Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2012-07-16T20:33:02Z No. of bitstreams: 1 Diêgo Madureira Atividade quimipssensibilizante....pdf: 8949330 bytes, checksum: a1fc3a89cc9967d30970ad432a1039b4 (MD5) / Made available in DSpace on 2012-07-16T20:33:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Diêgo Madureira Atividade quimipssensibilizante....pdf: 8949330 bytes, checksum: a1fc3a89cc9967d30970ad432a1039b4 (MD5) Previous issue date: 2012 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, Bahia, Brasil / O câncer é uma das principais causas de morte e apresenta importantes índices de morbidade em todo o mundo. Gliomas são os tumores primários malignos mais comuns e letais em adultos, e embora sejam estudados já há muito tempo, os avanços tecnológicos não se traduziram em ganhos terapêuticos reais, de forma que a sobrevida dos pacientes com esse diagnóstico continua muito baixa. Dessa forma, a pesquisa de novas formas de terapia e fármacos se apresenta como uma necessidade para a implementação de um tratamento realmente eficaz. As glutation S-transferases (GST) são enzimas multifuncionais que atuam na detoxificação celular por catalisarem a conjugação de compostos exógenos com o tripeptídeo glutation (GSH). Como esta reação também pode ocorrer com moléculas de agente terapêuticos, a expressão destas enzimas, principalmente a isoforma π, está relacionada com aquisição de resistência à quimioterapia no câncer, tornando-a um alvo na busca por novos fármacos. No presente trabalho, o 8-metoxipsoraleno (8-MOP), um derivado do psoraleno de uso clínico rotineiro no tratamento de doenças da pele, é apresentado como possível promissor agente antineoplásico por demonstrar atividade inibitória da GST-π e antiproliferativa em um modelo in vitro de glioma. O estudo adotou uma abordagem que associa técnicas químicas, bioquímicas e celulares. Análises de cinética enzimática foram feitas utilizando-se o GSH e o cloro 2,4-dinitrobenzeno (CDNB) como substratos e o conteúdo de GSH intracelular foi visualizado por coloração com monoclorobimano (MCB). As técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência e espetrofotometria auxiliaram no estabelecimento dos detalhes do mecanismo de ação. Para a avaliação da atividade antitumoral, células de glioma murino (C6) e humano (GL-15) foram usadas, além de astrócitos de rato como controle de células normais. A ação do 8-MOP na viabilidade, proliferação, migração, expressão de proteínas, morfologia e tipo de morte celular foi avaliada através de variadas técnicas. O composto inibiu competitivamente (aumentou Km sem alterar Vmax) a atividade enzimática, ligando-se ao sítio H da enzima. O 8-MOP agiu como quimiossensibilizante, potencializando o efeito de fármacos como etoposídeo e temozolomida em células tumorais. Além disso, reduziu a proliferação celular de forma tempo- e concentração-dependente, e induziu alterações morfológicas e apoptose quando em altas concentrações. Não foi observada morte celular por necrose. As células normais não foram afetadas nas mesmas proporções das tumorais. Adicionalmente, derivados cumarínicos estruturalmente relacionados ao 8-MOP apresentaram atividade similar, ou mesmo superior, à deste. Assim, o 8-MOP apresenta-se como um protótipo para novo agente para o tratamento, não apenas de glioma, mas do câncer de uma forma geral, podendo ainda ser útil no tratamento de outras doenças com falhas terapêuticas ligadas à GST. / Cancer is an important cause of mortality around the world. Gliomas are the most common and lethal primary malignant brain tumors, and have been studied for a long time. Nevertheless, the impact of technological advances on clinical outcome has not been satisfactory, and the available drugs are not able to provide significant increase on the survival of patients. Then, researches to find new therapeutic approaches, treatments and drugs are necessary. The Glutathione S-transferases (GSTs) are multifunctional enzymes which play a key role in cellular detoxification. Due to its ability to promote conjugation between drugs and the tripeptide glutathione (GSH), its expression is related to drug resistance, specially the isoform π (GSTP1-1), that plays a crucial role in cancer chemoprevention and chemoresistance and is a key target for anticancer drug development. In this work we presented, for the first time, the 8-methoxypsoralen (8-MOP), a psoralen derivative clinically used in skin diseases treatment, as a novel promising antitumor drug for acting as GST-π inhibitor and anti-proliferative agent. The approach was the association of chemical, biochemical and cellular techniques. Enzymatic kinetic analysis were performed in vitro using GSH and chloro-dinitrobenzene (CDNB) as substrates and cellular content of GSH was visualized by monochlorobimane (MCB) staining. Chromatographic and spectrophotometric techniques were used for elucidation of detailed mechanism of action. In order to investigate antitumor activity, rat glioma C6 cells and human glioblastoma GL-15 cells were used in tests, as well as rat astrocytes for comparison. The action of 8-MOP on cell viability, proliferation, migration, morphology, specific protein expression, and type of cell death was evaluated by several techniques. The drug inhibited dose-dependently and competitively (increased Km but did not change Vmax) the enzyme activity, binding to the H-site of GST-π. 8-MOP acted as chemosensitizer, increasing the effect of the drugs etoposide and temozolomide on tumor cells. Also, this drug reduced tumor cell proliferation in vitro time- and dose-dependently, and induced apoptosis and changes on cell morphology when used at high concentrations. No necrosis was observed. The normal astrocytes were not affected to the extent that tumor cells were. Additionally, coumarin derivatives structurally related to 8-MOP presented similar, or stronger, effects. Therefore, the 8-MOP is a prototype for new chemosensitizer and anti-cancer drug design, and could also be useful for treatment of other diseases with failure of therapy related to GST.