Submitted by Daniella Sodre (daniella.sodre@ufpe.br) on 2015-04-08T19:01:44Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Sheila Shrezaide Rocha Gondim.pdf: 876833 bytes, checksum: 0c5e8f448a15af195804324373750b28 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-04-08T19:01:44Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) TESE Sheila Shrezaide Rocha Gondim.pdf: 876833 bytes, checksum: 0c5e8f448a15af195804324373750b28 (MD5) Previous issue date: 2011-08-31 / CNPq / A carência nutricional mais amplamente distribuída no mundo é a deficiência de ferro, principal causa da anemia na infância, um importante problema de saúde pública com distribuição mundial, inclusive em países em desenvolvimento. Objetivo. Estimar a magnitude da anemia, analisar a tendência temporal, investigar os fatores associados e analisar a relação deste distúrbio com retinolemia e a desnutrição energético protéica. Método. Estudo de corte transversal, de base populacional e domiciliar, com amostra aleatória de 1108 crianças, de 6 a 59 meses de idade, ambos os sexos, distribuídas em nove municípios do Estado da Paraíba. A hemoglobina (Hb) foi analisada em sangue venoso com contador automático. A determinação do retinol sérico foi realizada em cromatografia líquida de alta resolução (HPLC). As condições sócio-econômicas e demográficas das crianças foram obtidas através de questionário. A tendência temporal da anemia foi avaliada pelo incremento/redução na prevalência de anemia, comparando as prevalências nos anos de 1982, 1992 e 2007. Na avaliação do estado nutricional energético-protéico foram utilizados peso e estatura pelos índices P/I, E/I e P/E em escores Z. As proporções foram comparadas pelo teste do qui-quadrado de Pearson e teste exato de Fisher. As associações foram testadas pelo modelo de regressão de Poisson. Resultados. A prevalência da anemia (Hb <11,0 g/dL) foi de 36,5% (IC95% 33,7 - 39,3). Houve um incremento de 88,5% nos casos de anemia entre os anos de 1982 a 1992 e uma estabilização na prevalência entre 1992 a 2007. A análise ajustada no modelo de Poisson demonstrou maior susceptibilidade à anemia nas crianças de 6 a 24 meses de idade, amamentadas por seis meses ou mais, que co-habitavam com mais de 08 pessoas no domicilio e moravam em casas com menos de 05 cômodos. Observou-se uma associação direta entre anemia e retinolemia inadequada, e entre anemia e desnutrição crônica. Conclusão. Os resultados revelaram que apesar da estabilização na prevalência da anemia, essa carência ainda é elevada no Estado da Paraíba. A associação deste distúrbio com a retinolemia e com o estado nutricional energético protéico sugere que ações simultâneas no combate a essas deficiências, possivelmente, ocasionará uma redução nos casos de anemia no contexto estudado.

Orientador: Maria de Fatima Sonati / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-12T21:21:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_MagnunNueldoNunesdos_M.pdf: 1780393 bytes, checksum: f42ac636ab51c50a200800b4e28c33c3 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O estresse oxidativo, particularmente no endotélio, exerce forte influência na gênese da vaso-oclusão e, assim, na evolução clínica e sobrevida de pacientes com Doenças Falciformes (DF). A fisiopatologia das DF está centralizada na propriedade de polimerização da desoxi-hemoglobina (Hb) S, mas fatores genéticos têm atuado como moduladores de suas complicações clínicas. A haptoglobina (Hp) é uma glicoproteína plasmática cuja função primordial é se ligar à Hb livre no plasma, impedindo a excreção renal de ferro e protegendo os vasos dos seus efeitos oxidativos. É ainda uma proteína de fase aguda positiva, com capacidade imunomodulatória. Dois alelos codominantes, HP1 e HP2, resultam em 3 genótipos/fenótipos principais, Hp1-1, Hp2-1 e Hp2-2, que correspondem a proteínas com características físico-químicas e funcionais distintas. Recentemente foi sugerido que o genótipo Hp2-2 tem sua freqüência diminuída com o aumento da idade de pacientes com DF e pode estar relacionado a um pior prognóstico. Experimentos in vitro têm demonstrado menor capacidade antioxidante e maior reatividade inflamatória relacionadas a esse fenótipo (Hp2-2). Assim, o objetivo do presente trabalho foi determinar, por PCR alelo-específica, os genótipos de Hp em 775 pacientes com DF (599 HbSS, 94 HbSC, 81 HbS/ß talassemia e 1 HbS/Deer Lodge), acompanhados no Hospital HEMOPE (Hemocentro de Pernambuco, região nordeste do Brasil) e subdivididos em 5 faixas etárias (de 3 meses a 5anos de idade - n = 237, de 6 a 10 anos- n = 96, de 11 a 15 anos - n = 89, de 16 a 20 anos - n = 95 e acima de 20 anos - n = 258). Os pacientes com idade superior a 20 anos foram ainda comparados a controles saudáveis (236 doadores de sangue da mesma região do país, ajustados para a proporção entre os sexos e pareados com os pacientes por idade e características étnicas predominantes); ambos os grupos foram também fracionados em faixas de 21 a 30 anos (140 pacientes e 111 controles) e superior a 30 anos de idade (118 pacientes e 125 controles). As distribuições das freqüências genotípicas de Hp não diferiram significativamente entre os cinco principais grupos de pacientes (p=0,7908), mesmo quando estes, adicionalmente, foram subdividos em faixas de idade de 3 meses a 16 anos (grupo pediátrico - n = 447) e superior a 16 anos (grupo adulto - n = 328) (p=0,7421). Quando os pacientes foram comparados ao grupo controle, as freqüências do genótipo Hp2-2 se mostraram inferiores (22,06% na média dos cinco grupos de pacientes - ou 22,48% no grupo V, versus 28,39% nos controles); nos pacientes com mais de 20 anos, ela sofreu redução com o aumento da idade, enquanto entre os controles se manteve estável (dado observado da comparação entre os subgrupos com idade de 21 a 30 anos - 25% de Hp2-2 nos pacientes versus 28,83% nos controles, e superior a 30 anos - 19,49% de Hp2-2 nos pacientes versus 28% nos controles). Estas diferenças, no entanto, não foram suficientes para que o nível de significância estatística fosse atingido (p = 0,6479 e 0,3780, respectivamente). Nossos resultados indicam uma redução nas freqüências do genótipo Hp2-2 dos pacientes em relação à população normal, intensificada com a progressão da idade a partir da vida adulta, mas também sugerem que as conseqüências eventualmente advindas de sua presença sejam, in vivo, minimizadas por mecanismos compensatórios inerentes aos organismos complexos. A casuística aqui analisada foi bastante expressiva, mas ainda não atingiu o tamanho amostral ideal para ser considerada representativa da população de pacientes com DF como um todo. Esses resultados se aplicam, então, exclusivamente ao grupo de pacientes ora estudado. Outras comparações efetuadas em busca da existência de interação entre o polimorfismo da Hp e os níveis de Hb Fetal, a presença de talassemia a (deleção -a3,7) e os haplótipos do cluster ß também não revelaram quaisquer dferenças significativas. / Abstract: Oxidative stress, particularly in the endothelium, exerts a strong influence on the genesis of sickle cell disease (SCD) vasoocclusion