Considerando que expressividade é uma forma significativa de comunicação corporal, que busca através da Dança a harmonia das formas biológica, cultural e filosófica do ser humano, este estudo objetiva descrever e compreender a percepção dos acadêmicos de Educação Física que cursam a disciplina de Metodologia do Ensino da Dança Escolar sobre sua expressividade. Inicialmente são apresentados conceitos, classificações, bem como os níveis de complexidade da expressividade. Na seqüência faz-se uma interação entre Expressividade, Educação Física e Dança, ressaltando a importância do ato criativo da expressividade dentro do contexto de ensino. Participaram do estudo 16 acadêmicos do curso de Educação Física da Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões (URI) Campus de Erechim, que cursavam a disciplina de Metodologia do Ensino da Dança Escolar. Os instrumentos utilizados na pesquisa foram entrevistas semi-estruturadas (inicial e final) e notas de campo. O período de coleta de dados aconteceu de 02 de abril de 2008 a 28 de maio de 2008 na Sala de Dança e no Auditório Central da URI. As informações obtidas foram agrupadas em unidades de significado, que reescritas, originaram categorias de análise. Os resultados mostram uma significativa evolução em relação às definições de expressividade, evidenciando a linguagem do corpo em sua sensibilidade, bem como a constatação de como é possível criar e também incentivar a criação de novos movimentos, derrubando barreiras sociais com a Dança inserida no contexto da Educação Física. / If we consider that expressivity is one significative way of corporal communication, which searches through Dance the harmony of the biological, cultural and philosophical forms of human being, so this study desires to describe and to understand the perception of Physical Education undergraduate students who attend classes of Methodology of School Dance Teaching about their expressivity. In the beginning of this study is showed the concepts, classifications, as well as expressivity complexity levels. In the sequence, it does a interaction between Expressivity, Physical Education and Dance, it noted the importance of the creative act of expressivity inside teaching’s context. The participants were 16 students of Physical Education course from Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões (URI), Campus de Erechim. They attend classes of Methodology of School Dance Teaching discipline. The instruments utilized in the research were semistructured interviews (initial and final) and field notes. The collective period has happened at April 02nd, 2008 until May 28th, 2008 at Dance Room and at URI’s Central Auditorium. The informations were grouped in units of meanings that were rewrited. This originated the analyze categories. The results show a significative evolution related to expressivity definitions, which clear out the body language in your sensibility, as well as the observation that creating and also motivating the creation of new movements are possible, breaking down social obstacles with the Dance taking a place inside the Physical Education’s context.

Apesar da obtenção de animais nascidos vivos a partir de oócitos imaturos bovinos congelados ou vitrificados, um dos grandes desafios continua sendo o desenvolvimento de um método que proporcione melhores resultados de viabilidade pós-criopreservação. Assim como a ação dos crioprotetores empregados, a eficiência no processo de maturação in vitro (MIV) influi diretamente na taxa de desenvolvimento embrionário. Durante a maturação oocitária in vitro observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão gênica de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária e de composição do meio de MIV. O objetivo deste trabalho foi avaliar a expressão gênica das proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e HSP70-1 (proteína de choque térmico) em células do cumulus oophorus de oócitos imaturos bovinos submetidos a exposição e/ou vitrificação em duas soluções crioprotetoras e, posteriormente, maturados in vitro. Foram comparadas duas soluções de vitrificação (SV): SV1 = 20% de etileno glicol (EG) + 20% de 1,2 propanediol (PRO), e SV2 = 20% de EG + 20% DMSO + 0,5M de sacarose. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em 6 grupos experimentais: G1 (AOC), CCOs não maturados; G2 (AMC), CCOs submetidos à MIV; G3 (B1EC), CCOs expostos à SV1 e submetidos à MIV; G4 (B2EC), CCOs expostos à SV2 e submetidos à MIV; G5 (A1VC), CCOs vitrificados com a SV1 e submetidos à MIV; G6 (A2VC), CCOs vitrificados com a SV2 e submetidos à MIV. A MIV foi realizada em TCM 199 suplementado com soro de égua em estro, à 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Após a MIV, 5 CCOs de cada grupo (G2 a G6), foram coletados, submetidos ao desnudamento mecânico e as células do cumulus foram concentradas por centrifugação e acondicionadas em tubos cônicos de 0,5 ml em nitrogênio líquido. O restante dos CCOs destes grupos foi submetido a fecundação e cultivo in vitro sob condições semelhantes a MIV. Para a extração do RNA total das amostras de células do cumulus foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi re-suspenso e as amostras foram submetidas à captação específica do mRNA utilizando-se um “kit” comercial de separação magnética. Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos quatro transcritos de bovinos (link protein, HAS2, conexina 43 e HSP70-1). O grupo de oócitos imaturos exposto a SV1 apresentou uma taxa de blastocistos (30,1%) semelhante ao grupo controle (38,1%) e significativamente superior ao grupo exposto a SV2, (16,9%; p=0,0013). Houve diferença significativa (p<0,0001) entre o grupo controle e os grupos vitrificados nas soluções SV1 e SV2, tanto na taxa de clivagem (respectivamente, 79,2%; 22,1% e 43,3%) quanto no desenvolvimento até o estádio de blastocisto (respectivamente, 35,6%; 0% e 4,1%). A análise dos resultados de abundância relativa obtida a partir das células do cumulus oophorus de 5 CCOs bovinos em cada um dos seis grupos experimentais, após três repetições, não mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de link protein (p=0,738), HAS2 (p=0,772), conexina 43 (p=0,130) e HSP70-1 (p=0,333). / The major challenge in the cryopreservation of bovine immature oocytes is still developing a method that provides adequate results of survival and viability after vitrification. As the action of cryoprotectants employed, the efficiency of in vitro maturation (IVM) process directly influences the embryonic development. The mucification and expansion of the granulosa cells from the cumulus oophorus-oocyte complex (COC), caused by copious synthesis and deposition of extracellular matrix components, is observed during oocyte maturation in vitro. Such changes in the cumulus appearance are used as indicative of the oocyte maturation occurrence and contribute to fertilization. The gene expression of proteins associated with the extracellular matrix of the cumulus cells could be on the oocyte and/or IVM medium composition influences. The aim of this study was to evaluate, through the RT-PCR technique, the gene expression of hyaluronic acid synthase protein 2 (HAS2), link protein (HAPLN1), connexin 43 (GJA1) and heat shock protein 70 (HSP70-1) in the cumulus oophorus cells of bovine immature oocytes exposed and/or vitrified in cryoprotectant solutions and then matured in vitro. We compared two vitrification solutions (VS): VS1 = 20% ethylene glycol (EG) + 20% 1,2 propanediol (PRO), and VS2 = 20% EG + 20% DMSO + 0.5 M sucrose. The COCs were obtained from cow ovaries, collected right after slaughter. After the morphological selection, the COCs were allocated into six experimental groups: G1- imature COCs; G2- COCs subjected to IVM; G3- COCs exposed to VS1 and subjected to IVM; G4- imature COCs exposed to VS2 and submitted to IVM; G5- COCs vitrified with VS1 and subjected to IVM; and G6- COCs vitrified with VS2 and submitted to IVM. The IVM was performed in TCM 199 supplemented with oestrus mare serum, at 39°C, under 5% of CO2 and maximum relative humidity, for 22 to 24 hours. After IVM, five COCs in each group (G2 to G6) were collected, the oocytes were stripped of cumulus cells by vortexing and the cells were concentrated by centrifugation and placed in conical tubes of 0.5 ml in liquid nitrogen. In each group COCs were subjected to in vitro fertilization and culture under similar conditions from used in MIV. The RNA extraction from samples containing the cumulus cells was performed by using TRIzol® reagent protocol. Total RNA was re-suspended and the samples were subjected to the specific capture of mRNA using a commercial kit for magnetic separation. The mRNAs were reverse transcribed into cDNA using the RT-PCR technique to evaluate patterns of expression of the four bovine transcripts (link protein, HAS2, connexin 43 and HSP70-1). The immature oocytes group exposed to VS1 showed a blastocyst rate (30.1%) similar to the control group (38.1%) and significantly higher than the group exposed to VS2, (16.9%, p = 0.0013). Significant difference (p <0.0001) was observed between the control group and groups vitrified in the VS1 and VS2, both in the rate of cleavage (respectively, 79.2%, 22.1% and 43.3%) and the development to the blastocyst stage (respectively, 35.6%, 0% and 4.1%). The results of relative abundance obtained from the cumulus cells of the five bovine COCs in each experimental group, after three repetitions, showed no significant difference between the groups tested for the transcripts of link protein (p = 0.738 ), HAS2 (p = 0.772), connexin 43 (p = 0.130) and HSP70-1 (p = 0.333).

290 f. / Submitted by Suelen Reis (suziy.ellen@gmail.com) on 2013-04-25T18:26:13Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Dulciene Silva.pdf: 2686276 bytes, checksum: 1bf2b3107b28fa25eb5580aa5fb6867e (MD5) / Approved for entry into archive by Maria Auxiliadora Lopes(silopes@ufba.br) on 2013-04-30T16:17:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação Dulciene Silva.pdf: 2686276 bytes, checksum: 1bf2b3107b28fa25eb5580aa5fb6867e (MD5) / Made available in DSpace on 2013-04-30T16:17:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Dulciene Silva.pdf: 2686276 bytes, checksum: 1bf2b3107b28fa25eb5580aa5fb6867e (MD5) Previous issue date: 2004 / O exercício docente permite constatar que, apesar dos onze anos de convivência com o processo de escolarização formal, os estudantes, ao chegarem à universidade,apresentam uma recorrente dificuldade com relação a sua expressão oral. Ao mesmo tempo em que busca os fundamentos epistemológicos, pedagógicos, lingüísticos e psicológicos das raízes deste problema, esta pesquisa procura compreender as relações entre atividades lúdicas e desenvolvimento da expressão oral. Possui, enquanto objetivo, investigar a relação entre ludicidade e desenvolvimento do potencial expressivo e comunicativo dos estudantes, ou, mais especificamente, compreender como ou de que forma uma prática pedagógica lúdica possibilita o desenvolvimento da expressividade destes indivíduos. Nas últimas décadas, psicólogos, psicanalistas, sociólogos e pedagogos têm-se debruçado à compreensão da importância da atividade lúdica na dinâmica do desenvolvimento global do indivíduo. Contextualizando algumas destas abordagens, utilizando as contribuições de teorias que inauguraram uma abordagem sistêmica de ser humano e da realidade e, ao mesmo tempo, relacionando os fundamentos psicossomáticos da expressividade pesquisados por Wilhelm Reich com o conceito de ludicidade apresentado por Cipriano Luckesi, esta pesquisa discute os alicerces de uma proposta pedagógica voltada para potencializar a expressão oral dos estudantes. Para o seu desenvolvimento, foi utilizada uma metodologia fundamentada na pesquisa-ação,trabalhando-se empiricamente durante um semestre letivo com estudantes matriculados em Laboratório de Expressão Oral, disciplina até então integrante do currículo mínimo da graduação em Letras Vernáculas da Universidade do Estado da Bahia - UNEB. O estudo sinaliza que, ao possibilitar a vivência da dimensão totalizante do ser através da experiência integradora do sentir/pensar/fazer, a ludicidade constitui um valioso recurso para recriar nos estudantes a sua espontaneidade, a sua criatividade e autoconfiança e, desta forma, contribuir para que sua expressão oral possa emergir de forma mais inteira e mais significativa. / Salvador

Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-11-06T19:57:37Z No. of bitstreams: 1 Leonardo Vicitini Arruda Desenvolvido de plasmídio para expressão proteíca....pdf: 2125843 bytes, checksum: cf2e5fe050fd36b4ebba0206f40d6e3a (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-06T19:57:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Leonardo Vicitini Arruda Desenvolvido de plasmídio para expressão proteíca....pdf: 2125843 bytes, checksum: cf2e5fe050fd36b4ebba0206f40d6e3a (MD5) Previous issue date: 2013 / Universidade Federal da Bahia. Faculdade de Medicina da Bahia. Salvador, BA, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil. / Protozoários do gênero Leishmania provocam uma ampla gama de doenças, e passam por um processo de diferenciação entre o inseto vetor e a forma intracelular no hospedeiro mamífero. Apesar das diferenças entre as formas do ciclo de vida, não estava descrita ferramenta para expressar proteínas de modo estágio específico. Neste trabalho apresentamos um plasmídio para Leishmania que expressa proteína recombinante de forma estágio específica. Testamos uma possível construção que usava as região 3’ UTR do gene amastina para controlar a expressão de uma proteína fluorescente e a expressar exclusivamente na fase amastigota. Também utilizamos a região 3’ UTR de uma tubulina para obter uma fluorescência homogênea em todos os estágios do ciclo de vida do parasita. Assim como esperado, obtivemos uma fluorescência exclusiva para a fase amastigota quando utilizamos a região 3’ UTR da amastina, e uma fluorescência constitutiva quando a expressão foi regulada pela região 3’ UTR da tubulina. O plasmídio descrito neste trabalho é versátil, pois a droga de seleção ou a proteína a ser expressa podem ser substituídas com grande facilidade. Adicionalmente, como o plasmídio pFL expressou um gene repórter exclusivamente no estágio amastigota ou constitutivamente, acreditamos que este plasmídio pode também ser utilizado para expressar proteínas de forma restrita aos estágios promastigota metacíclico e procíclico. Alguns possíveis usos desta nova ferramenta também são discutidos nesta tese / The parasitic protozoan Leishmania causes a wide spectrum of diseases and passes through differentiation between the sand fly and the intracellular form. Despite distinction between life-cycle forms of the parasite, there is no described tool to express a protein in a specific stage. Here, we present a plasmid for Leishmania that can express recombinant proteins in a specific life-cycle stage. We tested one possible construction that used the 3’ UTR region of the amastin gene to control the expression of a fluorescent protein exclusively in the amastigote stage. We also used the 3’ UTR of a tubulin to obtain a homogeneous fluorescence in all stages of the parasite life cycle. As expected, was observed a fluorescence exclusive to the amastigote phase with the 3’ UTR amastin construction, and a constitutive fluorescence when the expression were regulated by the 3’ UTR of a tubulin. The plasmid described here is versatile since the drug that will be used for selection or the protein that will be expressed can be easily changed. Moreover, plasmid pFL have expressed a reporter gene exclusively in the amastigote stage or constitutively, we believe that this plasmid can also be used to express proteins in metacyclic and procyclic promastigote stages only. Some possible uses of this new tool are also discussed.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-04-12T18:26:46Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1477435 bytes, checksum: 54c26ccf8c22f331c25e937b81f9b585 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-12T18:26:46Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1477435 bytes, checksum: 54c26ccf8c22f331c25e937b81f9b585 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Infecções que acometem o trato respiratório de suínos levam a significativas perdas econômicas na suinocultura mundial. Um dos principais patógenos respiratórios em suínos é a bactéria Actinobacillus pleuropneumoniae, o principal agente causal da pleuropneumonia. Atualmente podem ser encontrados 16 sorotipos de A. pleuropneumoniae com virulência distinta e complexa, sendo os principais fatores de virulência: exotoxinas Apx, lipopolissacarídeo (LPS), cápsula e a capacidade de formação de biofilme. O controle da doença é baseado no uso de antibióticos e cuidados no manejo da granja. A profilaxia pela imunização passiva ainda é ineficiente devido à dificuldade na obtenção de uma vacina contra todos os sorotipos encontrados. Assim, novas abordagens experimentais na elaboração de uma vacina eficiente associada a uma resposta imune protetora são essenciais porque podem representar novas alternativas na estratégia de controle da doença. A proteína Hfq é um componente central de regulação global pós-transcricional e participa diretamente na regulação da expressão de genes por facilitar a interação de RNAs pequenos com mRNAs alvos, sendo esta uma abordagem atual e relacionada ao controle da virulência em diversas bactérias patogênicas. Neste sentido, o estudo da chaperona de RNA Hfq é de extrema importância, uma vez que já foi demonstrado seu efeito pleiotrópico e impacto na virulência, na resposta a diferentes tipos de estresse e no crescimento celular de vários patógenos, incluindo A. pleuropneumoniae. Portanto, esse trabalho teve como objetivos: caracterizar in silico a proteína Hfq em A. pleuropneumoniae e analisar a expressão e a fase de maior abundância desta proteína ao longo do crescimento de A. pleuropneumoniae. As análises filogenéticas realizadas foram baseadas em análises de comparação de sequências de aminoácidos da proteína Hfq de diferentes membros da classe Gammaproteobacteria, na qual A. pleuropneumoniae está inserida. As demais análises foram conduzidas utilizando os sorotipos 1, 8 e 15 de A. pleuropneumoniae, sendo utilizadas as linhagens do tipo selvagem (WT) e hfq::3XFLAG. O alinhamento de sequências da proteína Hfq revelou uma identidade de 98% entre as proteínas Hfq de A. pleuropneumoniae