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, Florianópolis, 2016. / Made available in DSpace on 2016-12-20T03:10:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 343118.pdf: 1756477 bytes, checksum: a6edeb41446ef0ccc7254ddf8334858a (MD5) Previous issue date: 2016 / Os objetivos deste trabalho foram avaliar o efeito da pressão durante a etapa de prensagem do mosto e adição de glutationa na composição química de vinhos brancos e avaliar as principais características durante o armazenamento em garrafa. Sintetizar, identificar e elucidar a estrutura de compostos originados em reações de oxidação envolvendo ácidos hidroxicinâmicos e glutationa ou cisteinil-glicina, bem como desenvolver um método para quantificação simultânea desses compostos e seus precursores em vinhos elaborados com diferentes tratamentos de proteção da oxidação. Para avaliação do efeito de da prensagem do mosto e adição de glutationa em vinhos foram utilizadas as variedades Chardonnay, Sauvignon blanc, Manzoni e Garganega (V. vinífera) cultivadas em Videira, no Estado de Santa Catarina, Brasil. Diferentes frações do mosto foram obtidas em processo contínuo: sem aplicação de pressão (FR freerunjuice); pressão de 0,5 - 1,0 bar (prensagem intermediária) e aplicação de pressão de 1,0 - 2,0 bar (prensagem alta). A glutationa reduzida (GSH) foi adicionada aos vinhos antes do engarrafamento em concentração de 10 mgL-1. Foram avaliados os parâmetros enológicos clássicos, polifenóis totais, o-difenóis, flavanóis totais, atividade antioxidante in vitro e índice de escurecimento por espectrofotometria e compostos fenólicos individuais e concentração de glutationa total, reduzida e oxidada por cromatografia líquida de alta eficiência. Para síntese dos produtos de oxidação foi utilizado um sistema de solução modelo contendo ácido caftárico ou cafeico, glutationa ou cisteinil-glicina e extrato de enzima polifenol oxidase (PPO). Os produtos das reações foram primeiramente identificados por cromatografia líquida acoplada à espectrômetro de massas (UPLC-MS) e os principais compostos sintetizados foram estruturalmente elucidados por ressonância magnética nuclear (RMN). Para a validação e aplicação do método, foram utilizados vinhos brancos da variedade Chardonnay, o método de monitoramento de múltiplas reações (UPLC-MS-MS) foi validado e aplicado para a quantificação de produtos de oxidação e seus precursores em vinhos brancos com diferentes tratamentos de proteção da oxidação. Resultados obtidos neste estudo mostraram que as condições de prensagem dos mostos afetaram a composição química dos vinhos com os quais foram produzidos, levando à maior extração de compostos fenólicos, principalmente ácido caftárico, bem como maior concentração de glutationa. A adição de glutationa em vinhos antes do engarrafamento mostrou-se efetiva na proteção dos principais compostos de vinhos brancos (especialmente ácidos hidroxicinâmicos), prevenindo o escurecimento. Nas reações de síntese dos produtos de oxidação entre ácidos hidroxicinâmicos e glutationa ou cisteína-glicina, o 2-S-glutathionyl trans-caftaricacid, 2-S-glutathionyl trans-caffeicacid e 2-S-cysteinylglycyl trans-caftaricacid foram os principais produtos obtidos, porém espécies minoritárias foram estruturalmente elucidadas por experimentos de RMN: 2,5-di-S-glutathionyl trans-caftaricacid; 2-S-glutathionyl cis-caftaricacid; 5-S-glutathionyl trans-caftaricacid; 2,5-di-S-glutathionyl trans-caffeicacid; 5-S-glutathionyl trans-caffeicacid; 2-S-glutathionyl cis-caffeicacid; 6-S-glutathionyl trans-caffeicacid; 2-S-cysteinylglycyl cis-caftaric e 5-S-cysteinylglycyl trans-caftaric. O método de UPLC-MS-MS para a quantificação dos principais produtos de oxidação, ácidos hidroxicinâmicos e glutationa reduzida e oxidada foi desenvolvido e validado, em 26 minutos de corrida cromatográfica foi possível quantificar 13 compostos em vinhos brancos: 2-S-glutathionyl trans-caftaricacid, 2-S-glutathionyl trans-caffeicacid e 2-S-cysteinylglycyl trans-caftaricacid, ácidos caftárico (cis e trans), cafeico, cumárico, cutárico, cumárico glicosídeo (1 e 2), ferúlico glicosídeo, glutationa reduzida e glutationa oxidada. Entre os diferentes tratamentos de proteção de vinhos brancos avaliados, a adição de SO2 no momento da colheita e na prensa pneumática se mostrou o mais efetivo.