Chemicals in indoor air, either emitted from a source or from a reaction, have been suggested to cause ill health in buildings. However, no clear correlations between exposure and health effects have been made. In this thesis we studied the reaction between monoterpenes, a group of biogenic unsaturated C10 hydrocarbons, and ozone. Ozonolysis of monoterpenes was used as model reactions for unsaturated compounds in ambient air. Also the products formed from these reactions have been suggested as important participants in the occurrence of discomfort and ill health in buildings. To enable a reliable and sensitive measurement of ppb-ppt levels of monoterpenes and the formed products in the presence of ozone an evaluation of available scrubber materials was made. Potassium iodide was shown to remove ambient levels of ozone and have a recovery of >95% for all monoterpenes and formed products included in the investigation. Experimental conditions showed to have a large impact on the initial steps of the ozonolysis, and also on the composition of the formed products. We showed that water plays an important and complex role both in the initial stage of ozonolysis of ∆3-carene and in the formation and composition of products from the ozonolysis of ∆-pinene. The use of experimental design facilitated the evaluation of the investigated reactions. We showed that the formation of OH radicals could be studied using multiple linear regression models and that the presence or absence of OH radicals had a profound impact on the formation of many of the formed products. We also made an observation of the lack of formed OH radicals in the ozonolysis of limonene and discussed probable causes of this observation. Despite the short reaction times and the ambient levels of ozone and monoterpenes used in our experiments we showed that a number of oxidation products were formed, and that the reaction rate is significantly increased in a ventilation system. This formation is underestimated by theoretical calculations and leads to high amounts of known irritants in the indoor air. We showed that theoretical calculations underestimate the formation of these oxidation products 3-13 times, depending on ventilation system and monoterpene.

Catharanthus roseus est une plante médicinale produisant divers types d’alcaloïdes indoliques monoterpéniques (AIM) d’intérêt en santé humaine. Ainsi, les AIM dimères comme la vinblastine et la vincristine sont utilisés en chimiothérapie anticancéreuse et les alcaloïdes monomères de type hétéroyohimbine présentent diverses activités pharmacologiques. La fabrication de ces molécules dans la plante est fort complexe. Elle requiert un haut niveau de compartimentation tissulaire et subcellulaire et met en jeu plus d’une trentaine d’étapes enzymatiques, dont certaines sont encore très mal connues. Dans ce contexte, l’objectif de la thèse a consisté à élucider plusieurs étapes enzymatiques de la voie de biosynthèse des AIM. Nos travaux ont permis de caractériser de nouvelles isoformes enzymatiques de la famille des cytochromes P450 ainsi que les réductases qui leur sont associées. Ils ont abouti à l’identification de nouvelles déshydrogénases et mis en évidence, in planta, leurs interactions avec la strictosidine synthase suggérant une biosynthèse orientée vers les divers alcaloïdes de type hétéroyohimbine. Enfin, en ayant recours à l’ingénierie métabolique, un segment de la voie de biosynthèse a été transféré dans la levure Saccharomyces cerevisiae, lui conférant la capacité de bio-transformer la tabersonine en vindoline, l’un des deux précurseurs finaux des alcaloïdes dimères. / Catharanthus roseus is a medicinal plant producing various types of monoterpene indole alkaloids (MIA) with a great interest in human health. Dimeric alkaloids such as vinblastine and vincristine are used in cancer chemotherapy and monomeric heteroyohimbine alkaloids exhibit various pharmacological activities. The production of these molecules in the plant is very complex. It requires a high level of tissular and subcellular compartmentalization and involves more than thirty enzymatic steps, some of which are largely unknown. In this context, the aim of this thesis was to elucidate several enzymatic steps of the MIA biosynthetic pathway. Our work allowed us to characterize new enzyme isoforms of cytochrome P450 and their associated reductases. They also resulted in the identification of new dehydrogenases and highlighted their interactions with the strictosidine synthase suggesting a directed biosynthesis towards various heteroyohimbine type of alkaloids. Finally, engineered yeast containing a segment of the MIA biosynthetic pathway was able to convert tabersonine into vindoline, one of the two final precursors of the dimeric alkaloids.

O estresse de calor prejudica o crescimento e reprodução dos organismos vegetais, ao alterar a permeabilidade de membranas biológicas e desnaturar proteínas, limitando o metabolismo primário. Dentre as respostas ao estresse abiótico, está a síntese de metabólitos secundários. Braquicerina é um alcaloide monoterpeno indólico com ação antioxidante, protetora contra UV e antimutagênica sintetizado por partes aéreas de Psychotria brachyceras. O objetivo deste trabalho é investigar o metabolismo de braquicerina sob estresse de calor. Assim, espera-se contribuir para o conhecimento acerca do metabolismo secundário nas respostas ao estresse de calor, descrever a função in planta do composto, e fornecer ferramentas para obtenção do alcaloide para fins farmacêuticos. O acúmulo de braquicerina foi induzido em discos foliares mantidos a 40ºC por três dias, tanto em regime de elevação abrupta como gradual da temperatura. Baixa temperatura (10ºC) não afetou o acúmulo do alcaloide. Discos foliares de Psychotria carthagenensis, uma espécie que não sintetiza alcaloides monoterpeno indólicos, foram também desafiados por estresse de calor. Clorofila total, teor de peróxido de hidrogênio e peroxidação lipídica foram quantificados em ambas as espécies. P. carthagenensis foi relativamente tolerante ao calor, o que pode estar relacionado à sua elevada concentração de antocianinas, fortemente induzidas por choque térmico de 50ºC por 6h. Peroxidação lipídica foi reduzida nas amostras de P. brachyceras sob estresse de calor agudo ou gradual em comparação à condição controle, sendo este parâmetro inalterado nas duas condições em P. carthagenensis. O teor de peróxido de hidrogênio foi menor em P. brachyceras submetida a choque de térmico em relação ao controle, enquanto o mesmo parâmetro não foi alterado em P. carthagenensis. Discos foliares das espécies sensíveis ao calor Brugmansia suaveolens e Brassica oleracea, pré-tratadas com braquicerina em concentrações similares às encontradas em P. brachyceras, adquiriram