Universidade Federal de Uberlândia / CHAPTER II: Infection in insects stimulates a complex defensive response. Recognition of pathogens may be accomplished by plasma or hemocyte proteins that bind specifically to bacterial or fungal polysaccharides. Several morphologically distinct hemocyte cell types cooperate in the immune response. Hemocytes attach to invading organisms and then isolate them by phagocytosis, by trapping them in hemocyte aggregates called nodules, or by forming an organized multicellular capsule around large parasites. In the current investigation the cellular population in the hemolymph third instar larvae of M. scutellaris has been characterized by means of light microscopy analysis and phagocytosis assays were performed in vivo by injection of 0,5μm fluorescence beads in order to identify the hemocyte types involved in phagocytosis. Four morphotypes of circulating hemocytes were found in 3rd instar larvae: prohemocytes, plasmatocytes, granulocytes and oenocytoids. The results presented plasmatocytes and granulocytes involved in phagocytic response of foreign particles in 3rd instar larvae of M. scutellaris. CHAPTER III: Insects are continuously exposed to potentially pathogenic microorganisms and eukaryotic parasites, but only a few encounters result in infection. Insects possess a complex and efficient system of biological defense against pathogens and parasites. This system involves the following: the integument and gut as physical barriers to infection, coordinated responses of several subpopulations of hemocytes when these barriers are breached, and the induced synthesis of antimicrobial peptides and proteins, primarily by the fat body. The purpose in the present study was to verify a Toll receptor (MsToll) expression in Melipona scutellaris. By semiquantitative RT-PCR we evaluate the MsToll levels at different development stages and in different M. scutellaris workers tissues. The MsToll expression in the immune response was evaluated by real time RT-PCR in workers infected with Escherichia coli (gram-negative). Our data showed lower MsToll expression in the larval stage compared with other development stages. The specific tissue analysis showed that its expression in intestine was significantly higher compared with other tissues analyzed. Furthermore, the MsToll levels in innate immune response of M. scutellaris showed four folds enhanced in bees infected with E. coli compared with control. / CAPITULO II: Infecção em insetos estimula uma resposta defensiva complexa. O reconhecimento de patógenos pode ser realizado pelos hemócitos ou proteínas que se ligam especificamente em microorganismos com padrões moleculares específicos, os chamados (PAMPs). Diferentes células da hemolinfa cooperam na resposta imune. Os hemócitos reconhecem os patógenos e os isolam por fagocitose, formando nódulos ou, cápsula multicelular em torno do parasita. Nesse trabalho foram identificadas as células da hemolinfa da abelha sem ferrão Melipona scutellaris e caracterizados os hemócitos envolvidos no processo de fagocitose utilizando beads de 0,5μm de diâmetro, em média, com fluorescência vermelha. Na hemolinfa do 3° instar larval de M. scutellaris foram distinguidos quatro tipos de hemócitos: prohemócitos, plasmatócitos, granulócitos e oenocitóides. No ensaio de fagocitose foram identificados plasmatócitos e granulócitos, com beads fluorescentes fagocitados no citoplasma. CAPITULO III: Insetos são continuamente expostos a microrganismos potencialmente patogênicos, mas apenas alguns contatos resultam em infecção. Insetos possuem um complexo e eficiente sistema de defesa contra patógenos e parasitas, que envolve o tegumento e intestino como barreiras físicas para infecção; respostas coordenadas de vários tipos de hemócitos quando estas barreiras são violadas e a síntese de peptídeos antimicrobianos e proteínas, principalmente pelo corpo gorduroso. Nosso objetivo foi clonar e sequenciar parcialmente um gene do sistema imune inato MsToll da abelha Melipona scutellaris. Por análises de RT-PCR semiquantitativo avaliou-se os níveis de expressão de MsToll em diferentes estágios do desenvolvimento e em diferentes tecidos de operárias de M. scutellaris. A expressão de MsToll na resposta imune foi avaliada por RT-PCR tempo real em operarias infectadas com Escherichia coli (gram-negativa). Os resultados mostraram menor expressão do gene MsToll nos estágios larvais quando comparados com os demais estágios do desenvolvimento. A análise tecido específico de MsToll mostrou que em intestino sua expressão foi significativamente maior quando relacionado com os demais tecidos analisados. Com relação aos níveis de MsToll na resposta imune observou-se o aumentou de quatro vezes dos níveis desse transcrito em abelhas infectadas com E. coli comparadas com o controle. / Mestre em Genética e Bioquímica

