Le système immunitaire est divisé en deux réponses : innée et adaptative. Dans la réponse adaptative, les principaux acteurs sont les cellules T CD8 et CD4, dont l'activation est médiée par le complexe antigène-récepteur (TCR) et la génération de signaux intracellulaires. L'intensité du signal est contrôlée par l'affinité du ligand impliquant la kinase p56lck et la protéine adaptatrice SLP-76. Les souris dépourvues de SLP-76 sont bloquées dans leur développement thymique, ce qui rend difficile l'évaluation de l'importance de l'adaptateur, dans la fonction des cellules T périphériques. Récemment, le laboratoire Rudd a généré une souris knock-in (KI) avec une forme de SLP-76 mutée au niveau d'un seul résidu, K56, ayant des cellules T périphériques normales. Cette mutation empêche SLP-76 de se lier au complexe de pore nucléaire (CPN). L'objectif de ce mémoire est de comprendre le rôle de SLP-76, plus particulièrement du mutant K56E dans le contrôle de certains aspects de la fonction des cellules T périphériques. K56E sur un fond transgénique OT1, a montré une déficience partielle de la fonction et du métabolisme des cellules T en réponse à des ligands peptidiques d'ovalbumine de poulet, de différentes affinités. Plus précisément, les voies de la glycolyse et de la phosphorylation oxydative en ont été altérées. Dans l'ensemble, l'altération des fonctions et du métabolisme des lymphocytes T chez le mutant K56E confirme l'existence d'un lien entre le SLP-76 et le métabolisme des lymphocytes T, ce qui pourrait avoir des implications importantes dans le développement de thérapies ciblant la fonction des lymphocytes T. / The immune system is divided into two responses: innate and adaptive. In the adaptive response, the main players are CD8 and CD4 T-cells whose activation is mediated by ligation of the antigen-receptor complex (TCR) and its generation of intracellular signals. The strength of signal is controlled by the affinity of the ligand in a process that involves upstream kinases such as p56lck and downstream targets such as the adaptor protein SLP-76. Mice lacking SLP-76 are blocked in thymic development, making it difficult to assess the importance of the adaptor in peripheral T-cell function. Recently, the Rudd lab generated a knock-in (KI) mouse with a form of SLP-76 mutated at a single residue K56 which shows a normal peripheral T-cell compartment. The mutant prevents SLP-76 binding to the nuclear pore complex (NPC). The object of this dissertation is to understand role of SLP-76 and specifically the K56E mutant in the control of aspects of peripheral Tcell function. The K56E mutant on an OT1 TCR transgenic background showed a partial impairment of T-cell function and metabolism in response to chicken ovalbumin peptide ligands of different affinities. Specifically, both glycolysis and oxidative phosphorylation pathways were impaired in response to peptide ligand activation. Overall, the impairment of T-cell function and metabolism in the K56E mutant supports a link between SLP-76 and T-cell metabolism which may have important implications in the development of therapies targeting T-cell function.

Au cours de la transcription, plusieurs facteurs sont assemblés sur les ARN messagers pour former des Ribonucléoparticules de messagers (mRNPs), et contrôler leur maturation, leur stabilité et leur devenir dans le cytoplasme. Afin d’assurer la production de protéines fonctionnelles, la cellule dispose de plusieurs mécanismes de régulation et de contrôle de qualité assurant la fidélité de l’information génétique transmise au niveau ARN messager et protéine.Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, un ensemble de protéines associées au pore nucléaire, incluant la SUMO protéase Ulp1, a été impliqué dans un contrôle de qualité des mRNPs régulant leur export vers le cytoplasme. Ces données suggéraient que l’export des ARN messagers pourrait être contrôlé par la modification post-traductionnelle par le polypeptide SUMO d’un ou de plusieurs effecteurs au sein des mRNPs. Afin de mieux comprendre ces processus, nous avons combiné plusieurs approches visant à identifier ces protéines SUMOylées. En particulier, nous avons mis en place un crible protéomique visant à identifier les protéines dont l’association sur les mRNPs dépend d’Ulp1. Ce crible nous a permis de mettre en évidence une régulation par Ulp1 de l’assemblage du complexe THO sur les ARN messagers. Ce complexe, recruté sur les gènes et les mRNPs, est connu pour contribuer à l’efficacité de la transcription, prévenir l’instabilité génétique liée à la formation d’hybrides ADN matrice – ARN messager (dénommés R-loops) et permettre l’export des mRNPs. En combinant l’analyse biochimique de différentes catégories de mRNPs à des expériences d’immunoprécipitation de l’ARN, nous avons montré que l’activité de la SUMO-protéase Ulp1 est nécessaire à l’association du complexe THO sur différents ARN messagers. De plus, nous avons montré que le complexe THO est SUMOylé sur le domaine C-terminal de sa sous-unité Hpr1, et que Ulp1 régule cette modification. Enfin, cet événement de SUMOylation du complexe THO régule son association avec les mRNPs. L’analyse fonctionnelle de mutants affectant la SUMOylation du complexe THO révèle que des défauts de SUMOylation de ce complexe compromettent ses fonctions dans la transcription sans affecter l’export. De manière intéressante, nous avons observé que la présence d’un intron sur des rapporteurs LacZ diminue la sensibilité de leur expression à des inactivations ou des défauts de SUMOylation du complexe THO. Ce phénotype entraine une augmentation relative des niveaux d’ARN pré-messagers dans ces mutants, un phénomène rendant compte de la fuite cytoplasmique apparente d’ARN non épissés précédemment observée dans le mutant ulp1. L’ensemble de ces données caractérise pour la première fois un rôle de la SUMOylation dans le contrôle de l’assemblage et du devenir cellulaire des mRNPs. / During transcription, several factors associate with mRNA to form messenger Ribonucleoparticles (mRNPs), thereby controlling their processing, their stability, and their cytoplasmic fate. To ensure the production of functional proteins from these mRNAs, eukaryotic cells contain numerous regulatory and quality control systems in order to prevent aberrant mRNP accumulation and export.In the yeast Saccharomyces cerevisiae, several nuclear pore associated proteins, including the SUMO isopeptidase Ulp1, have been involved in a mRNP quality control regulating their nuclear export. These data suggested that post-translational modification by SUMO of one or several mRNP components could regulate mRNA export. In order to understand the molecular mechanisms underlying this process, we undertook several approaches to identify these SUMOylated factors. In particular, we have set up a proteomic screen to identify mRNP components whose assembly onto mRNPs depends on Ulp1 activity.This proteomic survey revealed an Ulp1-dependent regulation of THO complex assembly to mRNPs. This complex, recruited to transcribed genes and mRNPs, is known to regulate transcription elongation by preventing DNA-RNA hybrids formation (termed R-loops), and mRNP export. Through a combination of proteomic analysis of mRNPs assembled in Ulp1 mutant cells, with RNA / chromatin immunoprecipitation experiments, we demonstrate that Ulp1 controls specifically the recruitment of the THO complex within mRNPs. SUMOylation analysis further reveals that Ulp1 targets the THO complex subunit Hpr1 on its C-terminal domain for deSUMOylation. We further show that this SUMOylation event regulates THO complex association within mRNPs. Finally, functional analysis reveal that impaired deSUMOylation of the THO complex do not affect mRNP export, but disturbs expression of LacZ reporter genes, a phenotype classically associated with THO complex dysfunction. Intriguingly, the transcriptional effect of inactivation or impaired deSUMOylation of the THO complex on LacZ expression is alleviated by the presence of an intron, providing a molecular basis for previously reported pre-mRNA leakage phenotypes. Our data therefore unravels for the first time a function of SUMO in the control of mRNP assembly contributing to proper mRNP homeostasis.

