Ainda que descrita pela primeira vez em 1893 por Emil Kraepelin, a esquizofrenia continua sendo uma doença mental extremamente debilitante e de difícil tratamento. A introdução dos antipsicóticos típicos na década de 50 e dos atípicos na década de 90 mudou consideravelmente a realidade dos esquizofrênicos, no entanto a baixa eficácia (principalmente quanto aos sintomas negativos e cognitivos) associada a alta incidência de efeitos adversos requer inovação na farmacodinâmica de antipsicóticos. Alstonina, um alcaloide indólico, é o componente majoritário de uma preparação utilizada para tratar pacientes esquizofrênicos identificada em 1993 durante uma expedição etnofarmacológica à Nigéria. Alstonina mostra em camundongos um perfil tipo antipsicótico atípico, mas aparentemente difere dos compostos conhecidos sugerindo possíveis diferenças no mecanismo de ação. O objetivo dessa tese foi dar continuidade ao esclarecimento do mecanismo de ação da alstonina, especialmente ao que se refere a sua modulação sobre sistema dopaminérgico e serotonérgico. Foram utilizados modelos comportamentais com antagonistas específicos, autoradiografia quantitativa e captação sinaptossomal de dopamina para avaliar o efeito de alstonina sobre os receptores 5HT2A, 5HT2C, D2 e transportador de dopamina. Os resultados mostraram que o efeito tipo antipsicóticos de alstonina é dependentes dos receptores 5HT2A, 5HT2C; além disso mostrou-se que alstonina liga-se diretamente a receptores 5HT2A mas modula indiretamente receptores 5HT2C. O efeito de alstonina sobre esses receptores pode representar uma estratégia peculiar para modular seletivamente a atividade dopaminérgica em regiões corticais e límbicas, compatível com o desequilíbrio alegado para a patofisiologia da esquizofrenia. Um achado digno de nota é que diferindo de todos os antipsicóticos em clínica, os nossos resultados mostram que alstonina não possui afinidade por receptores dopaminérgicos D2. Ainda que preliminares, os nossos dados mostram que a administração aguda de alstonina aumenta a captação de dopamina, um mecanismo possível para diminuir a ativação de receptores dopaminérgicos pós sinápticos responsáveis por sintomas positivos. Ainda que haja lacunas no conhecimento do mecanismo de ação de alstonina, este estudo reforça a hipótese de um mecanismo de ação inovador potencialmente útil como protótipo para novos antipsicóticos. / Although first described in 1893 by Emil Kraepelin, schizophrenia continues to be an extremely debilitating and difficult to treat mental illness. The introduction of typical antipsychotics in the 50s and atypical in the 90s has considerably changed the reality of schizophrenics, but the low efficacy (especially for the negative and cognitive symptoms) associated with the high incidence of adverse effects requires innovation in the pharmacodynamics of antipsychotics. Alstonine, an indole alkaloid, is the major component of a preparation used for treating mental patients identified in 1993 during and ethnopharmacology field study in Nigeria. In mice alstonine shows the profile of an atypical antipsychotic but, apparently, differs from known compounds suggesting possible differences in the mechanism of action. The aim of this thesis was to continue to clarify the mechanism of action of alstonine, especially with regard to its modulation of dopamine and serotonin system. Behavioral models, specific antagonists, quantitative autoradiography, and dopamine synaptosomal uptake assays were used to evaluate the effect of alstonine on the 5HT2A, 5HT2C, and D2 dopamine transporter. The results showed that the antipsychotic-like effects of alstonine depend on the 5HT2A and 5HT2C serotonin receptor subtypes; additionally, we showed that alstonine directly binds to 5HT2A receptors but indirectly modulates 5HT2C. The effects of alstonine on these receptors may represent a unique strategy to selectively modulate dopamine activity in limbic and cortical regions, consistent with the imbalance alleged for schizophrenia pathophysiology. Noteworthy is the finding that unlike all antipsychotics in clinical practice, our results show that alstonine has no affinity for dopamine D2 receptors. Though preliminary, our data indicate that acute administration of alstonine increases the uptake of dopamine, a possible mechanism for decreasing the activation of post synaptic dopamine receptors responsible for schizophrenia positive symptoms. In spite of the gaps in the knowledge of the alstonine antipsychotic mechanism of action, this study reinforces the hypothesis that it presents a novel mechanism of action potentially useful as a prototype for innovative antipsychotics.