and, consequently, on patients' clinical evolution and survival. The pathophysiology of SCD is centered on the polymerization property of the desoxy-hemoglobin (Hb) S, but genetic factors can act as modulators of its clinical complications. Haptoglobin (Hp) is a plasma glycoprotein whose primary function is to bind to free hemoglobin, preventing excretion of iron by the kidneys and protecting blood vessels from its oxidative effects. It is also an acute phase positive protein with immunomodulatory capacity. Two codominant alleles, HP1 and HP2, result in 3 main genotypes / phenotypes, Hp1-1, Hp2-1 and Hp2-2, which correspond to proteins with different functional characteristics. Recently, it has been suggested that the Hp2-2 genotype frequency reduces with age in SCD patients and that this reduction may be associated with a worse prognosis. In vitro experiments have shown lower antioxidant capacity and higher inflammatory reactivity related to the phenotype (Hp2-2). Thus, the aim of this study was to determine, by allele-specific PCR, the Hp genotypes in 775 patients with SCD (599 HbSS, 94 HbSC, 81 HbS/ß-thalassemia and 1 HbS/ HbDeer Lodge), followed at HEMOPE (Pernambuco Blood Center, in the northeast region of Brazil), divided into 5 different age groups (3 months - 5 years - n=237, 6-10 years - n=96, 11-15 years - n=89, 16-20 years - n=95 and > 20 years - n=258). Those over 20 years of age were also compared with healthy controls (n=236, blood donors in the same country region, adjusted for the ratio between the gender and matched with patients by age and predominant ethnic characteristics); both groups were subdivided into 2 different age groups: 21 to 30 years (140 patients and 111 controls) and more than 30 years-old (118 patients and 125 controls). The distributions of Hp genotypic frequencies did not differ significantly among the five main groups of patients (p=0.7908), even when they, additionally, were divided into age groups from 3 months to 16 years (pediatric group - n= 447) and more than 16 years (adult group - n = 328) (p=0.7421). When the patients were compared to the control group, the frequencies of genotype Hp2-2 were lower (22.06% in means of five groups of patients - or 22.48% of group V versus 28.39% in controls); in patients over 20 years, this genotype was reduced with increased age, while it remained stable in controls (as seen from the comparison of the subgroups from 21 to 30 years of age - 25% of Hp2-2 in patients versus 28,83% in controls, and more than 30 years-old - 19.49% of Hp2-2 in patients versus 28% in controls). These differences, however, were not statistically significant (p = 0.6479 and 0.3780, respectively). Our results indicate a reduction in Hp2-2 genotype frequencies of patients, compared to the healthy controls, intensified with the progression of age from adulthood, but also suggest that the consequences resulting from their presence in vivo are probably minimized by compensatory mechanisms inherent in complex organisms. The population analyzed here was very expressive, but was not ideal to be considered as representative of SCD patients as a whole yet. These results apply only to the group of patients studied here. Other comparisons performed in search of the existence of interaction among the Hp polymorphism and Hb Fetal levels, a-thalassemia and cluster ß haplotypes also revealed no significant differences. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-09T01:16:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinho_FlaviaOliveira_M.pdf: 5027751 bytes, checksum: 898c2b8148658647ee62a31bdfe03263 (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: A AHSP é uma proteína que se liga à aHb, prevenindo a precipitação e a atividade pró-oxidante da mesma. Na presença de ßHb, o complexo protéico aHb-AHSP é desmembrado e a ßHb desloca a AHSP para formar a estrutura quartenária da hemoglobina. Em estudo com camundongos portadores de ß-talassemia com deleção do gene AHSP, foi demonstrado que estes camundongos apresentaram maior precipitação de aHb em seus eritrócitos e níveis acentuados de anemia. Adicionalmente, estudos in vitro, utilizando proteína recombinante, mostraram que quando as aHbs encontram-se estabilizadas pela AHSP, há menor produção de ROS em solução fisiológica. Desta forma, têm sido proposto que a AHSP talvez desempenhe um importante papel como modulador da gravidade clínica nas síndromes ß-talassêmicas. A relação entre a formação da hemoglobina e alterações na expressão do gene AHSP ainda é desconhecida em humanos. O estudo de tal relação molecular seria fundamental para que o papel da AHSP na eritropoese humana fosse melhor entendido, bem como embasaria futuros estudos sobre a gravidade clínica nas síndromes ß-talassêmicas em humanos. Diante disso, a relação entre a formação da hemoglobina e a diminuição da expressão do gene AHSP foi investigada neste estudo. Este trabalho teve como objetivos: induzir o silenciamento estável do gene AHSP em células humanas de linhagem eritróide, identificar possível precipitação de aHbs em células com redução na expressão do gene AHSP e investigar implicações no metabolismo celular decorrentes da diminuição significativa da expressão deste gene. Desta forma, células K562 foram transfectadas sem vetor, com vetor de expressão de short hairpin RNAs (shRNAs) para o gene AHSP e com vetor de expressão de shRNAs para uma seqüência de DNA controle não homóloga ao genoma humano através de eletroporação e de um reagente lipídico não lipossômico (Effectene®). Após a transfecção, as células passaram por um período de seleção com Neomicina. Terminado este período, o substrato Hemina foi acrescentado ao meio de cultura das células transfectadas e controle, para que a expressão de genes da linhagem eritróide fosse ativada. Amostras das culturas com Hemina foram coletadas e a expressão dos genes AHSP, a-globina, ?-globina e GATA-1 foi quantificada por real-time PCR. O silenciamento do gene AHSP, em ambos os processos de transfecção, foi significativo e acima de 70%, propiciando considerável precipitação de aHb evidenciada por imunofluorescência, bem como acentuada diminuição na produção de hemoglobina identificada através de citometria de fluxo. Além disso, por meio desta última metodologia, evidenciou-se que as células silenciadas para AHSP tiveram maior produção de ROS e maior porcentagem de marcação celular para Anexina e PI. Adicionalmente, a análise dos dados obtidos por real-time PCR demonstrou que não houve alteração significativa na expressão dos genes a-globina e ?