INTRODUÇÃO: o câncer é a doença que mais mata pessoas com idade abaixo de 85 anos e é um problema de saúde pública. Os tumores podem expressar em determinada fase de seu desenvolvimento proteínas anômalas que podem ser alvo de métodos diagnósticos e de intervenções terapêuticas. A expressão de NY-ESO-1 é detectada em 20 a 40% dos melanomas. Há evidências que esta expressão é mais freqüente em tumores de estágios mais avançados e está associada a um pior prognóstico. OBJETIVOS: determinar a frequência de expressão da proteína NY-ESO-1 no melanoma cutâneo e tentar correlacioná-la com o índice de Breslow, aspectos histopatológicos do melanoma, incluindo o infiltrado linfocítico tumoral, e a morbi-mortalidade dos pacientes. MÉTODOS: o presente estudo é longitudinal de coorte retrospectiva e foi realizado de agosto de 2009 a outubro de 2015. Foram selecionados 89 melanomas de 87 pacientes do Ambulatório de Tumores do Departamento de Dermatologia da FMUSP, divididos em 3 grupos, sendo: grupo 1: 34 melanomas com índice de Breslow <= 1,0 mm; grupo 2: 29 melanomas com índice de Breslow entre 1,1 - 4,0 mm e grupo 3: 26 melanomas com índice de Breslow >= 4,0 mm. As lâminas dos exames anátomo-patológicos destes pacientes foram revisadas quanto ao diagnóstico de melanoma, seu índice de Breslow e a presença de infiltrado linfocítico tumoral. A seguir, realizou-se exame de imunohistoquímica para a determinação da presença do antígeno NY-ESO-1 em todos os 89 tumores coletados e em mais 20 nevos (11 displásicos e 9 intradérmicos) escolhidos ao acaso. Através da revisão dos dados do prontuário, foram obtidos os dados clínicos de: idade, sexo, raça, fototipo da pele, local de aparecimento do melanoma, status do linfonodo sentinela quando realizado, desenvolvimento de metástases e sobrevida dos pacientes. Os dados anátomo-patológicos do tumor analisados foram: tipo histológico, presença de ulceração, e tipo de infiltrado linfocítico tumoral. Nos melanomas que apresentavam infiltrado linfocítico tumoral, foram realizados testes imunohistoquímicos para pesquisa de células CD3+, CD8+, FoxP3+ e CD8+FoxP3+ (duplamente positivas). RESULTADOS: O antígeno NY-ESO-1 esteve presente em 19% dos melanomas cutâneos primários e não foi detectado em nenhum dos 20 nevos pesquisados. A expressão do antígeno NY-ESO-1 esteve estatisticamente relacionada a tumores com espessuras maiores. Apresentou também uma associação inversa com o tipo extensivo superficial em relação aos outros tipos histológicos. O infiltrado linfocítico tumoral dos melanomas NY-ESO-1 positivos continha menor número de células CD3+, que se encontravam isoladas ou arranjadas em pequenos grupos de até 5 células, o que contrastava significantemente com os tumores NY-ESO-1 negativos, com maior densidade de células CD3+, dispostas em grandes grupos, com 6 ou mais células. A expressão da proteína NY-ESO-1 não esteve associada à idade, ao sexo, ao fototipo, ao sítio primário do tumor, à presença de ulceração, ao status do linfonodo sentinela, ao desenvolvimento de metástases ou à sobrevida. CONCLUSÕES: Há expressão de NY-ESO-1 em uma porcentagem considerável dos melanomas, principalmente nos mais espessos. O menor número de células CD3+ no infiltrado linfocítico tumoral, acrescido ao fato destas células estarem isoladas ou em pequenos grupos, sugere que embora imunogênico, a expressão do antígeno NY-ESO-1 não resulta num estímulo eficaz do sistema imune no combate ao tumor. O desenvolvimento de uma vacina para estes pacientes poderá, no futuro, aumentar as possibilidades terapêuticas do melanoma / INTRODUCTION: cancer is the disease that leads to the greatest number of deaths in people over 85 years old and it has become a major public health problem. Tumors may express aberrantly proteins during certain phases of their development, which can be target for diagnostic or treatment purposes. NY-ESO-1 is detected in 20 to 40% of melanomas. There is evidence that it is more frequent in advanced stages and that is associated with a worse prognosis. OBJECTIVES: to determine the frequency of NY-ESO-1 protein expression in cutaneous melanoma and to try to correlate it to Breslow index, melanoma histopathological aspects, including the tumor infiltrating lymphocytes, and patients morbi-mortality. METHODS: the present study is longitudinal of retrospective cohort. The research was carried on from August 2009 to October 2015. Eighty nine melanomas were selected from 87 patients in Oncology Outpatient Clinic, Dermatology Division, University of São Paulo and divided in 3 groups, such as: group 1: 34 melanomas with Breslow index <= 1,0 mm; group 2: 29 melanomas with Breslow index between 1,1 - 4,0 mm e group 3: 26 melanomas with Breslow index >= 4,0 mm. All specimens were reviewed for diagnostic, Breslow index and tumor infiltrating lymphocytes. After that, immunohistoquimical test for the presence of NY-ESO-1 antigen was performed in all 89 melanomas collected and in 20 nevi (11 dysplastic nevi and 9 dermal nevi) that were randomly chosen. By reviewing clinical charts, the following data was obtained: age, sex, skin phototype, site of the tumor, lymph node sentinel status, development of metastases and survival of the patients. The histological data analyzed was: histological melanoma type, presence of ulceration, grade of tumor infiltrating lymphocytes. In those melanomas that had tumor infiltrating lymphocytes, we performed immunohistoquimical tests for the presence of CD3+, CD8+, FoxP3+ and CD8+FoxP3+ (double positive) cells. RESULTS: antigen NY-ESO-1 was present in 19% of primary cutaneous melanomas and none of the 20 nevi. The expression of antigen NY-ESO-1 was statistically related to thicker melanomas. It presented also an inverse association with superficial spreading melanoma type compared to other subtypes. Tumor infiltrating lymphocytes of NY-ESO-1 positive melanomas had fewer CD3+ cells, that were isolated or arranged in small groups up to 5 cells, which was significantly different from tumors NY-ESO-1 negatives, with higher density of CD3+ cells, displayed in large groups of 6 or more cells. The expression of NY-ESO-1 protein was not associated to age, sex, phototype, site, ulceration, lymph node sentinel status, development of metastases and survival. CONCLUSIONS: A considerable amount of melanomas express NY-ESO-1, mainly thicker tumors. The fewer number of CD3+ cells in the tumor infiltrating lymphocytes, added to the fact of those cells being isolated or in small groups suggest that, although immunogenic, the expression of NY-ESO-1 antigen does not result in a efficient stimulus of the immune system to fight the tumor. The development of a vaccine to those patients may, in the future, enhance the roll of therapeutic possibilities for melanoma

