O objetivo foi desenvolver e avaliar uma metodologia simplificada para detecção de vírus entéricos humanos em lodo de esgoto. O método foi baseado em eluição viral com solução protéica, seguida de ultracentrifugação. Alguns parâmetros foram avaliados (tempo e pH de eluição, condições de clarificação e purificação). A seguir, foi aplicado à pesquisa de adenovírus, vírus da hepatite A e norovírus em amostras colhidas ao longo de 12 meses em duas ETEs do estado de São Paulo. Amostras pareadas de esgoto foram também examinadas como referência da presença viral. A detecção viral por PCR, RT-PCR e PCR em tempo real, revelou a presença de adenovírus, incluindo os entéricos (espécie F) e vírus da hepatite A tanto nas esgoto como no lodo de ambas as ETEs. Norovírus não foram detectados. Vírus infecciosos não foram detectados no lodo submetido ao tratamento químico (ETE A). Parte dos vírus presentes na água de esgoto ficaram retidos no lodo e análises estatísticas revelaram que o tratamento químico adotado na ETE A é eficiente para a inativação viral. / The aim was to develop and evaluate a simplified methodology for detection of human enteric viruses in sewage sludge. The method was based on viral elution with protein solution, followed by ultracentrifugation. Several parameters were evaluated, including time and elution pH, clarifying and purifying conditions. The method was applied to the detection of adenoviruses, hepatitis A virus and noroviruses in sewage sludge samples collected for twelve months at two sewage treatment plants in Sao Paulo state. Raw sewage samples were also collected as a reference for viral presence. PCR, RT-PCR and Real-Time PCR revealed the presence of adenoviruses, including the enteric ones (species F) and hepatitis A virus found both in sewage and sludge. Noroviruses were not detected in any samples. Cell culture infectious viruses were not detected in the sludge subjected to chemical treatment (STP A), and statistical analyses revealed the efficiency of this treatment for virus inactivation.

Hepatitis C virus (HCV) infection globally affects 130-150 million people. It causes both acute and chronic infections. Due to the severe side effects and low success rates of interferon based treatments, which formed the standard treatment for HCV, the treatment paradigm shifted to direct acting antivirals (DAAs). DAAs have revolutionized the treatment of hepatitis C virus infection. Clinical trials with combinations of DAAs have recorded >90% response with shorter treatment durations and fewer side effects than earlier treatments involving IFN. Outside the controlled setting of a clinical trial, however, response rates with DAA combinations are much lower (<70%). DAAs can fail if HCV accumulates mutations that confer drug resistance. Interestingly, the pre-existence of mutant frequency in the virus appears not to influence treatment outcome. A better predictor for DAA treatment outcome is yet to be unravelled. Surprisingly, individuals who respond poorly to IFN appear to be more likely to fail DAA treatment. IFN is a generic antiviral that improves immune responses and is expected not to have any bearing on DAA treatment outcomes. Why individuals with poor IFN sensitivity fail DAA treatment remains a mystery. In a recent study of the IFN signalling network, HCV has been shown to compromise IFN activity. It induces bistability in the network leading to distinct phenotypic responses of cells to IFN exposure. In particular, individuals who respond poorly to IFN tend to have a higher percentage of cells that are refractory to IFN; these cells allow viral persistence despite IFN exposure. We hypothesized here that in such individuals, greater ongoing replication would allow increased development of resistance and thus lead to the failure of DAAs. We constructed a model of viral dynamics that accounts for the distinct phenotypic responses of cells to IFN, viral replication and mutation, and the development of resistance to DAAs. Our model predicted that although the relative prevalence of pre- existing mutants is unaffected by IFN sensitivity, in agreement with observations, the growth of drug resistant mutants is accelerated in individuals with poor IFN sensitivity. Based on a distribution of IFN sensitivity across individuals, our model accurately described clinical observations of the response rates to different current treatment protocols. With this model, we predict that the common strategy of increasing the genetic barrier by adding more drugs to the combination was not necessary to avert the development of drug resistance. Instead, an optimised increase in DAA dosage alone or DAA+PR or PR dosage depending on the patient’s IFN sensitivity could help achieve success.