de diferentes sorotipos, além de demonstar que Hfq de espécies de uma mesma família possuem maior relação filogenética. A análise da estrutura tridimensional da proteína em A. pleuropneumoniae demonstrou a presença de estruturas características da proteína presente em outos patógenos Gram-negativos, como uma α-hélice e folhas β. A análise da velocidade específica de crescimento por ANOVA entre as linhagens WT e hfq::3XFLAG do mesmo sorotipo revelou que não há diferença de crescimento entre essas linhagens do mesmo sorotipo. Quanto à expressão de Hfq, foi detectado um maior acúmulo da proteína na fase estacionária de crescimento, no período de 6-8 horas, dependendo do sorotipo investigado, e que a expressão de Hfq foi diferencial entre os sorotipos analisados. Esses resultados revelaram que a proteína Hfq é conservada entre os sorotipos de A. pleuropneumoniae e possui estrutura tridimensional característica. Além disso, a inserção da etiqueta FLAG em Hfq não alterou o perfil de crescimento celular e hà um maior acúmulo da proteína na fase estacionária de crescimento, sendo que os sorotipos apresentaram distribuição das formas diferencial entre os sorotipos e dinâmica de acordo com a fase de crescimento. Essa diferença pode estar relacionada aos diferentes perfis de virulência e de resposta a diferentes condições investigadas previamente, uma vez que a abundância nestes sorotipos apresentou distribuição temporal distinta. / Infections that affect the respiratory tract of pigs lead to significant economic losses in the swine industry worldwide. One of the major respiratory pathogen in pigs is the bacterium Actinobacillus pleuropneumoniae, the main causal agent of the pleuropneumonia. Currently, 16 serotypes can be found of A. pleuropneumoniae with distinct and complex virulence, with the main factors of virulence: exotoxin Apx, lipopolysaccharide (LPS), capsule and the biofilm formation capacity. Control of the disease is based on the use of antibiotics and care in the management of the farm. Prophylaxis by passive immunization is still inefficient because of the difficulty in getting a vaccine against all serotypes found. Thus, new experimental approaches in the development of an effective vaccine associated with a protective immune response are essential because they can represent new alternatives in the disease control strategy. The Hfq protein is a key component of the global post-transcriptional regulation and directly participates in the regulation of gene expression to facilitate the interaction of small RNAs with target mRNAs, which is a current approach and it relates to the control of virulence in many pathogenic bacteria. In this sense, the study of Hfq RNA chaperone is of extreme importance, since it has already demonstrated its pleiotropic effect and impact on virulence in response to different types of stress and cellular growth of various pathogens, including A. pleuropneumoniae. Therefore, this study aimed: to characterize in silico the Hfq protein in A. pleuropneumoniae and to analyze the expression and phase greater abundance of this protein throughout the growth of A. pleuropneumoniae. The phylogenetic analyzes were based on comparative analysis of amino acid sequences of protein Hfq of different members of the class Gammaproteobacteria, which A. pleuropneumoniae is inserted. The other analyzes were conducted using the serotypes 1, 8 and 15 of A. pleuropneumoniae, being used strains of wild-type (WT) and hfq::3XFLAG. The sequence alignment of Hfq protein sequences showed an identity of 98% between Hfq proteins of A. pleuropneumoniae of different serotypes, also demonstrating that Hfq species of the same family have a greater phylogenetic relationship. The analysis of the three-dimensional structure of the protein in A. pleuropneumoniae demonstrated the presence of specific structures of protein present in other Gram-negative pathogens, how one α-helix and β-strands. The analysis of the specific growth rate by ANOVA between strains WT and hfq::3XFLAG of the same serotype showed that there is no difference in growth between the strains. As the expression of Hfq, a greater accumulation of protein in the stationary growth phase was detected in the period of 6-8 hours, depending on the serotype investigated, and the expression of Hfq was differential between serotypes analyzed. These results demonstrate that Hfq is conserved among serotypes of A. pleuropneumoniae and has a three-dimensional structure conserved. Moreover, the insertion of the FLAG tag on Hfq did not affect the cell growth profile and there is a greater accumulation of the protein in the stationary phase of growth, whereas serotypes showed the distribution of forms differential between serotypes and dynamically according to the growth stage. This difference may be related to different profiles of virulence and response to different conditions previously investigated, since these abundant serotypes showed distinct temporal distribution.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-05-12T11:09:27Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1226647 bytes, checksum: 9e3237bb24db4758f26f774a630a1f7e (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-12T11:09:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1226647 bytes, checksum: 9e3237bb24db4758f26f774a630a1f7e (MD5) Previous issue date: 2002-10-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A proteína SBP (Sucrose Binding Protein) foi inicialmente identificada pela sua capacidade de se ligar a sacarose e parece estar envolvida na via de translocação de sacarose em plantas superiores. Nesta investigação, foram isolados de uma biblioteca genômica de soja, propagada em λZAPII, dois clones genômicos, que correspondem às formas alélicas do gene SBP2. O número de cópias gênicas da família SBP foi estimado por Southern blot e por FISH (Fluorescence in situ Hibridization), utilizando o cDNA SBP e o clone genômico SBP2 como sondas, em lâminas com núcleos interfásicos de soja. O padrão de hibridização demonstrou a existência de dois pares de genes homólogos, com razão de hibridização diferente, representando os dois genes distintos, SBP e