaliar a potencialidade do modelo como plataforma para o screening de neurotoxicidade/neuroproteção de compostos e a possibilidade de manipulação gênica. As células proliferativas SH-SY5Y foram mantidas em meio de cultura DMEM/F12 (1:1) suplementado com 10% de SFB. A diferenciação foi induzida pela combinação de 10 μM de AR e meio de cultura com 1% de SFB durante 4, 7 e 10 dias. Foram avaliados parâmetros morfológicos (presença de neuritos) e neuroquímicos, através marcadores de diferenciação neuronal (DAT- transportador de dopamina; TH – tirosina hidroxilase; ENS – enolase neurônio específica; NeuN – proteína nuclear de neurônio; Nestina). Ainda, avaliamos parâmetros de estresse oxidativo através da atividade de enzimas antioxidantes e dos níveis de tióis reduzidos. Nossos dados mostraram que as células SH-SY5Y diferenciadas por 7 dias apresentaram mudanças morfológicas e o aumento do imunoconteúdo de todos os marcadores neuronais testados, e a concomitantemente diminuição do imunoconteúdo de nestina (marcador de células indiferenciadas). Além disso, o fenótipo neuronal apresentou uma maior atividade de alguns sistemas antioxidantes. Também foi avaliada a citotoxicidade frente ao H2O2 e à 6-OHDA nos dois fenótipos. As células diferenciadas se mostraram mais resistentes ao dano causado pelo H2O2 e mais sensíveis à 6-OHDA. Dessa forma, a citotoxicidade da 6-OHDA pode estar relacionada com o aumento do imunoconteúdo do DAT, visto que a neurotoxina entra na célula dopaminérgica através deste transportador. Interessantemente, as células diferenciadas apresentaram aumento dos níveis da proteína neuroprotetora DJ-1, que está relacionada a uma forma prematura de Parkinsonismo em humanos. Após a caracterização do modelo, nós utilizamos o fenótipo diferenciado como plataforma experimental para o screening de compostos neuroprotetores como os organocalcogênios. Nós determinamos a citotoxidade destes compostos em células diferenciadas da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y. A partir destes dados, foram selecionados compostos com baixa citotoxicidade e avaliamos a morfologia celular (densidade de neuritos). Nós verificamos que antes da perda de viabilidade, ocorre a perda de neuritos, sendo que este parâmetro é outra vantagem do modelo de célula diferenciada para avaliação da neurototoxicidade. Ainda, verificamos que estes compostos são capazes de prevenir o dano celular causado pela 6-OHDA. Além disso, nós caracterizamos a capacidade do modelo de ser manipulado geneticamente através da transfecção e superexpressão de plasmídeo contendo a proteína verde fluorescente, onde verificamos que a expressão é mantida durante a diferenciação. Dessa forma, nossos dados mostraram a eficácia da padronização da diferenciação induzida por AR da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y, pois estas células apresentam características morfológicas e neuroquímicas adequadas de neurônio dopaminérgico bem como pode ser aplicado não só para avaliação de neurototoxicidade/neuroproteção, mas também pode ser manipulado geneticamente. / The molecular mechanisms underlying the massive cellular loss found in the nigrostriatal pathway during the progression of Parkinson’s disease (PD) are not completely understood. Therefore, it is important to develop more suitable experimental models to study the molecular mechanisms of this neurodegenerative disorder. Proliferative human neuroblastoma cell line SH-SY5Y challenged with neurotoxins (e.g.: 6-hydroxydopamine – 6-OHDA) has been widely used as an in vitro model for PD. Many lines of evidence showed that this cell line differentiates with the combination of lower fetal bovine serum (FBS) and retinoic acid (RA) to dopaminergic-like neural cell. However, there are few studies addressing the differences between proliferative and RA-differentiated SH-SY5Y cells as well as their responses to 6-OHDA cytotoxicity. Moreover, there is no consensus in differentiation protocols. Hence, the objective of this study was to establish a RAinduced dopaminergic differentiation protocol and also evaluate its capabilities for drug screening of neurotoxicity/neuroprotection and genetic manipulation. Exponentially growing SH-SY5Y cells were maintained with DMEM/F12 (1:1) medium plus 10% FBS. Differentiation was triggered by the combination of 10 μM of RA plus medium with 1% of FBS during 4, 7 and 