<br> / Abstract : The aim of this work was to evaluate the effect of pression during the must pressing step in the white winemaking and the addition of glutathione to white wines and evaluate the main characteristics during bottle ageing. Synthesize, identify and elucidate the chemical structures of compounds originated in the oxidation reactions between hydroxycinnamic acids and glutathione or cysteinyl-glycine, as well to develop an analytical method to quantify these compounds and their precursors,simultaneously, in wines with different treatments against oxidation. To evaluate the effect of different pressings and glutathione addition in musts and wines Chardonnay, Sauvignon blanc, Manzoni and Garganega varieties (V. vinifera) cultivated in Videira, Santa Catarina State, Brazil were utilized. Different fractions of the musts were obtained in a continuos process: free run juice (no pression applied), light pressing (0.5 1.0 bar) and heavy pressing (1.0 2.0 bar). Reduced glutathione (GSH) was added into the wines before bottling in a concentration of 10 mgL-1. Oenological parameters, total polyphenols content, o-diphenols, total flavanols, antioxidant activity and browning index were evaluated by spectrophotometry and individual phenolic compounds and glutathione content were determined by high performance liquid chromatography. The oxidation adducts were synthesized utilizing a system of model solution containing caftaric or caffeic acid, glutathione or cysteine-glycine peptide and polyphenol oxidase enzyme (PPO). The reactions products were primarily identified by liquid chromatography coupled to mass spectrometry (UPLC-MS) and the main compounds synthesized were elucidated by nuclear magnetic resonance (NMR). For the method validation and application, white wines from Chardonnay variety were used, the multiple reactions monitoring method (UPLC-MS-MS) was validated and applied to quantify the oxidation adducts and their precursors in white wines elaborated with different treatments of protection against oxidation. The results obtained in this study showed that the pressing conditions of the must affected the chemical composition of the correspondent wines, leading to the higher extraction of phenolic compounds, especially caftaric acid, as well higher glutathione content. The glutathione addition in wines before bottling showed to have a protective effect on the main compounds of white wines, especially hydroxycinnamic acids, preventing the wine browning. In the synthesis reactions de oxidation products: 2-S-glutathionyl trans-caftaric acid, 2-S-glutathionyl trans-caffeic acid e 2-S-cysteinylglycyl trans-caftaric acidwere the main compounds originated, however minor species were elucidated by NMR experiments: 2,5-di-S-glutathionyl trans-caftaric acid; 2-S-glutathionyl cis-caftaric acid; 5-S-glutathionyl trans-caftaric acid; 2,5-di-S-glutathionyl trans-caffeic acid; 5-S-glutathionyl trans-caffeic acid; 2-S-glutathionyl cis-caffeic acid; 6-S-glutathionyl trans-caffeic acid; 2-S-cysteinylglycyl cis-caftaric e 5-S-cysteinylglycyl trans-caftaric.The UPLC-MS-MS method for the quantification of the main oxidation products and their precursors in wines was developed and validated, in 26 minutes of chromatographic run it was possible to quantify 13 compounds in white wines: 2-S-glutathionyl trans-caftaric acid, 2-S-glutathionyl trans-caffeic acid e 2-S-cysteinylglycyl trans-caftaric acid, caftaric acid (cis and trans),caffeic, coumaric and coutaric acids, coumaricglucoside (1 and 2), ferulicglucoside, reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSG). Among the treatments to protect white wines against oxidation evaluated, the SO2 addition at the moment of harvest and in the pneumatic press showed to be the more efficient.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pos-Graduação em Biotecnologia. / Made available in DSpace on 2012-10-21T18:22:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 205423.pdf: 909840 bytes, checksum: caed38f919c6375ba37640963988843d (MD5) / A zona costeira brasileira possui vários ecossistemas extremamente produtivos, mas com grande sensibilidade e susceptibilidade à degradação ambiental. O aumento do aporte antrópico causado principalmente pela crescente concentração populacional e sistemas deficientes de tratamento de efluentes, tem impactado estes ambientes. Os contaminantes podem provocar uma série de distúrbios metabólicos aos organismos e causar uma diminuição dos estoques pesqueiros, da qualidade dos recursos vivos, podendo alterar a cadeia trófica dos oceanos. O Conselho Internacional para a Exploração do Mar (ICES) tem recomendado que programas de monitoramento do ambiente marinho passem a utilizar metodologias

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-graduação em Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2012-10-22T06:58:07Z (GMT). No. of bitstreams: 0 / A leucemia linfoblástica aguda (LLA) é uma desordem maligna resultante da proliferação clonal de células progenitoras linfóides de linhagem T ou B. Conforme os protocolos de tratamento multicentro Berlin-Frankfurt-Münster (BFM), em torno de 80% das crianças diagnosticadas com LLA entram em remissão completa. No entanto, o tratamento de pacientes adultos com LLA, tem demonstrado modestas melhorias nas últimas duas décadas, devido à resistência apresentada pelos linfoblastos leucêmicos à quimioterapia, o que resulta na persistência à doença ou em recaída e, finalmente, causa a morte do paciente. Apenas 40% de pacientes adultos com leucemia linfoblástica aguda (LLA) entram em remissão completa com a terapia de indução hiper-CVAD (hiperciclofosfamida, vincristina, adriamicina, dexametasona). Vários estudos demonstraram que drogas antimicrotúbulos, que afetam a polimerização e despolimerização da tubulina, têm atividade citotóxica na LLA. Em trabalhos anteriores demonstramos que o taxol é citotóxico para células de linhagem linfoblástica leucêmica de origem humana (CEM) e murina (L-1210). Sendo assim, o objetivo do presente estudo foi investigar o envolvimento da atividade do NF-kB e dos níveis de glutationa na