Physical exercise has been implicated in several immunophysiological improvements especially during the aging process when an immunocompromised status could be established. Toxoplasma gondii is a protozoan parasite that causes a widespread opportunistic infection, which may present severe consequences, particularly to the fetus and immunocompromised patients. It is estimated that one-third of the human population worldwide has been infected by this parasite, being the reactivation during immunesenescence an unexplored public health issue. The present study was designed to assess the immunophysiological differences between exercised versus sedentary C57BL/6 male mice that have been infected by T. gondii. Before the two key set of experiments, several other sets were carried out to the prospection of the main found data of this study. There were two main sets of experiments: in the first set, the animals were infected after exercising and three groups were formed: experimental groups - infected sedentary (IS, n=6); infected exercised (IEx, n=6) and control group - non-infected sedentary (NIS, n=6). When splenocytes were stimulated by T. gondii-soluble tachyzoite antigens, it was found an significant increasing (P<0.0001) in interferon-gamma (IFN-&#61543;) production concomitant with any changes in IL-10, allowing a greater IFN-&#61543;/IL-10 ratios, produced by the cells from exercised group compared to sedentary one. However, there was no difference concerning quantification of T. gondii genomic DNA by qPCR and immunohistochemistry analysis in brain cysts (P>0.05). In order to further investigate the consequences of these data for the host, a second set of experiments was performed, when the animals were infected before exercising and four groups of animals were established for comparison purpose, as follows: experimental groups - infected sedentary (IS, n=7); infected exercised (IEx, n=6) and control groups - non-infected sedentary (NIS, n=6) and non-infected exercised (NIEx, n=6). It was found that exercised group survived longer (P<0.05) than sedentary one. In both sets of experiments, mice have been submitted to moderate exercises: running (14m/min; 3x/week) and strength (60-80% of one-repetition maximum; 2x/week). In summary, moderated aerobic and strength exercises are able to modulate immune responses against T. gondii infection, being these immunological features beneficial to the host. / A prática regular de exercício físico tem sido relacionado com melhoras imunopatológicas, especialmente durante o processo de envelhecimento quando pode haver um estado de imunocomprometimento. O Toxoplasma gondii é um parasito protozoário que causa infecção oportunista de forma global, podendo apresentar consequências severas, particularmente ao feto e pacientes imunocomprometimentos. É estimado que um terço da população mundial esteja atualmente infectado por este parasito, sendo a reativação durante a imunossenescência um tópico em saúde pública não explorado. O presente estudo foi projetado para avaliar parâmetros de diferenças imunológicas entre camundongos machos C57BL/6 exercitados e sedentários que tenham sido infectados por T. gondii. Antes dos experimentos chaves vários outros conjuntos de experimentos foram realizados para prospecção dos principais achados desta tese. Houve dois conjuntos de experimentos principais: no primeiro conjunto de experimentos, os animais foram infectados após o início dos exercícios formando-se três grupos: um grupo controle - sedentário não infectado (NIS, IS, n=4); dois grupos infectados - um sedentário (IS, n=4) e um exercitado (IEx, n=6). Quando esplenócitos foram estimuladas com antígeno de taquizoíto solúvel de T gondii (STAg), encontrou-se uma maior produção de IFN-&#61543;, concomitante à uma manutenção das taxas de IL-10, que permitiu uma maior razão de IFN-&#61543;/IL10 (P<0,0001) para o grupo exercitado comparado com o sedentário. No entanto, não houve diferenças no que diz repeito a quantificação de DNA genômico de T. gondii pelas análises de qPCR e imunohistoquímica de cistos cerebrais (P>0,05). Com objetivo de se pesquisar posteriormente as consequências destes dados para o hospedeiro, um segundo conjunto de experimentos foram realizados, quando os animais foram infectados antes do início dos exercícios, e quatro grupos foram estabelecidos para comparação deste propósito, como se segue: dois grupos controles não infectados - sedentário (NIS, n=6) e exercitado (NIEx, n=6), e dois grupos infectados - sedentário (IS, n=7) e exercitado (IEx, n=6). Encontrou-se que o grupo infectado exercitado teve sua longevidade aumentada (P<0,05) comparado com o infectado sedentário. Em ambos os conjuntos de experimentos, os camundongos foram submetidos à exercícios moderados: de corrida (14 m/min; 3 x/semana) e resistido (60-80% de uma repetição máxima; 2x/semana). Em síntese, exercícios físicos aeróbicos e resistidos moderados são capazes de modular a resposta do sistema imune no combate da infecção por T. gondii sendo estas características imunológicas benéficas para o hospedeiro. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