Le VHC est une cause majeure de cancer du foie. Le traitement actuel est caractérisé par à un cout élevé, la présence de toxicité et l’émergence de résistance virale. Dans la 1ère partie de ma thèse, je me suis intéressé à l’entrée virale. L’entrée est nécessaire pour l’initiation ; la dissémination et le maintien de l’infection et représente ainsi une cible intéressante dans le développement de thérapies antivirales : CD81 et SRBI sont les 1ers facteurs décrits comme importants pour l’entrée : Nous avons confirmé leur rôle clé dans l’entrée et les étapes suivant l’entrée. De plus, nous avons montré leur rôle crucial dans la transmission cellule/cellule. Le VHC infecte principalement les hépatocytes, nous avons étudié en seconde partie de ma thèse le tropisme restreint du VHC aux hépatocytes. En définissant les facteurs essentiels à l’infection de cellules non hépatiques et en développant un modèle cellulaire afin d’identifier de nouveaux facteurs d’assemblage et de réplication du VHC. / HCV infection is the leading cause of chronic liver disease. The current SOC is still limited by high costs, toxicity and emergence of viral resistance. In the first part of my thesis we focused our workon viral entry. Viral entry is required for initiation, spread, and maintenance of infection, and thus is a promising target for the development of new antiviral therapies. CD81 and SR-BI are the first entry factors identified as important for HCV entry. In our work we confirmed their crucial role in entry, especially at the post-binding step. In addition we proved their key role in viral dissemination through the cell-cell transmission. As HCV mainly infects hepatocytes, we studied in the second part of my thesis, the restricted cellular tropism of HCV to hepatocytes and we defined the minimal host factors rendering non hepatic cell lines susceptible to HCV infection by the establishment of a powerful tool to identify new assembly and replication factors.

Introdução: Pacientes com infecção crônica pelo VHC e superinfecção pelo vírus da hepatite A (VHA) ou o vírus da hepatite B (VHB), têm maior morbi-mortalidade quando comparados com pacientes que apresentam infecção aguda somente pelo VHA ou VHB. A mortalidade associada à hepatite A aguda pode estar particularmente elevada em pacientes com pré-existência de hepatite crônica causada pelo VHC. Por esta razão, a imunização ativa com vacinas contra o VHA e o VHB vem a ser obrigatória nesta população, e consequentemente esta sorologia deve ser determinada. Objetivos: O objetivo deste trabalho foi avaliar a prevalência de marcadores sorológicos da hepatite A e hepatite B em 1.000 pacientes com infecção crônica pelo VHC atendidos no Ambulatório de Hepatites da Divisão de Gastroenterologia e Hepatologia Clínica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo. Resultados: O anti-VHA IgG foi positivo em 923 de 1000 pacientes (92,3%). Quando estratificados por idade, o anti-VHA IgG foi encontrado em 61% dos pacientes entre 20 e 29 anos, 70% entre 30 e 39 anos, 85% entre 40 e 49 anos, 94% entre 50 e 59 anos e 99% nos pacientes com mais de 60 anos . O anti-HBc total foi positivo em 244 pacientes (24%). Estratificados por idade, em 4,3% dos pacientes entre 20 e 29 anos, 17% entre 30e 39 anos, 21% entre 40 e 49 anos, 24% entre 50 e 59 anos, e 28% dos pacientes com mais de 60 anos. Dos 244 pacientes anti-HBc IgG positivos, 0,8% são HBsAg positivo, 8,5% anti-HBc IgG isolado e 16% anti-HBs positivo. Conclusões: A prevalência de anti-VHA IgG nod nossos pacientes com hepatite C crônica foi semelhante à da população geral no município de São Paulo. No entanto, o anti-HBc totaI foi maior em nossos pacientes, quando comparada historicamente à população geral dos países ocidentais, sugerindo fatores de risco semelhantes para as hepatites B e C, o que enfatiza a importância dos programas de imunização nesta população / Background and Aims: Patients with chronic HCV and superinfection by hepatitis A virus (HAV) or hepatitis B virus (HBV) have higher morbidity and mortality when compared with those without HCV. For this reason, HAV and HBV active immunization has become mandatory in this population and hence their serological markers must be determined. The aim of this study was to evaluate the prevalence of serological markers of HAV and HBV infection in patients with chronic HCV. Methods: 1.000 chronic HCV infected patients at the University of Sao Paulo School of Medicine outpatient Liver Clinic were evaluated for the prevalence of serological markers of HAV and HBV infection. Results: Anti-HAV IgG was positive in 923 of 1000 patients (92.3%). When stratified by age, the anti-HAV IgG was found in 61% of patients between 20-29 years, 70% between 30-39 years, 85% between 40-49 years, 94% between 50-59 years, and 99% over 60 years of age. Anti-HBc IgG was positive in 244 patients (24%). Stratified by age, anti-HBc IgG was found in 4.3% of patients between 20-29 years, 17% between 30-39 years, 21% between 40 -49 years, 24% between 50-59 years, and 28% of patients over 60 years of age. Of the 244 anti-HBc IgG positive patients, 0.8% were also HBsAg positive, 8.5% were anti-HBc IgG isolated and 16% were also anti-HBs positive. Conclusions: The prevalence of anti-HAV IgG was similar to the general population in the city of São Paulo. However, anti-HBc IgG was higher in our chronic HCV patients, when compared historically to the general population of western countries, suggesting similar risk factors for HBV and HCV