Chez les eucaryotes, les pores nucléaires (NPCs), ancrés dans l’enveloppe nucléaire (EN), régulent les échanges nucléocytoplasmiques. Ces complexes, très conservés, sont composés d’une trentaine de protéines appelées nucléoporines (Nups) présentes en multiples copies au sein de chaque NPC. Chez la levure S. cerevisiae, seules quatre Nups, dont la protéine Pom33, possèdent des domaines transmembranaires. Une étude réalisée en amont de ce projet a permis de caractériser Pom33 et de montrer que le mutant pom33∆ est viable et ne présente pas de défaut apparent de transport nucléocytoplasmique mais se caractérise par un défaut de distribution des NPCs. Pom33 joue également un rôle dans l’assemblage des pores nucléaires au sein de l’EN (biogenèse de novo des NPCs). POM33 appartient à une famille de gènes très conservés. Il possède un paralogue chez S. cerevisiae, PER33, qui code pour une protéine localisée majoritairement au réticulum endoplasmique et minoritairement aux NPCs et qui n’est pas impliquée dans la biogenèse des NPCs. Chez les mammifères, il n’existe qu’un homologue de Pom33/Per33, TMEM33. Dans le cadre de ce doctorat, nous nous sommes demandés quels étaient les déterminants contribuant à l’adressage spécifique de Pom33 au niveau des NPCs et à sa fonction dans la biogenèse de ces structures. La purification de Pom33-ProtA, suivie de spectrométrie de masse, nous a permis d’identifier un nouveau partenaire de Pom33, le facteur d’import Kap123. Des approches in vitro ont montré une interaction directe entre Kap123 et le domaine C-terminal (CTD) de Pom33, qui est perturbée en présence de RanGTP. Par ailleurs, des prédictions in silico ont révélé la présence dans ce domaine CTD de deux hélices amphipathiques, conservées chez l’humain. Des analyses par dichroïsme circulaire et flottaisons ont confirmé la capacité du CTD à s’organiser en hélice en présence de membranes lipidiques et à interagir préférentiellement avec les membranes très courbées. L’expression d’une version mutée de Pom33-CTD, incapable de se lier aux membranes et couplée à la GFP, a révélé la capacité de ce domaine à agir comme un NLS, importé spécifiquement dans le noyau par Kap123. Alors que la délétion du domaine CTD affecte l’adressage de Pom33 aux NPCs et provoque un défaut de distribution des NPCs, la mutation des résidus basiques impliqués dans l’interaction avec Kap123 ou des résidus permettant sa liaison aux membranes lipidiques ne récapitule pas ce phénotype. En revanche, la perte combinée de ces deux déterminants affecte l’adressage de Pom33 aux NPCs et provoque un défaut de distribution des NPCs ainsi qu'une interaction génétique avec le mutant nup133∆, impliqué dans la biogenèse de novo des NPCs. Les résultats obtenus lors de cette étude indiquent donc que l’adressage de Pom33 est un mécanisme actif et multifactoriel, qui met en jeu au moins deux déterminants dans son domaine CTD. Ces données indiquent également un rôle de ce domaine dans la biogenèse de novo des NPCs, qui pourrait néanmoins n’être qu’un effet indirect de son rôle dans l’adressage de Pom33 aux NPCs. Au cours de cette étude, nous avons également mis en évidence d’autres partenaires potentiels de Pom33, en particulier Myo2, une localisation de Pom33 au niveau du bourgeon lors de la division et une interaction génétique entre POM33 et KAP123. Ces observations préliminaires ouvrent de nouvelles pistes de réflexion quant au rôle de Pom33 lors de la division cellulaire. / In eukaryotic cells, nucleocytoplasmic exchanges take place through the nuclear pores complexes (NPCs). These conserved macromolecular assemblies are embedded in the nuclear envelope (NE) and composed of ~30 distinct proteins called nucleoporins (Nups), each presents in multiple copies. In the budding yeast Sacharomyces cerevisiae, there are only four transmembrane Nups, including Pom33. A previous study leds to the characterization of Pom33 and revealed that pom33∆ mutant cells, although viable and without apparent alteration in nucleocytoplasmic transport, display NPCs distribution defect. Pom33 also contributes to the biogenesis of NPCs into the intact NE (de novo biogenesis). Pom33 is highly conserved among species and has a paralogue in S. cerevisiae, Per33, which can associate with NPCs but is mainly localized at the endoplasmic reticulum (ER) and NE. Unlike Pom33, Per33 is not involved in NPCs distribution and biogenesis. In mammalian cells, there is a unique homologue of Pom33/Per33, named TMEM33. In the context of this thesis, we aimed to identify the determinants involved in the specific targeting of Pom33 to NPCs and in its function in pore biogenesis. To characterize these determinants, we first performed affinity-purification experiments followed by mass spectrometry analyses. This identified a novel Pom33 partner, the nuclear import factor Kap123. In vitro experiments revealed a direct interaction between Pom33 C-terminal domain (CTD) and Kap123 that involves positively-charged residues within Pom33-CTD and is altered in the presence of Ran-GTP. Moreover, in silico analyses predicted the presence of two evolutionarily-conserved amphipathic ~-helices within Pom33-CTD. Circular dichroism studies and liposome co-floatation assays confirmed that this CTD domain is able to fold into ~-helices in the presence of liposomes and revealed its preferential binding to highly curved lipid membranes. When