fenótipo tolerante ao choque térmico. A expressão do gene que codifica a enzima triptofano descarboxilase (TDC), envolvida na biossíntese de braquicerina em P. brachyceras, foi fortemente inibida em discos foliares submetidos à 40ºC por 6h, 12h e 24h, sugerindo que o efeito da temperatura na estimulação de acúmulo de alcaloide ocorra em nível pós-transcricional. Em conjunto, os dados indicam que a exposição ao calor é um meio efetivo de aumentar o rendimento de braquicerina, cuja acumulação contribui para proteção contra os danos oxidativos associados. / Heat stress impairs plant growth and reproduction by altering membrane permeability and promoting protein denaturation, which limits primary metabolism. Secondary metabolites often take part in protection against abiotic stress responses. Brachycerine is a monoterpene indole alkaloid with antioxidant, UV protectant, and antimutagenic activity synthesized by Psychotria brachyceras shoots. Brachycerine metabolism was analyzed under heat stress, in order to shed light on brachycerine‘s in planta function and to provide potential tools to improve alkaloid yields for pharmaceutical analysis. Accumulation was induced in leaf disks kept at 40ºC for three days, both by abrupt and stepwise temperature increase. Brachycerine concentration was not affected by low temperature (10ºC) exposure. Leaf disks of Psychotria carthagenensis, a species devoided of alkaloids, were also challenged by heat. Total chlorophyll, hydrogen peroxide and lipid peroxidation concentrations were determined in both species. P. carthagenensis was relatively tolerant to heat treatments which may be explained by its high anthocyanin concentration, strongly induced by heat shock of 50ºC for 6h. Brugmansia suaveolens and Brassica oleracea, pre-treated with brachycerine in concentrations equivalent to those found in P. brachyceras, had a heat shock tolerant phenotype, based on chlorophyll content. Expression of the TRYPTOPHAN DECARBOXYLASE gene, which encodes for an enzyme involved in alkaloid biosynthesis (TDC) was strongly repressed in leaf disks exposed to 40ºC for 6h, 12h e 24h, suggesting that temperature effect may occur at post-transcriptional level. Taken together, data indicate that heat exposure is an effective means to increase yields of brachycerine, whose accumulation contributes to protect against associated oxidative damage.

Made available in DSpace on 2015-04-01T12:09:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 parte1.pdf: 3938300 bytes, checksum: d776c692585937cc573fe392dbb20e02 (MD5) Previous issue date: 2012-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Terpinen-4-ol (4TRP) is a monoterpe alcohol and component of the essential oils of several aromatic plants. Similarly to 4TRP, other monoterpenoid alcohols have showed anticonvulsant activity in convulsion animal models. The present report aimed to investigate the psychopharmacological effects of terpinen-4-ol, specifically the anticonvulsant activity. Mice (Mus musculus) swiss male and and rats (Rattus norvegicus) wistar male were used. In experiments in vivo, the 4TRP was administered at doses of 25 to 200 mg/kg, ip, and concentrations of 10, 20 and 40 ng/2μL, icv. For in vitro experiments, concentrations were 0.1 mM and 1.0 mM. General tests as pharmacological behavioral screening, spontaneous movement, potentiation of sleeping time induced by pentobarbital and rota rod test were initially performed to investigate the profile of action of this monoterpene in the CNS. In all these methods, the results suggest that this drug has psycholeptics profile and does not cause significant changes in motor coordination of animals. Next, more specific experiments were performed to evaluate the psicodepressor profile: the elevated plus maze (EPM) test and the perforated plate have been selected to investigate possibleanxiolytic effects. In these experiments, and the doses tested, were not observed consistently indicative of anxiolytic activity related to 4TRP. Later, tests were performed to evaluate the possibility of this substance present a profile of anticonvulsant activity. According to the behavioral parameters evaluated, 4TRP (via ip) was able to inhibit seizures induced by both Pentylenetetrazole (PTZ) and Maximal electroshock (MES), presenting a potential anticonvulsant effect. In a subsequent step, following the animals by electroencephalographic recordings, we observed that animals treated with 4TRP (via icv) were protected against PTZ-induced seizures, corroborating the results of the previous step. In the search for a characterization of the possible mechanisms by which this substance exerts this action, we investigate more clearly the involvement of the GABAergic system employing the methodologies convulsions induced by picrotoxin (PIC) and seizures induced by 3-mercapto-propionic acid (3-MP). In accordance with the results, it is possible to infer that the action exerted by monoterpenoid is related to the GABAergic system and that the presence of flumazenil, a selective antagonist of the benzodiazepine site of GABA A receptors, was unable to reverse the anticonvulsant effect of 4TRP, demonstrating that this is not the same binding site of benzodiazepines. In a subsequent step, using the technique of "Whole-Cell Patch Clamp , demonstrated that 4TRP was able to decrease the sodium current in sodium channels of voltage-dependent in isolated cells of neurons in dorsal root ganglia (DRG), and possibly its effect is related to changes in neuronal excitability in consequence of modulation of these channels. It was concluded that 4TRP has psychopharmacological effects, with an anticonvulsant profile. Its mechanism of action appears to be mediated by interference with the GABAergic system and does not involve activation, at least directly, the benzodiazepine site of GABAA receptors and that involves the blockade of sodiumchannels voltage-dependent. / O 4-terpineol (4TRP) é um monoterpeno álcool monocíclico, que pode ser encontrado em óleos essenciais de plantas aromáticas diversas. Vários estudos têm relatado os efeitos apresentados por monoterpenos estruturalmente análogos ao 4TRP sobre o Sistema Nervoso Central (SNC). Justificando-se pela lacuna existente na farmacoterapia das epilepsias, a realização deste trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos psicofarmacológicos do 4TRP. Camundongos (Mus musculus) Swiss, machos e ratos (Rattus novergicus) Wistar, machos foram utilizados. Nos experimentos in vivo, o 4TRP foi administrado em doses variando entre 25 a 200 mg/kg, i.p., e nas concentrações de 10, 20 e 40 ng/2µL, i.c.v. Para os experimentos in vitro, as concentrações utilizadas foram 0,1 mM e 1,0mM. Como triagem farmacológica, para investigar o perfil de ação deste monoterpeno no SNC, foram