A paracoccidioidomicose é uma micose sistêmica caracterizada por ser uma doença granulomatosa. As formas benignas da doença são caracterizadas por uma infecção localizada, contendo granulomas compactos com poucos fungos; já nas formas mais graves, ocorre um processo granulomatoso frouxo com focos de necrose e intensa disseminação fúngica. Objetivou-se avaliar o desenvolvimento de lesões granulomatosas em baço, fígado, pulmão e epiplon de camundongos, após infecção pela via intraperitoneal com o isolado de alta virulência, Pb18, em diferentes períodos de infecção após tratamento com fármacos, os quais possuem mecanismo de ação relacionado com a alteração no balanço entre a síntese e degradação dos produtos do colágeno, interferindo diretamente na formação do granuloma A citocina IFN-<font face=\"Symbol\">g, o antibiótico Tetraciclina e as drogas antiinflamatórias Lumiracoxib e Celecoxib. Avaliamos a presença de alguns componentes do granuloma (colágeno, células do infiltrado inflamatório, de citocinas primordiais para sintese/degradação da MEC do granuloma, presença de P. brasiliensis). / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic mycosis that is endemic in Latin America, whose causative agent is the thermal dimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis (Pb). PCM is a granulomatous disease, and the formation of granulomas can be understood as a mechanism of the body to block and limit the invasiveness of the fungus or its antigenic components, once unable to lyse them. Bening forms of the disease are characterized by a localized infection, where granulomasa are compact and contain few fungi. More severe forms present loose granulomatous processes with foci of necrosis and severe fungal. Studies in which granulomatous response was developed in resistant (A/J) and susceptible (B10.A) mice to the high virulence isolate Pb18 showed the presence of different patterns of injuries related to the type of extracellular matrix (ECM) components and the different cells types in the area, suggesting a important role of these elements in the formation and constitution of the granuloma and thus the outcome of infection. In our project, we aimed to evaluate the development of granulomatous lesions in the spleen, liver, lung and omentum of mice susceptible to PCM after intraperitoneal infection with Pb18, at different periods of infection (acute and chronic) with or without treatment with drugs. These drugs have mechanisms of action closely related to the change in the balance between synthesis and degradation of collagen Thus, they interfere directly in the granuloma formation and in maintaining the viability of fungi and also with the development of fibrosis. Which is a common and devastating sequelae of numerous infections including the PCM, with the characteristic proliferation of fibroblasts and deposition of ECM. The treatments were chosen based on prior knowledge on their effects on the course of experimental murine PCM. IFN-<font face=\"Symbol\">g was chosen due to its antifibrotic effect, being an activator of macrophages in infection by P. brasiliensis and increasing the fungicidal effect of neutrophils. The antibiotic tetracycline was used because of its inhibitory effect on the synthesis of extracellular matrix, limiting antimicrobial activity and the ability of collagenase to degrade ECM. Finally, the antiinflammatory drugs Celecoxib and Lumiracoxib (inhibitors of the COX-2 enzyme) 11 were used because they cause an increase in the expression of collagen type III and type IV. We analyzed the components of the granuloma (collagen, inflammatory cells, cytokines essential for synthesis / degradation of the ECM of the granuloma, the presence of P. brasiliensis). Among the cytokines analyzed, we studied the importance of TNF-<font face=\"Symbol\">&#945 in the formation of granulomas and regulation of matrix metalloproteinases (MMP) synthesis and function. We analyzed TGF-<font face=\"Symbol\">b because it negatively modulate the secretion of nitric oxide by macrophages and promote the accumulation of ECM and is believed to be the central mediator of the process of fibrosis in several pathologies. IFN-<font face=\"Symbol\">g was studied because of its correlation to the preferential Th1 immune response in diseases and infectious processes of fungal and bacterial infections, and also because it modulates fibroblast function.

Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termo-dimórfico que se apresenta na forma de hifa a 25?C e forma de levedura a 37?C. Após inalação de conídios e propágulos de hifas presentes no ambiente, o fungo encontra no hospedeiro as condições ideais para transição em levedura, capaz de causar a doença paracoccidioidomicose (PCM), primariamente pulmonar, podendo ser seguida de disseminação sistêmica. O processo infeccioso é caracterizado pelo reconhecimento de constituintes de leveduras por receptores de células do sistema imune, especialmente fagócitos, que são ativados e produzem citocinas. Neutrófilos são as primeiras células recrutadas para o local da infecção, onde combatem o patógeno, fagocitando-o e liberando mediadores e efetores, como citocinas, ROS (Espécies Reativas de Oxigênio) e NETs (Armadilhas extracelulares de neutrófilos). Esses eventos, além de fatores ambientais e genéticos, têm influência sobre a resistência do hospedeiro ao fungo e, consequentemente, sobre a progressão da doença. Um aspecto da epidemiologia da doença impressiona: a incidência de PCM é mais alta em homens do que em mulheres, especialmente na idade reprodutiva. Especula-se que a melhor resposta das mulheres ao fungo possa relacionar-se à maior concentração de estrógeno, uma vez que esse hormônio, in vitro, inibe a transição de hifa em micélio. Adicionalmente, nosso grupo verificou, em modelo murino de PCM, que machos e fêmeas divergem quanto à resposta imunitária frente ao fungo, favorecendo a resistência de fêmeas. Todavia, neutrófilos, a despeito de sua aparente relevância em infecções fúngicas, nunca foram estudados quanto ao eventual papel na determinação de diferenças de gênero constatadas na PCM. Este trabalho teve como objetivo comparar neutrófilos de homens e mulheres quanto às funções reguladoras e efetoras, quando essas células são infectadas in vitro com leveduras de P. brasiliensis (multiplicidade de infecção (MOI) 5:1). Participaram do estudo 38 homens e mulheres saudáveis, com idade entre 23 e 35 anos. Como critério de inclusão no estudo, as mulheresIX deveriam estar entre o primeiro e o 15º dia do ciclo menstrual ou utilizarem anticoncepcional à base de estrógeno na data da coleta. Os neutrófilos, purificados a partir do sangue periférico e incubados com leveduras de P. brasiliensis e, estudados quanto às habilidades de fagocitose e eliminação de leveduras, produção de citocinas e ROS desenvolvidas por células oriundas de homens e mulheres. Os resultados indicam que os neutrófilos de mulheres mataram o fungo com maior eficiência e produziram maiores concentrações de TNF. Entretanto, dentre as funções neutrofílicas testadas, algumas não foram afetadas pelo gênero do doador, como a habilidade de fagocitose e a produção de ROS. Alguns ensaios foram precedidos da adição ao meio de ?-estradiol sintético. Na presença do hormônio sintético, verificamos que (i) neutrófilos de homens limitaram o crescimento fúngico de maneira mais eficiente; (ii) neutrófilos de homens e mulheres diminuíram a produção de TGF-?. Concluímos que há diferenças entre funções de neutrófilos oriundos de homens e de mulheres frente à infecção por P. brasiliensis. Parte dos déficits funcionais detectados em neutrófilos de homens frente à infecção fúngica foi revertida pela adição de estrógeno ao meio em que se procederam os ensaios. As observações feitas neste trabalho permitem postular que os neutrófilos, sob efeito do estrógeno, contribuem para que as mulheres sejam mais resistentes à PCM. / Paracoccidioides brasiliensis is a thermo-dimorphic fungus that appears as hyphae at 25 ° C and yeast at 37 ° C. After inhalation of conidia and propagules of hyphae resident in the environment, the fungus finds in the host the ideal conditions for transition in yeast, capable of causing the disease Paracoccidioidomycosis (PCM), primarily pulmonary, and may be followed by systemic dissemination. The infectious process implies in recognition of fungal constituents by immune cell receptors, especially phagocytes, which are activated. Neutrophils, the first recruited cells to the infection focus, fight the pathogen and initiate cytokines\' releasing and effector events, such as reactive oxygen species (ROS) production and