resistência à apoptose induzida por compostos antimicrotúbulos, taxol e vincristina, e comparar a depleção dos níveis de GSH com a atividade da bomba de efluxo MRP, em células de linhagem de leucemia linfoblástica aguda humana. Os resultados demonstraram que tanto o taxol como a vincristina induziram a apoptose de maneira concentração-dependente em células CEM, porém, o taxol foi mais citotóxico do que a vincristina. Além disso, apenas o taxol depletou os níveis de GSH de maneira significante e inibiu a atividade do NF-kB, mesmo quando em associação com a ciclofosfamida. Esses resultados sugerem que o efeito citotóxico do taxol nas células CEM é mais eficaz do que o da vincristina pois, além de ter diminuído os níveis de glutationa intracelular, inibiu a atividade da MRP e impediu o restabelecimento dos níveis normais de GSH, através da inibição da atividade do NF-kB.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia. / Made available in DSpace on 2012-10-19T21:39:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0Bitstream added on 2014-09-26T02:47:48Z : No. of bitstreams: 1 184426.pdf: 19410415 bytes, checksum: 65707fa98d106af5611cc55c8828e6b5 (MD5) / Este trabalho avaliou os efeitos das vitaminas E e C na supersensibilidade dopaminérgica induzida por haloperidol, um modelo animal de discinesia tardia. Os resultados mostram que a vitamina E atenuou os parâmetros comportamentais indicativos de supersensibilidade, enquanto a vitamina C potencializou o efeito do neuroléptico, porém a administração concomitante destas vitaminas atenuou os parâmetros que caracterizam o fenômeno. A avaliação das enzimas catalase, superóxido dismutase, e glutationa peroxidase, e ainda da glutationa total, da glutationa oxidada, bem como a razão destas, não foi alterada pelos tratamentos com haloperidol ou com as vitaminas empregadas no presente estudo.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Oxidative stress may be initiated by a decline in the antioxidant defence system or by an overproduction of free radicals leading to an imbalance between oxidants and antioxidants. The most significant alteration in the antioxidant defence is a decrease in reduced glutathione (GSH) concentration. GSH depletion is linked to a number of disease states; including cancer, neurodegenerative and cardiovascular diseases. GSH is the main nonprotein thiol involved in the antioxidant cellular defence against xenobiotics and naturally occurring deleterious compounds, such as free radicals and hydroperoxides. GSH not only protects cell membranes from oxidative damage, but also helps to maintain the sulphydryl groups of many proteins in the reduced form, a requeriment for their normal function. Free radicals induce lipid peroxidation that plays important roles in the pathological process of many diseases such cardiovascular diseases. Given the role of GSH in the protection against oxidative stress and detoxification of xenobiotics, its availability in the reduced form may be a key factor in the maintenance of health. Therefore, its determination in human erythrocytes is necessary. Metodologies for measuring GSH in human biological samples and their feasibility as routine methods in the clinical chemistry laboratory are important. The high-performance liquid chromatography (HPLC) became recently the method of choice for measuring GSH, because it is rapid, highly specific, sensitive and reproducible. Recent reports describe the use of HPLC with fluorescence detection of derivatives or electrochemical detection of the sulphydryl groups, however these detectores are not as widely available as ultraviolet-visible models. For the HPLC analysis of blood samples, the removal of proteins is the most important cleanup step. In this study, a method was optimized and validated to determine the human erythrocyte GSH by HPLC, gradient elution, with ultraviolet detection, wavelength 330 nm. The separation was performed on a C18 column integrated with guard-column, at 39°C. Pre-column derivatization was performed with 5, 5´-dithio-bis (2-nitrobenzoic) acid (DTNB), Ellman´s reagent. The erythrocytes were separed, hemolized and deproteinized with 15% trichloroacetic acid before the derivatization. The analytical parameters were evaluated: linearity, selectivity, precision, accuracy, limit of detection, limit of quantification, robustness, recovery and stability. The optimized method was applied in healthy human (control group) and patients receiving hemodialysis treatment. The assay was linear from 0.5 to 3.0 mM. The relative standard deviation for intra- and inter-day precision was lower than 10% with accuracy (%bias) was within ± 10% for the three GSH concentrations. The average recovery of GSH from erythrocytes was over 94%. The limit of detection was 0.0024 mM and the limit of quantification was 0.0081 mM. Derivatized samples with DTNB showed good stability for a month at 20°C. The method was evaluated in blood samples from healthy subjects and hemodialyzed patients. Erythrocyte GSH levels of patients were significantly (p<0.05) increased when compared with control group. Many patients received vitamin supplementation, 70% and erythropoietin, 75%. The healthy subjects showed GSH levels similar to previous reports. The results demonstrated that the optimized method is linear, reproducible, provided low limit of detection and quantification, and is feasible. / O estresse oxidativo pode ser iniciado pela diminuição do sistema de defesa antioxidante ou por uma produção