Dados recentes do nosso laboratório demonstram que somente a co-transdução, não a tradução individual, com vetores adenovirais portadores de Interferon-beta (IFN?) (citocina imuno modulatória) e p19Arf (parceira funcional da proteína supressora de tumor p53) resulta na morte celular massiva do melanoma murino B16F10. A capacidade desse tratamento combinado de induzir uma resposta imune antitumoral ainda não foi avaliada. Dessa maneira, o objetivo do presente trabalho foi investigar se células B16F0 tratadas por essa combinação são capazes de induzir uma resposta imune antitumoral em um modelo de vacinação profilático de melanoma. Para isso, essas células foram co-transduzidas com os vetores AdPGp19 e AdPGIFN? e 48 horas depois, inoculadas como agente vacinal no flanco esquerdo (sítio da vacina) de camundongos C57BL/6 imunocompetentes. Sete dias após a última vacinação, esses animais foram desafiados com células B16F10 naïve no flanco direito (sítio do desafio). A progressão tumoral do desafio foi significativamente reduzida, mesmo quando o desafio tumoral foi feito 73 dias após da vacinação. Porém, como os animais imunizados desenvolveram tumores no sítio da vacina, condições para o uso dessas células tratadas foram avaliadas, revelando que: o número de células e de aplicações usadas durante a vacinação tem influência no aparecimento desse tumores, e que apenas com o tratamento combinado os camundongos permanecem livres de tumor. A influência do sistema imune para este resultado foi revelada após protocolo de imunussupressão. Em seguida, o papel da p19Arf e do IFN? na proteção antitumoral da combinação foi estudado. In vitro, os efeitos antitumorais da combinação parecem ser mais influentes da reposição de p19Arf do que da expressão de IFN?, mas já in vivo, na presença do sistema imune, foram mais dependentes do IFN?. Com a combinação estes efeitos mostraram-se mais pronunciados, induzindo uma proteção antitumoral e maior sobrevida aos animais vacinados. Estes resultados indicam que a combinação p19Arf e IFN? pode ser aplicada como um agente imunoterápico e sugerem que a associação entre morte celular e imuno estimulação pode beneficiar o tratamento contra o câncer / Previously, we have shown in a mouse melanoma model of in situ gene therapy that co-transduction, but not individual application, with adenovirus vectors expressing the Interferon-beta (IFN?) (immune modulatory cytokine) and p19Arf (functional partner of the p53 tumor suppressor) transgenes results in massive cell death and reduced tumor progression. However, the capability of this combined treatment to stimulate an antitumor immune response has not been evaluated. Therefore, the aim of this work was to investigate, trough a prophylactic vaccine model, if B16F10 cells treated by the p19Arf and IFN? combination could induce such immune response. To do so, these cells were co-transduced by the AdPGp19 e AdPGIFN? adenoviral vectors and 48 hours after, inoculated as a vaccine agent in the left flank (vaccine site) of immune competent C57BL/6 mice. Seven days after the last vaccine, a tumor challenge was done with naïve B16F10 cells in the right flank (challenge site). Tumor progression was markedly reduced, even when challenge was done 73 days after the vaccination. However, since these animals developed tumors where the vaccine was applied, more appropriate conditions for the use of these treated cells were pursued, thus revealing that: the number of cells and inoculations can dictate tumor development, and also, that only with the combined treatment was tumor formation abolished. The influence of the immune system for this result was revelead by performing an immune supression protocol. Next, the roles of p19Arf and of IFN? were studied. In vitro, the antitumor effects were stronger upon the introduction of p19Arf than IFN?, but in vivo, in the presence of the immune system, the effects were more IFN? dependent. In fact, these effects were more pronouced with the combined treatment, inducing protection against tumor formation and progression and increasing survival in the vaccinated animals. Taken together, these results demonstrate the application of cells treated by the p19Arf e IFN? combination as an effective vaccine agent and also indicates that the association between cell death and immune stimulation may benefit the treatment of cancer

As muitas formas diferentes de câncer representam uma grande dimensão no âmbito da saúde pública mundial. Embora os esforços da medicina diagnóstica, vários tumores permanecem sem resposta à terapia tradicional. Uma alternativa é o uso de terapia gênica, a qual consiste a transferência de um gene terapêutico para a célula tumoral com a expectativa de inibição da progressão tumoral. Nosso laboratório desenvolveu uma série de vetores adenovirais onde a expressão do transgene é controlada pela p53 e usamos esses vetores para mostrar que a presença de p19Arf (um parceiro funcional de p53) sensibiliza células de melanoma murino, B16-F10 (p53-tipo selvagem), associado à ação do interferão-beta (IFNbeta, uma citocina pleiotrópica) quando testado in vitro. Mesmo que os vetores adenovirais representem o sistema de transferência gênica mais utilizado para a terapia de genes de câncer, seu uso por via sistêmica é limitado principalmente por inativação pelo sistema imune. Diferentes técnicas visam proteger as partículas de vírus do sistema imunológico e direcioná-las para o leito tumoral. Uma dessas técnicas envolve a utilização de células estaminais mesenquimais (MSCs). As propriedades dos MSC incluem a auto renovação, o potencial de diferenciação, bem como a sua capacidade de migrar e infiltrar