expressed in yeast, under conditions abolishing Pom33-CTD membrane association, Pom33-CTD behaves as a Kap123-dependent nuclear localization domain. While deletion of Pom33 C-terminal domain (Pom33-∆CTD-GFP) impairs Pom33 NPC targeting and stability and leads to a NPC distribution phenotype, mutants affecting either Kap123 binding or the amphipathic properties of the ~-helices do not display any detectable defect. However, combined impairment of lipid and Kap123 binding affects Pom33 targeting to NPCs and leads to an altered NPC distribution and a genetic interaction with the deletion of NUP133, a gene coding for a nucleoporin involved in NPCs biogenesis. Together, these results indicate that Pom33 targeting to NPCs is an active and multifactorial process that requires at least two determinants within its CTD. They also suggest a role of Pom33-CTD in the de novo NPCs biogenesis process, which could however only be an indirect consequence of its requirement for Pom33 targeting to NPCs. Our mass spectrometry analysis also identified other partners of Pom33, in particular Myo2, a molecular motor required for the cell cycle-regulated transport of various organelles and proteins and for correct alignment of the spindle during mitosis. Our studies also revealed a specific localization of Pom33 at the bud tip during mitosis and a genetic interaction between POM33 and KAP123. Taken together, these preliminary observations open new perspectives regarding additional functions of Pom33 during cell division.

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Movement is a prerequisite for normal fetal development and growth. Intrauterine movement restrictions cause a broad spectrum of disorders in which the unifying feature is a reduction or lack of fetal movement, giving rise to the term fetal akinesia deformations sequence (FADS [OMIM 208150]). FADS corresponds to a clinically and genetically heterogeneous constellation of properties and is characterized by multiple joint contractures, facial abnormalities, and lung hypoplasia as a result of the decreased in utero movement of the fetuses. Affected babies are often prematurely and stillborn, and those born alive typically die within minutes or hours after birth. The genetic causes for this fatal disorder are ill-defined as a genetic diagnosis is rarely executed, but mutations in three genes, namely RAPSN, DOK7, and MUSK, as well as in the subunits of the muscular nicotinic acetylcholine receptor (AChR) have been described. These mutations are thought to affect neuromuscular junctions, although this has not been proven experimentally.The nucleoporin NUP88 is a constituent of the nuclear pore complex (NPC), the gate for all trafficking between the nucleus and the cytoplasm. NUP88 resides on both the cytoplasmic and the nuclear side of NPCs, and it is found in two distinct subcomplexes. It associates with NUP214 and NUP62 on the cytoplasmic face, while on the nuclear side NUP88 binds NUP98 and the intermediate filament protein lamin A. The NUP88-NUP214-NUP62 complex plays an essential role in the nuclear export of a subset of proteins and pre-ribosomes, which is mediated by the nuclear export receptor CRM1. NUP88 in particular somewhat participates in the nuclear export of NF-κB proteins in a CRM1-dependent manner. Moreover, NUP88 is frequently overexpressed in a variety of human cancers, and its role in cancer appears linked to the deregulation of the anaphase-promoting complex. Here, we report the first Mendelian disorders caused by mutations in NUP88 and with that the first lethal developmental human disease due to mutations in a nuclear pore component. We demonstrate that biallelic mutations in NUP88 are likely to cause fetal akinesia of the Pena-Shokeir subtype. We confirm in zebrafish that loss of NUP88 impairs movement and the mutations identified in the affected individuals resemble a loss-of-function phenotype. We show that loss of NUP88 affects expression and localization of rapsyn, the protein encoded by RAPSN, in human and mouse cell lines, and patient samples. Consistent with altered rapsyn, AChR clustering and neuromuscular junction formation in zebrafish are abnormal. We therefore propose that defective NUP88 function cause FADS by affecting neuromuscular junction formation.Keywords: Nuclear pore complex, NUP88, Fetal Akinesia Deformation Sequence, rapsyn, acetylcholine receptor clustering, synaptic transmission, fetal development, inherited developmental disorder. / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Signal transduction by transforming growth factor β (TGF-β) cytokines is mediated by an evolutionarily conserved mechanism that depends on the Smad proteins to transduce an extracellular stimulus into the nucleus. In the unstimulated state, Smads spontaneously shuttle across the nuclear envelope and distribute throughout the cell. Upon TGF-β or bone morphogenetic protein (BMP) stimulation, the receptor-activated Smads are phosphorylated, assemble into complexes with Smad4, and become mostly localized in the nucleus. Such signal-induced nuclear translocation of activated Smads is essential for TGF-β–dependent gene regulation that is critical for embryonic development and homeostasis. The molecular machinery responsible for this process, especially how the activated Smads are imported as complexes, is not entirely clear. Thus, I became