extracellular traps (NETs) formation. Together, they influence the host resistance to the fungus and, consequently, the disease course. One aspect of the PCM epidemiology is impressive: its incidence is higher in men than in women, especially during their reproductive period. It is speculated that the women\'s better response to the fungus may be related to the estrogen higher concentration they have, since this hormone, in vitro, inhibits the yeast\'s growth. Additionally, our group has previously reported that in a murine PCM model, males and females differ on the immune response to the fungus, which favors the females\' resistance. However, neutrophils, despite their apparent relevance in fungal infections, have never been studied for their possible contributive role in the gender differences found in PCM. This work aimed to compare the neutrophils regulatory and effector functions in men and women when these cells were in vitro infected with P. brasiliensis yeasts. Healthy men and women aged between 23 and 35 have participated in the study. To be included, at the date of neutrophil harvesting women should be between the first and the 15th day of the menstrual cycle or use estrogen-based contraceptives. Neutrophils purified from peripheral blood were incubated with P. brasiliensis and assessed for the capacity of phagocytosis and elimination of yeasts, as well asXI for the production of cytokine and ROS. Neutrophils from women killed the fungi more efficiently and produced higher concentrations of TNF. Nonetheless, the donor gender has not affected some tested neutrophil functions, namely phagocytosis ability and ROS production. Moreover, assays performed in the presence of synthetic ?-estradiol showed that (i) men neutrophils started to kill yeasts more efficiently than in the absence of the hormone; (ii) neutrophils from men and women decreased the production of TGF-?. We conclude that in vitro infection with P. brasiliensis unveiled differences between men and women neutrophils\' functions. Part of the functional insufficiency verified in men\'s neutrophils of fighting against the fungal infection reversed by the estrogen addition to the assay medium. The results of this work allow postulating that neutrophils contribute to the women\'s resistance to paracoccidioidomycosis.

Orientador: Rinaldo Poncio Mendes / Resumo: Introdução. A correlação entre gravidade da paracoccidioidomicose e patogenicidade e imunogenicidade dos fungos causadores tem sido pouco investigada e foi o objetivo deste estudo. Metodologia. As cincos cepas Pb192, Pb234, Pb326, Pb417 e Pb531 foram identificadas pelo seqüenciamento da região Exon 2 da gp43. A patogenicidade foi determinada pelo cálculo da dose letal 50% (DL50%) e pela contagem do número de unidades formadoras de colônias, realizada na sexta semana pós-infecção de camundongos BALB/c. A imunogenicidade foi determinada pela avaliação da resposta imune humoral específica, utilizando-se a reação de imunodifusão dupla em gel de ágar e da imunidade celular, determinada pela concentração das citocinas interleucina -2, interleucina-10, interferon-γ, fator de necrose tumoral – α e do fator de crescimento do endotélio vascular, em tecido pulmonar. Quatro amostras clínicas foram recém-isoladas de pacientes com paracoccidioidomicose, provenientes da Região de Botucatu - os isolados Pb234 e Pb417, de pacientes com a forma crônica moderada; o Pb326 de um caso com a forma aguda grave; e o Pb531, de um caso com a forma crônica grave. As demais cepas Pb192, Pb01 e 8334 foram cedidas pelo laboratório de Moléstias infecciosas. Resultados. As cepas Pb417 e Pb326 agruparam-se às cepas identificadas como P. brasiliensis S1a, a Pb531 às P. brasiliensis S1b e as cepas Pb234 e Pb192 às cepas depositadas como P. restrepiensis (PS3). Os resultados demonstraram correlação direta entre ... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Introduction. The investigation of paracoccidioidomycosis and pathogenicity and immunogenicity of the provoking fungi has been little investigated and was the objective of this study. Methodology. As strains, Pb192, Pb234, Pb326, Pb417 and Pb531 were included by sequencing the Exon 2 region of gp43. The pathogenicity was determined by calculating the 50% lethal dose (LD50%) and by counting the number of colony forming units performed in the sixth week post-infection of BALB / c mice. Immunogenicity was determined by the humoral immune response, using the agar gel immunodiffusion reaction and the cellular immunity, determined the concentration of cytokines interleukin-2, interleukin-10, interferonγ, tumor necrosis factor - and factor of vascular endothelial growth in lung tissue. Surgical has been associated with patients with paracoccidioidomycosis, derived from the Botucatu - the Pb234 and Pb417; the Pb326 of a case with a severe severe form; and Pb531, of a case with severe chronic form. The other strains Pb192, Pb01 and 8334 were transferred by the laboratory of Infectious Diseases. Results. Pb417 and Pb326 strains were grouped into the associated strains P. brasiliensis S1a, Pb531 to P. brasiliensis S1b and strains Pb234 and Pb192 to strains deposited as P. restrepiensis (PS3). The results demonstrate the pathogenicity of disease error and severity. The small LD 50 values were measured in the following cases: severe disease, Pb531 and Pb326. Pb531 strain was considered to... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Rinaldo Poncio Mendes / Banca: Silvio Alencar Marques / Banca: Mário Léon Silva Vergara / Banca: Anamaria Mello Miranda Paniago / Banca: Gil Bernard / Resumo: Não há estudos publicados que tenham comparado itraconazol (ITC), associação sulfametoxazol-trimetoprim (cotrimoxazol - CMX) e ITC seguido de CMX (ITC/CMX), no tratamento da paracoccidioidomicose (PCM). Este estudo foi realizado para comparar eficácia, efetividade, segurança e tempos necessários para se alcançar cura clínica e sorológica em pacientes com PCM tratados com ITC ou CMX, antifúngicos mais utilizados nessa micose. Foi conduzido um estudo quasi-experimental em 177 pacientes com diagnóstico confirmado ou provável de PCM, virgens de tratamento ou com doença reativada e há pelo menos seis meses sem antifúngicos. Foram consideradas duas fases no tratamento: 1) inicial ou de ataque, mantido até se obter cura clínica e normalização da velocidade de hemossedimentação; 2) complementar, mantido até obtenção da cura sorológica. A comparação de médias foi feita pelo teste de Mann-Whitney, a de freqüências pelo teste do chi-quadrado e das variáveis em função do tempo pelas curvas de Kaplan-Meier e regressão de Cox, utilizando-se p≤0,05 para indicação de diferenças significantes. No tratamento de ataque, 47 pacientes tratados com ITC e 130 que receberam CMX não revelaram diferença de eficácia e efetividade, mas foi menor o tempo de cura clínica para os que receberam ITC que os tratados com CMX (105 vs 159 dias; p=0,001), em especial pacientes com forma crônica. No tratamento complementar, eficácia e efetividade foram similares nos três tratamentos, porém o tempo de cura sorológica foi menor com ITC (161 dias) e CMX (495 dias) do que com ITC/CMX (881 dias) [p=0,02]. Os preditores independentes de menor tempo de cura sorológica foram tratamento com ITC [razão de risco = 6,61; IC95% (2,01- 21,75)] e CMX [razão de risco = 5,11;IC95% (1,91-13,67)]). A prevalência de efeitos colaterais foi menor com ITC (6,4%) do que com CMX (20,0%; p=0,03). Este estudo revelou ... / Abstract: Not available / Doutor

A paracoccidioidomicose (PCM) é uma infecção sistêmica causada pelo fungo Paracoccidioides sp. A doença é endêmica na maior parte dos países da América Latina, sendo os pulmões os órgãos mais afetados. O diagnóstico de PCM é feito com base na história clínica e epidemiológica, e confirmado pela visualização microscópica das estruturas fúngicas do Paracoccidioides a partir de secreções ou tecidos. Por vezes, a apresentação clínica e os achados histopatológicos da PCM simulam os de outras doenças, como a sarcoidose, e ocasionalmente são encontradas nas lesões formas excepcionalmente pequenas do Paracoccidioides, que podem ser confundidas com outros fungos, como o Histoplasma capsulatum. O presente trabalho objetivou identificar e caracterizar os casos que simularam sarcoidose e os que apresentaram formas pequenas de Paracoccidioides dentre os 856 casos de paracoccidioidomicose diagnosticados no Laboratório de Micologia do Complexo Hospitalar Santa Casa de Porto