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / No presente trabalho, foi avaliado a interaÃÃo entre os sistemas dopaminÃrgico e colinÃrgico atravÃs do estudo dos efeitos comportamentais (campo aberto e catalepsia) e neuroquÃmicos (densidade de receptores dopaminÃrgicos (D1 e D2-sÃmile) e muscarÃnicos (M1+M2-sÃmile) em corpo estriado de rato. As seguintes drogas foram utilizadas: mazindol (agonista dopaminÃrgico indireto), apomorfina (agonista dopaminÃrgico D1-sÃmile e D2-sÃmile), pimozida (antagonista dopaminÃrgico D2-sÃmile), SCH 23390 (antagonista dopaminÃrgico D1-sÃmile), pilocarpina (agonista muscarÃnico M1-sÃmile), carbacol (agonista muscarÃnico M2-sÃmile), pirenzepina (antagonista muscarÃnico M1-sÃmile), atropina (antagonista muscarÃnico M1 e M2 nÃo seletivo), clozapina (neurolÃptico atÃpico). Os resultados mostraram que a pimozida e o carbacol, sozinhos ou associados, causaram um aumento da resposta catalÃptica e uma diminuiÃÃo da atividade locomotora. O mazindol tambÃm aumentou a atividade locomotora. Carbacol, nas menores doses, e o mazindol aumentaram a densidade de receptores D1-sÃmile. A pimozida e a atropina, isoladamente, aumentaram a densidade de receptores D1-sÃmile no corpo estriado enquanto que a atropina causou uma diminuiÃÃo dos receptores D2-sÃmile e uma upregulation dos receptores muscarÃnicos. O mazindol aumentou o binding de 3H-NMS no corpo estriado. O presente trabalho sugere, de maneira geral, que existe uma relaÃÃo entre os receptores muscarÃnicos M1 e M2 com os receptores dopaminÃrgicos D1 e D2, sendo que esta relaÃÃo pode ocorrer de maneira positiva ou negativa, dependendo da seletividade e da dose das drogas utilizadas / In the study, the interaction between the dopaminergic and cholinergic systems through the study of behavioral (open field and catalepsy) and neurochemical (density of dopaminergic receptor (D1 and D2-like) and muscarinic (M1+M2-like)) effect in striatum rat was evaluated. The following drugs were used: mazindol (indirect dopaminergic agonist), apomorphine (D1-like and D2-like dopaminergic agonist), pilocarpine (M1-like muscarnic aginist), carbachol (M-2like agonist muscarinc), pirenzepine (M1-like antagonist muscarinic), atropine (non-selective M1 and M2 antagonist muscarinic), clozapina(non-typical neuroleptic). The results showed that the pimozida and carbachol, alone or associated, caused increase in the cataleptic response and reduction in the motor activity. The mazindol also increased the motor activity. In small dosage, the carbachol and mazindol increased the density of D1-like receptors. Isolated, the pimozida and atropine increased the density of the D1-like receptors in striatum whereas the atropine caused a reduction of D2-like receptors and upregulation of muscarinic receptors. This work suggests a relationship, between muscarinc receptors M1 and M2 and dopaminergic receptors D1 and D2, and that this relationship can occur in a positive and negative manner, depending on the selectivity and the dose of the used drug

Este trabalho tem como objetivo principal a utilização da técnica “bottom-up” para a construção de nanoestruturas de ouro por meio de técnicas voltamétricas sobre uma superfície de Carbono Vítreo. Estas estruturas foram caracterizadas por métodos microscópicos e voltamétricos. A dimensão crítica das nanoestruturas foi obtida por meio de uma curva Gausseana de distribuição de alturas e diâmetros, fornecendo um valor médio de 35 nm por 150 nm de diâmetro. As nanoestruturas obtidas foram modificadas pela deposição de uma camada automontada de cistamina (um tiól), resultando num substrato adequado para futuras aplicações como a imobilização de enzimas. Os comportamentos eletroquímicos da dopamina e do ácido ascórbico, sobre eletrodos de ouro, Carbono Vítreo e Nanoestruturado, foram avaliados para a caracterização das modificações dos eletrodos. A diferença dos potenciais de pico de oxidação do AA sobre eletrodos de Carbono Vítreo e de ouro, de cerca de 300 mV, possibilitou avaliar o recobrimento do Carbono Vítreo com nanoestruturas pela diminuição da corrente de pico. Já a dopamina foi utilizada neste trabalho para determinar a presença da camada automontada de cistamina sobre a superfície das nanoestruturas de ouro, uma vez que sua resposta voltamétrica mostra um deslocamento do potencial de pico quando realizada sobre Au e sobre Au modificado com a camada automontada. / The subject of this work is focused in the utilization of a “bottom-up” approach to develop an Au nanostructured electrodeposits on the glassy carbon surface by a voltammetric procedure. These Au nanostructures have been characterized either by microscopic and voltammetric techniques. The critical dimensions of nanostructures has been evaluated by a Gausean normal data distribution curve and presented, as results a mean height of 35 nm and a mean diameter of 150 nm. The Au nanostructures were further modified by the deposition of a cystamine (thiol) self-assembled monolayer, yielding a suitable substrate for enzyme immobilization, as a possible future application. The electrochemical behaviour of dopamine and ascorbic acid on gold, Glassy Carbon and nanostructures was studied aiming to characterize the modified electrode. The 300 mV shift in the oxidation peak potential for ascorbic acid on gold in relation to Glassy Carbon allows to calculate the nanostructure coverage factor by the peak current inhibition as 43%. Finally, dopamine was employed to detect the self assembled monolayer formation on the Au nanostructure through its voltammetric behaviour. The variation in the oxidation potential for DA on gold and self assembled monolayer was used as an indicator for such modification.

Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Grado de Magister en Ciencias Biológicas. / El sistema nervioso y el sistema inmune se encuentran íntimamente relacionados comunicándose bidireccionalmente mediante citoquinas, neuropéptidos y neurotransmisores, como la dopamina. Este neurotransmisor ejerce su efecto a través de cinco receptores dopaminérgicos que poseen diferentes grados de afinidad, contando con la mayor afinidad el receptor 3 (D3R). Su presencia se ha reportado en diferentes células del sistema inmune. La estimulación del D3R promueve la producción de IFN-γ en linfocitos T CD4+, favoreciendo su diferenciación a un perfil Th1. Sin embargo, el rol de este receptor en los linfocitos T CD8+ aún no se ha estudiado a cabalidad. En esta tesis se estudió la incidencia del D3R en la formación del perfil citotóxico en linfocitos T CD8+, que poseen un TCR transgénico específico para el péptido OVA(257-264) alojado sobre el MHC de clase I H2-Kb (linfocitos OT-I). La diferenciación in vitro muestra que la carencia del D3R en linfocitos OT-I (OT-I D3RKO) resulta en una reducción significativa en la producción de IFN-γ, TNF-α, IL-2 y en la expresión de CD25 (cadena α del receptor de IL-2) en respuesta a la estimulación con péptido OVA(257-264). Estas deficiencias se revierten al añadir IL-2 exógena a los cultivos, sugiriendo que el mecanismo de acción por el cual el D3R favorece la diferenciación hacia un fenotipo efector productor de IFN-γ y TNF- α ocurre a través de la producción de IL-2. Concordante con lo anterior, se observó que la expresión del D3R en linfocitos OT-I promueve la expansión clonal y la protección antitumoral frente a melanoma. En conjunto los resultados obtenidos en linfocitos T CD8+ sugieren que el D3R promueve la formación de un perfil citotóxico, induciendo la producción de IFN-γ y favoreciendo una alta tasa de expansión clonal, lo que conlleva a una mayor sobrevida frente a un desafío tumoral. / The nervous system and the immune system are intimately related, communicating bi-directionally through cytokines, neuropeptides and neurotransmitters. Dopamine is a neurotransmitter that exerts its effect through five dopaminergic receptors which display different degrees of affinity. The D3R, which display the highest affinity for dopamine, has been found expressed in CD4+ T cells, where its stimulation promotes high production of IFN-γ, favoring the acquisition of the Th1 profile. However, the role of this receptor in CD8+ T lymphocytes has not yet been fully studied. In this thesis the role of D3R in the acquisition of the cytotoxic profile by CD8+ T lymphocytes was studied. For this purpose, in this thesis CD8+ T-cells bearing a transgenic TCR specific for the recognition of the OVA peptide(257-264) over the class I MHC H2-Kb (OT-I lymphocytes) were used. In vitro differentiation experiments show that lack of D3R in OT-I lymphocytes (OT-I D3RKO) results in a significant reduction in the production of IFN-γ, TNF-α and on the expression of CD25 (α chain of the IL-2 receptor) in response to the stimulation with OVA peptide(257-264). These effects were reversed by adding exogenous IL-2 into the cultures, suggesting a mechanism by which D3R favors the differentiation towards an effector phenotype through the production of IL-2. In vivo experiments show that D3R expressed on OT-I lymphocytes favors a higher clonal expansion and thereby an stronger protection against melanoma tumors. The results obtained suggest that D3R promotes the formation of a more efficient cytotoxic profile capable of producing higher percentages of IFN-γ and higher rates of clonal expansion, which leads to greater survival in the face of a tumor challenge. / Junio 2020

Uma estratégia muito simples para estudar as propriedades eletroquímicas para qualquer proteína foi desenvolvida por meio de ligações estáveis de dopamina, um neurotransmissor de mamíferos superiores, com albumina sérica bovina. Os resultados foram avaliados por voltametria cíclica, espectrofluorimetria e espectrofotometria de primeira derivada na região do visível. Eletrodos de pasta de carbono não modificados foram usados para identificar o complexo BSA-5-Cys-DA   em solução, após isolamento por filtração molecular. Um aumento significativo do sinal de fluorescência de emissão em 350 nm em conjunto com o aparecimento de um sinal de absorção em 370 nm também foram identificados para o complexo. Neste sentido, a ligação covalente entre uma proteína teste com a dopamina revelou-se como um modelo favorável para estudos eletroquímicos de proteínas desprovidas de centros redox metálicos, juntamente com a sua capacidade dual para investigação eletroquímica e espectroscópica direta de proteínas, quer imobilizadas ou em solução. / A very simple strategy for studying electrochemical properties for any protein was developed by cross-linking dopamine with BSA. The results were evaluated by cyclic voltammetry, spectrofluorimetry and first-derivative spectrophotometry in the visible range. Unmodified carbon paste electrodes were used for identify the BSA-5-Cys-DA complexes in solution. This approach allowed overlapping the sluggish kinetics of electron transfer exhibited by proteins with non-metalic redox centers near the surface electrode. Furthermore, a marked increased in fluorescence signal at 350 nm emission together with the appearance of a BSA absorption signal at 370 nm arouse from the protein adducts. In this sense the covalent linkage between a test protein with dopamine show it as a dual candidate able to display both electrochemical and spectroscopic signals, and allow the use of this approach for identify and analyze proteins either in solution or immobilized.