interested in investigating the molecular requirements for nuclear targeting of Smads upon stimulation. Recently, whole-genome RNAi screening offers a complementary cell-based approach to functionally identify molecules that mediate nuclear accumulation of Smads in response to TGF-β. In the first part of this dissertation, I performed a genome-wide RNAi screen that uncovered the importin moleskin (Msk) required in nuclear import of Dpp-activated MAD. Both genetic and biochemical studies further confirmed this finding. I also investigated Smad interactions with the Msk mammalian orthologues, Importin7 and 8 and validated that Smads are bona fide cargos of Imp7/8. Besides the importin Msk, the screen also uncovered a subset of nucleoporins as required factors in signal-induced nuclear accumulation of MAD. Thus in the second part of this thesis, I focused on how the NPC mediates this Msk-dependent nuclear import of activated MAD. Most of these nucleoporins, including Sec13, Nup75, Nup93 and Nup205, were thought to be structural nucleoporins without known cargo-specific functions. We, however, demonstrated that this subset of nucleoporins was specifically used in the Msk-dependent nuclear import of activated MAD but not the constitutive import of cargos containing a classic nuclear localization signal (cNLS). I also uncovered novel pathway-specific functions of Sec13 and Nup93. Regulation of TGF-β signaling can be achieved not only by modulating Smad nuclear translocation but also by modifying Smad phosphorylation status. Previously we identified a kinase, Misshapen (Msn), that caused the linker phosphorylation of MAD, resulting in negative regulation of Dpp signaling (Drosophila BMP). In the third part of this thesis, I investigated the biological relevance of Msn kinase to Dpp signaling in Drosophila wings. Both over-expression and RNAi studies suggest that Msn is a negative regulator of the Dpp/MAD pathway in vivo. As a whole, my findings delineated two critical requirements for MAD nuclear import: the importin Msk and a unique subset of nucleoporins. For the first time, structural Nups are implicated in the direct involvement of cargo import, providing a unique trans-NPC mechanism.

La translocation de biopolymères à travers un nanopore intervient dans de nombreux processus biologiques et technologiques, comme le transport nucléocytoplasmique dans le pore nucléaire des cellules eucaryotes, la sécrétion de protéines, le séquençage rapide de l’ADN ou l’électrophorèse capillaire.Nous proposons une technique optique en molécule unique originale pour l’étude de la translocation de biopolymères à travers un nanopore basée sur l’effet Zero-Mode Waveguide. Nous nous sommes intéressés au passage d’ADN double-brin de plusieurs tailles, d’ADN simple-brin et d’ARN, entraînés par un flux à travers une membrane nanoporeuse track-etched. Nous montrons qu’il existe un flux critique régissant le passage des biopolymères indépendant du rayon des pores ainsi que de la taille des biopolymères et de leur nature, conformément aux prédictions théoriques de Brochard et de Gennes.Le pore nucléaire est un nanopore biologique responsable du transport sélectif entre le noyau et lecytoplasme des cellules. Nous avons étudié l’influence de la concentration en importinBeta1 – une protéine nécessaire au transport nucléocytoplasmique – sur l’organisation du canal central du pore nucléaire deXenopus laevis en mesurant la diffusion de molécules de Dextran fluorescentes à travers celui-ci. Nous observons une ouverture du canal central à basse concentration suivi d’un rétrécissement de celui-ci à plus forte concentration. Cette évolution du rayon du canal central avec la concentration en importin Beta1est conforme aux modèles en champ moyen de Opferman et coll. et de Ando et coll. et aux observations expérimentales sur des systèmes reconstitués in vitro de Lim et coll. et Zahn et coll. / The translocation of biopolymers through a nanopore is a feature common to many biological andtechnological processes such as the nucleocytoplasmic transport through the nuclear pore complex(NPC), protein secretion, fast DNA sequencing or capillary electrophoresis.We have developed an original single molecule optical detection technique for the study of biopolymerstranslocation through a nanopore based on the Zero-Mode Waveguide effect. We studied thepassage of double stranded DNA of different sizes, of single stranded DNA and of double-stranded RNAdriven by a flux through track-etched nanoporous membranes. We demonstrate that translocation isgoverned by a critical flux independent of both biopolymer size and nature and of the pore radius inagreement with the theoretical predictions of Brochard and de Gennes.The NPC is a biological nanopore responsible for the selective transport between cytoplasm andnucleus in cells. We studied the influence of importinBeta1 concentration – a protein involved in the nucleocytoplasmictransport – on the structure of the central channel of the NPC of Xenopus laevis byassessing the diffusion of fluorescently labeled Dextran molecules through the NPC. We observe anopening of the central channel at low concentration followed by a shrinking at higher concentrationin importinBeta1 in agreement with mean-field models from Opferman et al. and Ando et al. and withexperiments on biomimetic in vitro systems from Lim et al. and Zahn et al.