acquisition, so emphasizing the importance of immunization programs in this population. Keywords: Hepatitis C, Chronic; Hepatitis C; Hepacivirus, Prevalence; Hepatitis A; Hepatitis B Título: Prevalência de Marcadores Sorológicos das Hepatites A e B em Pacientes com Hepatite C Crônica atendidos no Ambulatório de Hepatites do Serviço de Gastroenterologia Clínica do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - HCFMUSP Background and Aims: Patients with chronic HCV and superinfection by hepatitis A virus (HAV) or hepatitis B virus (HBV) have higher morbidity and mortality when compared with those without HCV. For this reason, HAV and HBV active immunization has become mandatory in this population and hence their serological markers must be determined. The aim of this study was to evaluate the prevalence of serological markers of HAV and HBV infection in patients with chronic HCV. Methods: 1.000 chronic HCV infected patients at the University of Sao Paulo School of Medicine outpatient Liver Clinic were evaluated for the prevalence of serological markers of HAV and HBV infection. Results: Anti-HAV IgG was positive in 923 of 1000 patients (92.3%). When stratified by age, the anti-HAV IgG was found in 61% of patients between 20-29 years, 70% between 30-39 years, 85% between 40-49 years, 94% between 50-59 years, and 99% over 60 years of age. Anti-HBc IgG was positive in 244 patients (24%). Stratified by age, anti-HBc IgG was found in 4.3% of patients between 20-29 years, 17% between 30-39 years, 21% between 40 -49 years, 24% between 50-59 years, and 28% of patients over 60 years of age. Of the 244 anti-HBc IgG positive patients, 0.8% were also HBsAg positive, 8.5% were anti-HBc IgG isolated and 16% were also anti-HBs positive. Conclusions: The prevalence of anti-HAV IgG was similar to the general population in the city of São Paulo. However, anti-HBc IgG was higher in our chronic HCV patients, when compared historically to the general population of western countries, suggesting similar risk factors for HBV and HCV acquisition, so emphasizing the importance of immunization programs in this population

Na prática hemoterápica em todo mundo, a triagem e o diagnóstico da infecção pelo HCV continua sendo um desafio. Desta forma, considerando as variáveis genéticas do vírus da Hepatite C e as variáveis populacionais de cada região, o conhecimento mais profundo da realidade da epidemiologia molecular do vírus da Hepatite C na população de doadores de sangue em regiões específicas se torna cada vez mais imprescindível. Desta forma, este estudo visou realizar a caracterização sorológica e molecular da infecção pelo Vírus da Hepatite C (HCV) em doadores de sangue do Estado do Amazonas a fim de subsidiar conhecimentos para interpretação dos diferentes perfis laboratoriais e clínicos, além de contribuir para o conhecimento das rotas de transmissão e da epidemiologia da infecção do Amazonas. Foram estudados 154 doadores de sangue do Estado do Amazonas com sorologia repetidamente reativa para anti-HCV. Foram realizados testes sorológicos por ELISA e Imunoblot, testes de detecção de RNA viral plasmático por Nested PCR, determinação da carga viral e genotipagem do vírus por sequenciamento. O estudo foi realizado no período de setembro de 2005 a abril de 2007 quando o índice de descarte por anti-HCV reativo foi de 0,37%. Foi observado que 50% dos casos de Imunoblot indeterminado apresentaram positividade no Nested PCR indicando a presença de RNA plasmático. A carga viral baixa foi um fator limitante para a determinação do genótipo viral pelo método de sequenciamento de algumas amostras. A freqüência de casos presumidos de clearance viral plasmático na amostra estudada foi de 18,8%. O genótipo mais prevalente do HCV nos doadores do Estado do Amazonas foi o genótipo 1 (87,5%) seguido do genótipo 3 (12,5%). Considerando as nuances da história natural da Hepatite C e os diversos momentos clínicos que os doadores possam se encontrar devem ser adotadas mudanças de condutas do acompanhamento dos doadores sororeativos para anti-HCV no banco de sangue do Amazonas e no fluxograma de diagnóstico da infecção. / The screening and diagnostic of HCV infection continue to be a challenge on the hemotherapic practice because the unique characteristics of each population and the molecular variability of the virus. The aim of this study was to characterize the serologic and molecular profile of 154 anti-HCV+ Amazon blood donors from the Amazon Hematology and Hemoterapy Foundation. Screening for anti HCV antibody was performed using ELISA and recombinant Imunoblot assay. Seropositive samples were assessed further with Nested PCR, viral load and genotyping techniques. In the study period, 2005-2007 the anti-HCV discard rate was 0,37%. We observed that 50% of the indeterminate Immunoblot cases showed HCV RNA presence in plasma by Nested PCR. The most prevalent genotype between subjects of this study was genotype 1 (87,5%), followed by genotype 3 (12,5%). The presumed plasma clearance frequency was 18,8%. The low viral load was a determinant critical factor to the genotype determination in some samples. Considering the different stages of the HCV natural infection different conducts may be adopted with inclusion of molecular testes as the first option for confirmation to the follow up of the positive anti-HCV blood donors in the Amazon blood bank and in the algorithm of the infection diagnostic, saving resources and providing a better counseling for the reactive donors.