tumores. Para este fim, nosso objetivo era utilizar MSCs murinos como portadores de adenovírus que expressam IFNbeta e para verificar se a presença de p19Arf nas células tumorais aumentaria a sua sensibilidade para IFNbeta. Para itso, os CTMs foram isolados da medula óssea ou do tecido adiposo de ratinhos C57BL/ 6 machos. Foi verificada a presença de marcadores de CTM (Sca1, CD29) e a ausência de marcadores para linhagens hematopoiéticas (CD31, CD11b, CD45). Sendo as CTM do tecido adiposo foram mais fáceis de cultivar, estes foram utilizados nos seguintes ensaios. In vitro, a aplicação do vector adenoviral que codifica um gene repórter (eGFP) resultou em mais de 70% de eficiênciamde transdução de CTM, sem indução de alterações morfológicas até 72 horas após o tratamento. A aplicação de vector portador de IFNbeta também foi bem tolerada, no entanto transdução com p19Arf sozinho ou em combinação com IFNbeta induziu alterações morfológicas nas CTMs. Em seguida, as células B16-F10 foram transduzidas ou não com o vetor codificando p19Arf e co-cultivadas com MSCs que foram transduzidas ou não com IFNbeta, demonstrando que a presença de p19Arf confere sensibilidade aumentada de células B16-F10 ao tratamento com IFNbeta . Em ensaios preliminares, os tumores B16-F10 foram estabelecidos subcutaneamente em camundongos C57BL / 6 e, posteriormente, as MSC marcadas com eGFP foram aplicadas na circulação após a injeção da veia da cauda. Após 48 horas, estes tumores foram recuperados e a presença de células positivas para eGFP foi confirmada, indicando que os MSCs se infiltraram no microambiente do tumor / The many different forms of cancer represent a tremendous investment for public health all over the world. Although the efforts of both diagnostic and therapeutic medicine have reduced the number of deaths due to cancer, many tumor types remain impervious to traditional therapy. An alternative is the use of gene therapy which entails the transfer of a therapeutic gene to the tumor cells with the expectation of inhibiting tumor progression. Our laboratory has developed a series of adenoviral vectors where transgene expression is controlled by p53 and we have used these vectors to show that the presence of p19Arf (a functional partner of p53) sensitizes murine melanoma cells, B16-F10 (p53-wild type), to the action of interferon-beta (IFNbeta, a pleiotropic cytokine) when tested in vitro. Even though adenoviral vectors are the most utilized gene transfer system for cancer gene therapy, their systemic application is limited principally by immune inactivation. Different techniques aim to protect the virus particles from the immune system and to direct them to the tumor bed. One of these techniques involves the utilization of mesenchymal stem cells (MSCs). The properties of MSCs include self-renewal, the potential for differentiation as well as their ability to migrate to and infiltrate tumors. To this end, our objective was to utilize murine MSCs as carriers of adenovirus that express IFNbeta and to verify if the presence of p19Arf in the tumor cells would enhance their sensitivity to IFNbeta. For this, MSCs were isolated from bone marrow or adipose tissue from male C57BL/6 mice. The presence of MSC markers (Sca1, CD29) was verified as was the absence of markers for hematopoietic lineages (CD31, CD11b, CD45). Since the MSCs from adipose tissue were easier to cultivate, these were utilized in the following assays. In vitro, application of the adenoviral vector encoding a reporter gene (eGFP) at a multiplicity of infection of 1000 resulted in the transduction of more than 70% of the MSCs and without the induction of morphological alterations even by 72 hours post treatment. The application of a vector encoding IFN? was also well tolerated, however transduction with p19Arf alone or in combination with IFNbeta induced morphologic alterations in the MSCs. Next, B16-F10 cells were transduced or not with the vector encoding p19Arf and co-cultivated with MSCs that had been transduced or not with IFNbeta, demonstrating that the presence of p19Arf confers enhanced sensitivity of B16-F10 cells to the treatment with IFN?. In preliminary assays, B16-F10 tumors were established subcutaneously in C57BL/6 mice and later MSCs labeled with eGFP were applied in the circulation upon tail vein injection. After 48 hours, these tumors were recovered and the presence of eGFP-positive cells was confirmed, indicating that the MSCs infiltrated the tumor microenvironment

INTRODUÇÃO: O melanoma cutâneo constitui cerca de 3% de todos os tumores da pele. Atinge indivíduos jovens com média de idade de aparecimento entre 50 e 58 anos. Em torno de 20% dos doentes apresentarão doença avançada e morrerão antes de completar cinco anos de sobrevida. CASUÍSTICA E MÉTODOS: Neste estudo retrospectivo de 364 casos acompanhados de maio de 1993 a janeiro de 2006 descreveram-se as variáveis: sexo, idade, cor, localização da lesão primária, tipo de crescimento, espessura de Breslow, nível de Clark, presença de ulceração, estadiamento e suas correlações. RESULTADOS: Predominou o sexo feminino (58,8%) resultando em uma proporção de 1,4 mulheres para cada homem. A média das idades dos pacientes foi de 58,9 anos e a mediana de 61,0 anos. Pacientes não-brancos constituíram 13,7% da amostra. Para homens e mulheres o melanoma cutâneo localizou-se, predominantemente no tronco (24,3-38,0%) e pés (21,4-23,9%). O melanoma acrolentiginoso representou 22,3% de toda amostra. Os padrões melanoma expansivo superficial e melanoma nodular (p < 0,001) e lesões no tronco (52,8%) predominaram nos indivíduos brancos. O melanoma acrolentiginoso (64%) e a localização nos pés (68,2%)prevaleceram nos pacientes não-brancos. Observou-se minoria de casos com lesão primária in situ (14,6%- EC 0) e alto percentual de melanoma cutâneo espesso (39,7% > 4,0 mm). Presença de ulceração foi observada em 13,4% para tumores finos (= 1,0 mm). Homens apresentaram lesões mais espessas (p = 0,011) e ulceradas (p < 0,001) em relação às mulheres, assim como idosos em relação à não idosos (p = 0,021 para a espessura e p = 0,015 para ulceração). A sobrevida média para os pacientes com doença localizada foi de 97,8 meses e a taxa de