SBP2. Para investigar a funcionalidade da sequência do promotor SBP2, aproximadamente 2,0 quilobases da região 5’ foram sequenciadas e fusionadas aos genes repórteres GUS (beta-glucuronidase) e GFP (Green Fluorescent Protein) e analisados em plantas de tabaco transgênicas. Os ensaios histoquímicos demonstraram que ambos os promotores exibem expressão tecido- específica. Estes resultados foram confirmados pela fluorescência tecido- específica da expressão de GFP. Consistente com seu envolvimento no transporte de sacarose a longa distância, os promotores SBP2 dirigiram a expressão dos genes repórteres com alta especificidade para o floema de todos os órgãos analisados, como meristema, caule, folha e raiz. Entretanto, altos níveis de expressão foram observados predominantemente no meristema e em folhas- dreno. Foi também demonstrado que o promotor SBP2 é regulado de modo dependente da forma e da concentração de açúcar disponível no meio de cultura de células de tabaco transgênico em suspensão. Deleções no promotor SBP2 foram feitas para a identificação de regiões contendo elementos regulatórios em cis. Ensaios histoquímicos com plantas transgênicas contendo as construções quiméricas com as deleções do promotor demonstraram que o padrão tecido-específico do gene SBP2 é coordenado pela interação entre elementos regulatórios positivos e negativos. A região contida entre as posições -2000 até -490 possui elementos positivos que potencializam a expressão no floema, uma vez que a deleção dessa região causou um decréscimo substancial na atividade do promotor. A deleção adicional do promotor até a posição -364 restaurou a atividade do promotor em todos os tecidos analisados. Como conseqüência, a atividade quantitativa de GUS foi muito superior àquela observada para o promotor intacto. Estes resultados indicam a presença de um elemento silenciador, na região delimitada pelas posições -489 a -364. Além disso, a região de -363 a -132 possui um elemento positivo, responsável pela expressão no meristema radicular, uma vez que a deleção deste fragmento silencia a expressão de GUS no meristema radicular. O padrão de expressão tecido- específico, das construções quiméricas das deleções do promotor, se correlaciona com a distribuição dos elementos DOF na seqüência do promotor, em associação com os elementos O2 e GCN4. Coletivamente, estes resultados mostram que o promotor SBP representa uma poderosa ferramenta biotecnológica útil para o direcionamento da expressão de genes alvos para o tecido vascular de plantas de soja e tabaco transgênicas. / Tese importada do Alexandria, apresenta somente resumo em português.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-06-23T11:41:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 388479 bytes, checksum: 3f6213e3987bc7cbece94deab1128175 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-23T11:41:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 388479 bytes, checksum: 3f6213e3987bc7cbece94deab1128175 (MD5) Previous issue date: 2001-03-15 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A região codificadora do gene LAC4, que codifica a β-galactosidase de Kluyveromyces marxianus var. lactis, foi isolada do plasmídeo pLAC4-12, por meio da técnica de reação de polimerização em cadeia (PCR) com oligonucleotídeos iniciadores, que amplificam um fragmento de aproximadamente 3.000 pb. Com os objetivos de expressar e secretar a β- galactosidase, este fragmento foi clonado em um vetor de expressão e secreção pPIC9 do sistema de expressão de Pichia pastoris. A região codificadora LAC4 intacta e uma versão truncada foram fundidas em fase com a seqüência sinal de secreção do fator-α, sob controle do promotor AOX1. A hidrólise dos DNAs recombinantes obtidos com as enzimas de restrição apropriadas confirmou a clonagem da região codificadora LAC4 intacta nas orientações anti-senso e senso e da versão truncada no vetor pPIC9. Os clones foram linearizados e usados para transformar células eletrocompetentes de Pichia pastoris GS115 (His - e Mut + ). Colônias recombinantes foram isoladas e as inserções da região codificadora LAC4 intacta e truncada no genoma da levedura foram confirmadas por “PCR” com iniciadores específicos. Colônias recombinantes positivas foram cultivadas em glicerol e a expressão dos genes recombinantes foi induzida com metanol. Amostras foram coletadas periodicamente e o meio extracelular e a massa de células analisados quanto à atividade de β -galactosidase. Nenhum aumento na atividade de β - galactosidase foi observado perante o controle. Espera-se que a transformação de linhagens da levedura Mut - com os clones obtidos possa resultar na produção de uma proteína funcional. / The codins Kluyveromyces region marxianus of var. the lactis β-galactosidase was isolated LAC4 from gene, pLAC4-12, from by polimerase chain reaction (PCR) technique with primers that amplify a fragment of approximately 3.000 bp. Expression and secretion vector to expresse and secrete β-galactosidase, the intact and truncated LAC4 coding regions were fused in phase with the factor-α secretion signal sequence in the Pichia pastoris pPIC9. Appropriate restriction enzyme hydrolates confirmed the insertion of the intact LAC4 coding region in sense and antisense orientations, as well as its truncated version in to the pPIC9 vector. The clones were linearized and used to transform electrocompetent Pichia pastoris GS115 (His - e Mut + ) cells. Recombinant cells were isolated and the insertions of intact and truncated LAC4 coding regions in the yeast genome were confirmed by PCR with specific primers. Positive recombinant colonies were grown in glycerol and the expression of the heterologous genes was induced with methanol. Samples were periodically collected and the extracellular medium and cell mass were analyzed for β-galactosidase activity. No increase in β-galactosidase activity was observed over the control. The transformation of Mut - yeast cell lines with the clones is expectial to result in the production of a functional protein. / Dissertação importada do Alexandria