A doença hepática crônica causada pelo vírus da hepatite C (HCV) tornou-se, nos últimos anos, uma das principais comorbidades dos pacientes portadores do vírus da imunodeficiência humana (HIV) nos países desenvolvidos. Os pacientes coinfectados com HIV/HCV apresentam uma progressão mais rápida para a cirrose e as suas complicações que os pacientes monoinfectados com HCV. Embora os mecanismos responsáveis por esta evolução não estejam totalmente esclarecidos, a expressão da molécula de HLA-G, um HLA de classe Ib não clássico, que tem propriedades bem reconhecidas na regulação negativa da resposta imune, pode estar relacionada à progressão da doença hepática. Os objetivos deste trabalho foram analisar o perfil de expressão de HLA-G em tecido hepático de pacientes coinfectados HIV/HCV e identificar possíveis variáveis do hospedeiro, do HCV e do HIV que possam estar relacionadas com a expressão de HLA-G na biópsia hepática. Para isso, 57 amostras de biópsia hepática de pacientes coinfectados com HIV/HCV, nas quais a imuno-histoquímica para HLA-G foi realizada, foram analisadas retrospectivamente quanto à expressão desta molécula no tecido hepático. Avaliaram-se também outras características histopatológicas da biópsia como grau de fibrose, atividade inflamatória, deposição de ferro e gordura. Determinou-se o polimorfismo de inserção ou deleção de 14 pares de bases da região 3` não traduzida do exon 8 do gene do HLA-G, que está relacionada com a produção de RNA-mensageiro, em 43 destes pacientes, além do polimorfismo de IL-28B, relacionado com a resposta ao tratamento do HCV, em 44 deles. Características bioquímicas e virológicas, tanto do HIV quanto do HCV também foram avaliadas. O genótipo 1 do HCV foi o mais prevalente (87,75%), especialmente o subgenótipo 1a (60%). A expressão do HLA-G foi observada em 38 (66,7%) amostras de fígado, e foi mais frequente em estágios moderados e severos de fibrose do que em estágios mais leves (94,1% x 55%, P < 0,01). Não houve relação entre a expressão do HLA-G e os outros parâmetros estudados. Embora a progressão para a cirrose no contexto da coinfecção por HIV/ HCV seja um processo complexo, modulado por muitos factores, a associação da intensidade de fibrose com a expressão do HLA-G pode indicar que a expressão desta proteína desempenha um importante papel nos mecanismos que contribuem para a progressão da doença, por meio da regulação negativa da resposta imune contra o HCV na coinfecção pelo HIV. / Chronic liver disease induced by hepatitis C virus (HCV) infection has recently become one of the most common comorbidities in patients who are infected with the human immunodeficiency virus (HIV) in developed countries. HIV/HCV coinfected patients show faster progression to cirrhosis and its complications than the HCV monoinfected patients. Even though the responsible mechanisms for this evolution have not been entirely clarified yet, the expression of the HLA-G molecule, a HLA from the non-classic Ib class, with well-known properties of negatively regulating the immune response, may be related to the liver disease progression. The aims of the present work were to analyze the HLA-G expression profile in the liver micro ambience of HIV/HCV coinfected patients and to identify possible host factors, HIV or HCV, that may be related to the HLA-G expression on the liver biopsy. For this purpose, 57 liver biopsies of HIV/HCV coinfect patients, in which immunohistochemistry for HLA-G had been performed, were retrospectively analyzed according the HLA-G expression on the hepatic tissue. Other histopathological features in the liver biopsies, such as fibrosis degree, inflammatory activity, iron deposition and fat were also evaluated. The polymorphism of insertion or deletion in 14-base pairs of the 3`non-translated region of exon 8 of the HLA-G gene, which is related to the production of HLA-G messenger RNA, was evaluated in 43 of the patients. Also, the polymorphism of IL-28B, related to the response to HCV treatment, was evaluated in 44 of them. Biochemical and virological features of HIV and HCV were also evaluated. The HCV genotype 1 was the most prevalent (87.75%), especially the subgenotype 1a (60%). The expression of HLA-G was observed in 38 (66.7%) samples of the liver biopsies, and it was most frequent in moderate and severe stages of fibrosis than in the mild stages (94.1% x 55%, P < 0.01). There was no established relationship between HLA-G and other parameters studied. Although the progression to cirrhosis in the context of HIV/HCV coinfection is a complex process modulated by many factors, the association of HLA-G expression with the intensity of the liver fibrosis may indicate the protein expression play an important role in the mechanisms that contribute to the progression of the disease, through the negative regulation of the immune response against HCV setting of a coinfection with HIV.