-globina, e apenas GATA-1 apresentou expressão tardia significativa nas células silenciadas para AHSP. Finalmente, estes dados indicam que a expressão do AHSP está fortemente relacionada com a formação da hemoglobina e sugerem, pela primeira vez, que este gene codifica uma proteína de função crucial durante a eritropoese humana. Ainda, estes resultados reforçam a função da AHSP descrita previamente em modelos animais / Abstract: Alpha hemoglobin stabilizing protein (AHSP) is a chaperone protein that binds alpha hemoglobin chain (aHb), avoiding its precipitation and its pro-oxidant activity. In the presence of beta hemoglobin chain (ßHb), the aHb-AHSP complex is dismembered, ßHb displaces AHSP to generate the quaternary structure of hemoglobin. A study demonstrated that loss of AHSP exacerbates aHb precipitation and anemia in ß-thalassemic mice. Additionally, studies in vitro showed that recombinant AHSP inhibits the production of reactive oxygen species caused by aHb precipitation. Hence, it has been proposed that AHSP may perform an important role as a genetic modifier in ß-talassemia disease. The relationship between hemoglobin formation and alterations in AHSP expression has not yet been described in human cells. Studying this relationship would be strongly important for a better understanding of the AHSP role performed in human erythropoiesis, as well as would support future studies about the possibility of AHSP acts as a genetic modifier in human ß-thalassemia syndromes. Faced with the situation described above, we investigated the relationship between hemoglobin formation and reduction in AHSP expression. Our study aimed to induce the stable AHSP knockdown in erythroid human cells, identify possible aHb precipitation in cells with reduction of AHSP expression and analyze the cellular and molecular aspects resulted from AHSP knockdown in erythroid human cells. Hence, to address this goals short hairpin RNA (shRNA) expression vectors aimed at AHSP mRNA target sequence and at no-human mRNA target sequence were cloned and transfected into K562 cells using eletroporation and a non-liposomal lipid reagent. After transfection, K562 cells were cultured with neomycin which was added to select a population of cells that stably express the AHSP-shRNA. Then, K562 cells were induced to express erythroid genes by hemin addition in cell culture medium. Hemin-induced K562 cell samples were collected and AHSP, alpha-globin, gamma-globin and GATA-1 expressions were quantified by real-time PCR. The RNAi-mediated knockdown of AHSP expression was statistically significant above of 70% in both used ways for cell transfection. Further, AHSP knockdown resulted in a considerable alpha hemoglobin chain precipitation observed through immunofluorescence, as well as in a significant decrease of hemoglobin production identified through flow cytometry. Besides this, AHSP knockdown cells demonstrated an increased reactive oxygen species (ROS) production and were more positive for Annexin and Propidium Iodide (PI) than control cells in flow cytometry assays. Alpha-globin and gamma-globin expressions did not differ in control, negative and AHSP-shRNA cells. However, GATA-1 had late expression evaluated in hemin- induced AHSP-shRNA cells in relation to control and negative control cells. Finally, these data indicate that AHSP is strongly significant in hemoglobin formation and suggest that AHSP is a key chaperone protein during the human erythropoiesis. Moreover, these data strengthen the fact that AHSP stabilizes the alpha hemoglobin chain to avoid its precipitation and its ability to generate ROS which implicates in cell death as was previously described in a murine model and in vitro approaches / Mestrado / Medicina Experimental / Mestre em Fisiopatologia Médica

A hemoglobina de Glossoscolex paulistus (HbGp) é caracterizada por uma massa molecular de 3,6 MDa, alta estabilidade oligomérica, resistência a auto-oxidação, e alta afinidade em ligar oxigênio. A estrutura quaternária desta macromolécula apresenta 144 cadeias com grupo heme (globinas) e 36 cadeias sem grupo heme (linkers), dispostos em duas camadas hexagonais. No presente trabalho estudos de caracterização das subunidades da HbGp, bem como da estabilidade da HbGp em diferentes formas, em função do pH, e em diferentes concentrações de ureia, por diferentes técnicas biofísicas, foram realizados. Os estudos de caracterização por eletroforese SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS e ultracentrifugação analítica (AUC) das subunidades isoladas mostraram que apenas o monômero d obtido da cromatografia de exclusão por tamanho (SEC) tem alto grau de pureza. Para as demais frações mais de uma contribuição foi observada em solução. Assim, para a fração trimérica, duas espécies estão presentes em solução, a espécie predominante (87 %) é atribuída ao trímero abc e a outra espécie (13 %) pode ser associada ao complexo (abc + L). Os dados espectroscópicos e de AUC mostraram que a estabilidade da HbGp depende fortemente do estado de oxidação do heme, do ligante coordenado no centro metálico e da concentração de proteína. Assim, a forma oxidada, a meta-HbGp, mostrou-se menos estável em meio alcalino e na presença de ureia, seguida pelas formas oxi- e cianometa-HbGp. Desta forma, no pH 8,0, a meta-HbGp está totalmente dissociada em trímero abc e monômero d, enquanto a oxi-HbGp está apenas parcialmente dissociada com uma contribuição de 88 % de proteína íntegra em solução e a cianometa-HbGp não sofre dissociação oligomérica. Os valores de coeficiente de sedimentação s20,w e massa molecular (MM) determinados para as espécies em solução são similares aos observados para as correspondentes espécies isoladas por SEC. Na presença de ureia a mesma tendência foi observada para as três formas da HbGp. Porém, para uma caracterização melhor de processo de desnaturação, os dados espectroscópicos foram analisados usando modelos de dois e três estados para obter informações sobre os parâmetros termodinâmicos do sistema. Assim, bons ajustes foram obtidos usando ambos os modelos, no entanto, o modelo de três estados foi mais adequado para descrever o processo. Por este modelo o processo de desnaturação da HbGp pode ser descrito por duas etapas. A primeira etapa, na faixa de 1,0 - 3,0 mol/L de ureia, está associada a transição do estado nativo para o estado intermediário (N &rarr; I), e é caracterizada pela dissociação do oligômero nas diferentes subunidades da HbGp. O estado intermediário apresenta propriedades físico-químicas similares ao estado nativo, sugerindo que o processo de dissociação oligomérica não induz mudanças significativas na estrutura secundária e na região do grupo heme da proteína. Os parâmetros termodinâmicos associados à primeira transição apresentaram erros consideráveis, que podem ser atribuídos à complexidade do estado intermediário com diferentes espécies em solução bem como à semelhança ao estado nativo. A segunda etapa (I &rarr; U) com transição bem definida entre 4,5 - 5,0 mol/L de desnaturante é caracterizada pela desnaturação das subunidades dissociadas. Os dados de AUC e SAXS são consistentes com os dados obtidos por espectroscopia, onde a primeira etapa do processo foi caracterizada pela dissociação oligomérica do oligômero em dodecâmero (abcd)3, tetrâmero abcd, trímero abc e monômero d. Para concentrações acima de 4,0 e 5,0 mol/L de ureia, para oxi-HbGp e cianometa-HbGp, respectivamente, aumentos significativos nos valores de I(0), Dmax e Rg sugerem que as subunidades da HbGp estão desnaturadas em solução. As massas moleculares (MM) obtidas por espectrometria de massas e AUC, e os coeficientes de sedimentação s20,w são