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Le complexe de pores nucléaires est le seul point d'entrée et de sortie du transport nucléocytoplasmique. Le panier nucléaire, l'un de ses principaux composants, s'est avéré impliqué dans la régulation des gènes et pourrait jouer un rôle majeur dans le contrôle de la qualité de l'export d'ARNm. Cependant, on sait peu de choses sur le fonctionnement du panier dans l'export nucléaire et la régulation des gènes. La principale composante structurelle du panier, la TPR (Translocated Promoter Region), est considérée comme l'acteur principal de la fonction de contrôle de la qualité du panier. Il reste à établir par quel mécanisme cette protéine assure la sélection des mRNP compétentes pour l'exportation. Malgré son implication connue dans le contrôle de la qualité des mRNP, l'exportation et la maturation, des questions demeurent: que fait vraiment le panier, qu'est-ce qui définit le contrôle qualité, comment le panier nucléaire est-il capable d'identifier l'ARN qui n'est pas compétent pour l'exportation et quels sont les rôles de différentes protéines composant le panier nucléaire. Récemment, il a été montré que la protéine TPR est présente dans deux populations, l'une dans le nucléoplasme et l'autre liée au NPC. Nos études préliminaires utilisant FRAP (Fluorescence Recorvery After Photobleaching) et la microscopie à molécule unique montrent que les molécules nucléoplasmiques de TPR ne sont pas impliquées dans un échange rapide avec les molécules assemblant avec les paniers ancrés au NPC et présentent différentes sous-populations basées sur la diffusion. L'analyse de études protéomiques préliminaires de notre laboratoire a révélé que l’interactome de TPR présente un enrichissement inattendu en protéines impliquées dans la maturation de l'ARNm, notamment l'épissage et les facteurs de traitement de l'extrémité 3'. Ces résultats pourraient suggérer des interactions complexes des nouvelles fractions nucléoplasmiques de TPR avec la machinerie de maturation des ARNms et nous amènent à poser les questions suivantes : Quelle est la fonction de la protéine du panier TPR lorsqu'elle n'est pas associée au NPC, et la TPR nucléoplasmique participe-t-elle au métabolisme de l'ARN nucléaire, reliant potentiellement les processus nucléaires au contrôle de la qualité au NPC? Mon projet s'est concentré sur l'étude des fonctions et de la dynamique de la protéine du panier nucléaire TPR à l'aide de techniques d'imagerie fluorescente en cellule vivante et de suivi de protéine unique. Nous avons pu identifier la dynamique et la localisation des différentes populations de TPR à partir des profils de diffusion de leurs trajectoires, qui peuvent être réparties en 5 catégories : Dirigée, Brownienne, Restreinte, Confinée et Butterfly. Nos données suggèrent que les trajectoires confinées pourraient être liée à l’association de TPR à la chromatine tandis que les browniennes représenteraient les molécules de TPR diffusant librement dans le noyau. De plus, nous avons constaté que les trajectoires dirigées et restreintes pourraient être liées à la maturation de l'ARN vu que ces deux sous-populations de TPR sont les plus affectées lorsque la transcription est inhibée. Également, en absence de la transcription par l’ARN polymérase II, TPR forme des granules dans le nucléoplasme, suggérant son implication durant la transcription active. Ainsi, notre étude montre que la fraction nucléoplasmique du TPR est subdivisée en fractions non associées aux pores hétérogènes qui pourraient jouer plusieurs rôles dans le métabolisme de l'ARN et la qualité de l'export. / The nuclear pore complex is the only entry and exit point for the nucleocytoplasmic transport. The nuclear basket, one of its main components, was shown to be involved in gene regulation and could play a major role in quality control of mRNA export. However, little is known on how the basket functions in nuclear export and gene regulation. The main structural component of the basket, TPR (Translocated Promoter Region), is thought to be the main actor in the quality control function of the basket. It is yet to be establish by which mechanism this protein ensures the selection of