La malaltia de Parkinson és una de les malalties neurodegeneratives humanes més freqüents, especialment en pacients d'edat avançada amb una simptomatologia provocada especialment per la manca de DA. La gènesi d'aquesta malaltia no és clara, si bé sembla haver un component genètic en un nombre reduït dels casos diagnosticats, la principal causa roman encara desconeguda. La hipòtesi neurotòxica està present des de fa molt temps i el que sembla més lògic és pensar en l'existència d'una condició mixta, es a dir, una predisposició genètica (congènita, heretada o adquirida) i un detonant que podria ser endogen o exogen. Diverses evidencies suggereixen un paper important de la dopamina en el dany neuronal observat durant la malaltia, per aquest motiu, mitjançant diversos experiments, el nostre laboratori ha determinat els efectes de diferents concentracions de dopamina (DA) sobre la viabilitat de les cèl·lules SH-SY5Y. El primer que s'ha fet es comprovar que la DA s'acumula dins la cèl·lula i aproximadament a quines concentracions ho fa. La DA entra ràpidament dins la cèl·lula, on arribarà a unes concentracions inferiors però properes a les utilitzades extracel·lularment.El primer pas dins de la toxicitat produïda per la DA sembla clarament implicar la seva oxidació intracel·lular. Totes les alteracions produïdes per la DA s'han bloquejat amb antioxidants d'acció intracel·lular com la N-acetilcisteïna. Així doncs, per garantitzar que la DA no sigui tòxica, cal que no s'oxidi. És difícil precisar si la toxicitat de la DA pot estar vinculada al seu procés d'oxidació o als metabòlits reactius que es produeixen. En el primer cas la DA, a l'oxidar-se, està donant lloc a peròxid d'hidrogen i, per tant, a un potencial estrès oxidatiu. En les nostres cèl·lules, l'augment de peroxidació per efecte de la DA és relativament suau, a menys que s'incorpori Fe3+ en el medi com a catalitzador d'aquest procés. En el segon cas s'ha de considerar que la DA està donant lloc a quinones i a aminocroms. Les primeres són prou reactives com per unir-se a grups tiol de forma covalent i per tant, potencialment, poder modificar qualsevol proteïna. Venim a suggerir i en part a demostrar que la DA, oxidant-se a dopaquinona i dopaminocrom, pot reduir-se novament en presència de NADH o NADPH i donar lloc a un cicle redox en el que es pot disminuir considerablement el contingut de la forma reduïda d'aquests coenzims, essencials pel bon funcionament cel·lular. A part d'aquesta alteració redox, s'han observat altres alteracions com a conseqüència de l'oxidació de la DA. Una de les més primerenques és l'acumulació de proteïnes ubiqüitinitzades. Com a conseqüència d'aquest fet i d'altres mecanismes s'activarien una sèrie de vies que modificarien l'expressió de tota una gama de gens implicats en la transducció de senyals i en mort o supervivència cel·lular com GADD153 i C/EBP-beta així com de l'alfa-sinucleïna. L'acumulació d'alfa-sinucleina, conjuntament amb la de les proteïnes alterades per les quinones i les proteïnes ubiqüitinitzades no degradades pel proteosoma pot afavorir la formació d'agregats de nucleació, amb característiques d'agressoma, que donen lloc a la formació al seu voltant de vacuoles autofàgiques i a l'activació d'un senyal d'estrès reticular. La DA desencadena doncs clarament i de forma dosi-dependent un procés d'autofàgia en el citoplasma cel·lular. Pensem que la finalitat de l'autofàgia és un cop més la de salvar la cèl·lula, però si l'agressió no s'atura la cèl·lula s'acaba morint per acció de la mateixa autofàgia, o bé mitjançant un procés apoptòtic en alguns casos o simple necrosi en d'altres. BNIP3 és una proteïna la expressió de la qual també incrementa després del tractament amb DA. BNIP3 ja s'ha descrit anteriorment com factor que s'indueix quan hi ha autofàgia. Un dels factors que la regulen és HIF-1-alfa, factor que s'indueix ràpidament en situacions d'hipòxia o d'estrès oxidatiu i com hem vist després del tractament amb DA. Per tant, la cèl·lula es comporta de forma semi-anaeròbica, de manera que la relació lactat/piruvat augmenta, i com a conseqüència d'aquest fet, els nivells d'AMP han d'estar augmentats, podent-se activar l'AMPK. Aquest procediment per si sol pot explicar l'aturada de la ruta de mTOR observada per part de la DA, sense descartar algun efecte més directe sobre TSC1/TSC2 o Rheb. / "Mechanisms of cell damage triggered by dopamine in SH-SY5Y cells."TEXT:Dopamine (DA) could play a central role in neuronal dopaminergic degeneration in Parkinson's disease and other neurodegenerative disorders. The mechanisms leading to neuronal damage and death are not yet fully understood.We have used human neuroblastoma SH-SY5Y cells that are sensitive to dopamine, with the aim to further understand the molecular mechanisms through which dopamine may damage the cell. DA enters the cell in a dose-dependent and saturating way. DA triggers a redox cycle that causes a slight increase in peroxidation (DCFH) and a decrease in the reductive power of the cell that could be assessed by MTT, NADH concentration and GSH/GSSG relationships. Such an effect is reflected in a decrease in cell viability, a decrease in oxygen consumption and an increase in cytosolic calcium concentration. The transcription factors C/EBPß and GADD153/CHOP increase their expression. Parameters of endoplasmic reticulum stress (grp78) are activated and a consistent autophagy is observed using electronic microscopy.Autophagy is a process characterized by the presence of double or multiple-membrane cytoplasmic vesicles sequestering cytoplasm and organelles such as mitochondria and endoplasmic reticulum.The genes related with autophagy and their products are currently known as ATG. The microtubule-associated protein light chain 3 (LC3) (the mammalian orthologue of yeast ATG8) is a useful procedure for autophagy detection. We show that dopamine increases LC3 expression and its proteolysis product LC3-II which is localized in autophagosamal membranes.The PI3K-AKT-mTOR pathway is involved in autophagy induced by starvation. The activation of S6K (a downstream substrate of mTOR) decreases after incubation with dopamine. This is indicative of a mTOR inhibition by dopamine. 3-Methyladenine blockes autophagy but not the LC3 increase. Beclin 1 (ATG6) is also involved in this process.Moreover, a multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) showed an increase in BNIP3, NOXA and PUMA expression after DA treatment. BNIP3 and p53 expression were confirmed by WB. BNIP3 is a member of the BH3-only family, which are factors involved in apoptosis and autophagy. Since BNIP3 is induced under hypoxic conditions we studied and found an increase of hypoxia inducible factor (HIF 1alpha) expression, suggesting a hypoxic-like condition caused by dopamine.