consistentes com outros resultados reportados para hemoglobinas ortólogas. Além disso, os resultados aqui apresentados representam um avanço importante na caracterização do processo de desnaturação de proteínas oligoméricas complexas. / Glossoscolex paulistus hemoglobin (HbGp) is characterized by a molecular mass of 3.6 MDa, a high oligomeric stability, a high resistance to oxidation and a high affinity to oxygen. The quaternary structure of this macromolecule consists of 144 globin chains, and 36 additional chains lacking the heme group, named linkers, organized in a double-layered hexagonal structure. In this current work the characterization of the HbGp subunits and the effect of pH and urea upon the oligomeric stability were studied by several biophysical techniques. Our results obtained by electrophoresis SDS-PAGE, MALDI-TOF-MS and analytical ultracentrifugation (AUC) showed that only the monomer d isolated by size exclusion chromatography (SEC) presented high purity. For the other fractions various species were observed in the solution. Thus, for the trimeric fraction, two species are present in the equilibrium, the main species with percentage contribution of 87 % is assigned to the trimer abc and the species with 13 % in the solution is associated to the complex (abc + L). Additionally, the data obtained by several spectroscopic techniques and AUC show clearly that the oligomeric stability of HbGp depends on the iron oxidation state, the specific ligand coordinated to the iron and the protein concentration. Therefore, our results show that the met-HbGp form is the less stable one in the alkaline medium and in the presence of urea, followed by the oxy- and cyanomet- forms. In this way, at pH 8.0, the met- form is fully dissociated into smaller subunits, such as, trimer abc and monomer d, while the oxy-HbGp is partially dissociated with a significant percentage contribution (88 %) of undissociated protein, and the cyanomet-HbGp does not undergo oligomeric dissociation. The sedimentation coefficients (s20,w) and molecular masses (MM) values for species present in the solution, at different pH, are very close to the values obtained for isolated species. In the presence of urea the same behavior was observed for the three HbGp forms as compared to the alkaline medium. However, for a full characterization of the unfolding process the thermodynamic parameters were obtained by spectroscopic data analysis using models of two and three states. Adequate fits were obtained for both models, but the three states model was very appropriate to describe the HbGp denaturation process. Thus, the denaturation process of HbGp is defined by two phases. The first phase between 1.0 and 3.0 mol/L, of urea is assigned to the transition of native state to an intermediate state (N &rarr; I), and is characterized by dissociation of the oligomer in several subunits. The strong similarity of the intermediate state to the native one suggests that oligomeric dissociation induces little changes in the secondary structure and the region of heme group of the protein. As a consequence, the thermodynamic parameters associated to the first transition have large errors due to the complexity of the intermediate state with different species in the solution, as well as its great similarity to the native state. The second phase (I &rarr; U), associated with a cooperative transition at 4,5 - 5,0 mol/L of denaturant agent, is attributed to the unfolding of the dissociated subunits. Our AUC and SAXS data are very consistent with spectroscopic data. Thus, in the first phase the oligomeric dissociation of whole protein in dodecamer (abcd)3, tetramer abcd, trimer abc and monomer d was observed. For urea concentrations above 4.0 - 5,0 mol/L, for oxy-HbGp and cyanomet-HbGp, respectively, the significant increase in I(0), Dmax and Rg values suggests that the HbGp subunits are denatured in the solution. The molecular masses values (MM) obtained by mass spectrometry and AUC, and the sedimentation coefficients (s20,w) are consistent with others results reported in the literature for orthologous hemoglobins. In addition, the results of this work correspond to an important advance in the characterization of the denaturation process of this complex oligomeric protein.

Orientador: José Eduadro Tanus dos Santos / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-21T14:18:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sertorio_JonasTadeuCau_D.pdf: 15317741 bytes, checksum: 8f9e412dcb5f88fa28c13ad829f48faa (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: O óxido nítrico (NO) exerce um importante papel durante as alterações hemodinâmicas que normalmente acompanham uma gravidez sadia (GS). Entretanto, em mulheres com pré-eclâmpsia (PE), uma síndrome caracterizada por hipertensão e proteinúria, a vasodilatação da circulação sistêmica materna está comprometida. Isso possivelmente ocorre devido a uma menor biodisponibilidade de NO, a qual resulta de uma menor produção e uma maior degradação do NO. Como a hemoglobina livre no plasma sequestra o NO pela rápida reação de dioxigenação, o que pode comprometer a eficiência do processo de vasodilatação mediado pela via do NO/guanilato ciclase, formulamos a hipótese de que pacientes com PE, quando comparadas com grávidas sadias, apresentariam concentrações aumentadas de hemoglobina livre no plasma, o que resultaria em maior degradação (consumo) do NO e menor biodisponibilidade de NO. Além disso, também formulamos a hipótese de que os diferentes fenótipos da haptoglobina (Hp) podem modular a biodisponibilidade de NO ao influenciar o consumo de NO na PE. A haptoglobina é uma proteína polimórfica (Hp1-1, Hp2-1 e Hp2-2) que se liga à hemoglobina para formar um complexo (Hb-Hp) que é removido da circulação, prevenindo o consumo de NO e o estresse oxidativo induzido pela hemoglobina. Os produtos do gene da haptoglobina apresentam diferentes propriedades bioquímicas e biofísicas, o que pode influenciar a taxa de eliminação (clearance) do complexo Hb-Hp. Para avaliar a biodisponibilidade de NO, foram analisadas as concentrações de nitrito no plasma e no sangue total em um analisador de NO. O consumo de NO foi determinado no plasma através do método de quimiluminescência. As concentrações de hemoglobina plasmática e haptoglobina foram analisadas com kits de imunoensaio enzimático (ELISA). Os genótipos da haptoglobina foram determinados pela Reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-PCR). Encontramos concentrações reduzidas de nitrito no plasma e no sangue total de grávidas com PE comparado com grávidas sadias. As amostras de plasma de grávidas com PE consumiram mais NO e apresentaram maiores concentrações de hemoglobina livre do que as amostras de grávidas sadias. Além disso, verificamos que há correlação positiva entre as concentrações de hemoglobina plasmática e o consumo de NO, correlação negativa entre o consumo de NO e as concentrações de nitrito plasmático e no sangue total e, por fim, correlação negativa entre as concentrações de hemoglobina livre plasmática e as concentrações de nitrito no plasma e