realizados inicialmente testes gerais comportamentais como o teste da movimentação espontânea, potencialização do tempo de sono induzido por pentobarbital e o teste da barra giratória para investigar o perfil de ação deste monoterpeno no SNC. Em todas essas metodologias, os resultados obtidos sugerem que este apresenta perfil de droga psicoléptica, sem alterar, no entanto, a coordenação motora dos animais de forma significativa. Posteriormente, para avaliar possíveis efeitos ansiolíticos, foram realizados os testes do labirinto em cruz elevado (LCE) e o teste da placa perfurada. Nesses experimentos, nas doses testadas, o 4TRP não apresentou indicativos consistentes de atividade ansiolítica. Em seguida, foram realizados testes com o objetivo de avaliar a possibilidade de esta substância apresentar um perfil de atividade anticonvulsivante. De acordo com os parâmetros comportamentais avaliados, 4TRP (via i.p.), foi capaz de inibir convulsões induzidas tanto pelo pentilenotetrazol (PTZ) como pelo eletrochoque máximo (ECM), apresentando um potencial efeito anticonvulsivante. Em uma etapa posterior, acompanhando os animais através de registros eletroencefalográficos, percebe-se que animais tratados com 4TRP (via i.c.v.), foram protegidos contra convulsões induzidas por PTZ, corroborando com os resultados da etapa anterior. Para uma caracterização dos possíveis mecanismos pelos quais esta substância exerce sua ação, buscou-se evidenciar a participação do sistema GABAérgico empregando as metodologias: convulsões induzidas pela picrotoxina (PIC) e convulsões induzidas pelo ácido 3-mercapto-propiônico (3-MP). Em conformidade com os resultados, pode-se afirmar que a ação deste monoterpenóide está relacionada ao sistema GABAérgico e ainda que a presença do flumazenil, um antagonista seletivo do sítio benzodiazepínico dos receptores GABAA, não foi capaz de reverter o efeito anticonvulsivante de 4TRP, demonstrando que este não atua no mesmo sítio de ligação dos benzodiazepínicos. Em uma etapa subsequente, utilizando a técnica de Patch Clamp-Whole Cell , demonstrou-se que 4TRP foi capaz de inibir significaticamente a corrente de canais de sódio dependentes de voltagem em células isoladas de neurônios de gânglios da raiz dorsal (GRD), estando o seu efeito, possivemente relacionado à mudanças na excitabilidade neuronal em conseqüência da modulação desses canais. Conclui-se que 4TRP apresenta efeitos psicofarmacológicos, com perfil de fármaco anticonvulsivante, que seu mecanismo de ação parece ser mediado pela interferência com o sistema GABAérgico e não envolve a ativação, pelo menos de forma direta, do sítio benzodiazepínico dos receptores GABAA e que envolve o bloqueio dos canais para sódio dependentes de voltagem.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2983358 bytes, checksum: 841eb9a88b914fcfbceacd7ae51d1b3b (MD5) Previous issue date: 2013-08-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The essential oils of herbs have a variety of bioactive compounds, such as monoterpenes. These monoterpenes have several pharmacological activities described as analgesic, anti-inflammatory, antidepressant and anticonvulsant, among others. The (-)- myrtenol is a monoterpene alcohol monocyclic, of pleasant odor, used in the cosmetics industry. However, the absence of research on possible pharmacological activities of this monoterpene has encouraged the present research. This study investigates the effect of (-)- myrtenol, intraperitoneally in adult male Swiss mice under experimental models of pain and inflammation. Initially, the research was initiated with lethal dose 50 (LD50) of monoterpene, in order to establish safe doses for subsequent tests. To investigate the action profile of monoterpene in the central nervous system, a pharmacological screening behavior was carried out, the effect of which in animals treated with (-)- myrtenol was that of analgesia. Then methodologies were conducted to evaluate the antinociceptive activity. The (-)- myrtenol (25, 50 and 100 mg/kg, i.p) increased the latency to the onset of abdominal writhing induced by acetic acid and reduced the number of writhing when compared to the control group. In the formalin test, using the same doses, (-) myrtenol did not alter the duration of paw licking in the neurogenic phase (0-5 min), but it inhibited significantly (p <0,001) the time of paw licking along the inflammatory phase (15-30 min). In the test of nociception induced by glutamate, the three doses of monoterpene reduced time of paw licking. In the hot plate test, which is sensitive and specific to drugs that act through a central mechanism, the (-)- myrtenol did not alter the paw withdrawal latency. With these results, we propose that the antinociceptive action of (-)- myrtenol may be a peripheral and not central mechanism of action. In an attempt to elucidate the mechanism of action involved in the antinociceptive effect of (-)- myrtenol, pharmacological tools were used in the formalin test. The antinociception produced by (-)- myrtenol (100 mg/kg, i.p) was reversed by naloxone (5 mg/kg, s.c) naloxonazine (10 mg/kg, s.c), glibenclamide (10 mg/kg, s.c), L-NOARG (50mg/kg, i.p) and yohimbine (0,15 mg/kg, i.p) only in the second phase of the formalin test. In view of the outstanding action of monoterpene in the second phase of the formalin test, we have investigated its possible anti-inflammatory activity. In this evaluation, treatment with (-)- myrtenol (50 and 100 mg/kg, i.p) was effective in reducing the paw edema induced by carrageenan (500 mg / paw), prostaglandin E2 (5 nmol / paw) and bradykinin (3 nmol / paw) at all times tested. In the model of carrageenan-induced peritonitis (1%), the monoterpene decreased the influx of leukocytes and also the levels of IL-1&#946; and TNF-&#945; in peritoneal fluid. Therefore, this study has demonstrated that (-)- myrtenol has antinociceptive activity with the participation of opioid receptor &#956;1, K+ATP channels, oxidonitrergic and adrenergic &#945;2. Furthermore, (-)- myrtenol has exhibited anti-inflammatory activity by inhibiting the formation of paw edema and reduced leukocyte influx, possibly by inhibiting the production of pro-inflammatory cytokines IL-1&#946; and TNF-&#945;. / Os óleos essenciais obtidos de plantas medicinais possuem uma variedade de compostos bioativos, como os monoterpenos. Estes monoterpenos possuem distintas atividades farmacológicas descritas, como analgésica, anti-inflamatória, antidepressiva e anticonvulsivante dentre outras. O (-)-mirtenol é um monoterpeno, álcool monocíclico, de odor agradável, utilizado na indústria de cosméticos. No entanto, a ausência de pesquisas sobre as possíveis atividades farmacológicas deste monoterpeno incentivou à realização deste trabalho. O presente estudo investigou o efeito