Made available in DSpace on 2015-04-11T13:57:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lucinete Okamura Kimura.pdf: 3604811 bytes, checksum: 944fcd9a6fb1e06fc9a8b1ff83801f92 (MD5) Previous issue date: 2011-02-03 / Hepatitis B virus (HBV) infection is one of the most serious public health problems in the world. At least two billion people are infected, with over 350 million showing serological markers of active infection, despite prevention by vaccination. In Brazil, the HBV endemicity is heterogeneous, with the most prevalent disease in the north region. Among the indigenous population, epidemiological serum studies have reported high rates of hepatitis B prevalence in the Brazilian component of the Amazon rainforest. Studies have shown that in some cases the serological markers are not enough to detect viral activity, and in these situations, molecular tests are more sensitive and specific. The proposal of this study was to determine the prevalence of DNA (deoxyribonucleic acid) of hepatitis B virus in indigenous ethnic groups (Kanamary, Matis, Mayoruna, Marubo, Kulina and Korubo) in habitants of the rivers Curuçá and Itaquaí at the Javari Valley, Amazon, Brazil. This was a descriptive, cross-sectional study, such as used in case detection. One hundred and eighty (180) samples were analyzed from the indigenous communities of São Sebastião, Volta Grande, Pedro Lopes, Massapê, Remancinho and Bananeira. The samples were subjected to polymerase chain reaction (PCR) and semi-nested PCR to Hepatitis B virus, S gene. The prevalence for HBV-DNA of S gene was 51.1% (92/180). Among the PCR positive samples for HBV-DNA, 18/49 (36.7%) were from Marubo, 68/125 (54.4%) from Kanamary and 6/6 (100%) from other ethnicities. With regards to socio-demographic data, no significant difference was found (p=0.889) in relation to gender (statistical analysis at 5%). However, when analyzing age it was observed that the natives had lower median age (p<0.001) of 23 years old, suggesting that sexual activity was the main form of HBV transmission. There was no statistical difference found in relation to sources of infection and the presence of HBV DNA, as well as clinical aspects, with the exception of fever (p<0.001). The high prevalence of HBV-DNA of 75% (15/20) in pregnant women (p=0,009) demonstrates association with vertical transmission. The results confirm the high prevalence of HBV DNA in the Javari Valley, making it important to devise strategies for control and a more effective prevention in combating the spread of HBV / A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) é um dos mais sérios problemas de Saúde Pública do mundo. Estima-se que dois bilhões de pessoas estejam infectadas, com mais de 350 milhões apresentando marcadores sorológicos de infecção ativa, apesar da prevenção pela vacinação. No Brasil, a endemicidade do VHB é heterogênea, sendo a doença mais prevalente na região norte do país. Entre a população indígena, estudos soro epidemiológicos relatam altas taxas de prevalência de hepatite B na Amazônia brasileira. Pesquisas têm demonstrado que, em alguns casos, os marcadores sorológicos não são suficientes para detectar uma atividade viral e, nessas situações, os testes moleculares se mostram mais sensíveis e específicos. O presente estudo se propôs determinar a prevalência do DNA (ácido desoxirribonucléico) do vírus da hepatite B em povos de etnias indígenas habitantes dos rios Curuçá e Itaquaí no Vale do Javari, Amazonas, Brasil, pertencentes às etnias Kanamary, Matis, Mayoruna, Marubo, Kulina e Korubo. Tratou-se de um estudo descritivo, transversal, do tipo detecção de caso. Foram analisadas 180 amostras pertencentes às comunidades indígenas de São Sebastião, Volta Grande, Pedro Lopes, Massapê, Remancinho e Bananeira. As amostras foram submetidas à reação em cadeia da polimerase (PCR) e semi-nested para vírus da hepatite B, gene S. A prevalência encontrada para o DNA-VHB gene S foi de 51,1% (92/180). Entre as amostras positivas para DNA-VHB PCR, 18/49 (36,7%) pertenciam à etnia Marubo, 68/125 (54,4%) à Kanamary e 6/6 (100%) a outras etnias. Quanto aos dados sóciodemográficos dos casos positivos para DNA-VHB PCR, pôde-se verificar que não houve diferença significante ao nível de 5% em relação ao gênero (p= 0,889). No entanto, quando se analisou a idade foi observado que os indígenas com PCR positiva para DNA-VHB apresentavam menores mediana de idade (p<0,001) de 23 anos, sugerindo ser a atividade sexual uma das principais formas de transmissão do VHB. Não foi constatada nenhuma diferença estatística em relação às fontes de contágio e à presença do DNA-VHB, como também aos aspectos clínicos, com exceção da febre (p<0,001). A alta prevalência do DNA-VHB de 75% (15/20) em gestantes (p=0,009) demonstra associação com a transmissão vertical. Os resultados comprovam a alta prevalência do DNA-VHB no Vale do Javari, tornando-se importante traçar estratégias de controle e prevenção mais eficazes no combate à disseminação do VHB