competent mRNPs for export. With all these involvement of the basket in quality control, export, and maturation, one question remains: What is the basket really doing, what defines quality control, how the nuclear basket can identify RNAs that aren’t competent for export, and what are the roles of the different proteins that make up the basket. Recently it was shown that TPR is present in two populations, one in the nucleoplasm and another bound at the NPC. Our preliminary studies using FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) and single molecule microscopy shows that the nucleoplasmic TPR molecules aren’t exchanging with the baskets anchored at the NPC and present different subpopulations based on diffusion. Analysis of preliminary proteomics studies from our laboratory revealed an interactome with an unexpected enrichment of proteins involved in mRNA maturation notably splicing and 3’ end processing factors. These results imply complex interactions of the new fractions of TPR and lead us to ask these following questions: What is the function of the basket protein TPR when it is not associated with the NPC, and does nucleoplasmic TPR participate in nuclear RNA metabolism, potentially linking nuclear processes to quality control at the NPC? My project focused on investigating the functions and dynamics of the nuclear basket protein TPR using fluorescent live-cell and single-protein imaging techniques. We were able to identify the dynamics and localization of the different populations of TPR based on the diffusion profiles of their trajectories, which can be divided in 5 categories: Directed, Brownian, Restricted, Confined and Butterfly. Our data suggest that the confined population might be linked to chromatin association of TPR, whereas the Brownian would represent the free diffusing TPR molecules in the nucleus. We further found that the Directed and Restricted trajectories could be linked to RNA maturation as these two subpopulations of TPR are most affected when transcription is inhibited. Moreover, in absence of transcription, TPR forms granules in the nucleus, suggesting its implication during active transcription. Altogether, our study shows that the nucleoplasmic fraction of TPR is subdivided in heterogenous diffusive fractions that could play several roles in the metabolism of RNA and quality of export

The nuclear pore complex (NPC) is perhaps the largest protein complex in the eukaryotic cell, and controls the movement of molecules across the nuclear envelope. The NPC is composed of up to 30 proteins termed nucleoporins (Nups), each grouped in different sub-complexes. The transmembrane ring sub-complex is composed of Nups responsible for anchoring the NPC to the nuclear envelope. Bioinformatic analysis has traced all major sub-complexes of the NPC back to the last eukaryotic common ancestor, meaning that the nuclear pore structure and function is conserved amongst all eukaryotes. In this study Arabidopsis T-DNA knockout lines for these genes were investigated to characterise gene function. Differences in plant growth and development were observed for the ndc1 knockout line compared to wild-type but gp210 plants showed no phenotypic differences. The double knockout line gp210 ndc1 was generated through crosses to observe plant response to the knockout of two anchoring-Nup genes. No synergistic affect from this double knockout was observed, suggesting that more, as yet unidentified Nups function the transmembrane ring in plants. The sensitivity to nuclear export inhibitor leptomycin B (LMB) was tested also for knockout lines, although growth sensitivity to the drug was not observed. Nucleocytoplasmic transport of knockout lines was measured in cells transformed by particle bombardment. To express fluorescent protein constructs actively transported through the NPC, localisation of protein determined the nucleocytoplasmic transport of the cell. The ndc1single knockout and the double knockout gp210 ndc1 exhibited decreased nuclear export. Further experiments in determining NDC1 localisation and identification of other Nups in the transmembrane ring sub-complex would bring a more comprehensive understanding to the plant NPC.