A endometriose (EDT) é caracterizada pela presença de tecido endometrial fora da cavidade uterina, e afeta mulheres em idade reprodutiva. Postulamos que alterações na frequência de células T reguladoras (Treg), natural killer (NK), supressoras mielóides (MDSC) e dendríticas (DC) no peritônio justificariam a redução da capacidade do sistema imune de reagir contra as células endometriais, permitindo sua implantação em locais ectópicos. Aqui, células Treg, NK, MDSC e DC foram quantificadas no fluido peritoneal (FP) e sangue de mulheres com EDT, a fim de associa-las ao desenvolvimento da doença; níveis de citocinas também foram avaliados. Na EDT, observou-se aumento na frequência de Treg, MDSC e DC no sangue e aparente redução destas no FP; ainda, a concentração de IL-12 foi menor no sangue comparadas ao grupo controle. Não foram observadas diferenças quanto às células NK e as outras citocinas analisadas. Os resultados indicam aumento da frequência de populações reguladoras em amostras de sangue de pacientes EDT, entretanto esses resultados não são refletidos no FP. / Endometriosis (EDT) is a gynecological disease characterized by the presence of endometrial cells out of the uterine cavity, which affects women in reproductive age. We postulated that alterations in the frequencies of regulatory T cells (Treg), natural killer cells (NK), myeloid-derived suppressor cells (MDSC) and dendritic cells (DC) in the peritoneum could justify the reduced capacity of the immune system to react to these ectopic endometrial cells, allowing them to invade distant tissues. Here, Treg, NK, MDSC and DC were quantified in the peritoneal fluid (PF) and peripheral blood (PB) of women with EDT, in order to associate them with the development of EDT; cytokine levels were also assessed. In EDT, higher frequencies of Treg, MDSC and DC in the PB and apparent lower frequencies of these cells in the PF were observed; IL-12 concentration was smaller in PB of EDT compared to control. No differences between groups were observed for NK cells and the other cytokines evaluated. The results indicate higher frequencies of regulatory cells in PB samples of EDT patients, although these findings were not reflected in PF samples.

As interações entre o sistema nervoso central e os sistemas imune e endócrino são o objeto de estudo da psiconeuroimunologia. Protocolos de indução de estresse têm sido amplamente utilizados como métodos confiáveis de investigação da relação entre transtornos psiquiátricos, aspectos psicológicos, traços de personalidade, ansiedade e a resposta imune. O procedimento de simulação de falar em público (SFP) é um protocolo experimental validado que reconhecidamente é capaz de ativar o eixo hipotálamo-hipófise-adrenal (HPA) e produzir respostas de estresse em sujeitos humanos. Esse método foi utilizado para: 1) Comparar a reatividade imunológica de indivíduos com diagnóstico de fobia social com a de indivíduos sem qualquer diagnóstico psiquiátrico; 2) Investigar se ocorrem alterações imunes subseqüentes à exposição a um estressor agudo induzido em laboratório e 3) identificar e correlacionar parâmetros imunológicos com traços de personalidade, humor, níveis de ansiedade e medidas fisiológicas. Os traços de personalidade foram investigados por meio dos seguintes instrumentos: Inventário de Temperamento e Caráter (TCI), Escala de Afeto Positivo e Negativo (PANAS), Inventário de Ansiedade Traço (IDATE-T), Inventário de Depressão de Beck (BDI), Inventário de Estratégias de ?Coping? de Folkman e Lazarus e Adaptação da Escala de Percepção de Estresse (PSS). Os sintomas de ansiedade foram avaliados por meio da Escala Analógica Visual de Humor (VAMS), da Escala de Sintomas Somáticos (ESS) e do IDATE-Estado. As variáveis psicofisiológicas avaliadas foram pressão arterial sistólica (PAS), diastólica (PAD), batimentos cardíacos (BPM), resposta galvânica da pele (GSR) e temperatura. Os níveis plasmáticos de catecolaminas (adrenalina, noradrenalina e dopamina) e hormônios