CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A toxicidade ao meio ambiente, a baixa biodegrabilidade e a crescente resistÃncia de insetos praga da agricultura e de insetos vetores de doenÃas aos inseticidas tradicionalmente utilizados tem estimulado o desenvolvimento de alternativas com maior biodegradabilidade e especificidade, especialmente de origem vegetal. Nesse sentido, o presente estudo consistiu na purificaÃÃo, caracterizaÃÃo e avaliaÃÃo do efeito biolÃgico in vitro de um novo inibidor de tripsina obtido das sementes de Sapindus saponaria sobre as enzimas digestivas de insetos. AtravÃs de precipitaÃÃo com Ãcido tricloroacÃtico (TCA), cromatografia de afinidade à tripsina e cromatografia de fase reversa em sistema UFLC, foi purificado um novo inibidor de tripsina (SSTI2) pertencente ao grupo de inibidores do tipo Batata I, uma categoria de inibidores de peptidases serÃnicas com reconhecido efeito tÃxico sobre insetos. O inibidor nativo e fragmentos desse gerados por tratamento enzimÃtico com tripsina e pepsina foram analisados e sequenciados por espectrometria de massa do tipo MALDI-TOF e ESI-TOF, determinando assim a sua massa molecular acurada (MM = 7571, 976 Da) e elucidando a sua estrutura primÃria (64/69 aminoÃcidos). O inibidor apresentou uma IC50 de 8,3 x 10-2 μmol.L-1 contra a tripsina bovina, mas apresentou baixa atividade inibitÃria sobre as enzimas quimotripsina (13,24  0,28%) e papaÃna (5,28  0,42%), e nÃo foi capaz de inibir a proteÃlise promovida pela bromelaÃna. O SSTI2 inibiu moderadamente a atividade catalÃtica das enzimas digestivas totais dos insetos, com percentual de inibiÃÃo variando entre 4,74  0,45% a 56,06  1,41%. No entanto, o inibidor foi eficaz em atuar sobre as enzimas digestivas do tipo tripsina presentes nos intestinos dos insetos Aedes aegypti (92,44  0,99%), Anthonomus grandis (77,93  0,12%), Anticarsia gemmatalis (32,21  0,57%) e Spodoptera frugiperda (71,44  1,23%). Esse expressivo efeito inibitÃrio do SSTI2 sobre a atividade catalÃtica das peptidases do tipo tripsina provenientes do intestino mÃdio dos insetos sugere um possÃvel efeito supressor no desenvolvimento e sobrevivÃncia de insetos alimentados com dietas contendo o inibidor. Assim, futuros estudos in vivo e avaliaÃÃes de outras propriedades bioquÃmicas do inibidor serÃo importantes para determinar a potencial aplicaÃÃo biotecnolÃgica do SSTI2, especialmente para o combate de A. aegypti, A. grandis e A. gemmatalis. AlÃm disso, a sequÃncia do SSTI2 elucidada nesse estudo possibilita a sÃntese, clonagem do gene codificante e expressÃo heterÃloga dessa potencial ferramenta biotecnolÃgica. / Environmental toxicity, low biodegradability and increased resistance in agricultural pest insects and in insect vectors of diseases to insecticides traditionally used for their control have encouraged the development of chemical alternatives with greater specificity and biodegradability especially from plants. In this way, the present study aimed the purification, characterization and evaluation of activity towards pest insect digestive enzymes of a new trypsin inhibitor obtained from Sapindus saponaria seeds. This new trypsin inhibitor obtained from S. saponaria seeds (SSTI2) belongs to Potato I inhibitor family and was purified by protein precipitation with trichloroacetic acid, affinity chromatography and reverse phase chromatography using UFLC system. The native inhibitor and its fragments generated by enzymatic treatment with trypsin and pepsin were analyzed and sequenced by MALDI-TOF and ESI-TOF mass spectrometry, determining its accurate molecular mass (MM = 7571, 976 Da) and primary structure (64 of 69 amino acids). The SSTI2 showed an IC50 of 8.3 x 10-2 μmol.L-1 against bovine trypsin, and a much lower inhibitory activity on the enzymes chymotrypsin (13.24  0.28%) and papain (5.28  0 , 42%), but was unable to inhibit proteolysis promoted by bromelain. In spite to show moderate inhibition of total digestive enzymes (4.74  0.45% to 56.06  1.41%), the inhibitor was very effective upon trypsin-like enzymes present in Aedes aegypti (92.44  0.99%), Anthonomus grandis (77.93  0.12%), Anticarsia gemmatalis ( 32.21  0.57%) and Spodoptera frugiperda (71.44  1.23%) guts. This strong inhibitory effect of SSTI2 on the catalytic activity of trypsin-like peptidases of insectâs midguts suggests a possible suppressive effect on development and survival of insects fed with diets containing the inhibitor. Thus, future in vivo assays and evaluation of other biochemical properties will be important to establish the potential biotechnological application of SSTI2, especially for the combat of Ae. aegypti, A. grandis and An. gemmatalis. Furthermore, the sequence of SSTI2 elucidated in this study allows the chemical synthesis, cloning of coding gene sequence and heterologous expression of this potential new biotechnological tool.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Physic nut (Jatropha curcas L.) is an important crop due to its ability of storing high content of oil in the seeds, which can serve as raw material for biodiesel production. Because of the presence of toxic constituents like phorbol esters (PEs) and curcins, the seed cake produced as a result of oil extraction cannot be utilize for animal feed. Development of the genotypes better suited for the industrial applications and biodiesel production as well as with lower level of toxic constituents is being hampered by a lack of understanding about the a) proteins related to the biosynthesis and degradation of fatty acids (FAs) and triacylglycerides (TAGs), b) role of proteins deposited during seed development and c) proteins related to the synthesis and storage of toxic compounds during seed development. Agreeing with this, we have performed the anatomical analysis of the developing seeds of J. curcas, followed by the proteome analysis of the endosperm isolated from the seeds of J. curcas at five different developmental stages, which resulted into the identification of the 1517, 1256, 1033, 752 and 307 proteins, from Stage 6, 7, 8, 9 and 10, respectively, summing up to a total of 1760 proteins. Proteins with similar expression pattern were grouped into five different clusters and protein quantification based on spectral counts was determined. Besides identification of the proteins involved in the biosynthesis and degradation of the FAs and TAGs, we also identified a large number of proteins involved in the metabolism of the carbohydrates, which are important for supplying energy and carbon source for the synthesis of TAGs in heterotrophic seeds. Among the members of different classes of seed storage proteins (SSPs), we have identified four SSPs named as nutrients reservoir, which in contrast to the other SSPs showed decreasing deposition pattern during seeds development and revealed to have special role during seed development. In addition, peptidases belong to different mechanistic classes were identified, which have a range of functions, highlighting the role in reserve mobilization during germination. Isoforms of curcin were also identified in this proteome analysis which were absent in our previous proteome analysis of the other tissues from these seeds, suggesting that the deposition of these toxic proteins only occur in the endosperm. Similarly, several enzymes involved in the biosynthesis of diterpenoid precursors were identified in this proteome analysis but, like in our previous proteome analysis of the other tissues from J. curcas seeds,we were unable to identify any terpene synthase/cyclase, enzymes responsible for the synthesis of PEs, which collectively suggesting that the synthesis of PEs may not occur in seeds of this plant. In conclusion, the strategy used here enabled us to provide a first in depth proteome analysis of the endosperm from J. curcas developing seeds, which along with providing information regarding important aspects of the seed development, also set the foundation of a proteomic approach to study biotechnologically important plant species. / PinhÃo manso (Jatropha curcas L.) à uma cultura importante devido à sua habilidade em armazenar alto conteÃdo de Ãleo nas sementes, as quais podem servir como matÃria-prima para a produÃÃo de biodiesel. Devido à presenÃa de constituintes tÃxicos como Ãsteres de forbol e curcina, a torta da semente produzida como resultado da extraÃÃo do Ãleo nÃo pode ser utilizada na alimentaÃÃo animal. O desenvolvimento de genÃtipos mais adequados a aplicaÃÃes industriais e à produÃÃo de biodiesel assim como apresentando baixos nÃveis de constituintes tÃxicos està sendo prejudicado pela falta de entendimento sobre a) proteÃnas relacionadas a biossÃntese e degradaÃÃo de