Alegre, no período de 1981 a dezembro de 2013. Foram identificados 8 casos mimetizando a sarcoidose e 12 apresentando formas pequenas de Paracoccidoides. Dos casos que simularam a sarcoidose, todos eram fumantes do sexo masculino, com idades variando entre 27 e 59 anos (média = 42,5 anos) e apresentaram tosse produtiva, infiltrado fibronodular bilateral aos exames de imagem e granulomas sarcoides na biópsia pulmonar, recebendo prednisona como tratamento inicial. O diagnóstico de PCM, nestes casos, foi realizado por meio de cortes histológicos corados ao GMS (n=8), exame direto do escarro (n=2) e imunodifusão (n=4). Dentre os casos que apresentaram formas pequenas do Paracoccidioides, todos eram fumantes, tinham idades variando entre 33 e 68 anos (média = 55,58 anos), 10 eram do sexo masculino, e 10 apresentavam sintomas consistentes com os da PCM (dois pacientes eram assintomáticos). O diagnóstico etiológico, em todos os casos, foi realizado por meio de cortes histológicos seriados corados ao GMS (que revelaram as formas multibrotantes patognomônicas do Paracoccidioides) e corroborado por exame direto do escarro (n=3), imunodifusão (n=6) e cultura (n=1). Com isto, ressalta-se a importância da consideração dos diagnósticos diferenciais da paracoccidioidomicose. Visto que a sarcoidose é um diagnóstico de exclusão, o achado de granulomas epitelioides sem necrose deve incitar a busca ativa por agentes etiológicos com a utilização das colorações de ZN e GMS. E nos casos em que se encontram formas pequenas ou pouco usuais do Paracoccidioides, devem-se realizar cortes histológicos seriados e escalonados corados ao GMS e utilizar técnicas laboratoriais complementares, como imunodifusão e cultura, para assegurar o seu diagnóstico. / Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic infection caused by the fungus Paracoccidioides sp. The disease is endemic in most Latin American countries, and the lungs are the most affected organs. The diagnosis of PCM is based on clinical and epidemiological features, and confirmed by the microscopic visualization of yeasts of Paracoccidioides from clinical specimens. Sometimes the clinical presentation and histopathological findings of PCM mimic those of other diseases, such as sarcoidosis, and occasionally exceedingly small forms of Paracoccidioides are found in lesions, which can be confused with other fungi, such as Histoplasma capsulatum. This study aimed to identify and characterize the cases that simulated sarcoidosis and those with small forms of Paracoccidioides among the 856 cases of paracoccidioidomycosis diagnosed in the Mycology Laboratory of the Hospital Complex Santa Casa de Porto Alegre, from 1981 to December 2013. 8 cases were identified mimicking sarcoidosis and 12 with small forms of Paracoccidoides. All the cases that mimicked sarcoidosis were male smokers, aged between 27 and 59 years (mean = 42.5 years) and had productive cough, bilateral fibronodular infiltrates on X-ray and sarcoid granulomas in the lung biopsy, receiving prednisone as initial treatment. The diagnosis of PCM in these cases was carried out by histological sections stained with GMS (n = 8), direct examination of sputum (n = 2) and immunodiffusion (n = 4). Among the cases with small forms of Paracoccidioides, all were smokers, aged between 33 and 68 years (mean = 55.58 years), 10 were male, and 10 had symptoms consistent with PCM (two patients were asymptomatic). The etiologic diagnosis in all the 12 cases was made by serial tissue sections stained with GMS (which revealed the multibudding pathognomonic forms of Paracoccidioides) and confirmed by direct examination of sputum (n = 3), immunodiffusion (n = 6) and culture (n = 1). In conclusion, it is emphasized the importance of considering the differential diagnosis of paracoccidioidomycosis. Since sarcoidosis is a diagnosis of exclusion, the finding of epithelioid granulomas without necrosis should encourage the active search for etiologic agents with the use of ZN and GMS stains. And in cases in which small or unusual forms of Paracoccidioides are found, serial histological sections stained with GMS and complementary laboratory techniques such as immunodiffusion and culture should be performed to ensure their diagnosis.