sobrevida específica para melanoma cutâneo foi de 85,1% em três anos. CONCLUSÕES: Esta amostra constituiu-se de pacientes com tumores espessos e ulcerados denotando diagnóstico tardio do melanoma cutâneo e pior prognóstico. Caracterizou-se por apresentar predomínio de mulheres, de pacientes não-brancos, de lesões nas extremidades e de melanoma acrolentiginoso. / INTRODUCTION: Cutaneous melanoma represents around 3% of all skin tumors. Affecting young patients, with mean age between 50 and 58 years old. About 20% of the patients will have advanced disease and will die before five years of survival. CASUISTIC AND METHODS: In this retrospective study of 364 cases recorded from May 1993 to January 2006 at the Melanoma Unit of Santa Casa de São Paulo the following variables were described: sex, age, skin color, tumor site, growth pattern, tumor thickness, Clark level, ulceration, staging and their correlations. RESULTS: Female (58,8%) prevailed resulting in 1,4 women for each man. The mean age of the patients was 58,9 years old and the median, 61,0 years old. Non-white patients were 13,7% of the sample. The anatomic site of cutaneous melanoma on men and women prevailed at trunk (24,3 – 38,0%) and feet (21,4 – 23,9%). Acral entiginous melanoma represented 22,3% of the cohort. Superficial expansive melanoma and nodular melanoma patterns (p<0,001) and trunk lesions (52,8%) predominated on white patients. Acral lentiginous melanoma (64%) and feet anatomic site 68,2%) prevailed on non-white patients. In situ primary lesions were observed in few cases (14,6% - EC 0) and there was high percentage of thick cutaneous melanoma (39,7% > 4,0 mm). In thin tumors (=1,0 mm) were found 13,4% of ulceration. Thickener (p = 0,011) and ulcerated lesions (p < 0,001) were found more in male and in elderly patients (p = 0,021 for thickeness and p = 0,015 for ulceration). The mean survival of patients with local disease was 97,8 months and the three-year survival rate for cutaneous melanoma was 85,1%. CONCLUSIONS: The cohort consisted mostly of thick and ulcerated tumors, which meant late diagnosis and bad prognosis. Also distinguished by considerable prevalence of female, non-white patients, limb lesions and acral lentiginous melanoma.

A vascularização tem um papel central na progressão tumoral e representa um alvo terapêutico de grande interesse. A inibição da angiogênese tem potencial de retardar a progressão tumoral e inibir metástase. Em decorrência disto, terapias anti-angiogênicas têm demonstrado ser promissora no controle do crescimento tumoral. Segundo a literatura, interferon-? (IFN?, ativador do sistema imune inato e adaptativo) e p19Arf (supressor de tumor e parceiro funcional de p53), quando estudados individualmente, alteram a vasculatura tumoral. Nosso grupo construiu e utilizou vetores adenovirais recombinantes portadores dos cDNAs de INFbeta e p19Arf e observou que a transferência desta combinação de genes induziu morte celular e diminuiu progressão tumoral, resultados foram observados em modelos murinos de melanoma B16 de terapia genica in situ, vacina profilática e vacina terapêutica. Neste trabalho, exploramos a ideia que a combinação dos vetores adenovirais portadores de INFbeta e p19Arf proporcionam efeitos anti-angiogênicos através de seu impacto em células endoteliais. Para averiguarmos essa hipótese, células endoteliais murinas (tEnd) foram transduzidas com os vetores adenovirais, revelando que o vetor Ad-p19 confere inibição da proliferação, formação de tubos, migração e induz aumento na expressão de genes relacionados a via de p53 e morte celular. O vetor Ad-IFNbeta sozinho ou adicionado em combinação com Ad-p19, não teve impacto significante nestes ensaios. Alternativamente, a influencia indireta, ou parácrina, nas células tEnd cultivadas juntamente com as células B16 transduzidas com os vetores adenovirais também foi investigada. Quando as células B16 foram transduzidas com Ad-IFNbeta ou a co-transdução Ad-IFNbeta+Ad-p19 em co-cultura com a linhagem tEnd, houve inibição da proliferação. Não observamos efeito inibitório na tEnd da co-cultura quando as células da B16 foram transduzidas somente com Ad-p19. Seguindo o ensaio de co-cultura, produzimos meio condicionado da B16 transduzida com os vetores e aplicamos esses meios nas células tEnd. Observamos que Ad-IFN, sozinho ou em combinação com Ad-19, diminuiu a viabilidade, proliferação e levou a morte das células tEnd. Neste trabalho, constamos que inibição de células endoteliais pode ser realizada por transdução direta com Ad-19 ou quando estas células são expostas ao ambiente modulado por células tumorais transduzidas com o vetor Ad-IFNbeta. Mesmo que a transferência gênica de ambos IFNbeta e p19Arf não demonstrou ser uma abordagem superior à aplicação dos genes isolados, observamos que nossa abordagem pode ter um impacto importante na inibição da angiogênese pelas células endoteliais / The vasculature plays a central role in tumor progression and represents a therapeutic target of great interest. Inhibition of angiogenesis has the potential to slow down tumor progression and inhibit metastasis. As a result, anti-angiogenic therapies have been shown to be promising for the control of tumor growth. According to the literature, interferon ? (IFN?, activator of the innate and adaptive immune systems) and p19Arf (tumor suppressor and functional partner of p53) when studied individually alter tumor vasculature. Our group has constructed and used recombinant adenovirus vectors carrying the cDNAs of INFbeta and p19Arf and noted that the transfer of this combination of genes induced cell death and decreased tumor progression, as observed in the B16 murine model of in situ melanoma gene therapy as well as prophylactic and therapeutic vaccine approaches. In this study, we explore the idea that the combination of adenoviral vectors bearing INFbeta and p19Arf produce anti-angiogenic effects due to their impact on endothelial cells. To test this hypothesis, murine endothelial cells (tEnd) were transduced with adenoviral vectors, revealing that Ad-p19 vector confers inhibition of proliferation, tube formation, migration and induces increased expression of genes related to the p53 cell death