Ãcidos graxos e triacilglicerÃis, b) o papel de proteÃnas depositadas durante o desenvolvimento da semente e c) proteÃnas relacionadas à sÃntese e reserva de compostos tÃxicos durante o desenvolvimento da semente. Diante disso, nÃs realizamos uma anÃlise anatÃmica de sementes em desenvolvimento de J. curcas, seguido por uma anÃlise proteÃmica do endosperma isolado de sementes dessa espÃcie em cinco diferentes estÃgios de desenvolvimento, o que resultou na identificaÃÃo de 1517, 1256, 1033, 752 e 307 proteÃnas, dos estÃgios 6, 7, 8, 9 e 10, respectivamente, somando um total de 1760 proteÃnas. ProteÃnas com padrÃo de expressÃo similar foram agrupadas em cinco grupos diferentes e a quantificaÃÃo das proteÃnas baseada na contagem dos espectros foi determinada. AlÃm da identificaÃÃo das proteÃnas envolvidas na biossÃntese e degradaÃÃo de FAs e TAGs, nÃs identificamos um grande nÃmero de proteÃnas envolvidas no metabolismo de carboidratos, as quais sÃo importantes para o fornecimento de energia e fontes de carbono para a sÃntese de TAGs em sementes heterotrÃficas. Entre os membros de diferentes classes de proteÃnas de reservas de sementes (SSPs), nÃs identificamos quatro SSPs denominadas reservatÃrios de sementes, que em contraste as outras SSPs mostraram decrÃscimo no padrÃo de deposiÃÃo e revelaram ter um papel especial durante o desenvolvimento da semente. Em adiÃÃo, peptidases pertencentes a diferentes classes mecanÃsticas foram identificadas destacando o papel da mobilizaÃÃo de reservas durante a germinaÃÃo. Isoformas da curcina ausentes em nossas anÃlises proteÃmicas prÃvias de outros tecidos da semente foram identificadas sugerindo que a deposiÃÃo dessas proteÃnas tÃxicas sà ocorre no endosperma. Similarmente, vÃrias enzimas envolvidas na biosÃntese de precursores de diterpenÃides foram identificadas nessa anÃlise proteÃmica, mas como em nossas prÃvias anÃlises proteÃmicas de outros tecidos de sementes de J. curcas, nÃs nÃo fomos capazes de identificar sintases/ciclases de terpenos, enzimas responsÃveis pela sÃntese de PEs, o que coletivamente sugere que a sÃntese desses compostos pode nÃo ocorrer nas sementes dessa planta. Em conclusÃo, a estratÃgia utilizada nos fornece a primeira anÃlise proteÃmica profunda do endosperma de sementes em desenvolvimento de J. curcas, o que alÃm de fornecer informaÃÃes sobre aspectos importantes do desenvolvimento da semente, tambÃm estabelece a base para uma pesquisa proteÃmica com o objetivo de estudar espÃcies vegetais importantes biotecnologicamente.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / This work reports the biochemical characterization, cytotoxic and allergenic effects of a lipid transfer protein isolated from M. citrifolia seeds (McLTP1), with trypsin and alpha-amylase inhibition properties. McLTP1 was purified with a procedure involving trichloroacetic acid precipitation and gel filtration chromatography. This protein showed significant inhibitory activities against trypsin (767,10  8,36 TIU/mgP), chymotrypsin (25,36  0,86 IU/mgP), papain (65,419  0,152 IU/mgP) and alpha-amylase (24,40%). Atomic force microscopy displayed that McLTP1 oligomerized in tetramers showing a central channel. Fluorescence and CD assays revealed that the McLTP1 structure is highly stable, regardless of pH and temperature levels. In vitro, McLTP1 presented a selective cytotoxic effect to human ovarian cancer cells (OVCAR-8; IC50 of 16,6 μg/mL) and demonstrated hemolytic effect against fresh rabbit red blood cels. Similarly to other non-specific lipid transfer protein reported, McLTP1 showed allergenic properties in mice, being considered as a true food allergen since it was able to sensitize the animals via the gastrointestinal tract. / Morinda citrifolia L. à uma espÃcie nativa do Sudeste da Ãsia intensamente investigada em funÃÃo de suas propriedades terapÃuticas reportadas hà mais de 2.000 anos. Recentemente, uma proteÃna transferidora de lipÃdeos denominada McLTP1 (UniProt Accession Number: C0HJH5) foi isolada de sementes de noni pelo nosso grupo de pesquisa. McLTP1 à uma proteÃna termoestÃvel de massa molecular 9,4 kDa, resistente à proteÃlise e dotada de atividades moduladoras da inflamaÃÃo e da dor pela via oral, promissoras e inÃditas para esse grupo de molÃculas. Este trabalho objetivou caracterizar bioquimicamente McLTP1, bem como avaliar o seu potencial alergÃnico em camundongos, como etapas bÃsicas para o seu uso racional e seguro do ponto de vista farmacolÃgico. Em adiÃÃo, as propriedades terapÃuticas de McLTP1 foram tambÃm ampliadas, atravÃs da investigaÃÃo de seu efeito citotÃxico em diferentes linhagens de cÃlulas tumorais. A proteÃna em estudo foi isolada utilizando o protocolo jà estabelecido, envolvendo as etapas de precipitaÃÃo seletiva de proteÃnas do extrato total das sementes de noni com Ãcido tricloroacÃtico 2,5% e cromatografia de exclusÃo molecular. O ensaio de alergenicidade in vivo foi conduzido apÃs prÃvia aprovaÃÃo pelo Comità de Ãtica para Uso de Animais da Universidade Federal do Cearà e utilizou fÃmeas nulÃparas com massa corporal entre 25 e 30 g. McLTP1 apresentou in vitro atividades inibitÃrias de tripsina (767,10  8,36 UIT/mgP), quimotripsina (25,36  0,86 UI/mgP), papaÃna (65,419  0,152 UI/mgP) e alfa-amilase (24,40%). A atividade inibitÃria de tripsina de McLTP1 foi reduzida significativamente em temperaturas superiores a 37 ÂC, apresentando atividade residual de apenas 5,91% quando aquecida a 100 ÂC por 30 min. Essa atividade foi tambÃm influenciada pelo pH, sendo de apenas 30,13% e 39,05% quando a proteÃna foi incubada em tampÃes de pH 3,0 e 12,0. O padrÃo de oligomerizaÃÃo de McLTP1 demonstrou a formaÃÃo de agregados dimÃricos/tetramÃricos delimitando um canal central de diÃmetro de 4,4 nm. As anÃlises espectroscÃpicas mostraram que McLTP1 apresenta espectro de CD similar Ãquele apresentado por outras proteÃnas transferidoras de lipÃdeos e caracterÃstico de proteÃnas ricas em alfa-hÃlice. Espectro de CD de McLTP1 nÃo mostrou alteraÃÃes significativas em diferentes temperaturas e pHs, corroborando com os dados de estabilidade obtidos anteriormente. Diferentemente, em condiÃÃes redutoras (DTT 1 mM) o espectro de CD mostrou alteraÃÃo na estrutura secundÃria da proteÃna e os mÃnimos e mÃximos de elipticidade molar foram tambÃm alterados na presenÃa de micelas iÃnicas de SDS (10 mM). McLTP1 apresentou atividade citotÃxica seletiva contra cÃlulas de cÃncer de ovÃrio (Ovcar-8; CI50: 16,6 μg/mL), nÃo sendo citotÃxica para as cÃlulas tumorais de cÃlon humano (HCT-116), leucemia humano (HL-60) e glioblastoma humano (SF-295) testadas. McLTP1 foi capaz de promover hemÃlise significativa em hemÃcias de coelho a partir da concentraÃÃo de 0,005 mgP/mL. McLTP1 apresentou potencial efeito alergÃnico in silico e em camundongos imunizados pela via oral, induzindo a sÃntese de anticorpos IgG e IgG1. Tal como descrito na literatura para outras LTPs, anticorpos anti-McLTP1 produzidos em coelho foram tambÃm capazes de reconhecer proteÃnas presentes em extratos de Rosaceae, Cucurbitaceae e na polpa do fruto de noni. Os dados obtidos permitiram caracterizar parcialmente a proteÃna em estudo, bem como avaliar o seu potencial imunogÃnico apÃs administraÃÃo oral. Novos testes serÃo conduzidos objetivando avaliar a importÃncia clÃnica dessas respostas, uma vez que testes de toxicidade demonstraram que McLTP1 nÃo foi capaz de promover reaÃÃes adversas em camundongos, mesmo apÃs administraÃÃo da dose de 8 mg/kg por 28 dias.