excessiva de radicais livres, um desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes. A alteração mais significativa nas defesas antioxi-dantes é a diminuição na concentração da glutationa reduzida (GSH). A depleção da GSH está relacionada a estados patológicos; incluindo câncer, doenças neurodegenerativas e cardiovasculares. É o principal tiol não protéico envolvido na defesa antioxidante contra produtos de biotransformação de xenobióticos e compostos deletérios formados naturalmente, como os radicais livres e hidroperóxidos. A glutationa não só protege as membranas celulares do dano oxidativo, mas também ajuda a manter os grupos sulfidrílicos de muitas proteínas na forma reduzida, mantendo sua função normal. Os radicais livres induzem a peroxidação lipídica que ocupa importante função nos processos patológicos de muitas doenças como as doenças cardiovasculares. Devido a importante função da GSH na proteção contra o estresse oxidativo e detoxificação de xenobióticos, sua disponibilidade na forma reduzida pode ser um fator essencial para a manutenção da saúde. Conseqüentemente, sua determinação em eritrócitos humanos é necessária. Assim, metodologias para a medida da GSH em amostras biológicas e sua exeqüibilidade como método de rotina em laboratórios de análises clínicas são fundamentais. A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tornou-se, recen-temente, o método de escolha para a medida de GSH porque é rápido, altamente seletivo, sensível e reprodutível. Relatos recentes descrevem o uso da CLAE com detecção por fluorescência de derivados ou detecção eletroquímica de grupos sulfidrílicos, no entanto, estes detectores não são largamente utilizados como os modelos de ultravioleta-visível. Para a análise de amostras sangüíneas por CLAE, a remoção de proteínas é a etapa de cleanup mais importante. Neste estudo, um método foi otimizado e validado para determinar GSH em eritrócitos humanos por CLAE, eluição por gradiente, detecção ultravioleta, comprimento de onda 330 nm. A separação foi realizada em uma coluna C18 integrada a uma coluna guarda, a 39ºC. A derivação pré-coluna foi realizada com ácido 5,5´ditio-bis (2-nitrobenzóico) (DTNB), reagente de Ellman. Os eritrócitos foram separados, hemolisados e desproteinizados com ácido tricloroacético 15% antes da derivação. Os parâmetros analíticos avaliados foram: linearidade, seletividade, precisão, exatidão, recuperação, limite de detecção, limite de quantificação, robustez e estabilidade. O método otimizado foi aplicado em amostras de sangue de indivíduos sadios (grupo controle) e de pacientes submetidos ao tratamento de hemodiálise. A análise foi linear de 0,5 a 3,0 mM. O desvio padrão relativo para a precisão intra- e inter-dia foi menor que 10% com exatidão (bias%) menor que ± 10% para as concentrações 0,5; 1,5 e 3,0 mM. A recuperação média de GSH em eritrócitos foi acima de 94%. O limite de detecção foi de 0,0024 mM e o limite de quantificação foi de 0,0081 mM. As amostras derivadas com DTNB mostraram boa estabilidade por um mês a 20°C. Os indivíduos saudáveis mostraram níveis de GSH semelhantes aos obtidos em trabalhos prévios. Os níveis eritrocitários de GSH dos pacientes foram significativamente aumentados (p<0,05) quando comparados com os do grupo controle. Muitos dos pacientes receberam suplementação vitamínica do complexo B, 70% e eritropoietina, 75%. Os resultados demonstraram que o método otimizado é linear, reprodutível, apresenta baixo limite de detecção e quantificação e é exeqüível.

Orientador: Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez / Banca: Patrícia Caetano de Souza / Banca: Luiz Henrique Florindo / Resumo: A Glutationa (GSH) é um tripeptídeo presente nas células, que em sua forma reduzida age como antioxidante, mantendo os grupamentos tiólicos nas proteínas em estado reduzido. Ao exercer função protetora, a glutationa é oxidada para sua forma dissulfeto, expondo quatro cargas negativas. A glutationa oxidada (GSSG) poderia interagir não covalentemente com moléculas capazes de ligar ânions, como a hemoglobina. Essa condição nos levou a investigar as possíveis mudanças estruturais e funcionais das hemoglobinas bovina, humana e majoritária do peixe matrinxã (Brycon cephalus) quando interagem alostericamente com a glutationa. As amostras de sangue bovina e humana foram purificadas e submetidas à eletroforese para verificação de pureza. As propriedades de ligação com oxigênio e controle alostérico foram analisados por tonometria a 20°C, calculando a afinidade de ligação com o O2 e a cooperatividade (n50). As condições experimentais adotadas foram, stripped, cloreto e glutationa oxidada (GSSG), nessas condições, as hemoglobinas bovina e humana apresentaram efeito Bohr alcalino. O cloreto induziu o maior efeito de diminuição da afinidade em praticamente todas as condições. As hemoglobinas apresentaram processo cooperativo de ligação de oxigênio, em todas as condições e em toda faixa de pH. No caso da hemoglobina bovina adulta, a GSSG aumentou a afinidade por O2, em toda a faixa de pH testada, enquanto para a humana isso ocorreu abaixo de pH 7,0. O cloreto capaz de diminuir a afinidade de forma efetiva em todas as condições. A hemoglobina bovina apresentou uma menor afinidade de ligação ao oxigênio em relação à hemoglobina humana. A glutationa oxidada atuou como efetor alostérico heterotrópico em hemoglobinas humana, bovina e matrinxã (Hb-II), aumentando a afinidade de ligação por oxigênio da hemoglobina. Entretanto, a glutationa na forma reduzida... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Glutathione (GSH) is an intracellular tripeptide, which in its reduced form acts as an antioxidant, keeping the cysteines in the reduced state. When exerting protective function, glutathione is oxidized to form its disulfide, exposing four negative charges. The oxidized glutathione (GSSG) could interact with molecules covalently able to bind anions, such as hemoglobin. That motivated us to investigate the possible structural and functional changes of bovine, human and a fish hemoglobin from the fish 'matrinxã' (Brycon cephalus) when they interact allosterically with glutathione. Samples of human and cattle blood were purified and subject to electrophoresis to verify their purity. The functional properties of oxygen binding and allosteric control were analyzed by the tonometric method at 20°C, calculating the affinity of O2-binding and cooperativity (n50). The tested experimental conditions involved hemoglobin in the absence (stripped) and in the presence of chloride and oxidized glutathione (GSSG). Under those circumstances, the human and bovine hemoglobins displayed an alkaline Bohr effect. Chloride induced the greatest effect of reducing affinity in all conditions. For all the experimental sets oxygen binding was cooperative. For bovine adult hemoglobin GSSG increased O2-affinity for all the tested pH values, whereas it occurred for human Hb for pH values above 7.0. Bovine Hb displayed lower O2-affinity than its human counterpart. Oxidized glutahione acted as a heterotropic allosteric effector in all the tested hemoglobins, increasing O2-affinity. However, GSH decreased O2-affinity of human and bovine Hbs. We assume that there is a binding site for GSSG at the R state, increasing O2-affinity, and another one for GSH at the T state, stabilizing its conformation and therefore lowering O2-affinity. / Mestre

Submitted by Renan Diego Zanetti null (zanetti.renand@gmail.com) on 2018-03-15T19:56:51Z No. of bitstreams: 1 Dissertação de Mestrado - Renan D. Zanetti.pdf: 6852623 bytes, checksum: 616ddb67ad5aaf92721c83e1abc0078f (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Carolina Gonçalves Bet null (abet@iq.unesp.br) on 2018-03-20T12:40:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 zanetti_rd_me_araiq_int.pdf: 6456659 bytes, checksum: dd18737c07ff01894050e9c82783c957 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-20T12:40:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 zanetti_rd_me_araiq_int.pdf: 6456659 bytes, checksum: dd18737c07ff01894050e9c82783c957 (MD5) Previous issue date: 2018-02-27 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O câncer é, atualmente, uma das principais causas de morte no mundo. Além disto, tem-se observado crescente resistência celular à forma de tratamento utilizando radioterapia com uso de drogas. O sistema enzimático glutationa S transferases (GSTs), um dos responsáveis por essa resistência, catalisa a conjugação da glutationa com a cisplatina, que é um dos fármacos mais aplicados na terapia do câncer, restringindo sua ação. Neste contexto, foi proposto a utilização de dinitrosilos de ferro (DNIC – dinitrosyl iron complex) [(Fe(NO)2Ligante] como alternativa para diminuição da resistência celular à agentes antineoplásicos. DNICs são geralmente formados em células expostas a óxido nítrico (NO) e ligam-se às enzimas da família GST inibindo seu efeito contra drogas anticâncer. Assim, propôs-se desenvolver complexos do tipo [Fe(NO)2X] (X = tiossemicarbazona), em que X seria um ligante com potencial atividade antineoplásica. Estes ligantes seriam facilmente substituídos por grupos da cadeia lateral de aminoácidos da GSTs, proporcionando um possível sinergismo de inibição da enzima e liberação de agentes antineoplásicos. As tiossemicarbazonas foram sintetizadas a partir de cinamaldeído e tiossemicarbazidas correspondentes em meio etanólico e caracterizados por espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IV), UV-Vis, ressonância magnética nuclear (RMN) de ¹H e ¹³C, espectrometria de massas e análise elementar, assim como seus produtos de ciclização testados. Os complexos foram obtidos a partir do precursor [Fe(CO)2(NO)2], preparado previamente, e as tiossemicarbazonas, em tetrahidrofurano (THF) e caracterizados por espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IV) condutância molar e espectrometria de massas (MS). / Cancer is currently one of the leading causes of death in the world. In addition, increased cellular resistance to the form of treatment using radiation therapy with drug use has been observed. The enzymatic system glutathione S transferases (GSTs), one of the responsible for this resistance, catalyzes the conjugation of glutathione with cisplatin, which is one of the drugs most applied in cancer therapy, restricting its action. In this context, has been proposed the use of iron dinitrosyls (DNIC - dinitrosyl iron complex) [(Fe (NO ) 2 Ligand ] as an alternative to decrease the cellular resistance to antineopl astic agents. DNICs are generally formed in cells exposed to nitric oxide (NO) and bind to the enzymes of the GST f amily inhibiting their effect against anticancer drugs. Thus, it was proposed t o develop complexes of type [Fe(NO) 2 X] (X = thiosemicarbazone), where X would be a ligand with potential antineoplastic activity. These linkers would be readily substituted by GSTs amino acid side chain groups, providing a possible synergism of enzyme inhibition and release of antineoplastic agents. Thiosemicarbazones were synthesized from cinnamaldehyde and corresponding thiosemicarbazides in ethanolic medium and characterized by absorption spectroscopy in the infrared (IR), UV - Vis region, ¹H and ¹ ³C nuclear magnetic resonance (NMR), mass sp ectrometry and elemental analysis , as well as their tested cyclization products. The complexes were obtained from the pr eviously prepared precursor [Fe(CO) 2 (NO) 2 ] and the thiosemicarbazones, in tetrahydrofuran (THF) and characterized by absorption spectros copy in the infrared (IR) r egion molar conductance and mass spectrometry (MS). / 16/04329-5