no sangue total. Esses dados sugerem que níveis aumentados de Hb livre resultam em consumo de NO aumentado e baixo biodisponibilidade de NO em pacientes com PE, quando comparados com grávidas sadias. Não encontramos diferenças nas frequências dos genótipos da haptoglobina entre grávidas com PE e GS. Em grávidas sadias, os genótipos da haptoglobina não apresentaram efeitos nos níveis de hemoglobina livre, no consumo de NO e nas concentrações de nitrito plasmático. Entretanto, pacientes com PE e genótipos Hp2-1 e Hp2-2 apresentaram níveis aumentados de hemoglobina livre (heme), consumo de NO elevado e concentrações reduzidas de nitrito quando comparados com pacientes com PE e genótipo Hp1-1. Esses achados indicam que apesar de o genótipo da haptoglobina não afetar o risco de se desenvolver PE, o genótipo Hp1-1 possivelmente exerce um papel de proteção na PE ao reduzir o sequestro de NO, enquanto que os genótipos Hp2-1 e Hp2-2 podem agravar a PE ao reduzir a biodisponibilidade de NO / Abstract: Nitric oxide (NO) plays an important role in the hemodynamic changes found during normal pregnancy (NP). However, preeclampsia (PE), a syndrome characterized by hypertension and proteinuria, is associated with impaired vasodilatation of the maternal systemic circulation, possibly due to decreased NO bioavailability resulting of lower NO production and increased NO degradation. Since cell-free hemoglobin scavenges NO through a high speed dioxygenation reaction, thus compromising the efficiency of the NO/soluble guanylyl cyclase pathway to elicit vasodilatory activity, we hypothesized that higher plasma hemoglobin concentrations exist in patients with preeclampsia compared with normal pregnant women, and the higher plasma hemoglobin concentrations could lead to increased NO consumption and lower NO bioavailability in preeclamptic patients. Moreover, we hypothesized that haptoglobin (Hp) phenotypes might modulate NO bioavailability by influencing NO consumption in preeclampsia. Haptoglobin is a polymorphic protein (Hp1-1, Hp2-1 and Hp2- 2) that binds hemoglobin to form a complex that is removed from circulation, thus preventing Hb-driven oxidative stress and NO scavenging. Hp protein products differ in biochemical and biophysical properties, which reflects on the Hb-Hp complex clearance rate. To assess NO bioavailability, we measured plasma and whole blood nitrite concentrations using an ozone-based chemiluminescence assay. A NO consumption assay was used to measure NO consumption. Plasma hemoglobin and haptoglobin concentrations were assessed with a commercial immunoassay (ELISA). Haptoglobin genotypes were determined using Real Time Polymerase Chain Reaction. We found lower whole blood and plasma nitrite concentrations in preeclamptic patients compared with normal pregnant women. Plasma samples from preeclamptic women consumed more NO and had higher plasma Hb levels than those found in normal pregnant women. We found significant positive correlations between plasma Hb and plasma NO consumption, negative correlations between plasma NO consumption and whole blood and plasma nitrite concentrations, and negative correlations between plasma Hb and whole blood and plasma nitrite concentrations. These findings suggest that increased plasma Hb levels lead to xiv increased NO consumption and lower NO bioavailability in preeclamptic patients compared with healthy pregnant women. Furthermore, we found no differences in Hp genotype frequencies between preeclamptic and NP groups. Haptoglobin genotypes had no effects on plasma heme levels, NO consumption and plasma nitrite in normal pregnant women. However, in preeclampsia, Hp2-1 and Hp2-2 were associated with higher plasma heme levels, increased NO consumption, and lower plasma nitrite compared with Hp1-1. These findings indicate that although haptoglobin genotype does not affect the risk of preeclampsia, Hp1-1 genotype may exert a protective role in preeclampsia by reducing NO scavenging, whereas Hp2-1 and Hp2-2 may further aggravate preeclampsia by reducing NO bioavailability / Doutorado / Farmacologia / Doutor em Farmacologia

Orientador: Fernando Ferreira Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-07T17:09:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_CamilaOrescodos_D.pdf: 28263366 bytes, checksum: 0bb038ac0bb395e9aed9a7089336b2d0 (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: AHSP é uma proteína eritróide específica que apresenta afinidade de ligação com a-globinas, estabilizando essas moléculas e dessa forma, evitando a precipitação nos precursores eritróides e bloqueando danos celulares causados pela oxidação de cadeias globínicas. Camundongos portadores de P-talassemia com deleção do gene AHSP apresentaram maior precipitação de cadeias a-globinas nas hemácias e níveis acentuados de anemia. Estudos in vitro utilizando proteína recombinante demonstraram menor geração de espécies reativas de oxigênio quando a-globinas encontram-se estabilizadas pela AHSP. Com o objetivo de analisar a importância da proteína AHSP como modulador de gravidade clínica nas síndromes P-talassêmicas o gene AHSP foi analisado em amostras de DNA de pacientes com P-talassemia, atendidos pelo Hemocentro da Unicamp, e em amostras controles durante minha tese de mestrado. Durante estes estudos, três características do gene AHSP foram detectadas. Estas características do gene AHSP foram investigadas durante o desenvolvimento deste presente trabalho. Primeiro, um polimorfismo localizado no posição 12888 no gene AHSP, que leva a substituição de uma Asparagina na posição 75 por uma Isoleucina (N75I), foi identificado em uma paciente heterozigota para P-talassemia (Pj9/pA) com anemia grave e em processos transfusionais freqüentes. Outras duas famílias apresentaram o polimorfismo N75I. Entretanto, nestes casos a presença do polimorfismo no gene AHSP não se correlaciona claramente com a gravidade clínica. O sequênciamento de amostras de indivíduos controles de várias partes do mundo sugerirão uma baixa freqüência deste polimorfismo na população analisada. Estudos de indivíduos saudáveis positivos para o polimorfismo N75I demonstraram precipitação e oxidação de cadeias globínicas nas hemácias. Análises funcionais com proteína recombinante sugerem que a proteína AHSP N75I apresenta características de ligação com a-globínas normais, mas é menos eficiente em evitar geração de espécies reativas de oxigênio por estas cadeias globínicas. Estes efeitos, quando em conjunto com ?