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / Mo-CBP4 à uma proteÃna ligante à quitina, com atividade anti-inflamatÃria e antinociceptiva, isolada de sementes de Moringa oleifera Lamarck, uma Ãrvore conhecida pelo seu valor medicinal. Este trabalho teve como objetivo a caracterizaÃÃo estrutural, farmacolÃgica e toxicolÃgica de Mo-CBP4, com foco na sua utilizaÃÃo como agente terapÃutico. Mo-CBP4 à um heterodÃmero de 11,8 kDa, composto por cadeias de 3,9 kDa e 8,4 kDa. O sequenciamento de Mo-CBP4 por degradaÃÃo de Edman e espectrometria de massas mostrou a presenÃa de muitos resÃduos de aminoÃcidos bÃsicos e alta similaridade com proteÃnas isoladas de sementes de M. oleifera. AnÃlises espectroscÃpicas utilizando dicroÃsmo circular demonstraram que Mo-CBP4 à composta por α-hÃlices (36%), folhas-β (15%), voltas (19%) e estruturas ao acaso (30%), com alta estabilidade estrutural frente a variaÃÃes de temperatura e pH. Mo-CBP4 (0,1, 1,0 e 10 mg/kg), por via endovenosa, mostrou atividade anti-inflamatÃria no modelo de peritonite induzida por carragenina em ratos, com inibiÃÃo (79%) da migraÃÃo de neutrÃfilos jà na menor dose. Atividade anti-inflamatÃria de Mo-CBP4 (40 mg/kg) tambÃm ocorreu por via oral em camundongos, usando o mesmo modelo citado, com significativa inibiÃÃo (48%) da migraÃÃo de neutrÃfilos. Tal atividade permaneceu mesmo apÃs aquecimento da proteÃna a 100 ÂC por 1 hora, porÃm, a prÃ-incubaÃÃo com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M foi capaz de reverter sua aÃÃo. Os nÃveis sÃricos de IL-1β e IL-10, apÃs induÃÃo de peritonite, sofreram alteraÃÃo com o prÃ-tratamento da proteÃna. Adicionalmente, Mo-CBP4 (10 mg/kg) mostrou atividade antinociceptiva, verificada atravÃs do teste da formalina (2,5%), quando administrada via intraperitoneal, inibindo apenas a dor perifÃrica. No modelo de hipernocicepÃÃo mecÃnica induzida por carragenina, animais tratados via oral com a proteÃna (20, 40 e 80 mg/kg), 1 hora antes do agente inflamatÃrio, mostraram-se mais resistentes à sensibilizaÃÃo apÃs 1, 3 e 5 horas, apresentando inibiÃÃo mÃxima na dose de 40 mg/kg, estando essa atividade relacionada com a reduÃÃo da migraÃÃo de neutrÃfilos. A hipernocicepÃÃo direta causada por PGE2 ou epinefrina nÃo sofreu alteraÃÃo com o prÃ-tratamento de Mo-CBP4. A proteÃna tambÃm nÃo causou comprometimento na atividade locomotora dos animais, quando submetidos ao teste do campo aberto. A administraÃÃo oral de Mo-CBP4 em dose Ãnica (2000 mg/kg) ou em doses repetidas (10, 40 e 100 mg/kg) nÃo resultou em efeitos tÃxicos ou adversos. Similarmente, avaliaÃÃo da citotoxicidade e genotoxicidade de Mo-CBP4, utilizando cÃlulas tumorais ou normais, mostrou ausÃncia de toxicidade. Os resultados obtidos sugerem que devido Ãs propriedades anti-inflamatÃria e antinociceptiva, alta estabilidade e aparente ausÃncia de toxicidade, Mo-CBP4 possui grande potencial como um futuro biofÃrmaco. / Mo-CBP4 is a chitin-binding protein that is associated with the antinociceptive and anti-inflammatory effects of Moringa oleifera seeds, a tree known for its medicinal value. The aim of this study was the structural, pharmacological and toxicological characterization of Mo-CBP4, focusing on its use as a therapeutic agent. Mo-CBP4 is a 11.8 kDa heterodimer, composed by 3.9 kDa and 8.4 kDa chains. Mo-CBP4 sequencing by Edman degradation and mass spectrometry showed the presence of many basic amino acid residues and high similarity with other proteins from M. oleifera seeds. Circular dichroism spectroscopy showed that the Mo-CBP4 contains 36% α-helix, 15% β-sheet, 19% turn and 30% unordered and high structural stability to temperature and pH variations. Mo-CBP4 (0.1, 1.0 and 10 mg/kg) by intravenous administration showed anti-inflammatory activity on the model of carrageenan-induced peritonitis in rats, with inhibition (79%) of neutrophil migration already at the lowest dose. Mo-CBP4 (40 mg/kg), when administered by oral route on mice, using the same mentioned model, also presented anti-inflammatory activity, causing a significant inhibition (48%) of neutrophil migration. Mo-CBP4 retained this activity even after heating at 100 ÂC or pre-incubation with 0.1 M N-acetyl-D-glucosamine, both for 1 hour. Serum levels of IL-1β and IL-10 after peritonitis induction changed in Mo-CBP4-pretreated mice. In addition, Mo-CBP4 (10 mg/kg), administered intraperitoneally, also showed antinociceptive activity by using the formalin (2.5%) test in mice model, inhibiting just the peripheral pain. In the carrageenan-induced mechanical hypernociception model, animals pretreated with oral Mo-CBP4 (20, 40 and 80 mg/kg), 1 hour prior to inflammatory agent use, proved to be more resistant to sensitization after 1, 3 and 5 hours, with maximal inhibition at a dose of 40 mg/kg, being this activity correlated with the reduction of neutrophil migration. Direct hypernociception caused by epinephrine or PGE2 was not affected with Mo-CBP4 pretreatment. Mo-CBP4 did not impair the locomotor activity of animals in the open field test. In general, no toxic signs or adverse effects were seen after oral administration of Mo-CBP4 at a single dose (2000 mg/kg) or after repeated doses (10, 40 and 100 mg/kg). Similarly, cytotoxicity and genotoxicity tests with Mo-CBP4, using tumour or normal cells, showed no toxicity. The results suggest that due to anti-inflammatory and antinociceptive properties, high stability and apparent lack of toxicity, Mo-CBP4 has great potential as a future biopharmaceutical drug.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Seminal plasma is the fluid portion of semen and its presence positively affects the survival and parameters of sperm motility in rabbits. This study aimed (i) to verify the seminal concentrations of sodium, chloride and citric acid as a function of collection month, the color and aspect of the ejaculate, and to find the frequency of ejaculations with the presence of gel fraction, color and aspect of the semen of rabbits on tropical climate, (ii) to meet monthly protein spots and their possible correlation with seminal and biochemical parameters in rabbits. 20 rabbits of New Zealand White, raised in the flat-deck, fed commercial feed were used. The samples were collected twice a week, and then evaluated for volume, color, aspect, vigor, motility and sperm concentration. After the evaluations, the samples were centrifuged to obtain seminal plasma, which was stored in eppendorfs tubes at -18 oC. A monthly seminal plasma pool of each animal was made to evaluate the concentrations of sodium, chloride, citric acid and proteins. Significant monthly variations were found (p <0.05) in the concentrations of sodium, chloride and citric acid in the seminal plasma of rabbits. All mineral constituents analyzed suffered significant influence (p <0.05) by the color of the ejaculate, and the highest concentrations were found in the white-yellowish ejaculates. Correlation studies found a high and significant association between concentrations of sodium and vigor (r = 0.80, p <0.001), and between sperm concentration and citric acid (r = -0.64, p <0.02). Most of the ejaculates of rabbits showed no gel fraction. The results also showed that the white and milky ejaculate are the most common for the species. It was also observed an average concentration of 2.73  0.31 mg / dl total protein in samples of seminal plasma. From the quantification of total protein were prepared two-dimensional electrophoresis gels stained SDS-PAGE with silver nitrate, with a pH gradient between 3 â 10, mesh 15% and a concentration of 100 mg of protein per sample for each month. Gels were analyzed with the Image Master 2D Platinum 6.0.  software. The gel containing the most spots (555 spots) was the gel of the month of May, and the gel with fewer spots (71 spots) was observed in January, but no effect of month on the amount of spots was detected. The majority of spots present in seminal plasma of rabbits have pI below 8, and these spots, about 40% have pI acid, the distribution of the spots as a function of pI was homogeneous throughout the year. The distribution of spots depending on the molecular weight widely varied between the months. Except of a few months, most of the protein had a molecular weight above 100 kDa. The number of protein spot positively and moderately correlated with total protein (r = 0.57, p <0.05) and citric acid (r = 0.59, p <0.05). In silico analysis of 1411 protein spots found compatible proteins with the Swiss-Prote database and TrEMBL (UniProtKB). It is concluded that the composition of the seminal plasma of rabbits showed a broad monthly variation and ejaculated with high concentrations of citric acid are undesirable. In addition, the protein profile of rabbits has great affinity of the proteins to acidic and high molecular weight, no influence of the months of the year on the amount of protein spots identified were found and bioinformatics analysis tool does not provide consistent results with those obtained gel electrophoresis, but it allows an estimate of the probable proteins that can be found. / O plasma seminal representa a porÃÃo fluida do sÃmen e sua presenÃa afeta positivamente a sobrevivÃncia e os parÃmetros de motilidade espermÃtica em coelhos. Este trabalho teve como objetivos (i) verificar as concentraÃÃes seminais de sÃdio, cloretos e Ãcido cÃtrico em funÃÃo do mÃs de coleta, da cor e do aspecto do ejaculado, e encontrar a frequÃncia de ejaculados com presenÃa de fraÃÃo gel, cor e aspecto do sÃmen de coelhos criados em clima tropical; (ii) conhecer os spots proteicos mensais e suas possÃveis correlaÃÃes com parÃmetros seminais e bioquÃmicos de coelhos. Foram utilizados 20 coelhos da raÃa Nova ZelÃndia Branca, criados em sistema flat-deck, alimentados com raÃÃo comercial. Os ejaculados foram coletados duas vezes por semana, e logo avaliados quanto ao volume, cor, aspecto, vigor, motilidade e concentraÃÃo espermÃtica. ApÃs