do (-)- mirtenol, pela via intraperitoneal, em camundongos suíços machos adultos em modelos experimentais de dor e de inflamação. Inicialmente, foi realizada a pesquisa da dose letal 50 (DL50) do monoterpeno, no intuito de estabelecer doses seguras para os testes subsequentes. Para investigar o perfil de ação do monoterpeno no sistema nervoso central foi realizado a triagem farmacológica comportamental e o principal efeito observado nos animais tratados com (-)- mirtenol foi analgesia. Em seguida, foram realizadas metodologias para avaliar a atividade antinociceptiva. O (-)- mirtenol (25, 50 e 100 mg/kg, i.p.) aumentou a latência para o inicio das contorções abdominais induzidas por ácido acético e reduziu o número de contorções, quando comparado ao grupo controle. No teste da formalina, utilizando as mesmas doses, o (-) - mirtenol não alterou o tempo de lambida da pata na fase neurogênica (0-5 min), mas inibiu significativamente (p<0,001) o tempo de lambida da pata na fase inflamatória (15-30 min). No teste da nocicepção induzida por glutamato, as três doses do monoterpeno reduziram o tempo de lambida da pata. Já no teste da placa quente, que é sensível e específico para drogas que atuam por mecanismo central, o (-)- mirtenol não alterou a latência na retirada da pata. Com estes resultados podemos propor que a ação antinociceptiva do (-)- mirtenol pode ser por mecanismo de ação periférica e não central. Na tentativa de elucidar o mecanismo de ação envolvido no efeito antinociceptivo do (-)- mirtenol foram usadas ferramentas farmacológicas no teste da formalina. A antinocicepção produzida pelo (-)- mirtenol (100 mg/kg i.p.) foi revertida pela naloxona (5 mg/kg s.c.), naloxonazine (10 mg/kg s.c.), glibenclamida (10 mg/kg s.c.), L-NOARG (50mg/kg i.p.) e ioimbina (0,15 mg/kg i.p) somente na segunda fase do teste da formalina. Tendo em vista a destacada ação do monoterpeno na segunda fase do teste da formalina, investigamos sua possível atividade anti-inflamatória. Nessa avaliação, o tratamento com o (-)- mirtenol (50 e 100 mg/kg, i.p.) foi capaz de reduzir o edema de pata induzido por carragenina (500 &#956;g/pata), prostaglandina E2 (5 nmol/pata) e bradicinina (3 nmol/pata) em todos os tempos testados. No modelo da peritonite induzida por carragenina (1%), o monoterpeno diminuiu o influxo de leucócitos e também os níveis das citocinas IL-1&#946; e TNF-&#945; no lavado peritoneal. Portanto, este trabalho demonstrou que o (-)- mirtenol possui atividade antinoceptiva com participação dos sistemas opióidérgico &#956;1, canais de K+ATP, óxidonitrérgico e &#945;2-adrenérgico. Além disso, possui atividade anti-inflamatória ao inibir a formação do edema de pata e reduzir o influxo de leucócitos possivelmente pela inibição da produção das citocinas pró-inflamatórias IL-1&#946; e TNF-&#945;.

O estresse de calor prejudica o crescimento e reprodução dos organismos vegetais, ao alterar a permeabilidade de membranas biológicas e desnaturar proteínas, limitando o metabolismo primário. Dentre as respostas ao estresse abiótico, está a síntese de metabólitos secundários. Braquicerina é um alcaloide monoterpeno indólico com ação antioxidante, protetora contra UV e antimutagênica sintetizado por partes aéreas de Psychotria brachyceras. O objetivo deste trabalho é investigar o metabolismo de braquicerina sob estresse de calor. Assim, espera-se contribuir para o conhecimento acerca do metabolismo secundário nas respostas ao estresse de calor, descrever a função in planta do composto, e fornecer ferramentas para obtenção do alcaloide para fins farmacêuticos. O acúmulo de braquicerina foi induzido em discos foliares mantidos a 40ºC por três dias, tanto em regime de elevação abrupta como gradual da temperatura. Baixa temperatura (10ºC) não afetou o acúmulo do alcaloide. Discos foliares de Psychotria carthagenensis, uma espécie que não sintetiza alcaloides monoterpeno indólicos, foram também desafiados por estresse de calor. Clorofila total, teor de peróxido de hidrogênio e peroxidação lipídica foram quantificados em ambas as espécies. P. carthagenensis foi relativamente tolerante ao calor, o que pode estar relacionado à sua elevada concentração de antocianinas, fortemente induzidas por choque térmico de 50ºC por 6h. Peroxidação lipídica foi reduzida nas amostras de P. brachyceras sob estresse de calor agudo ou gradual em comparação à condição controle, sendo este parâmetro inalterado nas duas condições em P. carthagenensis. O teor de peróxido de hidrogênio foi menor em P. brachyceras submetida a choque de térmico em relação ao controle, enquanto o mesmo parâmetro não foi alterado em P. carthagenensis. Discos foliares das espécies sensíveis ao calor Brugmansia suaveolens e Brassica oleracea, pré-tratadas com braquicerina em concentrações similares às encontradas em P. brachyceras, adquiriram fenótipo tolerante ao choque térmico. A expressão do gene que codifica a enzima triptofano descarboxilase (TDC), envolvida na biossíntese de braquicerina em P. brachyceras, foi fortemente inibida em discos foliares submetidos à 40ºC por 6h, 12h e 24h, sugerindo que o efeito da temperatura na estimulação de acúmulo de alcaloide ocorra em nível pós-transcricional. Em conjunto, os dados indicam que a exposição ao calor é um meio efetivo de aumentar o rendimento de braquicerina, cuja acumulação contribui para proteção contra os danos oxidativos associados. / Heat stress impairs plant growth and reproduction by altering membrane permeability and promoting protein denaturation, which limits primary metabolism. Secondary metabolites often take part in protection against abiotic stress responses. Brachycerine is a monoterpene indole alkaloid with antioxidant, UV protectant, and antimutagenic activity synthesized by Psychotria brachyceras shoots. Brachycerine metabolism was analyzed under heat stress, in order to shed light on brachycerine‘s in planta function and to provide potential tools to improve alkaloid yields for pharmaceutical analysis. Accumulation was induced in leaf disks kept at 40ºC for three days, both by abrupt and stepwise temperature increase. Brachycerine concentration was not affected by low temperature (10ºC) exposure. Leaf disks of Psychotria carthagenensis, a species devoided of alkaloids, were also challenged by heat. Total chlorophyll, hydrogen peroxide and lipid peroxidation concentrations were determined in both species. P. carthagenensis was relatively tolerant to heat treatments which may be explained by its high anthocyanin concentration, strongly induced by heat shock of 50ºC for 6h. Brugmansia suaveolens and Brassica oleracea, pre-treated with brachycerine in concentrations equivalent to those found in P. brachyceras, had a heat shock tolerant phenotype, based on chlorophyll content. Expression of the TRYPTOPHAN DECARBOXYLASE gene, which encodes for an enzyme involved in alkaloid biosynthesis (TDC) was strongly repressed in leaf disks exposed to 40ºC for 6h, 12h e 24h, suggesting that temperature effect may occur at post-transcriptional level. Taken together, data indicate that heat exposure is an effective means to increase yields of brachycerine, whose accumulation contributes to protect against associated oxidative damage.