10 days. We evaluated the cell morphology (neurites) and the neuronal markers (Dopamine Transporter- DAT, Tyrosine Hydroxylase-TH, Neuron-Specific Enolase-NSE, Neuronal Nuclei Protein- NeuN, and Nestin immunocontent). Furthermore, we verify the activity of antioxidant enzymes and the reduced thiol levels. Our data demonstrated that SH-SY5Y cells differentiated for 7 days expresses all neuronal markers tested with concomitant decrease in nondifferentiated marker (nestin). Besides, they showed a higher activity of some antioxidant systems. We also evaluated the cytotoxicity of H2O2 and 6-OHDA in both phenotypes. Differentiated cells are more resistant to H2O2 and more sensitive to 6- OHDA. Hence, the damage caused by 6-OHDA could be related with the increase of DAT immuncontent, because this neurotoxin enters into the dopaminergic cell through this transporter. Interestingly, the differentiated cells have more levels of neuroprotective DJ-1 protein, which is related with a juvenile Parkinsonism. After establish the conditions of differentiation, we used the neuronal phenotype to perform a drug screening with organoselenide compounds. We verify the cytotoxicity of these compounds in differentiated cells. From these data, we selected compounds with low toxicity and evaluated the cell morphology (neurites density). We verify that before the loss of viability, there is a loss of neurites. This parameter is another advantage of the differentiated cells model to neurotoxicity evaluation. Moreover, these compounds were able to prevent neuronal cell death caused by 6-OHDA. We also characterized the ability of the model to be manipulated genetically through transfection and overexpression of a green fluorescent protein (GFP) plasmid. We verify that the expression of GFP is maintained during the differentiation. Hence, our data showed the efficacy of the RA-induced differentiation protocol of the neuroblastoma cell line SH-SY5Y, because these cells have morphological and neurochemical characteristics of dopaminergic neurons. Furthermore, the neuronal phenotype can be applyed not only to evaluate neurocytotoxicity/neuroprotection but also can be manipulated genetically.

A doença de Parkinson (DP) apresenta declínio da capacidade respiratória. Estudo utilizando um modelo de DP induzido pela injeção de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) no estriado mostrou redução no número de neurônios envolvidos no controle da respiração. O objetivo desse estudo foi avaliar alterações gliais no núcleo retrotrapezóide (RTN), núcleo do trato solitário, complexo pré-Bötzinger e grupamento respiratório ventrolateral rostral (rVRG) utilizando o mesmo modelo experimental. Em ratos Wistar que receberam a injeção de 6-OHDA bilateralmente no estriado observou-se redução na imunorreatividade para proteína ácida fibrilar glial em astrócitos no rVRG a partir de 30 dias, no RTN a partir de 40 dias e nas demais regiões a partir de 60 dias. Ainda, observamos o aumento da proteína ligante de actina cruzada em microglias na região do RTN aos 30 e 40 dias. Nossos dados sugerem que a redução astrocitária contribui para as alterações respiratórias observadas neste modelo experimental e a presença de neuroinflamação no RTN pode contribuir para a perda celular nesta região. / Parkinson\'s disease (PD) has a decline in respiratory capacity. A study using a model of PD induced by the injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) in the striatum showed a reduction in the number of neurons involved in the control of breathing. The aim of this study was to evaluate glial changes in the retrotrapezoid nucleus (RTN), nucleus of the solitary tract, pre-Bötzinger complex and rostral ventral respiratory group (rVRG) using the same experimental model. Wistar rats that received bilateral 6-OHDA injection in the striatum present a reduction in immunoreactivity for glial fibrillary acidic protein in astrocytes in the rVRG from 30 days, in the RTN from 40 days and in the other regions from 60 days. We also observed an increase of the Ionized calcium binding adaptor molecule 1 in microglia in the region of the RTN at 30 and 40 days. Our data suggest that astrocytic reduction contributes to the respiratory changes observed in this experimental model and the presence of neuroinflammation in the RTN may contribute to the cellular loss in this region.