MEDEIROS, Suelen Carneiro de. Expressão heteróloga de uma glicosil hidrolase da Família 18 (cv2736) de Chromobacterium violaceum em Pichia pastoris com potencial antibacteriano. 2012. 122 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2012. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-11T13:31:54Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_scmedeiros.pdf: 2847279 bytes, checksum: c0e6c68e1b479acad3f4108642933a87 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-08-02T20:21:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_scmedeiros.pdf: 2847279 bytes, checksum: c0e6c68e1b479acad3f4108642933a87 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T20:21:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_dis_scmedeiros.pdf: 2847279 bytes, checksum: c0e6c68e1b479acad3f4108642933a87 (MD5) Previous issue date: 2012 / Chitinases are enzymes capable of hydrolyzing chitin, a polysaccharide composed of units of N-acetyl-D- glucosamine, which is abundant in nature. The genome sequence of C. violaceum ATCC 12472 has revealed some genes encoding proteins with potential applications in agriculture and medicine, such as those encoding chitinases. This study aimed to express the protein CV2736 in Pichia pastoris KM71H and to evaluate its antimicrobial potential against microorganism of medical importance. To this purpose, the full ORF (encoding rCV2736 PS+) and a partial sequence of it, encoding a truncated protein without its putative signal peptide (rCV2736PS‒), were cloned into the vector pPICZ α A for expression in P. pastoris. The protein rCV2736 PS+ was detected in the cell-free culture medium of P. pastoris cells harboring the corre sponding expression cassete. The recombinant CV2736PS+ was produced in a heterogeneous manner, and when analyzed by SDS-PAGE, three protein bands with apparent molecular masses of 41. 3, 38.1 and 36. 2 kDa were detected. The protein band with the highest molecular mass (41.3 kDa) was stained with the Periodic acid - Schiff’s reagent, thus showing that this band corresponds to N-glycosylated rCV2736PS+. Furthermore, tryptic peptides identified by mass spectrometry (ESI-MS) confirmed the identity of the expressed protein. The recombinant protein produced without the first 22 amino acids(rCV2736PS‒) showed higher chitinase activity than that found for th e fraction containing rCV2736PS+, despite not being detected by SDS-PAGE. The recombinant protein CV2736PS+, present in the fraction F0/95 from the culture medium of induced cells, was active after heat treatment at 50 °C and its maximum chitinolytic activity was recorded at pH 3.0. This fraction was also able to degrade the synthetic substrates 4-nitrophenyl N,N'-diacetyl -β-D-chitobioside and 4-nitrophenyl N,N',N''-triacet yl chitotrioside, which characterizes an endochitinase activity. Abinitio molecular modeling demonstrated that the polypeptide of CV2736 likely folds as a(β/α)8 barrel (also known as TIM barrel), which is typical of the GH18 family proteins. The fraction F0/95 showed antimicrobial activity against Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and growth inhibition against Salmonella cholera-suis. The same fraction were evaluated against the yeast Candida albicans, but was not detectable inhibition of this microorganism in the assay. These results suggest that rCV2736 should be further studied as a new anti-bacterial agent. / Quitinases são enzimas capazes de hidrolisar quitina, um polissacarídeo formado por unidades de N-acetil-β-D-glucosamina, que é extremamente abundante na natureza. Após o sequenciamento do genoma de C. violaceum ATCC 12472, alguns genes referentes a proteínas com potencial biotecnológico foram encontrados, dentre eles os que codificam para quitinases. Este trabalho teve como objetivos expressar a proteína CV2736 de C. violaceum ATCC 12472 de forma recombinante em células de Pichia pastoris KM71H e avaliar seu potencial antimicrobiano frente a microrganismos de importância médica. Para isto, a sequencia completa da ORF (CV2736PS+), bem como uma sequencia parcial, codificando uma proteína truncada, sem um possível peptídeo sinal N-terminal (CV2736PS‒), foram clonadas no vetor de expressão pPICZαA, para expressão em P. pastoris KM71H. A proteína completa (rCV2736PS+) foi detectada em uma fração proteica, contendo as proteínas secretadas para o meio de cultura, por células de P. pastoris transformadas com o respectivo cassete de expressão recombinante. A rCV2736PS+ apresentou-se de forma heterogênea, quando analisada por SDS-PAGE, exibindo três bandas com massas moleculares aparentes de 41,3, 38,1 e 36,2 kDa, respectivamente, sendo uma delas (41,3 kDa) maior do que se poderia deduzir a partir da sequencia de aminoácidos. Após coloração com reagente de Schiff para revelação de glicoproteínas, constatou-se que essa banda (41,3 kDa) correspondia a rCV2736PS+ na sua forma N-glicosilada. Além disso, rCV2736PS+ teve seus peptídeos identificados por espectrometria de massas, na fração F0/95 do meio de cultura livre de células. A proteína recombinante produzida sem os 22 aminoácidos iniciais (rCV2736PS‒) apresentou atividade quitinásica maior que a encontrada para a fração contendo rCV2736PS+, apesar de não ter sido detectada por SDS-PAGE. A fração F0/95 do meio de cultura contendo rCV2736PS+ mostrou-se termoestável até 50°C e com pico de atividade quitinolítica em pH 3,0. A mesma fração apresentou maior atividade endoquitinásica e ativa contra os substratos sintéticos 4-nitrofenil N,N’–diacetil-β-D-quitobiosídeo e 4-nitrofenil N,N’,N’’–triacetilquitotriose. A modelagem molecular evidenciou o dobramento na forma de barril (β/α)8 (barril TIM), típico das proteínas da família GH18. Do mesmo modo, a fração F0/95 foi testada contra seis espécies de bactérias, apresentando atividade microbicida contra Pseudomona aeruginosa, Escherichia coli e Staphylococcus aureus, e foi capaz de inibir o crescimento de Salmonella choleraesuis. A mesma fração foi testada contra a levedura Candida albicans, mas não foi detectada inibição do crescimento contra este microrganismo no ensaio. Portanto, a proteína recombinante rCV2736 pode, assim, ser considerada uma molécula com potencial antibacteriano. Palavras-chave: Quitinase; Pichia pastoris; antimicrobiano; Expressão heteróloga.