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disease characterized by a progressive degeneration of dopaminergic neurons in the Substantia Nigra pars compact (SNpc) with consequent depletion of dopamine in the striatum, which gives rise to characteristic motor symptoms of PD. Although its etiology of is unknown, several studies have been suggested that oxidative stress and inflammation play a critical function in the physiopathology of PD and antioxidant and ani-inflammatory agents could be helpful to slown down the dopaminergic neurodegeneration. Thus, many studies have evaluated the potential neuroprotective effect of these agentes, including Carvacrol (CA). CA is a phenolic monoterpene found in essential oils of many aromatic plants and it has a variety of pharmacological effects on Central Nervous System, including antioxidant and anti-inflammatory activities. In this context, the objective of this study was to investigate a possible neuroprotective effect of CA in two rat models of PD. Two experiments were performed: in the experiment I, male Wistar rats were submitted to repeated administration of a low dose (0.1 mg/kg, s.c.) of reserpine (RES) or vehicle of reserpine (VR) and concomitantly treated with CA at doses of 12.5 or 25 mg/kg (i.p.) or vehicle of carvacrol (VC). Across the treatment, the animal motor behavior was evaluated by catalepsy test, open field test and assessment of oral movements. In the experiment II, male Long-Evans rats were pretreated for seven days with CA at doses of 50 or 100 mg/kg (i.p.) or VC, and were then submitted to unilateral injection of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) or vehicle of 6-OHDA into the medial forebrain bundle (MFB). The animals were treated with CA or VC for three weeks after injection. Thereafter, they were assessed for motor behavioral function by open field, cylinder test, rotarod and amphetamine-induced circling test. In both experiments, upon completion behavioral tests, rats were perfused and theirs brains were subjected for tyrosine hydroxylase (TH) immunohistochemical analysis. In the experiment I, the results showed that the CA treatment, in both doses 12.5 e 25 mg/kg, was able to prevent the catalepsy behavior and the development of vacuous chewing movements induced by RES, however, CA failed to revert the decreased locomotor activity induced by RES in the open field test. In addition, CA in both doses prevented the depletion of TH immunostaining induced by RES in the SNpc and dorsal striatum. In the experiment II, the treatment with CA at dose of 50 mg/kg prevented the motor deficits induced by 6-OHDA injection in the open field test, cylinder test and rotarod, and increased the number of rotations induced by amphetamine. Moreover, CA attenuated the dopaminergic neurons damage in the SNpc and dorsal striatum induced by 6-OHDA injection. Taken together, our results suggest that CA shows neuroprotective effect, preventing or attenuating motor and neurochemical impairments induced by RES and 6-OHDA, so it may be regarded a promising therapeutic candidate for the prevention or treatment of PD. / A Doença de Parkinson (DP) é uma doença neurodegenerativa caracterizada por uma degeneração progressiva de neurônios dopaminérgicos da Substância Negra parte compacta (SNpc), o que resulta nas alterações motoras características desta patologia. Embora sua etiologia ainda permaneça desconhecida, vários estudos indicam que o estresse oxidativo e a inflamação exercem uma função crítica na fisiopatologia da DP e agentes antioxidantes e anti-inflamatórios poderiam desacelerar a neurodegeneração dopaminérgica. Assim, tem sido crescente o número de pesquisas relacionadas a investigação do potencial neuroprotetor destes agentes, entre eles, o Carvacrol (CA). O CA é um monoterpeno fenólico encontrado nos óleos essenciais de diversas plantas aromáticas e apresenta uma variedade de atividades farmacológicas sobre o Sistema Nervoso Central, incluindo atividades antioxidante e anti-inflamatória. Neste contexto, o objetivo deste estudo foi investigar um possível efeito neuroprotetor do CA em ratos submetidos a dois modelos de DP. Foram realizados dois experimentos: no experimento I, ratos Wistar foram submetidos a administração repetida de uma dose baixa (0,1 mg/kg, s.c.) de reserpina (RES) ou veículo da reserpina (VR) e tratados concomitantemente com CA nas doses de 12,5 ou 25 mg/kg (i.p.) ou com o veículo do carvacrol (VC). Ao longo do experimento, os animais tiveram seu comportamento motor avaliado através dos testes de catalepsia, campo aberto e avaliação dos movimentos orais. No experimento II, ratos Long-Evans foram pré-tratados por sete dias com CA nas doses de 50 ou 100 mg/kg (i.p.) ou VC, e então foram submetidos a uma injeção unilateral de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) ou veículo no feixe prosencefálico medial (medial forebrain bundle -MFB). Os animais foram tratados com CA ou VC por três semanas após a injeção de 6-OHDA e após este período tiveram seu comportamento motor avaliado através dos testes do campo aberto, cilindro, rotarod e rotações induzidas por anfetamina. Em ambos os experimentos, ao fim dos testes comportamentais, os animais foram perfundidos e seus cérebros foram processados para imunohistoquímica para tirosina hidroxilase (TH). No experimento I, os resultados mostraram que o CA em ambas as doses (12,5 e 25 mg/kg) preveniu o comportamento de catalepsia e o desenvolvimento de movimentos de mastigação no vácuo induzidos pela RES, porém não reverteu a redução da atividade locomotora causada pela RES no teste do campo aberto. O CA em ambas as doses preveniu a redução da marcação de TH induzida pela RES na SNpc e no estriado dorsal. No experimento II, os resultados mostraram que o CA na dose de 50 mg/kg preveniu os déficits motores induzidos pela injeção de 6-OHDA nos testes do campo aberto, cilindro e rotarod, e aumentou o número de rotações induzidas por anfetamina. Além disso, o CA atenuou o dano provocado pela injeção de 6-OHDA nos neurônios dopaminérgicos da SNpc e estriado dorsal. Os resultados obtidos no presente estudo sugerem que o CA apresenta um efeito neuroprotetor, prevenindo ou atenuando as alterações motoras e neuroquímicas induzidas pela RES e 6-OHDA. Desta forma, o CA pode ser considerado um candidato terapêutico promissor para a prevenção ou tratamento da DP.