A Doença de Parkinson (DP) é um distúrbio neurodegenerativo, caracterizada em parte pela perda de neurônios dopaminérgicos da via nigroestriatal, originada na substância negra com projeções para o estriado, causando vários déficits motores. Atualmente, o tratamento mais utilizado é a administração de L-DOPA, um análogo da dopamina. Porém, essa droga apresenta eficácia limitada e induz diversos efeitos colaterais. A exploração dos efeitos neuroprotetores, proliferativos e neuroregenerativos da bradicinina (BK) em modelo animal de DP pode conduzir à substituição celular do tecido lesionado pela 6-hidroxidopamina (6-OHDA). De fato, a BK e seus receptores possuem um grande espectro de ações fisiológicas, estando classicamente envolvida no controle da homeostase cardiovascular e inflamação, além de exercer efeitos protetores em fisiopatologias do sistema nervoso, como em modelos de acidente vascular cerebral. Vários tipos celulares têm suas vias de sinalização associadas à ativação do receptor B2 de cininas (B2BKR). Trabalhos anteriores de nosso grupo mostraram que a BK está envolvida na diferenciação neural de células progenitoras neurais por um loop autócrino que resulta em ativação do B2BKR. Os resultados apresentados neste trabalho mostram a eficácia do tratamento com BK, um agonista de B2BKR, em animais submetidos à lesão da via nigro-estriatal induzida por 6-OHDA. Além disso, há uma recuperação comportamental e histológica desses animais quando tratados com Captopril®, um potencializador dos efeitos farmacológicos da BK, e com [Phe8&#936;(CH-NH)Arg9]-Bradicinina, agonista estável do receptor B2BKR. Assim, concluímos que a ativação de B2BKR pela BK desencadeiaum processo de neuroregeneração dopaminérgica de animais submetidos à lesão por 6-OHDA. Trabalhos recentes mostram que o receptor B2BKR desempenha um importante papel neuroprotetor em modelo animal da Doença de Alzheimer, o que corrobora nossos achados. Juntos, esses resultados contribuem para o estabelecimento da ação neuroprotetora e neurorregenerativa da BK no modelo de animal de neurodegeneração dopaminérgica, tornando-a uma excelente candidata para aplicação em terapias de reparo neuronal. / Parkinson\'s disease (PD) is a neurodegenerative disorder partially characterized by the loss of dopaminergic neurons from the nigrostriatal pathway, originated in the substantia nigra with projections to the striatum, which causes several motor deficits. Currently, the most commonly used drug for PD treatment is levodopa. However, it has limited efficacy and induces several side effects. Elucidation of the neuroprotective, proliferative and neuroregenerative effects of bradykinin (BK) in animal models of PD can culminate in cellular replacement of the tissue damaged by 6-hydroxydopamine (6-OHDA). In fact, BK and its receptor have several physiological effects, being classically involved in the control of cardiovascular homeostasis and inflammation. Besides, BK exerts protective effects on nervous system pathophysiology, as observed in stroke models. Several cell types have their signaling pathways associated with the B2 kinin receptor (B2BKR) activation. Previous work from our group showed that BK is involved in differentiation of neural progenitor cells by an autocrine loop that results in activation of B2BKR. The results presented in this thesis show the efficacy of treatment with BK, through B2BKR activation, in animals submitted to nigrostriatal pathway injury induced by 6-OH dopamine. Furthermore, behavioral and histological recoveries of these animals were observed when treated with Captopril®, a potentiator of BK pharmacological effects, and with [Phe8&#936; (CH-NH) Arg9] -BK, a stable agonist of the B2BKR receptor. Thus, we conclude that BK activation of B2BKR triggers neuroregenerative processes in animals submitted to 6- OHDA injury. Recent studies showed that the B2BKR receptor plays an important neuroprotective role in an animal model of Alzheimer\'s disease, which corroboratesour findings. Together, these results contribute to the establishment of the neuroprotective and neuroregenerative actions of BK - an excellent candidate for neural repair therapies.