CORREIA, Tuana Oliveira. Quitinase de Classe I de feijão-de-corda (Vigna unguiculata): Estudo preliminar da expressão do gene, clonagem, expressão e purificação em Escherichia coli BL21(λ)DE3 e determinação da estrutura através da modelagem por homologia. 2007. 90 f.Dissertação (Mestrado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2007. / Submitted by Eric Santiago (erichhcl@gmail.com) on 2016-07-13T14:28:51Z No. of bitstreams: 1 2007_dis_tocorreia.pdf: 4501880 bytes, checksum: 7e0762a6def00c394cbdb56fc9fe2389 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-13T23:35:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2007_dis_tocorreia.pdf: 4501880 bytes, checksum: 7e0762a6def00c394cbdb56fc9fe2389 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-13T23:35:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2007_dis_tocorreia.pdf: 4501880 bytes, checksum: 7e0762a6def00c394cbdb56fc9fe2389 (MD5) Previous issue date: 2007 / In this work we have made a preliminary study on the expression of a class I chitinase gene from cowpea (Vigna unguiculata L.Walp), cloning and expression of this gene in Escherichia coli BL21(λ)DE3 cells and, through homology modeling, we determined the three­ dimensional structure of this protein. The expression of the class I quitinase gene from cowpea was performed by RT­PCR from the total RNA, with specific primers, from seeds and pods in distinct stages of development (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 and 18 days), belonging to two contrasting genotypes regarding to infection by Callosobruchus maculatus, IT81D­1053 (resistant) e TE97­419­07F (susceptible). The gene expression in leaves, roots, epicotyls and hipocotyls from two contrasting genotypes considering the infection by the nematoid Meloidogyne incongnita, CE­31(resistant) e TE97­411­1F (susceptible). The VuChiI gene cloning was accomplished from the amplified product on RT­PCR with IT81D­1053 seeds, and the amplified product from the genomic DNA of MONTEIRO. Eleven clones were obtained, from which nine were sequenced. The cloning of R7 clone was accomplished in pET15b vector and the expression of the recombinant protein was induced in the presence of IPTG 1mM. The protein, with 30 kDa, was visualized through a SDS­PAGE. The protein purified through an affinity chromatography in Sepharose column with immobilized Nickel did not had a significative hydrolytic activity. The models generated for the clones and for the native chitinase, have indicated that mutations that occurred did not changed the molecule's active sites. Thus, the class I chitinase gene from feijão­ de­ corda seems to present constitutive expression in all parts of the plant. The recombinant chitinase obtained was inactive. The specific mutations in the resulting clones suggests the occurrence of isoforms of this protein, what should be elucidated in the future. / No presente trabalho, foi realizado um estudo preliminar sobre a expressão de um gene de quitinase de classe I de feijão-de-corda (Vigna unguiculata L.Walp), a clonagem e expressão desse gene em células de Escherichia coli BL21(λ)DE3 e a determinação via modelagem por homologia da estrutura tridimensional dessa proteína. A expressão do gene da quitinase de classe I de feijão-de-corda foi obtida a partir de RT-PCR com oligonucleotídeos iniciadores específicos. Nessas reações, foram usadas amostras de RNA total de sementes e vagens em diferentes estágios de crescimento (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 e 18 dias), pertencentes a dois genótipos contrastantes quanto a infecção pelo Callosobruchus maculatus, IT81D-1053 (resistente) e TE97-419-07F (suscetível). A expressão foi avaliada também em folhas, raízes, epicótilo e hipocótilo de dois genótipos contrastantes quanto a infecção pelo nematóide das galhas Meloidogyne incongnita, CE-31 (resistente) e TE97-411-1F (suscetível). A clonagem do gene VuChiI foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes de IT81D-1053, e do produto amplificado a partir do DNA genômico de MONTEIRO. Foram obtidos 11 clones confirmados, dos quais 9 foram seqüenciados. A subclonagem do clone R7 foi realizada em pET15b e a expressão da proteína recombinante foi induzida na presença de IPTG 1mM. A proteína recombinante, com aproximadamente 30 kDa, foi visualizada através de um SDS-PAGE. A proteína purificada através de uma cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose com Níquel imobilizado não apresentou atividade quitinásica significativa. Os modelos gerados para os clones obtidos e para a quitinase nativa, indicam que as mutações ocorridas não alteram os sítios ativos das moléculas. Dessa forma, a quitinase de classe I do feijão-de-corda parece apresentar expressão constitutiva em todas as partes da planta. A quitinase recombinante obtida foi pouco ativa. As mutações pontuais nos clones obtidos sugerem a ocorrência de isoformas dessa proteína, o que ainda deve ser elucidado no futuro.