Previous studies have shown that monoterpenes, compounds mainly presented in essential oils, as well as some synthetic derivatives, have important pharmacological actions. Isopropoxy-carvacrol (IPC) is a new synthetic derivative, which was obtained from carvacrol and its pharmacological properties have not yet been investigated. The aim of this study was to analyze the antioxidant, anti-inflammatory and antinociceptive proprieties of IPC. In order to investigate the antioxidant activity, the nitric oxide scavenger activity and the inhibitory effect on the lipid peroxidation induced by FeSO4 or FeSO4+H2O2 in lipossome preparation were measured in vitro. For the in vivo evaluation, mice (25-30 g) and rats (150-230 g) were used. These animals received the administration of IPC at the doses of 10, 30 or 100 mg/kg or vehicle (Tween 80, 0.5%) by the intraperitoneal route (i.p.), 30 minutes before the experiments, or at the doses of 0.3-3 mg/ear, applied topically during the induction (in the case of mice ear edema test). The nociceptive parameters evaluated were the licking/biting time induced by formalin and the hyperalgesia induced by carrageenan, both injected in the mice paw. The inflammatory parameters evaluated were the rat paw edema induced by carrageenan, the mice ear edema induced by TPA (accompanied by the myeloperoxidase activity measurement in the ears) and leukocyte migration induced by carrageenan to the mice pleural cavity. We also assessed the locomotor activity of mice in the open field and the cytotoxicity of IPC in murine peritoneal macrophages. As the results of this study, IPC showed antioxidant activity in concentrations varying from 100 pg/mL to 100 g/mL. Additionally, the pre-treatment with IPC reduced the licking/biting time of the mice paws, both in the first and second phases of the formalin-induced nociception, respectively at the doses of 100 mg/kg or 30 and 100 mg/kg, when compared with the vehicle-treated group. In the assessment of carrageenan-induced hyperalgesia, the dose of 100 mg/kg of IPC was able to reduce the nociceptive threshold response at the time points of 1 h and 3 h after induction, when compared with the vehicle group. Besides, the administration of IPC did not affect the locomotor activity of mice in the open field test. In rats, the administration of IPC at the dose of 100 mg/kg significantly diminished the carrageenan-induced paw edema, when compared with the vehicle group. No antiedematogenic effect was observed by the local administration of IPC in the TPA-induced mice ear inflammation test, however, the myeloperoxidase activity was significantly decreased in the ears by the simultaneous application of IPC (0.3, 1 or 3.0 mg/ear). In the mice pleurisy induced by carrageenan, the dose of 100 mg/kg of IPC significantly reduced the number of total leukocytes and mononuclear cells found in the pleural cavity, when compared with the vehicle treated group, without altering the number of polymorphonuclear cells. Moreover, the IPC concentrations ranging from 0.1 to 100 g/mL did not affect the peritoneal macrophages viability. These results demonstrate that IPC has antioxidant, anti-inflammatory and antinociceptive activities, which enable future studies directed to the investigation of the mechanisms underlying the pharmacological effects of IPC and may contribute for the development of new drugs for the treatment of inflammation and pain. / Estudos anteriores mostraram que monoterpenos podem exercer ações farmacológicas importantes. O isopropóxi-carvacrol (IPC) é um novo derivado sintético do monoterpeno carvacrol e suas propriedades farmacológicas ainda não foram investigadas. O objetivo deste estudo foi avaliar as propriedades antioxidante, anti-inflamatória e antinociceptiva do IPC. A atividade antioxidante (in vitro) foi avaliada através da determinação da atividade sequestradora de óxido nítrico e da dosagem da peroxidação lipídica induzida por FeSO4 ou FeSO4+H2O2 em lipossomas. Para a avaliação in vivo, camundongos (25-30 g) e ratos (150-230 g) receberam administração de IPC nas doses de 10, 30 ou 100 mg/kg ou veículo (Tween 80, 0,5%), pela via intraperitoneal (i.p.), 30 minutos antes dos agentes flogísticos. Para determinação do edema de orelha e atividade de mieloperoxidase os camundongos receberam administração tópica nas doses de 0,3, 1 ou 3 mg/orelha, no momento da indução do edema de orelha. Os parâmetros nociceptivos observados foram o tempo de labida/mordida após injeção de formalina e a hiperalgesia após administração de carragenina, ambas na pata de camundongos. Como parâmetros inflamatórios foram avaliados o edema de pata induzido por carragenina em ratos, o edema de orelha induzido por 12-O-tetradecanoilforbol-acetato (TPA) em camundongos (acompanhado da atividade da enzima mieloperoxidase nestas orelhas) e a migração de leucócitos induzida por carragenina para a cavidade pleural de camundongos. Além disso, foram avaliados a atividade deambulatória de camundongos em campo aberto e a citotoxicidade do IPC em macrófagos peritoneais murinos. Os resultados obtidos mostraram que o IPC apresentou atividade antioxidante em concentrações variando entre 100 pg/mL e 100 g/mL. No teste da formalina o IPC reduziu o tempo de lambida da pata na 1° fase, na dose de 100 mg/kg e na 2° fase com as doses de 30 e 100 mg/kg, quando comparado com o grupo tratado com veículo. Na avaliação da hiperalgesia induzida por carragenina, apenas a dose de 100 mg/kg de IPC, foi capaz de reduzir o limiar de nocicepção nos tempos de 1 e 3 h após a indução, quando comparado ao grupo veículo. Além disso, a administração de IPC não afetou a atividade locomotora dos animais no campo aberto. Em ratos, a administração de IPC na dose de 100 mg/kg promoveu uma redução no edema de pata induzido por carragenina, quando comparado com o grupo veículo. Na orelha de camundongos não foi observado efeito antiedematogênico pela administração local de IPC, contudo, houve redução da atividade de mieloperoxidase nas orelhas, nas doses de IPC utilizadas (0,3 3,0 mg/orelha). Na pleurisia induzida por carragenina, a dose de 100 mg/kg reduziu o número de leucócitos totais e de mononucleares na cavidade pleural, quando comparado com o grupo tratado com veículo, sem alterar as contagens de polimorfonucleares. Além disso, o IPC não causou redução na viabilidade celular de macrófagos peritoneais nas concentrações testadas (0,1-100 g/mL). Estes resultados demonstram que o IPC possui atividades anti-inflamatória, antinociceptiva e antioxidante, servindo de base para estudos futuros que visem investigar os mecanismos envolvidos nesses efeitos farmacológicos e podendo contribuir para o desenvolvimento de novas substâncias para o tratamento da inflamação e da dor.