Os mecanismos moleculares que levam ao dano da via nigroestriatal durante a progressão da Doença de Parkinson (DP) ainda não estão totalmente elucidados. Dessa forma, existe a necessidade de desenvolver modelos experimentais adequados para o estudo desse distúrbio neurodegenerativo. A linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y tratada com neurotoxinas indutoras deste distúrbio (ex.: 6-hidroxidopamina - 6-OHDA) é amplamente utilizada como modelo in vitro da DP. Muitos estudos mostram que esta linhagem pode ser diferenciada em células dopaminérgicas através da combinação da diminuição do soro fetal bovino (SFB) em meio de cultura e da adição de neurotrofinas como o ácido retinóico (AR). No entanto, há poucos estudos mostrando as diferenças entre células proliferativas e diferenciadas da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y, além do efeito do tratamento com 6-OHDA. Ainda, não há um consenso nos protocolos de diferenciação. Dessa forma, o objetivo deste estudo foi estabelecer um protocolo de diferenciação dopaminérgica da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y, bem como avaliar a potencialidade do modelo como plataforma para o screening de neurotoxicidade/neuroproteção de compostos e a possibilidade de manipulação gênica. As células proliferativas SH-SY5Y foram mantidas em meio de cultura DMEM/F12 (1:1) suplementado com 10% de SFB. A diferenciação foi induzida pela combinação de 10 μM de AR e meio de cultura com 1% de SFB durante 4, 7 e 10 dias. Foram avaliados parâmetros morfológicos (presença de neuritos) e neuroquímicos, através marcadores de diferenciação neuronal (DAT- transportador de dopamina; TH – tirosina hidroxilase; ENS – enolase neurônio específica; NeuN – proteína nuclear de neurônio; Nestina). Ainda, avaliamos parâmetros de estresse oxidativo através da atividade de enzimas antioxidantes e dos níveis de tióis reduzidos. Nossos dados mostraram que as células SH-SY5Y diferenciadas por 7 dias apresentaram mudanças morfológicas e o aumento do imunoconteúdo de todos os marcadores neuronais testados, e a concomitantemente diminuição do imunoconteúdo de nestina (marcador de células indiferenciadas). Além disso, o fenótipo neuronal apresentou uma maior atividade de alguns sistemas antioxidantes. Também foi avaliada a citotoxicidade frente ao H2O2 e à 6-OHDA nos dois fenótipos. As células diferenciadas se mostraram mais resistentes ao dano causado pelo H2O2 e mais sensíveis à 6-OHDA. Dessa forma, a citotoxicidade da 6-OHDA pode estar relacionada com o aumento do imunoconteúdo do DAT, visto que a neurotoxina entra na célula dopaminérgica através deste transportador. Interessantemente, as células diferenciadas apresentaram aumento dos níveis da proteína neuroprotetora DJ-1, que está relacionada a uma forma prematura de Parkinsonismo em humanos. Após a caracterização do modelo, nós utilizamos o fenótipo diferenciado como plataforma experimental para o screening de compostos neuroprotetores como os organocalcogênios. Nós determinamos a citotoxidade destes compostos em células diferenciadas da linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y. A partir destes dados, foram selecionados compostos com baixa citotoxicidade e avaliamos a morfologia celular (densidade de neuritos). Nós verificamos que antes da perda de viabilidade, ocorre a perda de neuritos, sendo que este parâmetro é outra vantagem do modelo de célula diferenciada para avaliação da neurototoxicidade. Ainda, verificamos que estes compostos são capazes de prevenir o dano celular causado pela 6-OHDA. Além disso, nós caracterizamos a capacidade do modelo de ser manipulado geneticamente através da transfecção e superexpressão de plasmídeo contendo a proteína verde fluorescente, onde verificamos que a expressão é mantida durante a diferenciação. Dessa forma, nossos dados mostraram a eficácia da padronização da diferenciação induzida por AR da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y, pois estas células apresentam características morfológicas e neuroquímicas adequadas de neurônio dopaminérgico bem como pode ser aplicado não só para avaliação de neurototoxicidade/neuroproteção, mas também pode ser manipulado geneticamente. / The molecular mechanisms underlying the massive cellular loss found in the nigrostriatal pathway during the progression of Parkinson’s disease (PD) are not completely understood. Therefore, it is important to develop more suitable experimental models to study the molecular mechanisms of this neurodegenerative disorder. Proliferative human neuroblastoma cell line SH-SY5Y challenged with neurotoxins (e.g.: 6-hydroxydopamine – 6-OHDA) has been