Made available in DSpace on 2015-04-20T12:31:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cintia Mara Costa de Oliveira.pdf: 1536626 bytes, checksum: a546517f7c00e6b13c3a43eac85bbc3f (MD5) Previous issue date: 2007-06-01 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / The hepatitis B virus (HBV) is an agent of universal distribution which produces in humanity both the gaud and chronic infection. According to the World health organization (WHO) approximately 30% of world population, or about 2 billion of the people, are infected by the HBV. Of these, more than 350, million have become chronic patients. The molecular analysis of the genome HBV has allowed the identification of different genotypes as well as the main mutations which are present in its genome. The present study had as objective to make the sequence of S and C of HBV isolated from different samples born in the Amazon State and to analyze the frequency of mutations in these genes related with the disease evolution. Samples of 80 patients positive for the HBV were obdied. From these, 60 were born on Manaus and 20 on the urban zone of Labrea city, AM.. The amplification of the S gene and C gene by PCR showed that from 80 samples that were analyzed, 68 (85%) were DNA-HBV positive. The filogenetic analyze identified 3 genotypic groups A, D and F. The prevalent genotype was the A type 40/51 (78,4%), followed by F genotype, (7%) and D 2/51 (3,9%) as walles two undetermined sequences. The A genotype was the most frequent in the samples obtained of people who were born in Manaus, while the F genotype was prevalent in the samples of people from the interior of the Amazon State. Considering the mutations, a very low frequency of mutations related with the development of the disease both in the S and C gene was observed. / O vírus da hepatite B (VHB) é um patógeno de distribuição universal que produz no homem tanto a infecção aguda quanto a crônica. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), aproximadamente 30% da população do planeta, ou cerca de dois bilhões de pessoas no mundo, estão infectadas pelo VHB. Destas, mais de 350 milhões tornaram-se portadoras crônicas. A análise molecular do genoma VHB têm permitido a identificação de diferentes genótipos bem como das principais mutações presentes em seu genoma. O presente estudo teve como principais objetivos seqüenciar os genes S e C do genoma do VHB isolados de diferentes amostras obtidas de indivíduos naturais do Estado do Amazonas e analisar a freqüência de mutações nesses genes relacionando-as a evolução da doença. Foram analisadas um total de 80 amostras de plasma de indivíduos positivos para o VHB. Destas, 60 foram procedentes de Manaus e 20 da zona urbana do município de Lábrea, AM. A amplificação dos genes S e C por PCR mostrou que das 80 amostras analisadas, 68 (85%) foram DNA-VHB positivas. A análise filogenética identificou os três grupos genotípicos A, D e F. O genótipo A foi predominante em 40/51 (78,4%), seguido dos genótipos F 7/51 (13,7%) e D 2/51 (3,9%) além de duas seqüências não determinadas. O genótipo A foi mais freqüente nas amostras obtidas de indivíduos naturais da cidade de Manaus enquanto que o genótipo F predominou nas amostras de indivíduos procedentes do interior do Estado do Amazonas. Quanto às mutações observou uma baixa freqüência de mutações relacionadas ao desenvolvimento da doença tanto no gene S quanto no C.

O objetivo principal deste estudo foi avaliar fatores virais associados com a evolução para o carcinoma hepatocelular (CHC) em pacientes com hepatite B crônica. Para tanto caracterizamos os subgenótipos do HBV, investigamos a ocorrência de mutações nos genes pré-core/core do HBV associadas à presença de CHC avaliamos por análise filogenética a associação de linhagens virais com a ocorrência de CHC e por fim a associação de outros fatores de risco com o desenvolvimento de CHC. Foram incluídos 119 amostras de soro de pacientes com infecção crônica pelo HBV, destas amostras 60 pertencem ao grupo 1 (CHC), que são pacientes com diagnóstico confirmado de carcinoma hepatocelular e 59 amostras pertencem ao grupo 2 (sem CHC) que são pacientes com hepatite crônica sem detecção prévia de nódulos hepáticos. Foram obtidas informações acerca da idade, sexo e naturalidade. Além disso, os pacientes responderam a um questionário sobre fatores de riscos associados ao desenvolvimento de CHC. Foram realizados exames bioquímicos, sorológicos, determinação da carga viral, e amplificação por nested PCR e sequenciamento das regiões S/polimerase e pré-core/core do genoma viral para posterior caracterização dos genótipos/subgenótipos do HBV e pesquisa de mutações associadas com evolução da doença hepática. Em relação à idade e sexo não houve grande variação entre os grupos. Quanto à naturalidade a maioria era procedente da região sudeste, seguido pela região nordeste; e por fim seis pacientes eram procedentes de outros países. Com base no sobrenome dos pacientes avaliou-se também a frequência de etnia oriental na casuística estudada, que foi similar nos 2 grupos. O perfil sorológico HBeAg negativo foi o mais frequente nos dois grupos de pacientes, assim como níveis de carga viral abaixo de 2.000 UI/mL. Em relação aos exames bioquímicos foram observadas diferenças estatisticamente significantes nos níveis séricos de AFP (p= 0,0013), FA (p= 0,0003) e GGT (p= 0,005). Dentre os fatores de risco analisados neste estudo, o consumo de amendoim foi o único que apresentou significância estatística (p= 0,003). A região S/pol foi amplificada e sequenciada com sucesso em 58 amostras (28 do grupo 1 e 30 do grupo 2). Entre as 58 amostras analisadas 4 genótipos e 8 subgenótipos do