pathway. The Ad-IFNbeta vector alone had no significant impact on these tests. Alternatively, influences on paracrine effects are evaluated on endothelial cells co-cultured with B16 cells that were previously transduced with adenoviral vectors. When the B16 cells were transduced with Ad-IFNbeta or co-transduced with Ad-IFNbeta + Ad-p19, co-culture resulted in the inhibition of proliferation of the endothelial cells. When B16 cells were transduced with Ad-p19 only, co-culture did alter endothelial cell behavior. Following the co-culture assay, we produce conditioned medium from B16 cells that were transduced with the vectors and applied the media on tEnd cells. We noted that conditioned medium derived from B16 transduced with Ad-IFN alone or in combination with Ad-19 decreased the viability and proliferation and induced cell death of tEnd. In this work, we show that inhibition of endothelial cells can be performed directly by transduction with Ad-19 or when such cells are exposed to the environment modulated by tumor cells transduced with Ad-IFNbeta. Even though the gene transfer of both IFNbeta and p19 was not found to be superior to the application of single genes, we observed that our approach may have an important impact on the inhibition of angiogenesis through endothelial cells

Nas últimas décadas a medicina nuclear tornou-se uma grande aliada no auxílio ao diagnóstico de doenças e também para o tratamento do câncer. Parte deste sucesso está relacionada à constante pesquisa e desenvolvimento de novos radiofármacos. Uma classe de molécula que vem se mostrando promissora para o tratamento de tumores, tanto na sua forma orgânica quanto na forma de complexos organo-metálicos, é a tiossemicarbazona e seus derivados, os quais também podem formar complexos com radioisótopos metálicos dando origem a radiofármacos para diagnóstico e terapia. Neste trabalho foram preparados complexos com o ligante benzil-5-hidroxi-3-metil-5-fenil-4,5-diidro-1H-pirazol-1-carboditionato (H2bdtc) com os radioisótopos [99mTc]tecnécio, (67/68Ga)gálio e (111In)índio, e foram avaliados a pureza radioquímica, Log P e a estabilidade na presença de L-cisteína, L-histidina, soro albumina humana (SAH) e plasma de sangue humano; também foram avaliadas a taxa de captação dos radiofármacos in vitro em células de melanoma murino B16F10 e TM1M, além da avaliação da captação ex vivo e in vivo utilizando camundongos C57B/6 inoculados com as duas linhagens tumorais. Com o [99mT]tecnécio foram obtidos dois complexos diferentes, dependendo da concentração do PBS na solução, sendo que em um deles foi possível confirmar sua estrutura como [[99mTc]O(bdtc)(Hbdtc)] a partir do complexo de rênio [ReO(bdtc)(Hbdtc)], o outro complexo de [99mTc]tecnécio, bem como de (67/68Ga)gálio e (111In)índio não tiveram a estrutura caracterizada. A eficiência de marcação dos complexos foi superior a 90 %, com Log P maior que 1 para os complexos [[99mTc]O(bdtc)(Hbdtc)], [[99mTc]-bdtc] e [67/68Ga-bdtc] e 0,9 para [111In-bdtc]. Todos os complexos se mostraram com boa estabilidade na presença de L-cisteína e L-histidina, principalmente na primeira hora de incubação, mas não o foram na presença de SAH e plasma. A captação in vitro dos complexos em células B16F10 e TM1M variou entre 0,6 % e 1,8 %, e nos estudos de biodistribuição ex vivo foi obesrvada intensa e persistente captação hepática e no baço, superando 90 %, e captação no tumor variando de 0,2 % a 3 %, enquanto que nas imagens in vivo não foi possível observar de forma uma adequada captação nos tumores a ponto de permitir o uso como agente de diagnóstico. Os resultados permitem concluir que os complexos de derivados tiossemicarbazonas podem formar complexos com diferentes metais, mas novos derivados devem ser preparados para tentar melhorar o desempenho nos sistemas biológicos. Os experimentos com animais foram aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina - USP, processo 372/12 / In recent decades, nuclear medicine has been used as diagnostic agent for disease and for the treatment of cancer. Part of this success is related to the constant research and development of new radiopharmaceuticals. Thiosemicarbazone and their derivatives have proven to be promising agent for the treatment of tumors, both in its organic form or as organo-metallic complexes. Also, they can to form complexes with metal radioisotopes giving radiopharmaceuticals for diagnosis and therapy. In this work we prepared complex of benzyl-5-hydroxy-3-methyl-5-phenyl-4,5-dihydro-1H-pyrazol-1-carboditionato (H2bdtc) with radioisotopes [99mTc]technetium (67/68Ga)gallium and (111In)indium and the radiochemical purity, Log P and stability in the presence of L-cysteine, L-histidine, human serum albumin (HSA) and human blood plasma were assessed; also were assessed the in vitro uptake rate of radiopharmaceuticals in murine melanoma cells B16F10 and TM1M, besides the evaluation of ex vivo uptake and in vivo using C57Bl/6 mice inoculated with both tumor lines. With [99mT] technetium two different complexes were obtained, depending on the concentration of the PBS in the solution, and one of them was had its structure to confirm as [[99mTc]O(bdtc)(Hbdtc)] from the standard rhenium complex [ReO(bdtc)(Hbdtc)], the other [99mTc] echnetium complex as well as (67/68Ga)gallium and (111In)indium not have characterized the structure. The labeling efficiency of compleos was higher than 90%, with log P higher than 1 for the complexes [[99mTc]O(bdtc)(Hbdtc)], [[99mTc]-bdtc] and [(67/68Ga)-bdtc] and 0.9 to [111In-bdtc]. All the complexes showed good stability in the presence of L-cysteine and L-histidine, especially in the first hour of incubation, but not in the presence of HSA and plasma. The uptake in vitro complexes in B16F10 and TM1M cells varied between 0.6% and 1.8%, and in ex vivo biodistribution studies was obesrvada intense and persistent liver uptake and spleen, exceeding 90%, and tumor uptake in changing from 0.2% to 3%, while in vivo imaging was not possible to observe a properly uptake in tumors, not allowing to use these molecules as a diagnostic agent. The results indicate that the thiosemicarbazone derivative complex can give complexes with different metals, but new derivatives should be prepared to try to improve performance in biological systems. The animal experimentation was approved by Comissão de Ética em Pesquisa da Faculdade de Medicina - USP, proccess 372/12