as avaliaÃÃes os ejaculados foram centrifugados para obtenÃÃo do plasma seminal, que foi acondicionado em tubos eppendorfs a -18 oC. Um pool mensal de PS de cada animal foi feito para avaliaÃÃo das concentraÃÃes de sÃdio, cloretos, Ãcido cÃtrico e proteÃnas totais. Foram constatadas variaÃÃes mensais significativas (p<0,05) nas concentraÃÃes de sÃdio, cloretos e Ãcido cÃtrico no plasma seminal de coelhos. Todos os constituintes minerais analisados sofreram influencia significativa (p<0,05) da cor do ejaculado, e as concentraÃÃes mais elevadas foram constatadas nos ejaculados de cor branco-amarelada. O estudo de correlaÃÃes encontrou associaÃÃo alta e significativa entre as concentraÃÃes de sÃdio e vigor (r=0,80; p<0,001), bem como entre a concentraÃÃo espermÃtica e o Ãcido cÃtrico (r=-0,64; p<0,02). A maior parte dos ejaculados de coelhos nÃo apresentaram a fraÃÃo gel. Os resultados tambÃm mostraram que o ejaculado de cor branca e de aspecto leitoso sÃo os mais comuns nessa espÃcie. TambÃm foi verificado uma concentraÃÃo mÃdia de 2,73 Â0,31 &#956;g/dl de proteÃnas totais nas amostras de plasma seminal. A partir da quantificaÃÃo das proteÃnas totais foram confeccionados dois gÃis de eletroforese bidimensional SDS-PAGE corados com nitrato de prata, com gradiente de pH entre 3 â 10, malha de 15% e uma concentraÃÃo de 100 &#956;g de proteÃnas por amostra, para cada mÃs. Os gÃis foram analisados no software Image Master 2D Platinum 6.0. Â. O gel que continha o maior nÃmero de spots (555 spots) foi o do mÃs de maio, e o gel com menor nÃmero spots (71 spots) foi verificado em janeiro, mas nÃo houve efeito do mÃs sobre a quantidade de spots detectados. A maioria dos spots presentes no plasma seminal de coelhos tem pI abaixo de 8 e, destes spots, cerca de 40% tem pI Ãcido, a distribuiÃÃo dos spots em funÃÃo do pI foi homogÃnea ao longo do ano. A distribuiÃÃo dos spots em funÃÃo do peso molecular variou amplamente entre os meses. Com exceÃÃo de alguns os meses, a maioria das proteÃnas apresentaram peso molecular acima de 100 kDa. O nÃmero de spot proteicos correlacionaram-se moderada e positivamente com as proteÃnas totais (r=0,57; p<0,05) e com o Ãcido cÃtrico (r=0,59; p<0,05). A anÃlise in silico dos spots encontrou 1.411 proteÃnas compatÃveis com os bancos de dados Swiss-Prote e TrEMBL (UniProtKB). Concluiu-se que a composiÃÃo do plasma seminal de coelhos apresentou ampla variaÃÃo mensal e que ejaculados com alta concentraÃÃo de Ãcido cÃtrico sÃo indesejÃveis. AlÃm disso, o perfil proteico de coelhos apresenta grande parte das proteÃnas com afinidade a meio Ãcido e com alto peso molecular, nÃo houve influencia de meses do ano sobre a quantidade de spots proteicos detectados, e devido à ausÃncia de dados sobre coelhos, a ferramenta de anÃlise bioinformÃtica nÃo ofereceu resultados coerentes, mas permite uma estimativa das provÃveis proteÃnas que podem ser encontradas.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / Os efeitos da utilizaÃÃo de subprodutos animais em dietas para o camarÃo Litopenaeus vannamei sÃo pouco conhecidos. O presente estudo avaliou o desempenho zootÃcnico e as respostas alimentares de juvenis do camarÃo L. vannamei quando alimentados com dietas contendo subprodutos do abate de animais terrestres e de resÃduos do processamento de peixes como substitutos parciais ou totais da farinha de peixe. O trabalho foi dividido em duas etapas, uma consistindo do cultivo de camarÃes de 2,03  0,21 g por 72 dias em tanques de 500 l, sob um regime de recirculaÃÃo e filtragem contÃnua da Ãgua. Na segunda etapa, os subprodutos animais foram avaliados em um aquÃrio de dupla escolha quanto a sua atratividade alimentar para camarÃes de 7,12  0,65 g. As dietas usadas no cultivo consistiram de um controle S14 contendo 14,37% de farinha de resÃduos da filetagem de salmÃo cultivado, sendo as demais acompanhadas pela substituiÃÃo parcial ou total deste ingrediente: dieta Pl7+S10 com 7,00% de farinha de plasma de sangue suÃno ultra-filtrado e seco por pulverizaÃÃo, dieta Sg7+S9 com 7,00% de farinha de sangue seca por pulverizaÃÃo, dieta Ca13+S6 com 12,95% de farinha de carne e ossos 40, dieta Pn14+S4 com 14,39% de farinha hidrolisada de penas, dieta Cb18+S2 com 17,72% de farinha de carne e ossos 45, dieta Til15 com 15,12% de farinha de resÃduos da filetagem de tilÃpia cultivada, dieta PV15 com 16,24% de farinha de penas e vÃsceras de aves, dieta V16 com 16,24% de farinha de vÃsceras de aves e dieta Px19 com 18,67% de farinha de resÃduos da filetagem de peixes marinhos da pesca extrativista. Para as avaliaÃÃes de atratividade, os ingredientes foram incorporados a uma inclusÃo de 3,0% em uma raÃÃo constituÃda apenas por ingredientes de origem vegetal. Na despesca, foi observada diferenÃa estatÃstica significativa entre os tratamentos para todos os parÃmetros zootÃcnicos avaliados. Com exceÃÃo da dieta Sg7+S9, todas as demais dietas levaram a uma reduÃÃo no peso corporal final do L. vannamei em relaÃÃo à dieta controle (11,05  0,18 g). Comparado à dieta S14, houve tambÃm uma perda significativa no ganho de produtividade (dieta PV15, 288  30 vs. 555  59 g/m2), crescimento semanal (dietas PV15, Til15 e Cb18+S2, 0,55  0,02, 0,60  0,05, 0,67  0,04 vs. 0,87  0,07 g, respectivamente), consumo alimentar (dieta PV15, 8,9  0,42 vs. 13,5  0,02 g/camarÃo) e fator de conversÃo alimentar (dieta PV15, 2,24  0,18 vs. 1,74  0,08). As avaliaÃÃes de atratividade demonstraram que com exceÃÃo da farinha de carne e ossos 45, farinha hidrolisada de penas e farinha de vÃsceras de aves, todas as proteÃnas animais apresentaram um baixo percentual de escolhas e (ou) alta rejeiÃÃo alimentar comparado com a farinha de salmÃo. Em conclusÃo, a farinha de sangue seca por pulverizaÃÃo e a farinha de vÃsceras de aves mostraram-se, dentro dos nÃveis de inclusÃo adotados, como os ingredientes mais recomendados para substituiÃÃes parciais e totais da farinha de salmÃo, respectivamente, em dietas para juvenis do camarÃo L. vannamei. / The dietary effects of land and aquatic animal by-products on the growth performance of the white shrimp Litopenaeus vannamei are little known. This study evaluated the growth performance and feeding responses of juvenile shrimp L. vannamei when fed diets which partially or completely replaced a salmon byproduct meal for rendered animal byproducts obtained from the slaughtering of land animals and from fish processing waste. The work was divided into two phases, one consisting of rearing 2.03  0.21 g shrimp for 72 days in 500 l tanks, under clear-water with continuous water recirculation and filtration. In the second phase, two-by-two comparisons were carried out with each individual ingredient in a double-choice aquarium using 7.12  0.65 g shrimp. In the growth study, diets consisted of a control diet S14 with 14.37% of a salmon byproduct meal, while others contained animal proteins in partial or complete replacement of this ingredient: diet PL7+S10 with 7.00% spray-dried swine plasma meal, diet SG7+S9 with 7.00% spray-dried blood meal, diet Ca13+S6 with 12.95% meat and bone meal 40% crude protein (CP), diet Pn14+S4 with 14.39% hydrolyzed feather meal, diet CB18+S2 with 17.72% meat and bone meal 45% CP, diet Til15 with 15.12% farmed-tilapia processing waste meal, diet PV15 with 16.24% poultry byproduct with feather meal, diet V16 with 16.24% poultry byproduct meal and diet Px19 with 18.67% fisheries by-catch and processing waste meal. For the attractability assays, animal protein ingredients were added at a 3.0% dietary inclusion in a plant-based diet. At harvest, shrimp displayed statistically significant differences for all growth parameters evaluated. With the exception of diet S9+SG7, all other diets led to a reduction in the final body weight of L. vannamei compared to the control diet (11.05  0.18 g). In comparison to diet S14, there was also a significant loss in the gain of yield (diet PV15, 288  30 vs. 555  59 g/m2), weekly growth (diets PV15, Til15 and CB18+S2, 0.55  0.02, 0.60  0.05, 0.67  0.04 vs. 0.87  0.07 g, respectively), feed intake (diet PV15, 8.9  0.42 vs. 13.5  0.02 g/shrimp) and feed conversion ratio (diet PV15, 2.24  0.18 vs. 1.74  0.08). The percentage of positive choices and (or) rejection of feed intake was poorer for all animal ingredients than the salmon byproduct meal, except for the meat and bone meal 45% CP, the hydrolyzed feather meal and the poultry by-product meal. In conclusion, in diets for juvenile shrimp L. vannamei, the spray-dried blood meal and the poultry by-product meal, were the most recommended animal ingredients for partial and total replacement of salmon byproduct meal, respectively, within the maximum levels of dietary inclusion adopted.