Orientador: Ranulfo Monte Alegre / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-11T02:28:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Piedrahita-Aguirre_CesarAugusto_M.pdf: 332323 bytes, checksum: d9250bb3908b608666f8ee69b389ed24 (MD5) Previous issue date: 2008 / Resumo: A glutationa ou GSH (L-g-glutamil-L-cisteinilglicina) é um tripeptídeo sintetizado através de consecutivas reações enzimáticas. O qual possui várias funções metabólicas nas células, sendo que a principal é antioxidante. Alterações na concentração deste tripeptídeo têm sido observadas em pacientes com doenças, tais como, intoxicações com metais pesados, diabetes, processos inflamatórios no pulmão, doenças coronarianas, câncer e estados de imunodeficiência. É utilizada nas indústrias farmacêutica, de cosméticos e de alimentos. Os métodos químicos e enzimáticos de produção possuem várias desvantagens, desta forma a produção industrial é feita por fermentação, sendo utilizados principalmente as leveduras. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi estudar a composição do meio de cultura para produção de glutationa por Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 em frascos Erlenmeyer utilizando fontes alternativas mais econômicas e produtivas de carbono, nitrogênio e aminoácidos. Para se estudar a influência das variáveis concentrações de glicose, água de maceração de milho, extrato de levedura, lecitina e proteína de soro de leite, empregou-se um planejamento fatorial fracionado (25-1) totalizando 19 experimentos. Os ensaios foram realizados com pH inicial 5,0, temperatura 20°C, agitação 300 rpm e tempo de fermentação de 96 h. O melhor rendimento equivalente a 264,49 mg GSH/L foi obtido em 96h de fermentação, com um meio contendo 54 g/L de glicose, 50 g/L água de maceração de milho, 50g/L extrato de levedura, 6 mM de lecitina e 50 g/L de proteína de soro. Após verificar-se que nenhuma variável era estatisticamente significativa e, devido aos custos do extrato de levedura, empregou-se outros dois planejamentos Plackett-Burman 12 (PB-12) seqüenciais. No primeiro adicionou-se a variável MgSO4 e analisou-se os efeitos da composição do meio na concentração celular, obtendo-se na melhor condição uma concentração celular de 23,33 g/L e um rendimento de 278,42 mg/L de GSH com concentração de 90 g/L de glicose, 50 g/L de água de maceração de milho, 10 g/L de extrato de levedura, 5 mM de lecitina, 50 g/L de proteína de soro de leite e 10 g/L de MgSO4. Para o segundo planejamento PB-12 decidiu-se observar os efeitos das variáveis nos níveis experimentais mais baixos e fixou-se à proteína de soro de leite em 30 g/L, atingindo-se produção de 166,84 mg/L de GSH e 18,75 g/L de biomassa com meio de composição de 60 g/L de glicose, 30 g/L de água de maceração de milho, 4 g/L extrato de levedura, 0,5 mM de lecitina e 2 g/L de MgSO4. Nas condições deste trabalho, não se otimizou o meio de fermentação mas atingiu-se o objetivo de obter boa quantidade de GSH com o meio fermentativo de baixo custo / Abstract: Glutathione or GSH (Lg-glutamyl-L-cisteinilglicina) is a tripeptide synthesized through consecutive enzymatic reactions. Besides being a main antioxidant, it has several other metabolic functions. Changes in its concentration have been observed in patients who suffered from poisoning with heavy metals, diabetes, inflammatory processes in the lung, coronary diseases, cancer and states of immunodeficiency. It is used in the pharmaceutical, cosmetic and food industry. Chemical and enzymatic production methods have several disadvantages, thus standard industrial production is done by means of fermentation by yeast. The objective of this work was to study the composition of a low cost culture medium for the production of glutathione by Saccharomyces cerevisiae ATCC 7754 in bottles Erlenmeyer flask using alternative, more efficient sources of carbon, nitrogen and amino acids. To study the influence of variables such as glucose, water, corn steep liquor extract, yeast, lecithin and of whey protein, a fractional factorial design (25-1) was used is used totaling 19 experiments. The tests were performed at pH 5.0, 20°C, 300 rpm stirring and 96 h of fermentatio n. The higher yield equivalent to 264.49 GSH mg/L was obtained in 96 hours of fermentation, with a medium containing 54 g/L glucose, 50 g/L of water maceration of maize, 50 g/L yeast extract, 6 mM lecithin and 50 g/L whey protein. Based on the results it was verified that no variable was statistically significant and because of the cost of yeast extract, two other Plackett-Burman 12 (PB-12) sequential, plans were use to a the first plan, the variable MgSO4 was added and the effects of the composition of the medium concentration in the cell, were verified. As a result an optimed condition could be conclued being a cell concentration of 23.33 g/L and an feed of 278.42 mg/L of GSH with concentration of 90 g/L glucose, 50 g/L of water maceration of maize, 10 g/L yeast extract-, 5 mM lecithin, 50 g/L of whey protein and 10 g/L of MgSO4. For the second PB-12 planning it was decided to observe the effects of experimental variables in the lower levels and fix the concentration of whey protein, 30 g/L, reaching a production of GSH of up to 166.84 mg/L and 18.75 g/L of biomass with a composition of 60 g/L glucose, 30 g/L of water maceration of corn, 4 g/L yeast extract, 0.5 mM lecithin and 2 g/L of MgSO4. The medium could not be optimized but the objetive to obtain a reasonable amount of GSH utilizing a low cost culture medium was obtained. / Mestrado / Mestre em Engenharia de Alimentos