No período de agosto a outubro de 1992, foi realizado um estudo de prevalência de positividade cutânea à histoplasmina e à paracoccidioidina nas cidades de Cachoeira do Sul, situada no Vale do rio Jacuí, e de Santo Ângelo, na encosta ocidental do Planalto, Rio Grande do Sul, Brasil. A prevalência foi avaliada por testes intradérmicos histoplasmina e paracoccidioidina em 193 soldados de Cachoeira do Sul e 161 soldados de Santo Ângelo. Ambas as populações do sexo masculino e idade variando entre 17 e 19 anos. Em Cachoeira do Sul, considerando as leituras de 24 e 48horas, a prevalência de testes positivos à histoplasmina foi de 89% e à paracoccidioidina de 82%. Em Santo Ângelo 48% das reações intradérmicas foram positivas à histoplasmina e 39% à paracoccidioina. Houve relação estatísticamente significativa na cidade de Santo Ângelo para os indivíduos histoplasmina positivos com galinheiro em casa e para os que haviam participado da limpeza de galinheiro e/ou de local habitado por morcegos. Foi realizado radiograma de tórax em aproximadamente 6% dos indivíduos reatores fortes. Em Cachoeira do Sul, 17% e em Santo Ângelo, 30% dos radiogramas apresentavam calcificação.

Um mecanismo de tolerância periférica estudado é mediado por células T reguladoras (Tregs) que expressa o marcador CD25 e o fator de transcrição FoxP3. Estudamos o papel das Tregs nos fenômenos de imunossupressão na resistência e susceptibilidade genética dos hospedeiros contra o fungo. Animais A/J e B10.A foram depletados de células CD25 e outro grupo recebeu Ig de rato. Na 2ª semana de infecção, a depleção de células CD25 resultou em doença menos grave em ambas as linhagens com intenso afluxo de linfócitos T e macrófagos somente nos animais A/J. Na 10ª semana, a depleção de células CD25 também resultou em doença menos grave com aumento dos níveis de citocinas em ambas as linhagens. Neste período, entre os grupos controle, somente os animais A/J apresentaram aumento de linfócitos T e macrófagos. Em conclusão, os animais A/J apresentaram aumento da ativação da resposta imune enquanto que animais B10.A não desenvolveram eficiente ativação da resposta adaptativa mas que podem ter apresentado uma imunidade inata mais eficiente no controle do crescimento fúngico. / A mechanism for studying peripheral tolerance is mediated by regulatory T cells (Tregs) expressing the marker CD25 and the transcription factor FoxP3. We studied the role of Tregs in the mechanism of immunosuppression in genetic susceptibility and resistance of host against the fungus. A/J and B10.A mice were depleted of CD25 and control group received rat Ig. In the second week post infection, the depletion of CD25 cells resulted in low severity of disease in both mouse strains, with an intense influx of T lymphocytes and macrophages only in A/J. At 10 weeks, the depletion of CD25 also resulted in low severity disease with increased levels of cytokines in both mouse strains. Moreover, between the control group, only A/J mice showed an increase of T lymphocytes and macrophages. In conclusion, A/J mice showed increased activation of the immune response, whereas B10.A mice that had not developed efficient activation of the adaptive immune response, but that probably had an innate immunity that was more effective in controlling fungal growth.