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / Moringa oleifera Lam. à uma Ãrvore conhecida pelo seu valor medicinal, uma vez que extratos de todas as partes desta planta mostraram propriedades farmacolÃgicas reconhecidas pelo uso popular e corroboradas pela comunidade cientÃfica. Dentre as atividades farmacolÃgicas, destacam-se Ãquelas relacionadas a processos inflamatÃrios. Este trabalho teve como objetivo o isolamento e caracterizaÃÃo de uma proteÃna ligante à quitina de sementes de Moringa oleifera e avaliaÃÃo de suas atividades antinociceptiva e anti-inflamatÃria. As proteÃnas foram extraÃdas da farinha delipidada de sementes e o extrato total foi fracionado em albuminas e globulinas. A fraÃÃo albumÃnica foi submetida à cromatografia de afinidade em matriz de quitina. A fraÃÃo ligante à quitina eluÃda com N-acetil-D-glucosamina 0,1 M foi submetida à cromatografia de troca iÃnica acoplada a um sistema de FPLC, rendendo cinco picos protÃicos. O material eluÃdo com tampÃo acetato de sÃdio 0,5 M, pH 5,2, contendo NaCl 0,6 M, denominado Mo-CBP4 (Mo â Moringa oleifera; âCBP â âchitin binding proteinâ), teve um rendimento final de 0,54% e foi escolhido para dar continuidade ao trabalho. Mo-CBP4 apresentou-se como duas bandas protÃicas de massas moleculares aparentes de 27,5 e 16,5 kDa, em condiÃÃes nÃo-redutoras, e de 9,8 kDa em condiÃÃes redutoras. Eletroforese bidimensional desta proteÃna revelou a presenÃa de dois spots (18,7 e 13,4 kDa), com mesmo ponto isoelÃtrico (pI de 10,55). Trata-se de uma glicoproteÃna com 2,85% de carboidratos, nÃo apresentando atividade hemaglutinante. Mo-CBP4 mostrou-se tÃo eficiente quanto o sulfato de alumÃnio e potÃssio na capacidade de coagular material em suspensÃo na Ãgua. A proteÃna em questÃo foi resistente à proteÃlise no teste de digestibilidade in vitro utilizando pepsina, tripsina e quimotripsina. Para avaliar os efeitos antinociceptivo e anti-inflamatÃrio de Mo-CBP4, foi utilizado o modelo de contorÃÃes abdominais induzidas pela injeÃÃo de Ãcido acÃtico 0,8% (via i.p.) em camundongos. A proteÃna, nas doses de 1,0, 3,5 e 10 mg/kg, foi capaz de prevenir as contorÃÃes de maneira dose dependente, chegando a 98,9% de inibiÃÃo na dose de 10 mg/kg. Mo-CBP4 tambÃm apresentou atividade antinociceptiva por via oral (10 mg/kg), atingindo uma inibiÃÃo de 52,9% quando administrada 60 minutos antes da injeÃÃo de Ãcido acÃtico. Mo-CBP4 inibiu o aumento da permeabilidade vascular (89,1%) e a migraÃÃo leucocitÃria (60,9%) na dose de 10 mg/kg via i.p. A propriedade antinociceptiva parece ser independente do sÃtio de interaÃÃo ao carboidrato N-acetil-D-glucosamina, enquanto que a atividade anti-inflamatÃria mostrou um decrÃscimo quando a regiÃo de ligaÃÃo ao carboidrato foi bloqueada. Os resultados apresentados suportam cientificamente o uso popular da M. oleifera e mostram que uma proteÃna ligante à quitina, Mo-CBP4, està associada aos efeitos antinociceptivo e anti-inflamatÃrio das sementes / Moringa oleifera Lam. is a perennial multipurpose tree with a strong scientific evidence of its curative power and used in folk medicine to cure several inflammatory processes. This work aimed to isolate and characterize a chitin-binding protein from Moringa oleifera seeds, and evaluate its antinociceptive and anti-inflammatory effects. Chitin-binding proteins were obtained after application of albumin fraction from crude extract of M. oleifera seeds into a chitin column and the adsorbed fraction was applied in a Resource-S matrix attached to FPLC system. The fraction eluted with 50 mM sodium acetate buffer, pH 5.2, containing 0.6 M NaCl, named Mo-CBP4 was used for the experiment. Mo-CBP4 showed a single band on SDS-PAGE (molecular mass 9.8 kDa) in presence of reducing agent, however in the absence of 2-mercaptoethanol two bands corresponding to 27.5 and 16.5 kDa were observed. Bidimensional electrophoresis of this protein revealed the presence of two spots (18.7 and 13.4 kDa), with the same isoeletric point value corresponding to 10.55. Mo-CBP4 is a glycoprotein containing 2.85% neutral sugar, which failed to agglutinate untreated or trypsin-treated erythrocytes from rabbit or human origin. This protein showed coagulant activity, similar to aluminum and potassium sulfate, the coagulant most widely used in water treatment. Mo-CBP4 was subjected to in vitro digestion with pepsin, trypsin, or chymotrypsin and appeared to be markedly resistant to digestion. Acetic acid-induced abdominal constrictions, increase in vascular permeability and leukocyte migration tests were used for the antinociceptive and anti-inflammatory activities assessment. Mo-CBP4 (1.0, 3.5 and 10 mg/kg) into mice potently and significantly reduced the occurrence of abdominal writhing in a dose dependent manner by 18.9, 44.6% and 98.9%, respectively. In addition, the oral administration of the protein (10 mg/kg) resulted in 18% and 52.9% reductions in abdominal writhing when given 30 and 60 min prior to acetic acid administration, respectively. Mo-CBP4 also caused a significant and dose-dependent inhibition of peritoneal capillary permeability induced by acid acetic and significantly inhibited leukocyte accumulation in the peritoneal cavity. The effect antinociceptive appeared to be independent on the carbohydrate recognition site. However the anti-inflammatory activity was partially reversed when Mo-CBP4 was pre-incubated with specific carbohydrate ligand, showing that this effect is dependent on the carbohydrate recognition site

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / A Caatinga possui uma vegetaÃÃo heterogÃnea cuja biodiversidade taxonÃmica conta com mais de 2.000 espÃcies de plantas. Dentre essas, cerca de 220 pertencem à famÃlia das leguminosas com 80 espÃcies endÃmicas, Ãnicas desse bioma. Muitas sÃo usadas para diversas finalidades de forma indiscriminada, reduzindo consideravelmente a diversidade e o nÃmero de espÃcies antes mesmo do conhecimento de suas potencialidades. Estudos que possam agregar valor econÃmico e viabilizar o uso racional, sustentÃvel e a conservaÃÃo das mesmas, aliada à constante busca por novas fontes de proteÃnas vegetais para atender à demanda crescente da populaÃÃo, bem como a grande necessidade de descoberta de compostos naturais que auxiliem no combate aos patÃgenos humanos e de plantas, sÃo de extrema relevÃncia. Assim, o presente estudo objetivou avaliar o potencial nutricional e bioativo de sementes de dez espÃcies vegetais da Caatinga destacando a espÃcie mais promissora. Para tanto, dez espÃcies de leguminosas selvagens da Caatinga foram analisadas quanto a sua composiÃÃo nutricional, apresentando elevado percentual de proteÃna bruta (10,9  0,4 a 50,0  3,4 %), fibras (0,8  0,0 a 52,3 Â1,0 %) e energia (1.000 a 1.804 kJ/100g), com perfil de aminoÃcidos comparÃveis aos da soja, com maiores teores de lisina (1088 a 456 mg/gN) e histidina (199 a 918 mg/gN) e bom perfil de minerais por apreentar boas quantidades de (mg/100g de farinha) de todos eles, em especial, de ferro (3,8 a 20,2), cÃlcio (31 a 268), magnÃsio (102 a 244) e potÃssio (366 a 1.581). As sementes apresentaram baixas quantidades de lectinas (80 a 2.560 e 160 a 2.560 UH/gF, quando nÃo tratadas e tratadas com enzimas, respectivamente), inibidores de tripsina (4,1  0,4 a 27,4  0,2 &#61549;gTI/mgF ), ureases (465  13 a 47.178  3.351 U/KgF) e atividade tÃxica, em apenas trÃs espÃcies, com DL50 variando de 0,72  0,03 a 1,12  0,04 g/Kg peso. Foi determinado um Ãndice de qualidade nutricional para todas as espÃcies, o qual apontou a espÃcie Piptadenia moniliformis Benth. (Catanduva) como detentora de melhor