The essential oils, which are secondary metabolites produced by plants. These metabolites are part of the group of terpenes. Such organic molecules are characterized by presenting important pharmacological activities such as anti-inflammatory, antinociceptive, antimicrobial, among others. Thus, the essential oil of Hyptis pectinata (EOHP), a native fragrant plant of the states of Alagoas and Sergipe and widely used by the population, has attracted attention of researchers in order to validate its popular use. In addition, the isopulegol (ISOP), a major monoterpene in the industry for their flavoring properties and medicinal has been the subject of research in scientific research. However, EOHP present ISOP and the physico-chemical characteristics and limited water solubility, high volatilization photosensitivity and easy oxidation. In this perspective, an alternative to preserve the characteristics of these substances is the formation of supramolecular complexes involving cyclodextrins (CDs). The CDs have a molecular structure suitable for the formation of inclusion complexes since they have polar and hydrophilic surface cavity. Thus, the inclusion complex of essential oils and CDs improve the physico-chemical properties of these molecules to optimize the pharmacological activity thereof. Hence, the aim of this study was to identify the chemical constituents of OEHP by gas chromatography coupled to mass spectrometry with flame detector (GC-MS/FID) and from there to prepare the samples with β -CD and ISOP in the α- and β-CD by the methods of the physical mixture (PM), paste complexation (PC) and slurry complexation (SC). Furthermore, the physico-chemical characterization of the samples through the techniques of differential scanning calorimetry (DSC) was performed thermogravimetry/derivative thermogravimetry (TGA/DTG) absorption spectrophotometry in the infrared Fourier transform spectroscopy (FT-IR) scanning electron microscopy, X-ray diffraction (XRD), complexation efficiency by GC-MS/FID, pharmacological test formalin with the best complex obtained from OEHP and study of molecular modeling (docking) to isopulegol and CDs. Based on these results, we observed three major constituents in OEHP, (E) -caryophyllene (54.07%), caryophyllene oxide (14.91%) and germacrene-D (7.46%). The results of physicochemical characterization showed that the EC was the best method to complex (E)-caryophyllene and germacrene-D, caryophyllene oxide has not been complexed and this may be related to its low affinity for the cavity of β- CD. The formalin test showed a better antinociceptive and anti-inflammatory OEHP / β-CD when compared with pure EOHP that can be attributed to the high percentage of (E) -caryophyllene complexed. Regarding isopulegol, it was observed that α-CD complexes more stable inclusion of the β-CD, as showed in the docking analysis and PC/α-CD gave a higher ratio of complexing with respect to PM and SC. But the SC obtained with β-CD showed the highest molecular inclusion. Thus, the techniques used were efficient in the complexation of EOHP and ISOP. / Os óleos essenciais são metabólitos secundários das plantas constituídos de terpenos. Tais moléculas orgânicas caracterizam-se por apresentar atividades farmacológicas importantes como anti-inflamatória, antinociceptiva, antimicrobiana, dentre outras. Dessa forma, o óleo essencial da Hyptis pectinata (OEHP), uma planta odorífera nativa dos estados de Alagoas e Sergipe e bastante utilizada pela população, tem despertado interesse dos pesquisadores com o objetivo de validar o seu uso popular. Além disso, o isopulegol (ISOP), um monoterpeno importante na indústria por suas propriedades flavorizantes e medicinais tem sido objeto de investigação na pesquisa científica. Entretanto, o OEHP, bem como o ISOP apresentam características físico-químicas como solubilidade limitada em água, elevada volatilização, fotossensibilidade e fácil oxidação. Nessa perspectiva, uma alternativa para preservar as características dessas substâncias é a formação de complexos supramoleculares envolvendo ciclodextrinas (CDs). As CDs apresentam uma estrutura molecular adequada para a formação de complexos de inclusão uma vez que possuem cavidade apolar e superfície hidrofílica. Assim, os complexos de inclusão de óleos essenciais e CDs melhoram as características físico-químicas dessas moléculas de modo a otimizar a atividade farmacológica das mesmas. Diante disto, o objetivo do presente estudo foi realizar a identificação dos constituintes químicos do OEHP através da cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas com detector de chamas (CG-EM/DIC) e a partir daí preparar as amostras com β-CD e do ISOP em α- e β-CDs através dos métodos da mistura física (MF), malaxagem (MA) e co-evaporação (CE). Além disso, foi realizada a caracterização físico-química das amostras através das técnicas de calorimetria exploratória diferencial (DSC), termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG), espectrofotometria de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), microscopia eletrônica de varredura, difração de raios-X (DRX), eficiência de complexação através da CG-EM/DIC, ensaio farmacológico de formalina com o melhor complexo obtido do OEHP e estudo de modelagem molecular (Docking) para o ISOP e CDs. Diante dos resultados obtidos, foram observados três constituintes majoritários no OEHP, (E)-cariofileno (54,07%), óxido de cariofileno (14,91%) e germacreno-D (7,46%). Os resultados de caracterização físico-química demonstraram que o CE foi o melhor método para complexar o (E)-cariofileno e o germacreno-D, o óxido de cariofileno não foi complexado e isso pode estar relacionado a sua baixa afinidade pela cavidade da β-CD. O teste de formalina demonstrou melhor atividade antinociceptiva e anti-inflamatória do OEHP/β-CD quando comparado com o OEHP puro que pode ser atribuída ao elevado percentual de (E)-cariofileno complexado. Em relação ao ISOP, foi observado que a α-CD forma complexos de inclusão mais estáveis que a β-CD, pela análise de Docking, e a MA/α-CD forneceu uma maior razão de complexação em relação a MF e CE. Já o CE obtido com β-CD apresentou maior taxa de inclusão molecular. Assim, as técnicas utilizadas foram eficientes na complexação do OEHP e ISOP.