widely used as an in vitro model for PD. Many lines of evidence showed that this cell line differentiates with the combination of lower fetal bovine serum (FBS) and retinoic acid (RA) to dopaminergic-like neural cell. However, there are few studies addressing the differences between proliferative and RA-differentiated SH-SY5Y cells as well as their responses to 6-OHDA cytotoxicity. Moreover, there is no consensus in differentiation protocols. Hence, the objective of this study was to establish a RAinduced dopaminergic differentiation protocol and also evaluate its capabilities for drug screening of neurotoxicity/neuroprotection and genetic manipulation. Exponentially growing SH-SY5Y cells were maintained with DMEM/F12 (1:1) medium plus 10% FBS. Differentiation was triggered by the combination of 10 μM of RA plus medium with 1% of FBS during 4, 7 and 10 days. We evaluated the cell morphology (neurites) and the neuronal markers (Dopamine Transporter- DAT, Tyrosine Hydroxylase-TH, Neuron-Specific Enolase-NSE, Neuronal Nuclei Protein- NeuN, and Nestin immunocontent). Furthermore, we verify the activity of antioxidant enzymes and the reduced thiol levels. Our data demonstrated that SH-SY5Y cells differentiated for 7 days expresses all neuronal markers tested with concomitant decrease in nondifferentiated marker (nestin). Besides, they showed a higher activity of some antioxidant systems. We also evaluated the cytotoxicity of H2O2 and 6-OHDA in both phenotypes. Differentiated cells are more resistant to H2O2 and more sensitive to 6- OHDA. Hence, the damage caused by 6-OHDA could be related with the increase of DAT immuncontent, because this neurotoxin enters into the dopaminergic cell through this transporter. Interestingly, the differentiated cells have more levels of neuroprotective DJ-1 protein, which is related with a juvenile Parkinsonism. After establish the conditions of differentiation, we used the neuronal phenotype to perform a drug screening with organoselenide compounds. We verify the cytotoxicity of these compounds in differentiated cells. From these data, we selected compounds with low toxicity and evaluated the cell morphology (neurites density). We verify that before the loss of viability, there is a loss of neurites. This parameter is another advantage of the differentiated cells model to neurotoxicity evaluation. Moreover, these compounds were able to prevent neuronal cell death caused by 6-OHDA. We also characterized the ability of the model to be manipulated genetically through transfection and overexpression of a green fluorescent protein (GFP) plasmid. We verify that the expression of GFP is maintained during the differentiation. Hence, our data showed the efficacy of the RA-induced differentiation protocol of the neuroblastoma cell line SH-SY5Y, because these cells have morphological and neurochemical characteristics of dopaminergic neurons. Furthermore, the neuronal phenotype can be applyed not only to evaluate neurocytotoxicity/neuroprotection but also can be manipulated genetically.

Introdução: A articulação da fala é um dos aspectos fonoaudiológicos mais comprometidos na doença de Parkinson (DP). Pacientes com DP apresentam risco de manifestar apraxia não verbal e verbal. A apraxia não verbal ocorre quando há um déficit na habilidade de sequencialização dos movimentos voluntários não verbais da língua, lábios, mandíbula e outras estruturas orofaciais associadas, e a apraxia verbal é definida como um déficit na habilidade de sequencializar os controles motores necessários para o posicionamento correto dos articuladores durante a produção voluntária da fala. A prevalência com que apraxia da fala ocorre na DP não está bem estabelecida, sendo um distúrbio pouco explorado nesses pacientes. É um estudo inédito, até onde temos conhecimento, quanto à identificação dos erros práxicos verbais na DP. Objetivo: avaliar a prevalência da praxia não verbal e verbal em pacientes com doença de Parkinson, correlacionandoas com idade, escolaridade, tempo de doença e estadiamento da DP (Hoehn e Yahr), assim como correlacionar a apraxia não verbal com a apraxia verbal e identificar os erros práxicos verbais. Método: Estudo quantitativo, observacional, descritivo e de prevalência. Foram avaliados 45 pacientes acometidos pela DP, que realizaram seguimento clínico no ambulatório de Distúrbios do Movimento do Hospital de Clínicas de Porto Alegre, Brasil, através da aplicação do Protocolo de Avaliação da Apraxia da Fala, e o estadiamento da DP foi controlado através da escala de Hoehn e Yahr (H&Y). Resultados: A prevalência de apraxia não verbal e verbal nos pacientes com DP foi de 