-talassemia poderiam resultar em anemia mais grave, demonstrando a proteína AHSP N75I como um modificador genético nas síndromes talassêmicas. Segundo, através de análises computacionais, nós identificamos uma estrutura secundária na região 3'-UTR do RNA mensageiro do gene AHSP. semelhante a um elemento responsivo a ferro (IRE), presente em todas as espécies que apresentam o gene AHSP. Várias evidências demonstraram que, mesmo não apresentando as características principais para a caracterização de um IRE, esta estrutura secundária do gene AHSP é reconhecido pelas proteínas reconhecedoras de IREs (IRPs) regulando a estabilidade da molécula de RNA mensageiro em resposta aos níveis de ferro: 1) Recuperação do RNA mensageiro do gene AHSP através da imunoprecipitacão das proteínas IRP1 e IRP2: 2) Níveis elevados de ferro desestabilizam o RNA mensageiro do gene AHSP: mutações neste IRE levam à desestabilização constitutiva do RNA mensageiro; 3) Níveis elevados de ferro desestabilizam o RNA mensageiro do gene AHSP em camundongos que apresentam excesso de ferro. Estes dados contribuem para o melhor entendimento de como IRE atípicos podem ainda ser funcionais e sugerem um mecanismo que poderia regular a estabilidade de cadeias globínicas de acordo com os níveis de ferro. Além disso, sugerem que o excesso de ferro, que ocorre em pacientes com (3-talassemia. podem ser determinante na gravidade da doença por, provavelmente, aumentar os níveis de a-globinas livres e precipitando nos precursores eritróides. E, em terceiro, através de busca de sítios de ligação de fatores de transcrição no gene AHSP, nós encontramos um elemento MARE localizado no final do segundo éxon. Estudos de imunoprecipitaçâo de cromatina demonstraram ligação dos fatores de transcrição Nrf2, Bachl e Maf ao elemento MARE do gene AHSP e regiões controle. Concluindo, estes resultados demonstraram pela primeira vez um polimorfismo no gene AHSP que produz uma proteína não completamente funcional que pode estar relacionada com gravidade à p-talassemia e, além disso, descrevem dois mecanismos inéditos da regulação da expressão do gene AHSP que podem ser importantes na regulação deste gene em outras doenças hematológicas e durante a eritropoiese / Abstract: Alpha-hemoglobin stabilizing protein (AHSP) is an erythroid-specific molecular chaperone that binds the cx-chains of hemoglobin, preventing their precipitation and deleterious effects. Loss of AHSP exacerbates a-globin precipitation and anemia in a murine model for p-thalassemia. In vitro, recombinant AHSP inhibits the production of reactive oxygen species (ROS) by a-globin. To further define the role of AHSP as a modifier of P- thalassemia, we analyzed AHSP sequence for mutations in a large population of (3- thalassemic and control subjects. From this genomic screening three interesting features of the AHSP gene were found. First, a single nucleotide change that converts asparagine 75 to leucine (N75I) was identified in a patient who was heterozygous for P-thalassemia (p39/(3A). She presented with an unusually severe anemia that required regular blood transfusion. Another two families were positive detected for the SNP N75I. but the presence of other known genetic modifiers for thalassemia in these families made hard to correlate clinical severity with AHSP. Of the unrelated control subjects tested just one (0.35%) contained the SNP N75I. Analysis of red blood cells from this subject revealed normal hemoglobin indices but a small number of Heinz bodies, suggesting a non-fully functional AHSP. Analysis of the biochemical properties of the recombinant mutant protein showed that the binding affinity of AHSP N75I for a- hemoglobin is normal. Importantly, compared to wild type AHSP, the N75I mutant protein exhibited significantly reduced capacity to inhibit ROS production by a-hemoglobin. Hence, AHSP N75I may be less effective at conferring protection from oxidative-mediated damage by free a-hemoglobin in erythrocytes. These effects, when coupled with P-thalassemia, could result in more severe anemia, implicating AHSP N75I as a potential genetic modifier. Second, by computational algorithms, we identified IRE-like stem-loop structures in AHSP mRNA of multiple species, yet the primary sequences deviate significantly from canonical IRE consensus sequences determined by studies of classical IREs, such as Transferring receptor and Ferritin. Several lines of evidence now show that the AHSP IRE binds IRPs to regulate mRNA stability in an iron-dependent fashion: 1) AHSP mRNA co-immunoprecipitates with IRPs. 2) AHSP mRNA is destabilized by iron in both erythroid and heterologous cells; disruption of the IRE renders the mRNA constitutively unstable. To study how iron regulates AHSP expression in vivo, we treated mice with iron dextran for 10 days and then examined AHSP mRNA in Terll9+ erythroid progenitors by RT-PCR. We found that short-term iron overload reduced AHSP mRNA levels. Our findings indicate that AHSP mRNA stability is regulated by iron via an atypical 3'-UTR IRE. These findings extend the potential repertoire for functional IREs that do not conform as the previously defined canonical consensus sequences. In addition, they provide a potential mechanism by which erythroid cells can regulate globin stability according to iron status. As such, iron overload, which occurs in patients with p thalassemia, might aggravate the disease by further elevating the levels of toxic free a globin. And third, by computation analysis of transcriptional sites, we found a potential MARE element located at the end of the second exon. Experiments of chromatin imunoprecipitation assay determined the binding of the transcript factor Nrf2, Bachl and Maf to the MARE element of AHSP gene, as well to the positive controls. Overall, these results demonstrated for the first time a polymorphism on AHSP gene that produce a non fully functional protein that might be correlated with severity in p-thalassemia and two new mechanisms that control the AHSP gene expression with potential implications in another hematological diseases besides thalassemias and closely connecting AHSP with erythropoiesis / Doutorado / Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento / Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientadores: Maria de Fatima Sonati, Munir Salomão Skaf / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-14T12:16:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jorge_SusanElisabethDominguesCosta_M.pdf: 12500595 bytes, checksum: 271d153e901aa04d248746dbcf6d90c6 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: A hemoglobina (Hb), pigmento respiratório de todos os organismos vertebrados, encontra-se em elevadas concentrações nas hemácias e é responsável pelo transporte de O2 dos pulmões para os tecidos. A Hemoglobina humana constitui-se de dois pares de cadeias polipeptídicas (globinas), cada qual envolvendo um grupo prostético heme, que se liga reversivelmente ao O2. Mais de 1000 variantes estruturais da Hb humana já foram descritas, parte delas relacionada a manifestações clinicas importantes. Algumas variantes apresentam alteração funcional, que se traduz em afinidade modificada pelo O2. Quando elevada, há uma produção compensatoriamente maior de hemácias, levando a policitemia; quando diminuída, resulta em cianose. O Laboratório de Hemoglobinopatias do Departamento de Patologia Clinica da FCM/UNICAMP e um dos laboratórios de referencia no pais, tendo identificado, ate o momento, 12 hemoglobinas novas e 51 variantes raras. Destas, as variantes novas Hb Hb Boa Esperanca (?16 Lys?Thr), Hb Itapira (?30 Glu?Val), Hb Bom Jesus da Lapa (?30 Glu?Ala), Hb Olinda [ß22 (b4) -25 (b7)], Hb Caruaru (ß 122 Phe?Ser) e Hb S-Sao Paulo (ß6 Glu?Val ; ß65 