As muitas formas diferentes de câncer representam uma grande dimensão no âmbito da saúde pública mundial. Embora os esforços da medicina diagnóstica, vários tumores permanecem sem resposta à terapia tradicional. Uma alternativa é o uso de terapia gênica, a qual consiste a transferência de um gene terapêutico para a célula tumoral com a expectativa de inibição da progressão tumoral. Nosso laboratório desenvolveu uma série de vetores adenovirais onde a expressão do transgene é controlada pela p53 e usamos esses vetores para mostrar que a presença de p19Arf (um parceiro funcional de p53) sensibiliza células de melanoma murino, B16-F10 (p53-tipo selvagem), associado à ação do interferão-beta (IFNbeta, uma citocina pleiotrópica) quando testado in vitro. Mesmo que os vetores adenovirais representem o sistema de transferência gênica mais utilizado para a terapia de genes de câncer, seu uso por via sistêmica é limitado principalmente por inativação pelo sistema imune. Diferentes técnicas visam proteger as partículas de vírus do sistema imunológico e direcioná-las para o leito tumoral. Uma dessas técnicas envolve a utilização de células estaminais mesenquimais (MSCs). As propriedades dos MSC incluem a auto renovação, o potencial de diferenciação, bem como a sua capacidade de migrar e infiltrar tumores. Para este fim, nosso objetivo era utilizar MSCs murinos como portadores de adenovírus que expressam IFNbeta e para verificar se a presença de p19Arf nas células tumorais aumentaria a sua sensibilidade para IFNbeta. Para itso, os CTMs foram isolados da medula óssea ou do tecido adiposo de ratinhos C57BL/ 6 machos. Foi verificada a presença de marcadores de CTM (Sca1, CD29) e a ausência de marcadores para linhagens hematopoiéticas (CD31, CD11b, CD45). Sendo as CTM do tecido adiposo foram mais fáceis de cultivar, estes foram utilizados nos seguintes ensaios. In vitro, a aplicação do vector adenoviral que codifica um gene repórter (eGFP) resultou em mais de 70% de eficiênciamde transdução de CTM, sem indução de alterações morfológicas até 72 horas após o tratamento. A aplicação de vector portador de IFNbeta também foi bem tolerada, no entanto transdução com p19Arf sozinho ou em combinação com IFNbeta induziu alterações morfológicas nas CTMs. Em seguida, as células B16-F10 foram transduzidas ou não com o vetor codificando p19Arf e co-cultivadas com MSCs que foram transduzidas ou não com IFNbeta, demonstrando que a presença de p19Arf confere sensibilidade aumentada de células B16-F10 ao tratamento com IFNbeta . Em ensaios preliminares, os tumores B16-F10 foram estabelecidos subcutaneamente em camundongos C57BL / 6 e, posteriormente, as MSC marcadas com eGFP foram aplicadas na circulação após a injeção da veia da cauda. Após 48 horas, estes tumores foram recuperados e a presença de células positivas para eGFP foi confirmada, indicando que os MSCs se infiltraram no microambiente do tumor / The many different forms of cancer represent a tremendous investment for public health all over the world. Although the efforts of both diagnostic and therapeutic medicine have reduced the number of deaths due to cancer, many tumor types remain impervious to traditional therapy. An alternative is the use of gene therapy which entails the transfer of a therapeutic gene to the tumor cells with the expectation of inhibiting tumor progression. Our laboratory has developed a series of adenoviral vectors where transgene expression is controlled by p53 and we have used these vectors to show that the presence of p19Arf (a functional partner of p53) sensitizes murine melanoma cells, B16-F10 (p53-wild type), to the action of interferon-beta (IFNbeta, a pleiotropic cytokine) when tested in vitro. Even though adenoviral vectors are the most utilized gene transfer system for cancer gene therapy, their systemic application is limited principally by immune inactivation. Different techniques aim to protect the virus particles from the immune system and to direct them to the tumor bed. One of these techniques involves the utilization of mesenchymal stem cells (MSCs). The properties of MSCs include self-renewal, the potential for differentiation as well as their ability to migrate to and infiltrate tumors. To this end, our objective was to utilize murine MSCs as carriers of adenovirus that express IFNbeta and to verify if the presence of p19Arf in the tumor cells would enhance their sensitivity to IFNbeta. For this, MSCs were isolated from bone marrow or adipose tissue from male C57BL/6 mice. The presence of MSC markers (Sca1, CD29) was verified as was the absence of markers for hematopoietic lineages (CD31, CD11b, CD45). Since the MSCs from adipose tissue were easier to cultivate, these were utilized in the following assays. In vitro, application of the adenoviral vector encoding a reporter gene (eGFP) at a multiplicity of infection of 1000 resulted in the transduction of more than 70% of the MSCs and without the induction of morphological alterations even by 72 hours post treatment. The application of a vector encoding IFN? was also well tolerated, however transduction with p19Arf alone or in combination with IFNbeta induced morphologic alterations in the MSCs. Next, B16-F10 cells were transduced or not with the vector encoding p19Arf and co-cultivated with MSCs that had been transduced or not with IFNbeta, demonstrating that the presence of p19Arf confers enhanced sensitivity of B16-F10 cells to the treatment with IFN?. In preliminary assays, B16-F10 tumors were established subcutaneously in C57BL/6 mice and later MSCs labeled with eGFP were applied in the circulation upon tail vein injection. After 48 hours, these tumors were recovered and the presence of eGFP-positive cells was confirmed, indicating that the MSCs infiltrated the tumor microenvironment