HBV foram identificados, sendo o subgenótipo A1 o mais frequente nos dois grupos. Não se observou diferença estatisticamente significante na distribuição dos subgenótipos entre os dois grupos de pacientes. Na topologia da árvore filogenética construída com sequências do HBV isoladas dos pacientes incluídos neste estudo e sequências disponíveis no GenBank não se observou padrões de agrupamento associados com o perfil clinico do paciente (com e sem CHC). Foram obtidas sequências de boa qualidade da região précore/ core em 44 amostras, sendo 20 amostras do grupo 1 e 24 do grupo 2. Diversas das mutações investigadas foram identificadas na região précore/ core, as quais foram avaliadas estatisticamente para verificar a existência de diferença na frequência das mesmas entre os grupos de pacientes estudados. Entre as mutações identificadas se destacaram com significância estatística as seguintes mutações: T1768A (p= 0,006), a combinação das mutações C1766T + T1768A (p= 0,043) e G1888H (p= 0,05). Na análise de regressão logística simples foi possível identificar que a chance de um paciente do grupo 2 desenvolver CHC aumenta 14,7 vezes na presença de infecção por cepas do HBV com a mutação T1768A, enquanto que a infecção com cepas do HBV que albergam a mutação G1888H reduz tal chance 2,5 vezes / The aim of this study was to evaluate viral factors associated with the progression to hepatocellular carcinoma (HCC) in patients with chronic hepatitis B. For this goal, we characterized HBV subgenotypes, investigated the occurrence of mutations in pre-core/core genes associated with progression to HCC, characterized HBV strains through phylogenetic analyzes and evaluated risk factors associated with HCC. Were included 119 serum samples from patients with chronic HBV infection that were classified in 2 groups: 60 patients with confirmed HCC diagnosis (group 1) and 59 patients with advanced hepatitis B liver disease without the detection of nodular liver lesions and without HCC (group 2). Data about the age, sex and geographic precedence were obtained from medical records. The patients also answered a questionnaire on risk factors for developing HCC. Biochemical, serological and viral load testing were performed in all samples. Moreover, S/polymerase and precore /core regions of HBV DNA were amplified by nested PCR and sequenced by Sanger method. Sequences were analyzed to identify HBV genotypes and subgenotypes and to detect mutations in the precore/core gene. Patient\'s age and sex did not differ between the two groups. Most of the patients came from the Southeast region, followed by the Northeast region; and six patients were from other countries. Based on the patient\'s surname, they were evaluated concerning Eastern ethnicity, which was similar in the 2 groups. Most of the patients included in this study were HBeAg negative and showed viral load bellow 2,000 IU/mL. Concerning the biochemistry assays, statistically significant differences in serum levels of AFP (p = 0.0013), AP (p = 0.0003) and GGT (p = 0.005) were found. Among the risk factors analyzed in this study, peanut consumption was the only one statistically significant (p = 0.003). The S/pol region was successfully amplified and sequenced in 58 samples (28 from Group 1 and 30 from Group 2). Among the 58 samples analyzed, 4 genotypes and 8 subgenotypes were identified, subgenotype A1 was the most frequent in both groups and there was no statistically significant difference in the distribution of them between the two groups. In the phylogenetic tree topology built with HBV sequences isolated from patients included in this study and sequences available in GenBank, it was not observed any clustering associated with the clinical profile of the patients (with or without HCC). Sequences of good quality from pre-core/core region were obtained from 44 samples, 20 from group 1 and 24 from group 2. These sequences were analyzed and several mutations were found among which stood out with statistical significance: T1768A (p = 0.006) C1766T + T1768A (p = 0.043) and G1888H (p = 0.05). In addition to the comparative analysis, the changes were subjected to a simple logistic regression analysis which found that the chance of a patient in group 2 developed HCC increases 14.7 times in the presence of HBV infection strains with the T1768A mutation, while infection with HBV strains harboring the mutation G1888H reduces this chance by 2.5 times

Introdução e objetivos: A infecção crônica pelo VHC é considerada um grave problema de saúde pública mundial. O perfil epidemiológico vem mudando desde 1992 com a obrigatoriedade da pesquisa sorológica em doadores de sangue. Atualmente o uso de drogas ilícitas injetáveis é o fator de risco mais importante. Em muitos casos o mecanismo de contaminação não é identificado sendo definido como forma esporádica. O presente trabalho avaliou aspectos demográficos e epidemiológicos de pacientes com infecção crônica pelo VHC, em acompanhamento no ambulatório de Hepatologia do Serviço de Gastroenterologia da Divisão de Clínica Médica II do Hospital das Clínicas da FMUSP. Pacientes e métodos: Foram entrevistados 700 de um total de 1.112 pacientes adultos, no período de outubro de 2001 a novembro de 2003 (49% homens, 51% mulheres). Após a assinatura do termo de consentimento esclarecido, todos os pacientes foram submetidos à entrevista com questionário elaborado para este estudo, abrangendo aspectos demográficos, fatores de risco e uso de bebida alcoólica. O diagnóstico da infecção pelo VHC foi realizado através de teste sorológico Elisa de terceira geração e pesquisa do RNA viral através da reação em cadeia da polimerase. A determinação do genótipo do VHC foi realizada em 540 amostras de soro através do sequenciamento da região 5\' UTR. A biópsia hepática foi analisada em 470 pacientes e estadiada segundo critérios das Sociedades Brasileiras de Patologia e Hepatologia. Resultados: Não houve diferença significante entre a média de idade de homens e mulheres (49 ± 12,2 anos e 51 ± 12,5, respectivamente). 