24,4%. Não houve significância entre apraxia não verbal com idade, escolaridade, tempo de doença, estadiamento da DP (H&Y) e gênero. A correlação entre apraxia verbal e escolaridade foi significante (p≤0,05), mas não houve significância com idade, tempo de doença, estadiamento da DP (H&Y) e gênero. Os tipos de erros práxicos verbais mais frequentes foram as omissões (70,8%). Quanto ao ponto e modo articulatório os fonemas mais alterados foram os dentoalveolares (92%) e os vibrantes (57,7%), consecutivamente. Conclusão: Os pacientes com DP apresentaram apraxia não verbal e verbal com manifestação de muitos erros práxicos verbais, estando a apraxia verbal correlacionada com a escolaridade. / Introduction: The speech articulation is one of the aspects most impaired in Parkinson's disease (PD). Patients PD present risk of expressing nonverbal and verbal apraxia. The nonverbal apraxia occurs when there is a deficit in the sequencing ability of nonverbal voluntary movements of the tongue, lips, jaw and other associated orofacial structures, while the verbal apraxia is defined as a deficit in the ability of sequencing the necessary motor controls in order to place the articulators correctly during the voluntary speech production. The predominance with which apraxia of speech occurs in PD is not well established and rarely explored in these patients. As far as we know, it is an unprecedented study regarding the identification of verbal praxic errors in PD. Objective: To assess the prevalence of nonverbal and verbal apraxia in patients with Parkinson's disease, correlating them with age, education, duration of disease and PD stage (Hoehn e Yahr), as well as to correlate nonverbal with verbal apraxia and identify the verbal praxic errors. Method: Quantitative, observational, descriptive and prevalence study. Forty-five patients with PD were evaluated. They were submitted to the clinical follow-up in the Movement Disorders Clinic of the Cinical Hospital of Porto Alegre, Brazil, through the application of the Speech Apraxia Assessment Protocol. Additionally, the PD stage was controlled through the Hoehn and Yahr scale (H&Y). Results: The prevalence of nonverbal and verbal apraxia in patients with PD was 24.4%. There was no significance between the nonverbal apraxia with age, education, duration of disease, PD stage (H&Y), and genre. The correlation between verbal apraxia and education was significant (p ≤ 0.05), but there was no significance with age, duration of disease, PD stage (H&Y) and genre. Omissions were the most frequent kinds of verbal praxic errors with (70.8 percent). Regarding the place and mode of articulation, the most changed phonemes were the dentoalveolar (92%)and the vibrants (57.7%), consecutively. Conclusion: Patients with PD presented nonverbal and verbal apraxia with manifestation of many verbal praxic errors and verbal apraxia correlated with education levels.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disease characterized by a progressive degeneration of dopaminergic neurons in the Substantia Nigra pars compact (SNpc) with consequent depletion of dopamine in the striatum, which gives rise to characteristic motor symptoms of PD. Although its etiology of is unknown, several studies have been suggested that oxidative stress and inflammation play a critical function in the physiopathology of PD and antioxidant and ani-inflammatory agents could be helpful to slown down the dopaminergic neurodegeneration. Thus, many studies have evaluated the potential neuroprotective effect of these agentes, including Carvacrol (CA). CA is a phenolic monoterpene found in essential oils of many aromatic plants and it has a variety of pharmacological effects on Central Nervous System, including antioxidant and anti-inflammatory activities. In this context, the objective of this study was to investigate a possible neuroprotective effect of CA in two rat models of PD. Two experiments were performed: in the experiment I, male Wistar rats were submitted to repeated administration of a low dose (0.1 mg/kg, s.c.) of reserpine (RES) or vehicle of reserpine (VR) and concomitantly treated with CA at doses of 12.5 or 25 mg/kg (i.p.) or vehicle of carvacrol (VC). Across the treatment, the animal motor behavior was evaluated by catalepsy test, open field test and assessment of oral movements. In the experiment II, male Long-Evans rats were pretreated for seven days with CA at doses of 50 or 100 mg/kg (i.p.) or VC, and were then submitted to unilateral injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or vehicle of 6-OHDA into the medial forebrain bundle (MFB). The animals were treated with