A incidência do melanoma cutâneo em pacientes adultos jovens tem aumentado consideravelmente nos últimos anos. Há, contudo, carência de conhecimentos clinicopatológicos e moleculares sobre os melanomas que ocorrem nessa faixa etária. O presente estudo teve por objetivo avaliar 132 casos de melanoma cutâneo primário em pacientes com idade entre 18 e 30 anos, com ênfase no estudo das características clínicas, histopatológicas e avaliação molecular das mutações nos genes BRAF, NRAS e KIT. Em relação aos achados clínicos e histopatológicos, houve predomínio de indivíduos do sexo feminino (61,4%), sendo o tronco o sítio anatômico mais comumente envolvido (44,3%) e o melanoma extensivo superficial o tipo histológico predominante (79,5%). A mutação V600E no gene BRAF (BRAFV600E) foi analisada em 93 casos, utilizando-se a técnica de RT-PCR. Essa mutação foi identificada em 38,7% (36/93) e, estatisticamente, associada à fase vertical de crescimento (p = 0,01), infiltrado inflamatório discreto (p = 0,02) e presença de mitose intradérmica (p = 0,004). Houve, ainda, forte indício de associação com a presença de ulceração (p = 0,05). Todas essas variáveis apresentaram associação com pior prognóstico do melanoma cutâneo. Observou-se predomínio da mutação BRAFV600E em regiões anatômicas relacionadas à exposição solar intermitente. Nenhum caso de melanoma com fenômeno de regressão apresentou mutação BRAFV600E (p < 0,05). Não houve associação significativa entre BRAFV600E e sexo, tipo histológico, nível de Clark, índice de Breslow, elastose solar, invasão angiolinfática e perineural, satelitose, nevo melanocítico coexistente e sobrevida. A pesquisa de mutações NRAS, pela técnica de RT-PCR, detectou frequência de 3,95% (3/76). As três mutações encontradas foram do tipo 61K e ocorreram em pacientes do sexo masculino e em região de cabeça e pescoço. As mutações BRAFV600E e NRAS, quando presentes, eram mutuamente exclusivas. A frequência de mutações KIT, analisadas por sequenciamento, foi de 11,1% (3/27). As três mutações identificadas estavam localizadas no éxon 9 (G510, G498S e 489I). Houve concomitância de casos com mutação KIT tanto com NRAS, como com BRAFV600E. Devido ao pequeno número de casos com mutação em KIT e NRAS, não foi possível estabelecer correlações clínicas e histopatológicas com esses genes. Este estudo é o primeiro a descrever as mutações G510D e G498S no gene KIT em melanomas cutâneos. No presente estudo, a mutação BRAFV600E, em melanomas cutâneos de adultos jovens, correlacionou-se com características anatomoclínicas de pior prognóstico em relação aos melanomas selvagens para BRAFV600E / The incidence of cutaneous melanoma in young adults has dramatically increased in recent years. However, there is scarce data about the clinicopathological and molecular characteristics on the melanomas occurring at this age group. The present study aimed to evaluate 132 patients aged between 18 and 30 years with primary cutaneous melanoma with emphasis on the study of clinical, histopathological characteristics and molecular evaluation of mutations in BRAF, NRAS and KIT genes. Regarding the clinical and histopathological findings, the following results were found: female predominance (61.4%), trunk was the most commonly anatomical site involved (44.3%) and superficial spreading melanoma, was the most common histological type (79.5 %). The V600E mutation in BRAF (BRAFV600E) gene was analyzed in 93 cases, using RT-PCR. It was present in 38.7% (36/93) and statistically related to the vertical growth phase (p = 0.01), mild inflammatory infiltration (p = 0.02) and the presence of intradermal mitosis (p = 0.004). There was, also, strongly evidence of an association with the presence of ulceration (p = 0.05). Worse prognosis was associated with these variables. There was a predominance of BRAFV600E mutation in anatomical regions related to intermittent sun exposure. No cases of melanoma with BRAFV600E mutation showed regression phenomenon (p < 0.05). There was no significant association between BRAFV600E and gender, histological type, Clark level, Breslow thickness, solar elastosis, angiolymphatic and perineural invasion, sattelitosis, coexisting melanocytic nevus and survival. The presence of a mutation in NRAS, by RT-PCR was seen in 3.95% (3/76) of the cases. All these three mutations were of type 61K, occurred in male patients and the head and neck region. BRAFV600E and NRAS mutations, when present, were mutually exclusive. The frequency of KIT mutations, analyzed by sequencing, was 11.1% (3/27). The three mutations identified in this gene were located in exon 9 (G510, G498S and 489I). Concomitant mutations were found between KIT and NRAS and BRAFV600E. Due to the small number of KIT and NRAS mutated cases, it was not possible to establish clinical and histopathological correlations and mutation status in these genes. This study was the first to describe the G510D and G498S mutations in KIT gene in cutaneous melanomas. In the present study, BRAFV600E mutation in cutaneous melanoma of young adults correlated with anatomic and clinical features of worse prognosis compared to wild type

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:37:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_maria_cecilia_florisbal_dame.pdf: 53923 bytes, checksum: e82c085a8b324064158221bf46a754ba (MD5) Previous issue date: 2013-12-12 / This thesis is a continuation of a research project started with a diagnosis of dermatosis mechano-bullosa in a herd of buffaloes from a farm in southern Rio Grande do Sul. After this diagnostic it was created an experimental herd where several congenital defects and / or hereditary disorders have been diagnosed during more than two decades. These diseases were studied by a research group which the author of this thesis is a member. Thus, three papers are presented: the first one is a literature review about what has been diagnosed in Brazil on congenital defects and hereditary diseases in buffalo. It was concluded that undesirable genes are widespread in the population of buffaloes in the country; the second was a study conducted in partnership with UNESP / Jaboticabal, SP and UFCG / CSTR-Patos, PB to identify the mutation in the gene that determines the oculo-cutaneous albinism in Murrah buffalo. Another paper was accomplished to describe the occurrence of malignant melanoma in two albino buffalo. Although it is not a congenital or hereditary disease