Throughout the history of the development of treatments proposed for pain, medicinal plants and their secondary metabolites have played a key role. However, even more effective therapeutic options for the treatment of painful conditions are necessary. In this sense, the present study aimed to evaluate the effect of the inclusion complex of β-cyclodextrin (β-CD) containing carvacrol, a phenolic monoterpene present in the essential oil of medicinal plants of the genus Origanum, Thymus (Lamiaceae), on the oncology nociception (induced by tumor cell sarcoma 180, S180) in experimental animals. This thesis is formed by three chapters, consisting of a review of patents and two regular papers. Initially, the review Terpenes and derivatives as a new perspective for pain treatment: a patent review was elaborated, which describes patents on the analgesic properties of terpenes and prospects created from these records. After conducting the experimental protocols, the article Evidence for the Involvement of descending pain- inhibitory mechanisms in the attenuation of cancer pain induced by carvacrol , a monoterpene of Origanum oil was constructed, in which it has been shown that carvacrol (CARV) reduces nociception induced by tumor cells (S180), decreases the number of Fos positive neurons in lamina I of the Lumbar spinal cord and activates the brain nuclei involved in the descending inhibitory pain pathway, such as the periaqueductal gray, nucleus raphe magnus and locus coeruleus. Subsequently, the inclusion complex consisting of carvacrol and β-cyclodextrin (CARV/β-CD) was developed and characterized physicochemically through the method of co-evaporation. CARV complexation was able to increase the time of the antinociceptive effects of this compound in animals with S180 in 15 hours and improved the pharmacological response at lower doses, in addition to promoting a clear increase in solubility and stability. These data formed the patent submitted and approved by the Center for Innovation and Technology Transfer (CINTEC UFS) and forms the scientific basis of the article Encapsulation of β-cyclodextrin in carvacrol improves the pharmacological response on cancer pain . From these findings, we conclude that the analgesic effect of carvacrol on cancer pain can be enhanced by employing inclusion complexes containing β-cyclodextrin and may represent an interesting object of further translational research and clinical trials in order clinical evidence to be obtained, which is necessary for the development of new drugs for cancer-associated pain management. / Ao longo da história do desenvolvimento de propostas terapêuticas para o tratamento da dor, as plantas medicinais e seus metabólitos secundários tem exercido um papel fundamental. No entanto, ainda são necessárias opções terapêuticas mais eficazes para o tratamento de condições dolorosas. Neste sentido, o presente trabalho buscou avaliar o efeito do complexo de inclusão de β-ciclodextrina (β-CD) contendo carvacrol, um monoterpeno fenólico presente no óleo essencial de plantas medicinais do gênero Origanum e Thymus (Lamiaceae), sobre a nocicepção oncológica (induzida por células tumorais sarcoma 180, S180) em animais de experimentação. A tese é composta por três capítulos, constituídos de uma revisão de patentes e dois artigos científicos. Inicialmente foi elaborada a revisão Terpenes and derivatives as a new perspective for pain treatment: a patent review , a qual descreve as patentes sobre as propriedades analgésicas dos terpenos e as perspectivas criadas a partir destes registros. Após a realização dos protocolos experimentais foi elaborado o artigo Evidence for the involvement of descending pain-inhibitory mechanisms in the attenuation of cancer pain induced by carvacrol, a monoterpene of Origanum oil , no qual foi demonstrado que o carvacrol (CARV) reduz a nocicepção induzida por células tumorais (S180), diminui o número de neurônios Fos positivos na lâmina I da medula lombar e ativa núcleos cerebrais envolvidos na via descendente inibitória da dor, como a substância cinzenta periaquedutal, núcleo magno da rafe e locus ceruleus. Posteriormente, foi desenvolvido e caracterizado físico-quimicamente o complexo de inclusão constituído de β-ciclodextrina e carvacrol (CARV/β-CD) através do método de co-evaporação. A complexação do CARV foi capaz de aumentar o tempo do efeito antinociceptivo deste composto nos animais com o S180 em 15 horas e melhorar a resposta farmacológica em doses menores, além de promover nítido aumento de solubilidade e estabilidade. Estes dados compuseram a patente submetida e aprovada pelo Centro de Inovação e Transferência de Tecnologia (CINTEC UFS) e constitui a base científica do artigo Encapsulation of carvacrol in β-cyclodextrin improve the pharmacological response on cancer pain . A partir destes achados é possível concluir que o efeito analgésico do carvacrol sobre a dor oncológica pode ser aprimorado pelo emprego de complexos de inclusão contendo β-ciclodextrina e pode representar um interessante objeto de novas pesquisas translacionais e ensaios clínicos a fim de que sejam obtidas as evidências clínicas necessárias para o desenvolvimento de novos medicamentos destinados ao manejo da dor associada ao câncer.