qualidade nutricional, sendo assim destacada e avaliada in vivo a qualidade das proteÃnas de suas sementes. Os processamentos tÃrmicos (fervura, cozimento em micro-ondas e autoclavagen) e o processo de extraÃÃo de &#61537;-galactosÃdios nas sementes dessas espÃcies nÃo proporcionaram bom desempenho dos animais, tendo em vista a perda de peso apresentada. Melhoria nos parÃmetros nutricionais, como NPU e VB foi verificada apÃs a retirada de &#61537;-galactosÃdios dessas sementes, sugerindo que a anÃlise de outros processamentos para o aproveitamento das proteÃnas de suas sementes, pode tornÃ-las uma fonte promissora. AlÃm do alto potencial nutricional, as dez espÃcies apresentam tambÃm potencial bioativo devido à presenÃa de metabÃlitos secundÃrios como alcalÃides, catequinas, calchonas, auronas, flavonÃis, fenÃis flavonas, xantonas, flavononÃis, saponinas e triterpenÃides. Possuem proteÃnas bioativas como proteases, quitinases (0,23  0,02 a 2,0  0,33 nKat/mgP), &#946;-1,3-glucanases (0,01  0,0 a 0,8  0,01 nKat/mgP), alÃm de proteÃnas ativas contra microorganismos que tambÃm sÃo consideradas antinutricionais (lectinas, inibidores de tripsina, ureases e toxinas). A avaliaÃÃo dos extratos brutos (EB) das espÃcies mostrou que todas sÃo ativas contra larvas de Aedes aegipty com percentual de mortalidade variando de 13,33  0,54 a 100,00  0,00 %, exceto o EB de Caesalpinea bracteosa que foi ativo contra a cepa Bacillus subtilis e contra o fungo Fusarium oxysporum, juntamente como o EB de Dioclea megacarpa. A espÃcie Senna rugosa inibiu o crescimento das cepas Bacillus subtilis e Staphylococcus aureus. Os fungos fitopatogÃnicos Aspergilus niger e Colletotrichum truncatum foram inibidos pelos EBs de Piptadenia moniliformis e Enterolobium contortisiliquum, que alÃm destes, foi ativo frente a Neurospora sp. e Trichoderma viridae. A espÃcie P. moniliformis destacou-se por sua elevada atividade quitinÃsica (1,12  0,0 nKat/mgP) em adiÃÃo à atuaÃÃo contra modelos biolÃgicos susceptÃveis a essa enzima, tendo sido escolhida para sua purificaÃÃo. A fraÃÃo proteica purificada de P. moniliformis (PmFP) contÃm elevada atividade de quitinases e causou pequena reduÃÃo no crescimento das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Candida tropicalis, bem como da bactÃria B. subtilis. Inibiu ainda, a eclosÃo de ovos de A. aegypti com CI50 de 204, 42  2,19 ÂgP/ml e alterou a estrutura dos ovos e morfologia das larvas de primeiro estÃdio. A investigaÃÃo do potencial nutricional e bioativo das espÃcies mostrou boa composiÃÃo de nutrientes, em especial de proteÃnas e confirmou a presenÃa de compostos bioativos de natureza proteica e de metabÃlitos secundÃrios, tornando-as promissoras fontes de nutrientes e compostos antimicrobianos e anti-inseticidas que podem ser utilizados biotecnologicamente para fins agrÃcolas e industriais / The Caatinga Biome shows an heterogeneous vegetation with a taxonomic biodiversity of over 2,000 species of plants. Among these, approximately 220 belong to the Leguminosae family with 80 endemic species, unique to that biome. Many are used for various purposes in an indiscriminate manner, greatly reducing the variety and number of species even before the knowledge of their potential uses. Studies that can add economic value and enable the rational, sustainable use of these species, coupled with the constant search for new sources of plant protein to meet the ever increasing demand of the population are extremely important. Similarly important is the search for natural compounds which may help to combat human and plant pathogens. Thus, this study aimed to assess the nutritional and bioactive value of the seeds of ten plant species from Caatinga, highlighting the most promising ones. For this, the seeds were analyzed for nutritional composition, showing a high percentage of crude protein (10.9  0.4 to 50.0  3.4%), dietary fiber (0.8  0 , 0 to 52.3  1.0%) and energy (1,000 kJ/100g a1.804), with amino acid profile similar to that of soybeans, with higher amounts of lysine (1088-456 mg/gN) and histidine (199-918 mg/gN) and good mineral profile, with good content (mg/100 g flour) for all of them, especially, iron (3.8 to 20.2), calcium (31 to 268), magnesium (102-244) and potassium ( 366-1581). The seeds showed low amounts of lectins (80-2560 and 160-2560 UH / gF, when untreated and treated with enzymes, respectively), trypsin inhibitor &#61549;(4.1  0.4 to 27.4  0.2 GTI / mgF), urease (465  13 to 47,178  3,351 U / KGF) and toxic activity in only three species, with LD50 ranging from 0.72  0.03 to 1.12  0.04 g / kg body weight . Was given an index of nutritional quality for all species, which pointed to Piptadenia moniliformis Benth. species (Catanduva) as the most promising one and because of that the seeds of this species was had the quality of its proteins evaluated in vivo. The thermal processing (boiling, microwave cooking and autoclaving) as well as the removal of &#945;-galactosides did not improve animals performance. The nutritional parameters NPU and BV were improved when the animals were fed the seeds diet after removal of the &#945;-galactosides. This may indicate that the search for apropriate processing methods may turn these seeds a promising source of proteins. Besides the high nutritional potential, the seeds of the ten studied species also have bioactive potential due to the presence of secondary metabolites such as alkaloids, catechins, calchonas, Auron, flavonols, flavones phenols, xanthones, flavononols, saponins and triterpenoids. These seeds also have bioactive proteins such as proteases, chitinases (0.23  0.02 to 2.0  0.33 nkat / mg P), &#946;-1,3-glucanase (0.01  0.0 to 0.8  0, 01 nkat / mg P), and proteins active against microorganisms that are also considered antinutritional factors (lectins, trypsin inhibitors, urease and toxins). The evaluation of the crude extracts (CE) of the seeds showed that all species are active against the larvae of Aedes aegipti with mortality rates ranging from 13.33  0.54 to 100.00  0.00%, except that of Caesalpinea bracteosa which similarly to the CE of Dioclea megacarpa, was active against the bacterium Bacillus subtilis and against the fungus Fusarium oxysporum. Seeds extract of Senna rugosa species was able to inhibit the growth of Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus. The pathogenic fungi Aspergillus niger and Colletotrichum truncatum were inhibited by the CE of Piptadenia moniliformis and Enterolobium contortisiliquum. The latter was also active against Neurospora sp. and Trichoderma viridae. The species P. moniliformis was distinguished for its high chitinase activity (1.12  0.0 nkat / mg P) in addition to its activity against biological models susceptible to this enzyme. For these reasons attempts were made for its purification. The purified protein fraction of P. moniliformis (PmFP) contains high activity of chitinases and caused a small reduction in the growth of the yeasts Saccharomyces cerevisiae and Candida tropicalis, and of the the bacterium B. subtilis. This protein fraction also inhibits the hatching of A. aegypti eggs with IC50 of 204. 42  2.19 &#956;gP / ml. It causes changes in the eggs structure and in the morphology of first stage larvae. Thus, investigation of bioactive and nutritional potential of the species showed good composition of nutrients, especially of proteins, and confirmed the presence of bioactive compounds from protein nature and secondary metabolites, making them promising sources of nutrients, antimicrobial and insecticides that can biotechnologically be used for agricultural and industrial purposes.

Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / O pinhÃo-manso (Jatropha curcas L.) à uma planta oleaginosa, pertencente à famÃlia Euphorbiaceae, cujas sementes sÃo reconhecidas como matÃria-prima com potencial para a produÃÃo de Ãleo. Essa planta tambÃm à considerada tolerante a condiÃÃes adversas, tais como dÃficit hÃdrico e deficiÃncia nutricional do solo, o que favorece o seu cultivo em regiÃes Ãridas e semiÃridas. Objetivou-se avaliar os efeitos do estresse salino sobre a germinaÃÃo e a mobilizaÃÃo das reservas de sementes e plÃntulas de pinhÃo-manso, por meio de anÃlises bioquÃmicas, fisiolÃgicas e ultraestruturais. Os parÃmetros germinativos foram negativamente afetados pelo estresse salino, observando-se reduÃÃes significativas principalmente no percentual de germinaÃÃo e no Ãndice de velocidade de germinaÃÃo. Similarmente, a matÃria seca, avaliada no eixo embrionÃrio e no endosperma, foi reduzida pela salinidade. Com relaÃÃo aos compostos de reserva, os lipÃdios foram os mais abundantes, correspondendo a 64,0% da matÃria seca do endosperma da semente quiescente. Estes compostos apresentaram forte retardo em sua mobilizaÃÃo em condiÃÃo de estresse salino. As proteÃnas, a segunda reserva mais abundante (21,3%), tambÃm tiveram sua mobilizaÃÃo severamente afetada pelo tratamento salino. O amido foi detectado em pequena quantidade (5,5%), porÃm, verificou-se o aumento transiente de seu teor aos 5 dias apÃs a semeadura (DAS), que coincidiu com a intensa mobilizaÃÃo de lipÃdios, em condiÃÃes controle. Entretanto, em condiÃÃes de estresse salino, o amido foi pouco mobilizado. Os produtos da mobilizaÃÃo das reservas, em condiÃÃes controle, principalmente os aÃÃcares nÃo-redutores e aminoÃcidos livres aumentaram no endosperma, enquanto que, sob condiÃÃes de salinidade, eles foram pouco alterados. AlÃm disso, as anÃlises citoquÃmicas e ultraestruturais confirmaram a abundante quantidade de lipÃdios e proteÃnas, sendo detectados inÃmeros corpos proteicos e lipÃdicos no citoplasma das cÃlulas endospÃrmicas dessas sementes. A salinidade tambÃm promoveu alteraÃÃes morfolÃgicas e ultraestruturais nas cÃlulas endospÃrmicas durante a germinaÃÃo e desenvolvimento de plÃntulas. O presente estudo tambÃm avaliou o metabolismo lipÃdico atravÃs da anÃlise da composiÃÃo dos Ãcidos graxos do endosperma e da anÃlise da atividade enzimÃtica e da expressÃo gÃnica das enzimas lipase, liase do isocitrato e sintase do malato. Os Ãcidos graxos insaturados foram os mais abundantes, destacando-se o oleico e o linoleico-linolÃnico, que apresentaram incrementos em seus teores, em condiÃÃes controle, ao longo do perÃodo avaliado, porÃm, sob estresse salino foram pouco alterados. A lipase apresentou incremento na sua atividade ao longo da germinaÃÃo, que coincidiu com a intensa mobilizaÃÃo de lipÃdios observada no controle. Similarmente, a reduÃÃo dessa atividade foi correspondente ao retardo na mobilizaÃÃo dos lipÃdios em condiÃÃo de estresse salino. A atividade enzimÃtica da liase do isocitrato nÃo apresentou diferenÃas significativas entre os tratamentos atà Ãs 96 horas apÃs a semeadura (HAS), porÃm apÃs esse perÃodo, verificaram-se as maiores reduÃÃes na condiÃÃo de estresse salino, quando comparado ao controle. Jà a atividade da sintase do malato foi significativamente maior em condiÃÃes controle atà Ãs 144 HAS, entretanto, a partir desse perÃodo, essa atividade se mostrou superior em condiÃÃes salinas. Verificaram-se reduÃÃes na atividade dessas enzimas em decorrÃncia do estresse, o que teve correlaÃÃo com as mudanÃas na expressÃo dos genes da lipase e liase do isocitrato. Portanto, pode-se concluir que a salinidade contribuiu para o retardo na mobilizaÃÃo dos lipÃdios, a principal reserva encontrada nas sementes de J. curcas, o que foi correlacionado a reduÃÃo na atividade das enzimas envolvidas no seu metabolismo. / Jatropha curcas L. is an oilseed species belonged to Euphorbiaceae family, whose seeds are recognized as promising source for biodiesel production. Its ability to survive in adverse conditions, such as water stress and poor nutritional soil, is noteworthy, which favors its cultivation in arid and semiarid regions. Here we evaluate the negative effects promoted by NaCl salt stress on seed germination, reserve mobilization of J. curcas through biochemical, physiological and ultrastructural analysis. The seed germination parameters were significantly affected by salt stress, being observed that the main parameters affected were germination percentage and germination speed index. Similarly, the embryo and endosperm dry mass were reduced by Na+ and Cl- increase in the medium. Considering the reserve compounds, the most abundant reserve of these seeds were the lipids, which corresponded to 64.0% of endosperm seed quiescent dry mass. They showed a stronger delay in reserve mobilization under saline conditions. Proteins were the second most important reserve (21.3%), being severally affected by salinity. The starch was detected in little amount (5.5% of quiescent seed dry mass), however there was a transient increase in this contents at 5 DAI (days after imbibition), which was correlated to the intense lipid mobilization, in control conditions. On the other hand, in salinity, it was observed that starch mobilization was reduced. The seed reserve products (mainly non-reducing sugars and free amino acids) were increased in endosperm in control in relation to quiescent seed, during germination, whereas for salt conditions, these products were few changed. Additionally, cytochemical and ultrastructural analyses confirmed the large amount of protein and lipid bodies in endosperm cells, reaching the identification of a huge amount of protein and lipid bodies. Salt stress promoted morphological and ultrastructural changes in endospermic cells, during germination and seedling development confirming the biochemical analyses. The present study also evaluated the lipid metabolism, using the fatty acid composition analysis and enzymatic and expression genic analyses for lipase, isocitrate liase, malate sintase. The unsaturated fatty acids were the most abundant, highlighting oleic (C18:1) and linoleic-linolenic (C18:2; C18:3), showing increase in their contents, in control conditions, during the evaluated period. However, the fatty acids practically were not changed in salinity conditions. Lipase showed increase in their activity during germination, which corresponded to intense mobilization in lipids in control. In similar way, the reduction of this activity happened in salinity, correlating to lipid delay mobilization. The evident delay of protein and oil body mobilization could strongly affect initial seedling development. The liase isocitrate activity did not show significant differences between treatments until 96 hours after imbibition (HAI), however, following this period, it was verified the strongest reduction in salt stress condition. The activity of malate synthase was not significantly higher in control conditions until 144 HAI, however, following this period, this activity was higher in salinity. It were verified reductions in enzymatic activity due to salt stress, which were correlated to gene expression changes of lipase and isocitrate lyase. Therefore, salinity contributed negatively to lipid mobilization, the main reserve of J. curcas seeds, which was correlated to reduction in activity of the enzymes involved in lipid metabolism.