ALENCAR, Nara Lídia Mendes. Mobilização de reservas endospérmicas de pinhão-manso durante a germinação e desenvolvimento da plântula sob condições de estresse salino. 2014. 113 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2014. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-20T18:59:30Z No. of bitstreams: 1 2014_tese_nlmalencar.pdf: 19789582 bytes, checksum: 477d6a335fabe4308356d35ded24b482 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-26T18:41:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_tese_nlmalencar.pdf: 19789582 bytes, checksum: 477d6a335fabe4308356d35ded24b482 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T18:41:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_tese_nlmalencar.pdf: 19789582 bytes, checksum: 477d6a335fabe4308356d35ded24b482 (MD5) Previous issue date: 2014 / Jatropha curcas L. is an oilseed species belonged to Euphorbiaceae family, whose seeds are recognized as promising source for biodiesel production. Its ability to survive in adverse conditions, such as water stress and poor nutritional soil, is noteworthy, which favors its cultivation in arid and semiarid regions. Here we evaluate the negative effects promoted by NaCl salt stress on seed germination, reserve mobilization of J. curcas through biochemical, physiological and ultrastructural analysis. The seed germination parameters were significantly affected by salt stress, being observed that the main parameters affected were germination percentage and germination speed index. Similarly, the embryo and endosperm dry mass were reduced by Na+ and Cl- increase in the medium. Considering the reserve compounds, the most abundant reserve of these seeds were the lipids, which corresponded to 64.0% of endosperm seed quiescent dry mass. They showed a stronger delay in reserve mobilization under saline conditions. Proteins were the second most important reserve (21.3%), being severally affected by salinity. The starch was detected in little amount (5.5% of quiescent seed dry mass), however there was a transient increase in this contents at 5 DAI (days after imbibition), which was correlated to the intense lipid mobilization, in control conditions. On the other hand, in salinity, it was observed that starch mobilization was reduced. The seed reserve products (mainly non-reducing sugars and free amino acids) were increased in endosperm in control in relation to quiescent seed, during germination, whereas for salt conditions, these products were few changed. Additionally, cytochemical and ultrastructural analyses confirmed the large amount of protein and lipid bodies in endosperm cells, reaching the identification of a huge amount of protein and lipid bodies. Salt stress promoted morphological and ultrastructural changes in endospermic cells, during germination and seedling development confirming the biochemical analyses. The present study also evaluated the lipid metabolism, using the fatty acid composition analysis and enzymatic and expression genic analyses for lipase, isocitrate liase, malate sintase. The unsaturated fatty acids were the most abundant, highlighting oleic (C18:1) and linoleic-linolenic (C18:2; C18:3), showing increase in their contents, in control conditions, during the evaluated period. However, the fatty acids practically were not changed in salinity conditions. Lipase showed increase in their activity during germination, which corresponded to intense mobilization in lipids in control. In similar way, the reduction of this activity happened in salinity, correlating to lipid delay mobilization. The evident delay of protein and oil body mobilization could strongly affect initial seedling development. The liase isocitrate activity did not show significant differences between treatments until 96 hours after imbibition (HAI), however, following this period, it was verified the strongest reduction in salt stress condition. The activity of malate synthase was not significantly higher in control conditions until 144 HAI, however, following this period, this activity was higher in salinity. It were verified reductions in enzymatic activity due to salt stress, which were correlated to gene expression changes of lipase and isocitrate lyase. Therefore, salinity contributed negatively to lipid mobilization, the main reserve of J. curcas seeds, which was correlated to reduction in activity of the enzymes involved in lipid metabolism. / O pinhão-manso (Jatropha curcas L.) é uma planta oleaginosa, pertencente à família Euphorbiaceae, cujas sementes são reconhecidas como matéria-prima com potencial para a produção de óleo. Essa planta também é considerada tolerante a condições adversas, tais como déficit hídrico e deficiência nutricional do solo, o que favorece o seu cultivo em regiões áridas e semiáridas. Objetivou-se avaliar os efeitos do estresse salino sobre a germinação e a mobilização das reservas de sementes e plântulas de pinhão-manso, por meio de análises bioquímicas, fisiológicas e ultraestruturais. Os parâmetros germinativos foram negativamente afetados pelo estresse salino, observando-se reduções significativas principalmente no percentual de germinação e no índice de velocidade de germinação. Similarmente, a matéria seca, avaliada no eixo embrionário e no endosperma, foi reduzida pela salinidade. Com relação aos compostos de reserva, os lipídios foram os mais abundantes, correspondendo a 64,0% da matéria seca do endosperma da semente quiescente. Estes compostos apresentaram forte retardo em sua mobilização em condição de estresse salino. As proteínas, a segunda reserva mais abundante (21,3%), também tiveram sua mobilização severamente afetada pelo tratamento salino. O amido foi detectado em pequena quantidade (5,5%), porém, verificou-se o aumento transiente de seu teor aos 5 dias após a semeadura (DAS), que coincidiu com a intensa mobilização de lipídios, em condições controle. Entretanto, em condições de estresse salino, o amido foi pouco mobilizado. Os produtos da mobilização das reservas, em condições controle, principalmente os açúcares não-redutores e aminoácidos livres aumentaram no endosperma, enquanto que, sob condições de salinidade, eles foram pouco alterados. Além disso, as análises citoquímicas e ultraestruturais confirmaram a abundante quantidade de lipídios e proteínas, sendo detectados inúmeros corpos proteicos e lipídicos no citoplasma das células endospérmicas dessas sementes. A salinidade também promoveu alterações morfológicas e ultraestruturais nas células endospérmicas durante a germinação e desenvolvimento de plântulas. O presente estudo também avaliou o metabolismo lipídico através da análise da composição dos ácidos graxos do endosperma e da análise da atividade enzimática e da expressão gênica das enzimas lipase, liase do isocitrato e sintase do malato. Os ácidos graxos insaturados foram os mais abundantes, destacando-se o oleico e o linoleico-linolênico, que apresentaram incrementos em seus teores, em condições controle, ao longo do período avaliado, porém, sob estresse salino foram pouco alterados. A lipase apresentou incremento na sua atividade ao longo da germinação, que coincidiu com a intensa mobilização de lipídios observada no controle. Similarmente, a redução dessa atividade foi correspondente ao retardo na mobilização dos lipídios em condição de estresse salino. A atividade enzimática da liase do isocitrato não apresentou diferenças significativas entre os tratamentos até às 96 horas após a semeadura (HAS), porém após esse período, verificaram-se as maiores reduções na condição de estresse salino, quando comparado ao controle. Já a atividade da sintase do malato foi significativamente maior em condições controle até às 144 HAS, entretanto, a partir desse período, essa atividade se mostrou superior em condições salinas. Verificaram-se reduções na atividade dessas enzimas em decorrência do estresse, o que teve correlação com as mudanças na expressão dos genes da lipase e liase do isocitrato. Portanto, pode-se concluir que a salinidade contribuiu para o retardo na mobilização dos lipídios, a principal reserva encontrada nas sementes de J. curcas, o que foi correlacionado a redução na atividade das enzimas envolvidas no seu metabolismo.