60% cursaram até o ensino fundamental, 19,7% o ensino médio e 12,4% o superior. 1% dos pacientes tem ocupações ligadas ao setor primário da economia, 8% ao setor secundário e 52% ao setor terciário. 62% foram classificados como brancos e 67% como católicos. 60% referiram relacionamento estável monogâmico. Em 68,5% dos casos o diagnóstico foi estabelecido através de exames de rotina e em 19,4% durante doação de sangue. O principal fator de risco para infecção foi a realização de hemotransfusão antes de 1993 (46,4%). 10% dos pacientes referiram uso de drogas injetáveis e 3%, apresentavam ambos os fatores. Em 42% dos casos o mecanismo de infecção foi considerado como forma esporádica. O genótipo 1 foi responsável por 70% das infecções seguidas pelo genótipo 3 (25%). Grau leve de fibrose classificado como 0 ou 1 foi encontrado em 48,7% dos pacientes, estádio 2 em 18,5%, estádio 3 em 12,3% e estádio 4 (cirrose) em 20,4% dos casos. A análise multivariada mostrou que os fatores de risco para desenvolvimento de cirrose foram: uso de álcool(> 60g/dia, odds ratio 2.01), raça branca (odds ratio 2,2) e idade acima de 55,8 anos (odds ratio 2,2). Conclusões: A infecção crônica pelo VHC foi caracterizada por alta freqüência de formas esporádicas e predominância dos genótipos 1 e 3. Na maioria dos casos o diagnóstico da infecção foi realizado através de exames de rotina. Consumo de álcool acima de 60 g/dia, raça branca e idade acima de 55,8 anos foram fatores de risco para a progressão para a cirrose / Background and aims: Hepatitis C virus infection is considered a world-wide serious public health problem. Since 1992, the epidemiological profile of the infection has changed with the systematic serological testing in blood donors. Nowadays the use of illicit intravenous drugs remains one of the most important risk factor. Nevertheless, in a variable percentage of cases, the mechanisms of contamination can not be identified and those cases are referred as sporadic forms. The current work was aimed at evaluating the demographic and epidemiological profile of HCV infection in outpatients attending the Hepatology branch of the Division of Gastroenterology of University of São Paulo School of Medicine teaching hospital. Patients and methods: From October 2001 and November 2003, 700 out of 1.112 adult patients were enrolled in this study (49% men, 51% women). After the written informed consent was obtained, all patients were interviewed, using standardized questionnaire for collecting data about demographic data, risk factors and alcohol use. Routine serological testing for HCV was performed using third-generation ELISA assays and circulating HCV-RNA was detected by polymerase chain reaction. HCV genotyping was performed in 540 subjects by sequencing of the 5\' UTR region. Liver biopsy slides from 470 patients were available for the assessment of the degree of fibrosis, which was performed according to the criteria of the Brazilian Societies of Pathology and Hepatology Results: There was no significant difference between the mean age of men and women (49 ± 12.2 years and 51 ± 12.5, respectively). 60% had completed no more than basic education, 19.7% had finished high school and 12.4% had graduated from university. 1% worked in activities of the primary sector of economy, 8% in the secondary and 52% in the tertiary one. 62% were caucasian descendants. 67% were catholic. 70% were born in the Southeastern region of Brazil and 97% lived in the State of São Paulo. 60% declared to have a monogamic relationship in the last 6 months. In 68.5% the diagnosis of HCV infection was established by routine check-up tests and in 19.4% during blood donation. The major risk factor for HCV infection was blood transfusion before 1993 (46.4%). 10% of the patients were intravenous drug users, and 3% had both risk factors. In 42% of the cases, the mechanism of infection was considered sporadic. Genotype 1 was found in 70% of the cases, followed by genotype 3 (25%) and genotype 2 (2.7%). Liver fibrosis stage 0 or 1 was found in 48.7%, stage 2 in 18.5%, stage 3 in 12.3% and stage 4 (liver cirrhosis) in 20.4% of cases. Linear regression multivariate analysis showed that risk factors for developing liver cirrhosis were: alcohol abuse (> 60g/day, odds ratio 2.01), caucasian origin (OR 2.2) and age > 55.8 year old (OR 2.2). Conclusions: HCV infection profile in this cohort was characterized by a high frequency of sporadic forms and predominance of genotypes 1 and 3. The infection was diagnosed in most of the cases by routine check-up tests. Heavy alcohol use, caucasian origin and older age were risk factors for progression to cirrhosis