Lys?Glu) foram aqui caracterizadas funcionalmente, assim como as variantes raras Hb Iwata (a87 His??Arg), Hb Sunshine Seth (?94 Asp?His), Hb Deer Lodge (ß2 His?Arg), Hb Deer Lodge (ß2 His??Arg) + Hb S (ß6 Glu??Val), Hb G-Siriraj (ß7 Glu??Lys), Hb G-Siriraj (ß7 Glu??Lys) e Hb C (ß6 Glu??Lys) em associacao, Hb M-Saskatoon (ß63 His??Tyr), Hb Redondo (ß92 His? Asn), Hb Koln (ß98 Val??Met), Hb Coimbra (ß99 Asp??Glu) e Hb Dhonburi (ß126 Val?Gli)+ Btal. O metodo analitico empregado foi descrito por Rossi-Fanelli & Antonini (1958), e analisa espectrofotometricamente o comportamento da Hb frente a conhecidas pressões parciais de oxigênio (pO2), possibilitando a medida de afinidade (p50), da constante de Hill (n), que verifica o fenômeno de cooperatividade entre as cadeias globinicas para ligação do O2, o efeito Bohr (que indica facilidade na ligação Hb-O2 conforme e elevado o pH do meio), bem como a interação com o Inositol Hexafosfato (IHP), um fosfato polianion que dificulta a ligação entre a Hb e o O2. A exceção das Hbs Itapira e Bom Jesus da Lapa, em concentrações reduzidas nos hemolisados, todas as demais apresentam afinidade alterada pelo oxigênio. Como complementação ao estudo funcional, as Hbs Caruaru e São Paulo também foram submetidas a analise por dinâmica molecular, através dos programas VMD (Visual Molecular Dynamics), com dados inseridos nos softwares CHARMM (Chemistry at Harvard Molecular Mechanics) e NAMD (Nanoscale Molecular Dynamics). As demais variantes tiveram sua analise estrutural individualizada feita através da visualização de estruturas nativas depositadas no Protein Data Bank, para melhor compreensão da relação entre o aminoácido substituído e a função protéica alterada. Deste modo, foi possível estabelecer correlações entre a estrutura e a função e inferir sobre as manifestações clinicas resultantes da presença destas heme proteínas anômalas, ilustrando-se assim a importância desses estudos para a completa caracterização das variantes. / Abstract: The human hemoglobin (Hb) is the respiratory pigment of human organisms, found in high concentrations in the erythrocytes and is responsible for transporting O2 from the lungs to the peripheral tissues. This molecule is composed by two pairs of polypeptide chains (globin), each one involving a prosthetic group heme, which bind reversibly to the O2. More than 1000 structural variants had been described already; part of them related to important clinical manifestations. Some variants present functional alteration, with modified affinity for the O2. When it is increased, it has a higher compensatory production of the erythrocytes, causing policitemia; when decreased, it results on cyanosis. The Laboratory of Hemoglobinopaties of the Department of Clinical Pathology of the FCM/UNICAMP is one of the references laboratories in the country, and identified, until this moment, 12 new hemoglobins and 51 rare variants. The new variants Hb Hb Boa Esperanca (?16 Lys?Thr), Hb Itapira (?30 Glu?Val), Hb Bom Jesus da Lapa (?30 Glu?Ala), Hb Olinda [ß22 (b4) -25 (b7)], Hb Caruaru (ß 122 Phe?Ser) e Hb S-Sao Paulo (ß6 Glu?Val ; ß65 Lys?Glu) were, in the present study, functionally characterized, as well as the rare variants Hb Iwata (a87 His??Arg), Hb Sunshine Seth (?94 Asp?His), Hb Deer Lodge (ß2 His?Arg), Hb Deer Lodge (ß2 His??Arg) + Hb S (ß6 Glu??Val), Hb G-Siriraj (ß7 Glu??Lys), Hb G-Siriraj (ß7 Glu??Lys) e Hb C (ß6 Glu??Lys) em associacao, Hb M-Saskatoon (ß63 His??Tyr), Hb Redondo (ß92 His? Asn), Hb Koln (ß98 Val??Met), Hb Coimbra (ß99 Asp??Glu) e Hb Dhonburi (ß126 Val?Gli)+ Btal. The analytical method used was described for Rossi-Fanelli & Antonini (1958), which analyses, by spectrophotometer, the behavior of the Hb against known partial pressures of oxygen (pO2), making possible the measure of affinity (p50), the constant of Hill (n), that verifies the cooperativity, the Bohr effect (that it indicates the relation between Hb-O2 binding according to the pH), as well as the interaction with Inositol Hexaphosphoric acid (IHP), that difficult linkage between the Hb and the O2. Except from Hb Itapira and Hb Bom Jesus of the Lapa, in reduced concentrations at the total hemolysate, all the others presented modified affinity to the oxygen. As a complement of the functional study, the Hb Caruaru and Hb S-Sao Paulo were also submitted to previous molecular dynamics simulation. All the other variants were structurally analyzed by the study of the native structure deposited at the Protein Data Bank, to understand better the relation between the substituted residue and the modified one at the protein function. Therefore, it was possible to establish correlations between the structure and the function and to infer on the clinical manifestations because of the presence of these anomalous proteins, illustrating the importance of these studies for the complete characterization of the variants. / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

A proteólise limitada de certas proteínas leva à liberação de peptídeos opióides endógenos. Vários relatos apontam que peptídeos derivados da hemoglobina como hemorfinas e hemopressinas têm efeito antinociceptivo, pela atividade de modulação de receptores acoplados a proteínas G. No presente estudo, um ensaio de captura do substrato (ECS) foi combinado com a marcação isotópica e LC-MS/MS para identificar e caracterizar um novo fragmento da hemoglobina que se liga à EP24.15. O peptídeo AGH, identificado neste trabalho, inibe respostas de hipernocicepção periféricas através de receptores opióides do tipo <font face=\"Symbol\">m . A persistência do peptídeo AGH no tecido nervoso perfundido sugere relevância fisiológica. Embora o AGH seja derivado de hemoglobina e tenha atividade opióide, falta-lhe a sequência chave das hemorfinas (YPWT), indicando que ele pode pertencer a uma nova classe de peptídeos derivados da hemoglobina. Adicionalmente, o AGH modula as interações entre as proteínas 14-3-3<font face=\"Symbol\">e e EP24.15 in vitro, podendo estar relacionado com a secreção não convencional da EP24.15. / Limited proteolysis of certain proteins leads to the release of endogenous opioid peptides. Several reports have shown that hemoglobin-derived peptides such as hemorphins and hemopressins have an antinociceptive effect by modulating GPCR activity. In the present study, a substrate capture assay (SCA) was combined with isotopic labeling and LC-MS/MS to identify and characterize a new bioactive hemoglobin fragment that binds to EP24.15. AGH, a new peptide identified in this work, inhibits peripheral hyperalgesic responses through <font face=\"Symbol\">m opioid receptors (MOR). The persistence of AGH peptide in perfused nervous tissue suggests its physiological relevance. Although AGH is derived from hemoglobin and it is a peptide with opioid activity, it lacks the key sequence of hemorphins (YPWT), indicating that it is part of a new class of peptides derived from hemoglobin. Additionally, the AGH modulates interactions between 14-3-3<font face=\"Symbol\">e and EP24.15 proteins in vitro and may be related to the unconventional EP24.15 secretion.