CA or VC for three weeks after injection. Thereafter, they were assessed for motor behavioral function by open field, cylinder test, rotarod and amphetamine-induced circling test. In both experiments, upon completion behavioral tests, rats were perfused and theirs brains were subjected for tyrosine hydroxylase (TH) immunohistochemical analysis. In the experiment I, the results showed that the CA treatment, in both doses 12.5 e 25 mg/kg, was able to prevent the catalepsy behavior and the development of vacuous chewing movements induced by RES, however, CA failed to revert the decreased locomotor activity induced by RES in the open field test. In addition, CA in both doses prevented the depletion of TH immunostaining induced by RES in the SNpc and dorsal striatum. In the experiment II, the treatment with CA at dose of 50 mg/kg prevented the motor deficits induced by 6-OHDA injection in the open field test, cylinder test and rotarod, and increased the number of rotations induced by amphetamine. Moreover, CA attenuated the dopaminergic neurons damage in the SNpc and dorsal striatum induced by 6-OHDA injection. Taken together, our results suggest that CA shows neuroprotective effect, preventing or attenuating motor and neurochemical impairments induced by RES and 6-OHDA, so it may be regarded a promising therapeutic candidate for the prevention or treatment of PD. / A Doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa caracterizada por uma degeneração progressiva de neurônios dopaminérgicos da Substância Negra parte compacta (SNpc), o que resulta nas alterações motoras características desta patologia. Embora sua etiologia ainda permaneça desconhecida, vários estudos indicam que o estresse oxidativo e a inflamação exercem uma função crítica na fisiopatologia da DP e agentes antioxidantes e anti-inflamatórios poderiam desacelerar a neurodegeneração dopaminérgica. Assim, tem sido crescente o número de pesquisas relacionadas a investigação do potencial neuroprotetor destes agentes, entre eles, o Carvacrol (CA). O CA é um monoterpeno fenólico encontrado nos óleos essenciais de diversas plantas aromáticas e apresenta uma variedade de atividades farmacológicas sobre o Sistema Nervoso Central, incluindo atividades antioxidante e anti-inflamatória. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi investigar um possível efeito neuroprotetor do CA em ratos submetidos a dois modelos de DP. Foram realizados dois experimentos: no experimento I, ratos Wistar foram submetidos a administração repetida de uma dose baixa (0,1 mg/kg, s.c.) de reserpina (RES) ou veículo da reserpina (VR) e tratados concomitantemente com CA nas doses de 12,5 ou 25 mg/kg (i.p.) ou com o veículo do carvacrol (VC). Ao longo do experimento, os animais tiveram seu comportamento motor avaliado através dos testes de catalepsia, campo aberto e avaliação dos movimentos orais. No experimento II, ratos Long-Evans foram pré-tratados por sete dias com CA nas doses de 50 ou 100 mg/kg (i.p.) ou VC, e então foram submetidos a uma injeção unilateral de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) ou veículo no feixe prosencefálico medial (medial forebrain bundle -MFB). Os animais foram tratados com CA ou VC por três semanas após a injeção de 6-OHDA e após este período tiveram seu comportamento motor avaliado através dos testes do campo aberto, cilindro, rotarod e rotações induzidas por anfetamina. Em ambos os experimentos, ao fim dos testes comportamentais, os animais foram perfundidos e seus cérebros foram processados para imunohistoquímica para tirosina hidroxilase (TH). No experimento I, os resultados mostraram que o CA em ambas as doses (12,5 e 25 mg/kg) preveniu o comportamento de catalepsia e o desenvolvimento de movimentos de mastigação no vácuo induzidos pela RES, porém não reverteu a redução da atividade locomotora causada pela RES no teste do campo aberto. O CA em ambas as doses preveniu a redução da marcação de TH induzida pela RES na SNpc e no estriado dorsal. No experimento II, os resultados mostraram que o CA na dose de 50 mg/kg preveniu os déficits motores induzidos pela injeção de 6-OHDA nos testes do campo aberto, cilindro e rotarod, e aumentou o número de rotações induzidas por anfetamina. Além disso, o CA atenuou o dano provocado pela injeção de 6-OHDA nos neurônios dopaminérgicos da SNpc e estriado dorsal. Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que o CA apresenta um efeito neuroprotetor, prevenindo ou atenuando as alterações motoras e neuroquímicas induzidas pela RES e 6-OHDA. Desta forma, o CA pode ser considerado um candidato terapêutico promissor para a prevenção ou tratamento da DP.