FundaÃÃo de Amparo à Pesquisa do Estado do Cearà / A pesquisa foi conduzida no Setor de Suinocultura do Centro de CiÃncias AgrÃrias do Departamento de Zootecnia da Universidade Federal do CearÃ. O experimento teve a duraÃÃo de 42 dias e foi realizado com o objetivo de avaliar o desempenho zootÃcnico, a histomorfometria intestinal, o perfil microbiolÃgico fecal, a ocorrÃncia de diarrÃia, os indicadores sÃricos do metabolismo do nitrogÃnio e o custo de produÃÃo de leitÃes submetidos a dietas contendo diferentes fontes de proteÃna de origem animal e vegetal durante a fase 1 (21-42 dias de idade) e 2 (42-63 dias de idade) do perÃodo de creche. Participaram do ensaio, inicialmente, 80 leitÃes machos linhagem comercial desmamados aos 21 dias de idade e com peso mÃdio de 5,49kg. O delineamento experimental utilizado foi em blocos ao acaso, com 5 tratamentos, 4 repetiÃÃes e 4 animais por repetiÃÃo na 1 semana, 3 animais por repetiÃÃo na 2 semana e 2 animais por repetiÃÃo na 3 semana (final da fase 1) e por toda a fase 2, sendo feito o desdobramento num fatorial 2 x 2 + 1, composto por duas fontes protÃicas animal (farinha de carne - FC e plasma sanguÃneo em pà - PSP), duas fontes protÃicas vegetal (farelo de algodÃo - FA e farelo da amÃndoa da castanha de caju - FACC) e um adicional (dieta controle - T1). Quando a anÃlise de variÃncia detectou significÃncia entre os tratamentos, foram aplicados contrastes para testar os efeitos dos fatores. AlÃm disso, a comparaÃÃo de mÃdias para proteÃna de origem animal (POA) e proteÃna de origem vegetal (POV) com a dieta controle foi feita atravÃs do teste de Dunnet. As dietas experimentais foram isonutritivas com 22% de proteÃna bruta (PB) e 3.500 kcal ED/kg na fase 1, sendo T1 â Dieta controle (DC) + 10% de leite desnatado em pà (LDP); T2 â DC + 5% PSP+ 15% FA; T3 - DC + 5% FC + 15% FA; T4 â DC + 5% PSP + 15% FACC e T5 - DC + 5% FC + 15% FACC. Para a fase 2 os tratamentos continham 21% PB e 3.400 kcal ED/kg, sendo T1 â Dieta controle (DC) + 5% LDP; T2 â DC + 4% PSP+ 12% FA; T3 - DC + 4% FC + 12% FA; T4 â DC + 4% PSP + 12% FACC e T5 - DC + 4% FC + 12% FACC. Foi concluÃdo que a substituiÃÃo do LDP pelo PSP ou pela FC, como fontes protÃicas de origem animal, à viÃvel com respeito aos parÃmetros histomorfomÃtricos, na primeira e segunda semana da fase 1; contagem das colÃnias fecais (CCF) e concentraÃÃo plasmÃtica das proteÃnas totais (CPPT), ao final das fases 1 e 2; e concentraÃÃo plasmÃtica de urÃia (CPU), ao final da fase 2. Entretanto, para os parÃmetros de desempenho zootÃcnico, em ambas as fases; e ocorrÃncia de diarrÃia, na primeira semana da fase 1, apenas o PSP mostrou-se viÃvel. A inclusÃo de 15% de FA ou 15% de FACC, em substituiÃÃo parcial ao farelo de soja, como fonte protÃica de origem vegetal, à satisfatÃria em relaÃÃo aos parÃmetros histomorfomÃtricos, na primeira e segunda semana da fase 1; CCF, CPPT e CPU, ao final das fases 1 e 2; alÃm da ocorrÃncia de diarrÃia, na primeira semana da fase 1. Contudo para os parÃmetros de desempenho zootÃcnico apenas o FA revelou-se viÃvel em ambas as fases. NÃo foram registradas interaÃÃes significativas (P>0,05) entre os fatores (proteÃna de origem animal â POA x proteÃna de origem vegetal - POV) para os parÃmetros de desempenho zootÃcnico, nas fases 1 e 2; para a CCF e CPPT, ao final da fase 1 e 2; alÃm da CPU, ao final da fase 2. Entre os fatores (semana x dieta experimental) nÃo foram verificadas interaÃÃes significativas (P>0,05) para os parÃmetros histomorfomÃtricos. Todavia para a CPU, ao final da fase 1, foram constatadas interaÃÃes significativas (P<0,05). Na fase 1, a dieta controle, e as dietas contendo FC, como POA, e FACC, como POV, proporcionaram o maior nÃmero de cepas microbianas nas fezes dos leitÃes. Na fase 2, as dietas contendo PSP, como POA, e FA, como POV, proporcionaram o maior nÃmero de cepas microbianas nas fezes dos leitÃes. A melhor resposta econÃmica para produÃÃo de leitÃes no perÃodo de creche foi obtida com a dieta contendo PSP e FA (T2) / The research was developed in the Sector of Swine of the Department of Zootechnia of the Center of Agrarian Sciences of the Federal University of CearÃ. The experiment had the duration of 42 days and it was accomplished with the objective of evaluating the zootechnic performance, the intestinal histomorfometry, the fecal microbiological profile, the diarrhea occurrence, the serical indicators of the nitrogen metabolism and the production cost of piglets submitted to diets containing different sources of animal and vegetable protein origin during the phases 1 (21-42 days of age)and 2 (42-63 days of age) in the nursery period. They participated in the assay, initially, 80 male piglets of commercial lineage weaned at 21 days of age and with medium weight of 5,49kg. The experiment followed randomized blocks, with 5 treatments, 4 repetitions and 4 animals per repetition in the 1st week, 3 animals per repetition in the 2nd week and 2 animals per repetition in the 3rd week (end of phase 1) and for the whole phase 2, being made the unfolding in a factorial 2 x 2 + 1, composed by two sources of animal protein (meat meal - MM and powdered sanguine plasma - PSP), two sources of vegetal protein (cotton meal - CM and cashew nut meal - CNM) and an additional one (diet control - T1). When the variance analysis detected significance among the treatments, contrasts were applied to test the effects of the factors. Besides, the comparison of averages for protein of animal origin (PAO) and protein of vegetal origin (PVO) with the diet control which was done through the Dunnet tests. The diets were isonutritives with crude protein (CP) of 22% and level of energy of 3.500 kcal DE/kg in the phase 1, being T1 - Diet control (DC) + 10% of skimmed powdered milk (SPM); T2 - DC + 5% PSP+ 15% CM; T3 - DC + 5% MM + 15% CM; T4 - DC + 5% PSP + 15% CNM and T5 - DC + 5% MM + 15% CNM. For the phase 2 the treatments contained 21% CP and 3.400 kcal DE/kg, being T1 - Diet control (DC) + 5% SPM; T2 - DC + 4% PSP+ 12% CM; T3 - DC + 4% MM + 12% CM; T4 - DC + 4% PSP + 12% CNM and T5 - DC + 4% MM + 12% CNM. It was concluded that the substitution of SPM for PSP or for MM, as sources of protein of animal origin, is viable with regard to the histomorfometric parameters in the first and second week of phase 1; counting of the fecal colonies (CFC) and plasmatic concentration of total proteins (PCTP), at the end of phases 1 and 2; and plasmatic concentration of urea (PCU), at the end of phase 2. Nevertheless, for the parameters of zootechnic performance, in both phases; and diarrhea occurrence, in the first week of phase 1, just PSP was shown viable. The inclusion of 15% of CM or 15% of CNM, in partial substitution by the soybean meal, as source of vegetal origin protein, is satisfactory in relation to the histomorfometric parameters in the first and second week of phase 1; CFC, PCTP and PCU, at the end of phases 1 and 2; besides the diarrhea occurrence, in the first week of phase 1. However for the zootechnic parameters only the CM was revealed viable in both phases. Significant interactions were not registered (P>0,05) among the factors (protein of animal origin - PAO x protein of vegetal origin - PVO) for the zootechnic performance parameters, in phases 1 and 2, to the CFC and PCTP, at the end of phases 1 e 2; besides PCU, at the end of the phase 2. Among the factors (week x experimental diet) significant interactions were not verified (P>0,05) for the histomorfometric parameters. Though for PCU, at the end of the phase 1, significant interactions were verified (P <0,05). In the phase 1, the diet control, and the diets containing MM, like PAO, and CNM, like PVO provided the largest number of microbial stumps in the feces of the piglets. In phase 2, the diets containing PSP, as PAO, and CM, like PVO the largest number of microbial stumps in the feces of the piglets was provided. The best economical answer for production of piglets in the nursery period was obtained with the diet containing PSP and CM (T2)