Estudos com eletrodos modificados foram conduzidos utilizando dois sistemas porfirínicos supramoleculares diferentes. O primeiro foi baseado na modificação de eletrodo de carbono vítreo com uma porfirina de níquel tetrarrutenada, [NiIITPyP{RuII(bipy)2Cl}4]4+. A modificação do eletrodo foi realizada por meio de sucessivos ciclos voltamétricos em meio alcalino (pH 13), gerando um eletrodo com característica similar a eletrodos modificados com &#945;-Ni(OH)2. A caracterização química do filme formado foi realizada através das técnicas de voltametria cíclica, ressonância paramagnética eletrônica, espectroscopia eletrônica por reflectância e espectroscopia Raman com ensaio espectro-eletroquímico. Os resultados sugerem a formação de um polímero de coordenação, [&#181;-O2-NiIITPyP{RuII(bipy)2Cl}4]n, composto por subunidades porfirínicas ligadas entre si por pontes &#181;-peroxo axialmente coordenadas aos átomos de níquel (Ni-O-O-Ni). O crescimento do filme apresentou dependência da alcalinidade do meio pela formação do precursor octaédrico [Ni(OH)2TRPyP]2+ em solução, pela coordenação de OH- nas posições axiais do átomo de níquel. O processo de eletropolimerização indicou a participação de radical hidroxil, gerado por oxidação eletrocatalítica da água nos sítios periféricos da porfirina contendo o complexo de rutênio. O mesmo eletrodo foi aplicado como sensor eletroquímico para análise amperométrica de ácido fólico em comprimidos farmacêuticos. O sensor foi associado a um sistema de Batch Injection Analysis (BIA) alcançando considerável rapidez e baixo limite de detecção. Para as análises das amostras também foi proposto um método para a remoção da lactose, que agia como interferente. O segundo estudo envolveu a modificação de eletrodos de carbono vítreo com diferentes hemoglobinas, naturais (HbA0, HbA2 e HbS) e sintéticas (Hb-PEG5K2, &#945;&#945;-Hb-PEG5K2 e BT-PEG5K4), para a avaliação da eficiência na redução eletrocatalítica de nitrito mediada por FeI-heme. Os filmes foram produzidos pela mistura de soluções das hemoglobinas com brometo de didodecildimetiltrimetilamônio (DDAB), aplicados nas superfícies com consecutiva evaporação, formando filmes estáveis. Os valores de potencial redox para os processos do grupo heme e a sua associação com a disponibilidade do grupo na proteína foram avaliados por voltametria cíclica. Os valores das constantes de velocidade, k, para redução de nitrito foram obtidos por cronoamperometria em -1,1 V (vs Ag/AgCl(KCl 3M)) que foram utilizados para estudo comparativo entre as espécies sintéticas para eventual aplicação clínica. / Studies with modified electrodos were conducted using two different supramolecular porphyrin systems. The first one was based on the modification of glassy carbon electrode with a tetraruthenated nickel porphyrin, [NiIITPyP{RuII(bipy)2Cl}4]4+. The electrode modification was carried out through successive voltemmetric cycles in alkaline media (pH 13), generating an electrode with feature similar to &#945;-Ni(OH)2 modified electrodes. The chemical characterization of this film was performed by cyclic voltammetry, electronic paramagnetic resonance, reflectance electronic spectroscopy and Raman spectroscopy with spectroelectrochemistry assay. The results suggested the formation of a coordination polymer, [&#181;-O2-NiIITPyP{RuII(bipy)2Cl}4]n, composed by porphyrin subunits linked by &#181;-peroxo bridges axially coordinated to nickel atoms (Ni-O-O-Ni). The film growth showed dependence of the alkaline media by the formation of octahedral precursor [Ni(OH)2TRPyP]2+ in solution by way of axial coordination of OH- to the nickel atoms. The electropolymerization process showed to have a contribution from hydroxyl radicals, generated by electrocatalytic oxidation of water on the peripheral sites containing the ruthenium complexes. The same electrode was applied as an electrochemical sensor for amperometric analysis of folic acid in pharmaceutical tablets. The sensor was associated to a Bath Injection Analysis (BIA) system, achieving good sampling frequency and low detection limit. For the samples analysis, it was also proposed a method for lactose removal. The second study comprises the modification of glassy carbon electrodes with different hemoglobin species, of natural occurrence (HbA0, HbA2 e HbS) and synthetics (Hb-PEG5K2, &#945;&#945;-Hb-PEG5K2 e BT-PEG5K4) for evaluation of efficiency on electrocatalytic reduction of nitrite mediated by FeI-heme. The films were produced by mixing solutions of the hemoglobins with didecyldimethylammonium bromide (DDAB), applied on the surfaces with following solvent evaporation, forming stable films. The redox potential values for the heme group processes and the heme availability in the protein were evaluated by cyclic voltammetry. The reaction rate constants, k, for nitrite reduction were obtained by chronoamperometry at -1,1 V, which were used for comparative study between the synthetic species for further clinical applications.

A anemia é a causa primária de indicação de transfusão de glóbulos vermelhos e é especialmente prevalente e esperada em centros de terapia intensiva. Os benefícios das transfusões incluem aumento da oxigenação tissular, diminuição de hemorragias, tratamento da anemia e da hipovolemia. Os poucos estudos publicados têm demonstrado variações significativas nas práticas de transfusões de glóbulos vermelhos e o melhor momento para a indicação destas transfusões ainda não foi identificado. Objetivos Descrever a população de crianças que recebeu transfusão de glóbulos vermelhos com relação à faixa etária, concentração de hemoglobina (Hb) e taxa de hematócrito (HT), uso de saturação venosa central de oxigênio (SvO2), lactato sérico arterial, procedimentos terapêuticos e presença de disfunção de múltiplos órgãos e sistemas (DMOS). Métodos Estudo retrospectivo observacional, realizado no Centro de Terapia Intensiva Pediátrico (CTIP) do Instituto da Criança da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo, em 2004, com crianças que receberam transfusão de glóbulos vermelhos. Descrevemos o número de pacientes, faixa etária, motivo de internação no CTIP, presença de doença de base e de DMOS, uso de SvO2, lactato sérico arterial, Hb, HT e procedimentos terapêuticos (ventilação mecânica, drogas vasoativas e métodos de substituição renal). Resultados A transfusão de glóbulos vermelhos foi realizada em 50% dos pacientes internados. A idade mediana foi de 18 meses e o principal motivo de internação foi insuficiência respiratória (35% dos casos). Doença de base estava presente em 84% dos casos e DMOS em 47% dos casos. Foram realizadas coletas de Hb e HT em todos os casos e de SvO2 e lactato sérico arterial em 24% dos casos. A mediana de Hb pré-transfusional foi de 7,8 g/dl. Os pacientes transfundidos estavam sendo submetidos a algum procedimento terapêutico em 82% dos casos. Conclusões São realizadas transfusões de glóbulos vermelhos em todas as idades. A concentração de hemoglobina e a taxa de hematócrito são os principais dados utilizados para a indicação destas transfusões. O lactato sérico arterial e a SvO2 são pouco utilizados para se indicar a transfusão de glóbulos vermelhos. A maioria dos pacientes transfundidos recebe algum procedimento terapêutico e, em muitos casos, são realizadas transfusões em pacientes que apresentam DMOS. / Anemia is the primary cause of red blood cell transfusions and it is especially prevalent and even expected in critical care settings. The benefits of red blood cell transfusions include increase in tissue oxygenation, treatment of anemia and hypovolemia. There are substantial variations in transfusion practices and the optimal transfusion practice for various types of critically ill patients with anemia has not been established. Objectives To describe the clinical, hematological and therapeutic characteristics of children who received red blood cell transfusion in a Pediatric Intensive Care Unit (PICU). Methods Retrospective observational study, performed in the PICU of ?Instituto da Criança?, Medicine School of University of São Paulo, in 2004, with one hundred children who received red blood cell transfusion. We described the number of patients included in the study, age, reason for admission to the PICU, presence of baseline illness and multiple organ system failure (MODS), use of oxygen central venous saturation, arterial lactate, hemoglobin concentration (Hb), hematocrit (HT) and therapeutics procedures (mechanical ventilation, use of vasoactive drugs and renal replacement methods). Results The red blood cell transfusion occurred in 50% of the patients. Median age of patients was 18 months. The most common reason for admission was respiratory failure, in 35% of the cases. Baseline illness was present in 84% of the cases and MODS in 47% of the cases. Hb and HT were collected in all the cases and oxygen central venous saturation and arterial lactate were collected in 24% of the cases. The median pre-transfusion hemoglobin concentration was 7.8 g/dl. The patients were receiveing therapeutics procedures in 82% of the cases. Conclusions Red blood cell transfusions are performed in children of all ages. The hemoglobin concentration and hematocrit are the main reason to indicate the red blood cell transfusion. Arterial lactate and oxygen central venous saturation are rarely utilized. The majority of patients receive therapeutic procedures and, in many cases, patients with MODS are given red blood cell transfusions.