D'entre totes les catecolamines, la dopamina és la més important del sistema nerviós central, on regula funcions com la conducta motora, les emocions i la cognició. Donada la implicació del sistema dopaminèrgic en diverses disfuncions cerebrals, com ara l'esquizofrènia, la malaltia de Parkinson o el trastorn per dèficit d'atenció amb hiperactivitat, l'estudi d'aquest sistema ha esdevingut de gran importància. Els dos mecanismes més importants de terminació de l'activitat dopaminèrgica a nivell sinàptic són la recaptació mitjançant el transportador de la dopamina (DAT) i la degradació a través de la catecol-o-metiltransferasa (COMT). El gen del DAT presenta un polimorfisme consistent en un número variable de repeticions en tàndem (VNTR) de 40 parells de bases (bp). Aquest polimorfisme es troba en una regió no codificant del gen i, per tant, no està associat a mutacions en la seqüència d'aminoàcids de la proteïna, però sí s'han observat diferències en la disponibilitat de la proteïna associades al VNTR. Tot i que els estudis in vivo han estat poc concloents, els estudis in vitro suggereixen una major expressió de la proteïna associada a l'al·lel de 10 repeticions, la qual conduiria a menors nivells de dopamina sinàptica. La COMT és un enzim que pot catalitzar la metilació de petites molècules com fàrmacs, hormones i neurotransmissors o de macromolècules com les proteïnes, l'ARN o l'ADN. El gen de la COMT mostra un polimorfisme funcional causat per la transició d'una guanina a una adenina que suposa un canvi de l'aminoàcid valina per l'aminoàcid metionina al codó 108/158, depenent de si la forma de l'enzim codificada és la citosòlica (codó 108) o la membranal (codó 158). L'enzim que conté l'aminoàcid metionina és termolàbil a 37 ºC, mentre que l'enzim que conté l'aminoàcid valina mostra major estabilitat a temperatures entre els 37 i els 56 ºC. La major estabilitat comporta uns majors nivells d'activitat enzimàtica i, en conseqüència, una menor disponibilitat dopaminèrgica a nivell sinàptic. En els dos estudis que formen aquesta tesi vàrem avaluar l'efecte de les variants genètiques de la COMT i del DAT sobre l'activació cerebral relacionada amb la memòria de treball i el processament d'emocions, així com el seu impacte sobre les funcions cognitives prefrontals. A tal efecte, es va estudiar, mitjançant la tècnica de ressonància magnètica funcional (RMf) i l'administració de proves prefrontals, una mostra de subjectes sans dels quals s'havien obtingut prèviament el genotip per als polimorfismes Val108/158 Met de la COMT i 40 bp VNTR del DAT. Les anàlisis van mostrar una relació entre el genotip de la COMT i l'execució en el Wisconsin Card Sorting Tests (WCST). Concretament, el nombre d'al·lels Val estava relacionat amb un pitjor rendiment en aquest test, reflectit pel major nombre d'errors perseveratius. Pel que fa al genotip del DAT, es va observar un efecte sobre la variable temps de reacció del Continuous Performance Test (CPT). Els subjectes homozigots per a l'al·lel de 9 repeticions van ser els que van mostrar els temps de reacció més elevats, mentre que els subjectes homozigots per a l'al·lel de 10 repeticions van mostrar els temps de reacció més baixos. Tots dos genotips es van relacionar amb el nombre d'errors de comissió en el CPT. El nombre d'al·lels Val de la COMT i el nombre d'al·lels de 10 repeticions del DAT estaven relacionats amb un major nombre d'errors de comissió. Pel que fa a les dades de RMf no es va observar cap efecte dels genotips de la COMT i del DAT independentment, però sí un efecte additiu dels dos genotips sobre l'activació cerebral a la circumvolució frontal mitja (BA 9) durant la realització de l'N-back. Durant el processament d'emocions es va observar un efecte principal del genotip de la COMT en l'activació de l'amígdala dreta. Anàlisis posteriors van revelar una major activació de l'amígdala dreta en els subjectes homozigots per a l'al·lel Met en relació als portadors de l'al·lel Val. Els nostres resultats mostren, per tant, que les variacions genètiques que afecten la transmissió dopaminèrgica tenen un impacte sobre la fisiologia cerebral i sobre el rendiment cognitiu.