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / FundaÃÃo Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Cientifico e TecnolÃgico / O (-)-a-bisabolol, um Ãlcool sesquiterpenico comumente obtido de Matricaria chamomilla e de espÃcies do gÃnero Vanillosmopsis, foi testado em modelos animais padronizado de nocicepÃÃo, inflamaÃÃo e Ãlcera gÃstrica em camundongos. Nestes ensaios, o (-)-a-bisabolol foi utilizado nas doses de 25 e 50 mg/Kg nos modelos de nocicepÃÃo e 100 e 200 mg/Kg nos modelos de inflamaÃÃo e Ãlceras gÃstricas, administrados por via oral. O (-)-a-bisabolol demonstrou possuir atividade antinociceptiva nos modelos de nocicepÃÃo visceral induzida por Ãcido acÃtico intraperitoneal e na segunda fase do teste de nocicepÃÃo induzida pela injeÃÃo intraplantar de formalina. O (-)-a-bisabolol nÃo demonstrou atividade no modelo de nocicepÃÃo tÃrmica da placa quente. Esses achados sugerem que a aÃÃo antinociceptiva do (-)- a-bisabolol nÃo està ligada a mecanismos centrais e deve estar relacionada com o processo inflamatÃrio. Nos modelos de edema de pata induzidos por carragenina e dextrano os animais tratados com (-)-a-bisabolol exibiram edemas menores em comparaÃÃo com os animais tratados apenas com veÃculo. (-)-a-bisabolol foi capaz de diminuir os edemas de pata induzidos por 5-HT, mas nÃo os edemas induzidos por histamina, assim, pode-se relacionar a atividade anti-inflamatÃria do (-)-a-bisabolol a sua interferÃncia na aÃÃo/liberaÃÃo ou na sÃntese/metabolismo da 5-HT. O (-)-a-bisabolol mostrou ter atividade gastroprotetoras frente Ãs lesÃes gÃstricas induzidas por etanol absoluto ou indometacina. O mecanismo dessa aÃÃo foi testado farmacologicamente, realizando prÃ-tratamentos com L-NAME, Glibenclamida e Indometacina. Estes experimentos demonstraram que a aÃÃo gastroprotetora do (-)-a- bisabolol parece nÃo envolver o Ãxido nÃtrico, os canais de potÃssio ATP-dependentes ou a sÃntese de prostaglandinas. Por outro lado, a quantificaÃÃo de GSH nos tecidos gÃstricos dos animais nÃo lesionados e lesionados por etanol ou indometacina mostraram que o tratamento com (-)-a-bisabolol atenua o decrÃscimo de GSH associado as lesÃes pelos agentes lesivos, mas nÃo aumenta a sua quantidade nos estÃmagos dos animais nÃo tratados com etanol ou indometacina. Dessa forma o (-)-a-bisabolol aumenta a disponibilidade de GSH no tecido gÃstrico, possuindo aÃÃo antioxidante in vivo, o que nos permite associar esse achado a sua aÃÃo gastroprotetora. / (-)-a-bisabolol, a sesquiterpenic Ãlcool, is commonly obtained from Matricaria chamomilla and from species of Vanillosmopsis, it was tested in animal standardized models of nociception, inflamation and gastric ulcer in mice. In this assays, (-)-a-bisabolol was used in the doses of 25 and 50 mg/Kg in the models of nociception and 100 and 200 mg/Kg in the models of inflamatiom and gastric ulcers, administered by via oral. (-)-a-bisabolol demonstrated to have an antinociceptive activity in the models of visceral nociception induced by intraperitoneal acetic acid and in the second phase of the test nociception was induced by intraplantar administration of formaline. (-)-a-bisabolol did not demonstrate activity in the thermal nociception model of hot plate. These findings suggests that the antinociceptive action of (-)-a-bisabolol is not linked to central mechanisms and may be related with pre inflamatory process. In the models of paw oedema induced by carragenine and dextran the animals treated with (-)-a-bisabolol showed smaller oedemas as compared to animals treated only with the vehicle. (-)-a-bisabolol was capable to reduce the paw oedemas induced by 5- HT, but not the oedema induced by histamine, so it could relate the antiinflamatory activity of (-)-a-bisabolol to the interference in the action/liberation or in the systesis/metabolism of 5- HT. (-)-a-bisabolol demostrated having gastroprotective activity in the absolute ethanol and indomethacin-induced gastric lesions. The mechanism of this action was pharmacologicaly tested, doing pre-treatments with L-NAME, Glibenclamide and Indomethacin. These experiments demonstrated that tha gastroprotective action of (-)-a-bisabolol seems not to be involved the nitric oxide, potassium channels ATP-dependents or the sysntesis of prostaglandines. By the way, the quantification of GSH in the gastric tissues of not lesioned animals e lesionated by ethanol or indomethacin showed that the treatment with (-)-a- bisabolol atenuate the decrease of GSH associated with the lesive agents, but it did not increase its levels in the animals that not recieve ethanol or indomethacin. This way (-)-a- bisabolol increase the disponibility of GSH in the gastric tissue, having in vivo antioxidant activity, that allows us to associate this finding to its gastroprotective action.