it was observed only in the buffalo with oculocutaneous albinism and probably the condition is associated with a predisposition of these animals to develop tumors in the skin. / Esta tese dá continuidade a um projeto de pesquisa iniciado com o diagnóstico de dermatose mecanobolhosa em 1985 em um rebanho de búfalos pertencente a uma propriedade da zona sul do Rio Grande do Sul. A partir desse diagnóstico foi criado um rebanho experimental no qual por mais de duas décadas foram diagnosticados diversos defeitos congênitos e/ou hereditários que foram estudados por um grupo de pesquisa do qual faz parte a autora desta tese. Assim sendo, são apresentados três artigos científicos: o primeiro trata-se de uma revisão bibliográfica sobre o que foi diagnosticado no Brasil em relação a defeitos congênitos/doenças hereditárias em bubalinos concluindo-se que alguns genes indesejáveis estão disseminados na população de búfalos no País; o segundo foi um trabalho realizado em parceria com a UNESP/Jaboticabal, SP e com a UFCG/CSTR-Patos, PB que identificou a alteração no gene que determina o albinismo óculo-cutâneo em búfalos da raça Murrah. O terceiro artigo trata-se da descrição de melanoma maligno observado em dois búfalos albinos. Embora não seja um defeito congênito ou hereditário este neoplasma ocorreu somente nos búfalos com albinismo óculo-cutâneo do rebanho e acredita-se que a condição esteja associada à predisposição desses animais a desenvolverem tumores de pele.

Seleção de características é um tópico muito importante em aplicações de reconhecimento de padrões, especialmente em bioinformática, cujos problemas são geralmente tratados sobre um conjunto de dados envolvendo muitas variáveis e poucas observações. Este trabalho analisa aspectos de seleção de características no problema de identificação de redes de regulação gênica a partir de sinais de expressão gênica. Particularmente, propusemos um modelo de redes gênicas probabilísticas (PGN) que devolve uma rede construída a partir da aplicação recorrente de algoritmos de seleção de características orientados por uma função critério baseada em entropia condicional. Tal critério embute a estimação do erro por penalização de amostras raramente observadas. Resultados desse modelo aplicado a dados sintéticos e a conjuntos de dados de microarray de Plasmodium falciparum, um agente causador da malária, demonstram a validade dessa técnica, tendo sido capaz não apenas de reproduzir conhecimentos já produzidos anteriormente, como também de produzir novos resultados. Outro aspecto investigado nesta tese é o fenômeno da predição intrinsecamente multivariada (IMP), ou seja, o fato de um conjunto de características ser um ótimo caracterizador dos objetos em questão, mas qualquer de seus subconjuntos propriamente contidos não conseguirem representá-los de forma satisfatória. Neste trabalho, as condições para o surgimento desse fenômeno foram obtidas de forma analítica para conjuntos de 2 e 3 características em relação a uma variável alvo. No contexto de redes de regulação gênica, foram obtidas evidências de que genes alvo de conjuntos IMP possuem um enorme potencial para exercerem funções vitais em sistemas biológicos. O fenômeno conhecido como canalização é particularmente importante nesse contexto. Em dados de microarray de melanoma, constatamos que o gene DUSP1, conhecido por exercer função canalizadora, foi aquele que obteve o maior número de conjuntos de genes IMP, sendo que todos eles possuem lógicas de predição canalizadoras. Além disso, simulações computacionais para construção de redes com 3 ou mais genes mostram que o tamanho do território de um gene alvo pode ter um impacto positivo em seu teor de IMP com relação a seus preditores. Esta pode ser uma evidência que confirma a hipótese de que genes alvo de conjuntos IMP possuem a tendência de controlar diversas vias metabólicas cruciais para a manutenção das funções vitais de um organismo. / Feature selection is a crucial topic in pattern recognition applications, especially in bioinformatics, where problems usually involve data with a large number of variables and small number of observations. The present work addresses feature selection aspects in the problem of gene regulatory network identification from expression profiles. Particularly, we proposed a probabilistic genetic network model (PGN) that recovers a network constructed from the recurrent application of feature selection algorithms guided by a conditional entropy based criterion function. Such criterion embeds error estimation by penalization of rarely observed patterns. Results from this model applied to synthetic and real data sets obtained from Plasmodium falciparum microarrays, a malaria agent, demonstrate the validity of this technique. This method was able to not only reproduce previously produced knowledge, but also to produce other potentially relevant results. The intrinsically multivariate prediction (IMP) phenomenon has been also investigated. This phenomenon is related to the fact of a feature set being a nice predictor of the objects in study, but all of its properly contained subsets cannot predict such objects satisfactorily. In this work, the conditions for the rising of this phenomenon were analitically obtained for sets of 2 and 3 features regarding a target variable. In the gene regulatory networks context, evidences have been achieved in which target genes of IMP sets possess a great potential to execute vital functions in biological systems. The phenomenon known as canalization is particularly important in this context. In melanoma microarray data, we verified that DUSP1 gene, known by having canalization function, was the one which composed the largest number of IMP gene sets. It was also verified that all these sets have canalizing predictive logics. Moreover, computational simulations for generation of networks with 3 or more genes show that the territory size of a target gene can contribute positively to its IMP score with regard to its predictors. This could be an evidence that confirms the hypothesis stating that target genes of IMP sets are inclined to control several metabolic pathways essential to the maintenance of the vital functions of an organism.