A doença de Parkinson é a segunda doença neurodegenerativa mais frequente na espécie humana. A doença é caracterizada por tremor de repouso, bradicinesia (lentidão para executar os movimentos) e rigidez muscular. Os pacientes apresentam um processo de degeneração da substantia nigra, região produtora de dopamina e que modula a geração e manutenção do movimento ao liberar dopamina no estriado. Entre todos os distúrbios neurodegenerativos, esse é o único que possui uma opção terapêutica realmente eficaz: o precursor de dopamina levodopa. Porém, efeitos adversos, como discinesia e flutuações motoras, surgem como frequentes e sérios problemas decorrentes do seu uso crônico. O receptor de dopamina D2 (DRD2) é reconhecido como um dos maiores sítios de ação da dopamina no sistema nigroestriatal, controlando funções relacionadas ao movimento. Visto que fatores genéticos podem ter papel fundamental na determinação da ocorrência desses problemas, o objetivo do presente trabalho foi de investigar se polimorfismos na região dos genes DRD2 e ANKK1 (ankyrin repeat and kinase domain containing 1) estão associados com o risco de desenvolver discinesia e flutuações motoras em pacientes com Parkinson. Foram selecionados e avaliados 199 pacientes do ambulatório de Distúrbios do Movimento do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (RS), com diagnóstico de doença de Parkinson idiopática. Foram excluídos pacientes com: menos de um ano de tratamento com levodopa, diagnóstico incerto ou características consistentes de parkinsonismo atípico. Cento e noventa e nove pacientes foram genotipados para os polimorfismos ‐141C Ins/Del (rs1799732), rs2283265, rs1076560, C957T (rs6277), TaqIA (rs1800497) e rs2734849 na região dos genes DRD2/ANKK1. Portadores do haplótipo TTCTA apresentaram um risco aumentado para o aparecimento de discinesia (P=0.007; 1.538 [CI95% 1.126-2.101]). Não foi encontrada nenhuma associação entre o polimorfismo ‐141C Ins/Del e risco para o desenvolvimento de discinesia. Nenhum polimorfismo ou haplótipo teve associação com o aparecimento de flutuações motoras ou estava relacionado com a dose de medicação administrada diariamente aos pacientes. Nossos dados sugerem que polimorfismos na região envolvendo os genes DRD2 e ANKK1 estão associados com o aparecimento de discinesia decorrente do uso prolongado de levodopa. / Parkinson's disease is the second most common neurodegenerative disorder. The disease is marked by tremors, muscular rigidity, bradykinesia (slowness in the execution of movement) and postural instability. The patients present an ongoing degeneration process of substantia nigra, a dopamine producing region that modulates the generation and maintenance of movement by releasing dopamine in the striatum. The patients exhibit degeneration of substantia nigra dopamine, producing region and modulates the generation and maintenance of movement to release dopamine in the striatum. Among all neurodegenerative disorders, this is the only one who has a really effective therapeutic option: the dopamine precursor levodopa. However, its chronic use is associated with the occurrence of adverse effects such as motor fluctuations and dyskinesias. The dopamine receptor type 2 (DRD2) is recognized as one of the largest sites of action of dopamine in the nigrostriatal circuit, controlling functions related to movement. Since genetic factors could play a role in determining the occurrence of those problems, the aim of the present study was to investigate whether polymorphisms among DRD2 and ANKK1 (ankyrin repeat and kinase domain containing 1) genes are associated with the risk of developing dyskinesia and motor fluctuations in Parkinson’s disease patients. A total of 199 patients diagnosed with idiopathic Parkinson's disease were recruited and evaluated at the Movement Disorder Clinics at Hospital de Clínicas de Porto Alegre (RS). Patients with less than one year of treatment with levodopa, atypical or secondary Parkinsonisms were excluded. One hundred ninety-nine patients were genotyped for the ‐141CIns/Del, rs2283265, rs1076560, C957T, TaqIA and rs2734849 polymorphism at the DRD2/ANKK1 gene region. Carriers of the TTCTA haplotype showed an increased risk for the presence of dyskinesia (P=0.007; 1.538 [CI95% 1.126-2.101]). No association between the ‐141C Ins/Del polymorphism and dyskinesia was observed. No polymorphism or haplotype was associated with the appearance of motor fluctuations or was related to the daily dosage medication administered to patients. These results suggest that polymorphisms at the DRD2/ANKK1 gene region might play a role in the pathogenesis of levodopa-induced dyskinesia.