Os receptores do tipo Toll compreendem a família de receptores de reconhecimento de padrões melhor caracterizados, que podem ativar diferentes respostas imunes, dependendo de quais receptores e conjuntos de adaptadores são utilizados. Os TLRs, como TLR2, TLR4 e TLR9, e sua sinalização foram implicados no reconhecimento de P. brasiliensis e na regulação da resposta imune, no entanto, o papel do TLR3 ainda não está claro. Assim, a compreensão da função endossomal do TLR3 na PCM experimental é crucial. Utilizamos modelos in vitro e in vivo de infecção por P. brasiliensis, camundongos C57Bl/6 e TLR3-/-, para avaliar a contribuição da TLR3 no desenvolvimento da infecção. Mostramos que ausência de TLR3 leva o aumento de óxido nítrico e a capacidade fagocítica por macrófagos nas primeiras 4 horas de interação com leveduras P. brasiliensis. Mostramos ainda que os camundongos TLR3-/- desempenham papel protetor após 30 dias de infecção intratraqueal com P. brasiliensis, mostrando diminuição do aumento de CFU, perfil de resposta Th1 e Th17, bem como aumento de células citotóxicas T CD8+ produtoras de IFN-&#947; e IL-17. As células citotóxicas T CD8+ mostraram ser essenciais para o controle da infecção nos camundongos TLR3-/-, uma vez que a depleção dessas células levou a progressão da doença. Em estágios iniciais, 3 e 5 dias de infecção, observamos aumento do recrutamento de neutrófilos para o pulmão. Estudos recentes indicam que o TLR3 é um receptor importante para a resposta imune na micose e sua ausência favorece a infecção por fungos. Em contraste, nossos resultados mostram que, no caso do PCM, o TLR3 é prejudicial ao hospedeiro, sugerindo que a ativação do TLR3 pode ser um possível mecanismo de escape de P. brasiliensis. / Toll-like receptors comprise the best-characterized pattern-recognition receptor family that can activate different immune responses, depending on which receptor and adaptor set are utilized. TLRs, such as TLR2, TLR4 and TLR9, and their signaling have been implicated in the recognition of P. brasiliensis and regulation of the immune response, however, the role of TLR3 remains unclear. Thus, understanding the endosomal function of TLR3 in experimental PCM is crucial. We used in vitro and in vivo models of infection by P. brasiliensis, C57Bl/6 and TLR3-/- mice, to assess the contribution of TLR3 on development of infection. We show that absence of TLR3 leads to increased nitric oxide and phagocytic capacity by macrophages in the first 4 hours of interaction with yeasts P. brasiliensis. We also showed that TLR3-/- mice play a protective role after 30 days of intratracheal infection with P. brasiliensis, showing a decrease in the CFU increase, Th1 and Th17 response profile, as well as an increase in cytotoxic CD8+ cells producing IFN-&#947; and IL-17. The cytotoxic T CD8+ cells were shown to be essential for the control of infection in TLR3-/- mice, since the depletion of these cells led to the progression of the disease. In the initial stages, 3 and 5 days of infection, we observed increased recruitment of neutrophils to the lung. Recent studies indicate that TLR3 is an important receptor for the immune response in mycosis and its absence favors fungal infection. In contrast, our results show that in the case of PCM, TLR3 is detrimental to the host, suggesting that TLR3 activation may be a possible escape mechanism of P. brasiliensis.

Paracoccidioidomicose é adquirida pela via respiratória e o óxido nitrico (NO) está envolvido na eliminação de patógenos. Nós propusemos investigar o papel do NO na doença em animais NO-/- sintase deficientes (iNOS-/-) e seu grupo WT. Na 2ª semana de infecção, a ausência de NO resultou em doença menos grave com aumento dos níveis de TNF-a acompanhado com o intenso afluxo de linfócitos T e macrófagos para os pulmões. Na 10ª semana, os animais iNOS-/- desenvolveram alta carga fúngica nos pulmões com menor afluxo de celulas T ativadas e macrófagos e presença de células T reguladoras CD4+CD25+FoxP3+ nos pulmões. Somente os animais iNOS-/- desenvolveram lesões pulmonares organizadas em granulomas, embora não foi detectado diferença na mortalidade para ambos os grupos. As diferenças morfológicas nas lesões foram abolidas pela depleção de TNF-a que induziu nos animais iNOS-/- uma mortalidade precoce e intenso afluxo inflamatório nos pulmões. Além disso, a depleção de linfócitos TCD8+ resultou em doença mais grave e menor recrutamento celular pulmonar nos animais iNOS-/-. / Paracoccidioidomycosis is acquired by the respiratory route and nitric oxide (NO) is involved in the killing of pathogens, we aimed to investigate the role of NO in the course of the disease using NO- synthase deficient (iNOS-/-) and WT mice. At week 2 postinfection, NO absence resulted in less severe infection associated with increased TNF-a levels besides a massive influx of activated T cells and macrophages to the lungs. By week 10, iNOS-/- mice developed increased fungal burdens allied with less pronounced influx of activated T cells and macrophages and increased presence of regulatory CD4+CD25+FoxP3+ T cells to the lungs. Only iNOS-/- mice developed organized pulmonary granulomas, although no differences in the mortality rates were detected. The differences in the morphology of lesions were partially abrogated by TNF-a depletion which, induced a precocious mortality of iNOS-/- and massive influx of inflammatory pulmonary cells. Indeed, the CD8+T cells depletion developed a more severe infection with less recruitment of pulmonary cells in iNOS-/- mice.