Made available in DSpace on 2015-12-06T23:00:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 1999 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Nos ultimos dois seculos, o conhecimento sobre o sistema nervoso central expandiu-se consideravelmente, possibilitando atualmente o tratamento de muitas patologias do sistema nervoso central. Uma dessas patologias, entretanto, a discinesia tardia nao apresenta nenhum tratamento terapeutica de eficacia comprovada (Soares, 1997). A discinesia tardia e uma sindrome caracterizada por movimentos involuntarios repetitivos, normalmente envolvendo a lingua, boca e face, ocasionalmente atingindo tambem o pescoco, membros superiores e quadris. Acredita-se ser a discinesia tardia um efeito colateral da exposicao prolongada aos antipsicoticos (neurolepticos). Essa disfuncao motora Pode persistir por meses ou anos apos a retirada do tratamento com neuroleptico, podendo ate mesmo ser irreversivel (Karniol, 1979; Casey, 1985; Kane, 1995). Nesta tese de Mestrado, procuramos estudar os efeitos comportamentais da administracao de buspirona sobre modelos animais de discinesia tardia. Os modelos animais utilizados foram: [1] a supersensibilidade dopaminergica induzida por um tratamento prolongado com haloperidol e quantificada pela atividade espontanea de ratos em um campo aberto e [2] pelo comportamento estereotipado induzido pela apomorfina e [3] a quantificacao dos movimentos orofaciais de ratos apos um tratamento repetido com reserpina. O tratamento prolongado com buspirona per se (3.0 mg/kg, i.p., duas vezes ao dia, por 30 dias) nao resultou em uma supersensibilidade comportamental em nenhum dos dois modelos animais. O tratamento concomitante de buspirona foi capaz de diminuir os sintomas da supersensibilidade dopaminergica induzida pelo haloperidol (2.0 mg/kg, i.p., uma vez ao dia, por 30 dias) e quantificada pela atividade geral em campo aberto, mas nao pelo comportamento estereotipado induzido pela apomorfina. Nos experimentos agudos, apesar de a buspirona per se diminuir tanto a atividade gera em campo aberto como o comportamento estereotipado induzido pela apomorfina, a co-administracao de buspirona nao foi capaz de modificar o efeitos agudos do haloperidol sobre esses dois modelos animais. No terceiro modelo, ratos foram tratados com salina ou buspirona (3.0 mg/kg, i.p., duas vezes ao dia) e veiculo ou reserpina (O,1 mg/kg, s.c., dias intercalados) por 19 dias. No vigesimo dia, os animais foram observados para a quantificacao de seus movimentos orofaciais: frequencia de protrusao de lingua e movimentos...(au) / In the last two centuries, the knowledgement about the central nervous systems increased enormously, making possible the treatment of patients who suffer of all sort of central nervous systems’ diseases. One of this diseases is Tardive Dyskinesia, a syndrome characterized by repetitive involuntary movements, usually involving mouth, face and tongue and sometimes limb and trunk musculature. The syndrome is considered to be an adverse effect of prolonged administration of antipsychotic drugs (normally named neuroleptics). It persists for moths after neuroleptic has been discontinued and may be irreversible (Karniol, 1979; Casey, 1985; Kane, 1995). In a recent meta-analysis study, Soares (1997) concluded that there is no efficacious therapeutic interventions for tardive dyskinesia. In this thesis, we studied the behavior effects of buspirone administration on animal models of tardive dyskinesia. These models comprised the [1] dopaminergic supersensitivity induced by long-term haloperidol administration, which is quantified by the spontaneous activity (locomotion and rearing frequency) of rats observed in an open-field or [2] by the apomorphine-induced stereotyped behavior, and [3] the quantification of orofacial dyskinesia in rats repeatedly treated with reserpine. In the first an second models, buspirone per se (3.0 mg/kg, i.p., twice daily, for 30 days) did not produce dopaminergic supersensitivity. When buspirone was given in combination to haloperidol (2.0 mg/kg, i.p., once daily, for 30 days), it decreased the neuroleptic withdrawal symptoms as detected in open-field but not in apomorphine-induced stereotypy. Although single administration of buspirone per se decreased both open-field and apomorphine-induced stereotypy behavior, buspirone single administration did not modify the acute effects of haloperidol on these two behavioral models.In the third model, rats were co-treated with saline or buspirone (3.0 mg/kg, i.p., twice daily) and vehicle or reserpine (0.1 mg/kg, s.c., once every other day) for 19 days...(au) / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2010 / Made available in DSpace on 2012-10-25T05:12:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 278128.pdf: 2341713 bytes, checksum: 3e227bd8c7a8e65672287970e2f60430 (MD5) / Além dos sinais motores clássicos, a doença de Parkinson é caracterizada por déficits cognitivos e emocionais, os quais precedem as alterações motoras, como tem sido demonstrado por diversos autores. O presente estudo teve como principal objetivo investigar se uma degeneração parcial dos neurônios dopaminérgicos induzida pela administração de 6-hidroxidopamina seria capaz de induzir alterações comportamentais pré-motoras em ratos. O curso temporal da lesão nigroestriatal foi avaliado através de imunoistoquímica para tirosinahidroxilase e os níveis de dopamina, noradrenalina e serotonina foram analisados em várias regiões cerebrais através de Cromatografia Líquida de Alta Pressão com Detecção Eletroquímica. Foram realizados testes para avaliar uma variedade de funções comportamentais, incluindo atividade locomotora, comportamento tipo-depressivo, anedonia, ansiedade e memória nos ratos lesionados com 6-hidroxidopamina. A infusão bilateral de 6-hidroxidopamina no corpo estriado de ratos causou lesão precoce dos terminais dopaminérgicos no corpo estriado e corpos celulares na substância negra. A lesão nigroestriatal foi acompanhada por uma perda precoce de dopamina no corpo estriado, que permaneceu estável por um período de três semanas de observação. Além disso, foi observada uma redução tardia de dopamina no córtex pré-frontal, porém não no hipocampo. Alterações noradrenérgicas e serotonérgicas foram também observadas após a administração de 6-hidroxidopamina. Os resultados indicam que os ratos lesionados com 6- hidroxidopamina apresentaram uma redução no consumo de sacarose e um aumento no tempo de imobilidade no teste do nado forçado, sugerindo um efeito tipo anedônico - depressivo. Além disso, foi observada uma atividade do tipo ansiogênica no teste do labirinto em cruz elevado, bem como alterações cognitivas na versão com pista do labirinto aquático de Morris e no teste do reconhecimento social. Estes achados sugerem que a degeneração dopaminérgica parcial, associada a alterações dopaminérgicas, noradrenérgicas e serotonérgicas no corpo estriado e córtex pré-frontal pode ter causado os déficits emocionais e cognitivos observados neste modelo de fase inicial da doença de Parkinson. Evidências recentes em modelos animais sugerem que o bloqueio dos receptores canabinóides CB1 poderia ser benéfico para o alívio da inibição motora típica da doença de Parkinson. Desta forma, nós investigamos se a administração de SR141716A, um antagonista seletivo dos receptores CB1, seria capaz de reduzir os déficits IX emocionais e cognitivos observados, respectivamente, no teste do nado forçado e do reconhecimento social neste modelo de doença de Parkinson pré-motora. Os resultados mostraram que, uma semana após a cirurgia, no teste no nado forçado, o aumento do tempo de imobilidade observado nos animais tratados com 6-hidroxidopamina foi reduzido pela injeção aguda de 3 mg/kg de SR141716A, enquanto que doses menores (0,5 e 1 mg/kg) não foram efetivas. Três semanas após a cirurgia, o aumento no tempo de investigação no teste do reconhecimento social causado pela administração de 6-hidroxidopamina foi atenuado pela exposição aguda a baixas doses de SR141716A. As análises de Cromatografia Líquida de Alta Pressão mostraram alterações nos níveis estriatais de dopamina e nos níveis de noradrenalina e serotonina no córtex pré-frontal após a injeção de SR141716A. Esses resultados sugerem que o receptor CB1 pode desempenhar um papel importante nos estágios iniciais da doença de Parkinson. / In addition to classic motor symptoms, Parkinson's disease is characterized by cognitive and emotional deficits, which have been demonstrated to precede motor impairments. The present study addresses the question of whether a partial degeneration of dopaminergic neurons using 6-hydroxydopamine in rats is able to induce premotor behavioral signs. The time-course of nigrostriatal damage was evaluated by tyrosine hydroxylase-immunohistochemistry and the levels of dopamine, noradrenaline and serotonin in various brain regions were analyzed by High-Performance Liquid Chromatography with Electrochemical Detection. Tests that assessed a variety of behavioral functions, including locomotor activity, depression, anhedonia, anxiety and memory were conducted on 6- hydroxydopamine-lesioned rats. Bilateral infusion of 6-hydroxydopamine in the striatum of rats caused early damage of dopaminergic terminals in striatum and in cell bodies in substantia nigra pars compacta. The nigrostriatal lesion was accompanied by early loss of dopamine in the striatum, which remained stable through a threeweeks period of observation. In addition, a late loss of dopamine in the prefrontal cortex, but not in the hippocampus, was seen. Additional noradrenergic and serotonergic alterations were observed after 6-hydroxydopamine administration. Six-hydroxydopamine - lesioned rats showed decreased sucrose consumption and an increased immobility time in the forced swimming test, an anhedonic-depressive-like effect. In addition, an anxiogenic-like activity was seen in the elevated plus maze test and cognitive impairments were observed on the cued version of the Morris water maze and social recognition tests. These findings suggest that partial striatal dopaminergic degeneration and parallel dopaminergic, noradrenergic and serotonergic alterations in striatum and prefrontal cortex may have caused the emotional and cognitive deficits observed in this rat model of early phase Parkinson#s disease. Recent evidence in animal models suggests that the blockade of cannabinoid CB1 receptors might alleviate motor dysfunction typical of Parkinson's disease. Therefore, we investigated whether antagonism of CB1 receptors would improve emotional and cognitive deficits in the rat model of pre-motor Parkinson#s disease induced by an intrastriatal injection of 6-hydroxydopamine. Our results showed that immobility time was reduced by acute 3 mg/kg SR141716A, while 0.5 and 1 mg/kg doses were not effective. Three weeks after surgery, a 6-XI hydroxydopamine-induced increase in investigation time in social recognition test was improved by low doses of SR141716A. High-Performance Liquid Chromatography analysis demonstrated alterations in striatal dopamine as well as noradrenaline and serotonin in prefrontal cortex after SR141716A injection. These findings suggest a role for CB1 receptors in the early symptoms caused by degeneration of dopaminergic neurons in striatum, as observed in Parkinson#s disease.