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-12-20Bitstream added on 2014-06-13T20:09:23Z : No. of bitstreams: 1 000736403.pdf: 2027693 bytes, checksum: d4421ff9f2de84b0955662de4c9a9da9 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / A interação fungo-hospedeiro resulta em um processo complexo cujo conhecimento permite melhor entendimento da patogênese das micoses sistêmicas. Espécies de Paracoccidioides são agentes causadores da paracoccidioidomicose (PCM), doença progressiva, crônica e sistêmica, geograficamente confinada na América Latina. O fungo é termodimórfico e a infecção ocorre após a inalação de conídios ou fragmentos de hifas, que ao entrarem em contato com o hospedeiro podem ser transformadas em formas leveduriformes. Esse evento é importante para o estabelecimento da PCM, associado a fatores ligados ao fungo bem como ao hospedeiro. A virulência fúngica é descrita como um evento altamente complexo onde em diferentes estágios da infecção ocorre a expressão de múltiplos genes, podendo estar fortemente associados ao estabelecimento da doença. A adesão e a sobrevivência no interior do hospedeiro são extremamente importantes para o estabelecimento da patogênese. Alguns genes de Paracoccidioides spp se apresentam diferencialmente expressos durante a transição dimórfica do fungo, apresentando baixos níveis de expressão na forma miceliar quando comparadas com a forma leveduriforme, sugerindo que estes possivelmente seriam fatores na composição de estratégias moleculares que P. brasiliensis utiliza para morfo-adaptação e sobrevivência no hospedeiro. O objetivo deste trabalho foi estudar a expressão de genes relacionados a alguns dos fatores de virulência de P. brasiliensis e P. lutzii na fase miceliar e leveduriforme, visando verificar o nível de expressão no fungo bem como na interação com células fagocíticas e epiteliais. Para tanto foram realizados ensaios de infecção com P.brasiliensis (Pb18) e P. lutzii (P01), nas fases miceliar e leveduriforme em células epiteliais pulmonares (MRC-5) e macrófagos alveolares (AMJ2-C11) utilizando a técnica de PCR em tempo real (qRT-PCR). Os genes eleitos para este estudo foram os... / The fungus - host interaction results in a complex process whose knowledge allows a better understanding of the pathogenesis of systemic mycoses. Paracoccidioides species are causative agents of paracoccidioidomycosis (PCM), a progressive, chronic and systemic disease , geographically confined to Latin America. The fungus is thermally and infection occurs after inhalation of conidia or hyphal fragments, which on contact with the host can be transformed into yeast forms. This event is important for the establishment of PCM besides other factors related to the host-fungus interaction. The fungal virulence is described as a highly complex event that enables the expression of multiple genes of the fungus in different stages of infection and can be strongly associated with the development of the disease. Adherence and survival within the host are extremely important for the establishment of pathogenesis. Paracoccidioides spp differentially expressed some genes during the dimorphic fungus transition, having low expression levels in the mycelial form compared with yeast-form, suggesting that these factors were likely to be in the composition of molecular strategies of P. brasiliensis that uses to morpho- adaptation and survival in the host. The aim of this study was to compare the gene expression of the some virulence factors of Paracoccidioides species by real-time PCR. For the assays, the infection was performed with the yeast and mycelial phase of P. brasiliensis (Pb18) and P. lutzii (P01) in pulmonary epithelial cells (MRC-5) and alveolar macrophages (AMJ2 -C11) using RT- PCR. The genes chosen for this study were those which express the 43 kDa glycoprotein (gp43), enolase, glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase (GAPDH), 14-3-3 (30kDa), phospholipase, protease and hemolysin (Duf gene). The results showed a significant increase in the levels expression of enolase, gp43 and GAPDH in the yeast phase of P. brasiliensis. Enolase was more ...