do eixo HPA (cortisol e ACTH) também foram dosados. Realizou-se a contagem de células imunes polimorfonucleares e mononucleares no sangue periférico e mediu-se a atividade citotóxica de células NK e neutrófilos. Dosou-se proteínas de fase aguda e imunoglobulinas (A, D, G, M e E) a produção de citocinas no sangue por ELISA e RT-PCR. Os dados foram submetidos a análises de variância para dados com medidas repetidas testando efeitos de grupo, sexo, momento experimental e interações. As correlações entre as variáveis foram testadas por regressões múltiplas e coeficientes de correlação de Pearson. Os resultados apontam que o SFP foi eficiente para induzir estresse e produzir alterações detectáveis em diversos dos parâmetros investigados. As diferenças entre fóbicos sociais e controles são significativas para traços de personalidade e atuam ao longo do tempo para as medidas psicofisiológicas. Alterações imunes e hormonais estiveram mais frequentemente associadas ao gênero do que ao grupo experimental, e afetaram mais homens. Além disso, as alterações imunes foram de pequena magnitude afetando componentes inespecíficos da resposta imune. Conjuntamente, os resultados apontam uma relativa ativação do eixo HPA em fóbicos mas que não corresponde a alterações imunes de mesma magnitude. Mais estudos com uma amostra maior e a investigação de outros parâmetros são necessários para compreender melhor como a fobia social afeta o sistema imune de homens e mulheres e investigar se as alterações podem aumentar a susceptibilidade a doenças nesse grupo de sujeitos. Uma vez que essa interação seja melhor compreendida poderá subsidiar estratégias mais adequadas para abordar e elaborar estratégias de prevenção e intervenção capazes de promover comportamentos saudáveis. / Interactions among the nervous, immune and endocrine systems are the object of study of Psychoneuroimmunology. Stress protocols have been broadly used as reliable means to investigate the relationship among psychiatric disorders, psychological aspects, personality traits, anxiety and immune response has been studied using these interactions. The Simulated Public Speaking (SPS) is a validated experimental procedure known to activate the Hypothalamus-Pituitary-Adrenal (HPA) axis and produce stress responses in human subjects. This method was used to: 1) compare the immune reactions of individuals with a diagnosis of social phobia to that of individuals without any psychiatric diagnosis; 2) investigate if immune alterations occur subsequent to the exposure to an acute laboratory induced stressor; 3) identify and correlate immune parameters with personality traits, mood, anxiety levels and physiologic measures. Personality traits were investigated with Cloninger?s Temperament and Character?s Inventory (TCI), Positive and Negative Affects Scale (PANAS), State-Trait Anxiety Scale (STAI?T), Beck?s Depression Inventory (BDI), Lazarus?s Coping Strategies Inventory, Perceived Stress Scale (PSS). Anxiety symptoms were investigated along the procedure with the Bodily Symptoms Scale (ESS), STAI-E and the Visual Analogue Mood Scale (VAMS). Psychophysiologic variables assessed were Systolic (PAS) and Diastolic (PAD) Blood Pressure, Heart Rate (BPM), Galvanic Skin Response (GSR) and temperature. Plasmatic circulating levels of cathecolamines (Adrenaline, Noradrenaline and Dopamine) and HPA axis hormones (Cortisol, ACTH) were assessed. Peripheral blood cell population counts were obtained for polymorphonuclear (PMN) and mononuclear cells. Cytotoxic activity of neutrophils and NK cells was assessed, as well as cytokine production by ELISA and RT-PCR. Acute phase proteins and immunoglobulins (A, D, G, M, and E) were dosed on peripheral blood. Data was submitted to variance analysis for data with repeated measures testing effects of group, sex, experimental moment and interactions on variables. Correlations among variables were tested by multiple regressions and Pearson?s correlation deltas. The results show SPS was efficient in inducing stress and produce detectable alterations in several of the parameters investigated. Differences between social phobics and controls are significant for personality traits and, along time for psychophysiologic measures. Hormonal and immune alterations were more often associated to gender rather than to the group subjects belonged to, with men being more susceptible to the procedure. Also, immune changes were of small magnitude, usually affecting inespecific components of the response. Together, the results point to a relatively higher activation of the HPA-axis in social phobics, but one that does not correspond to immune responses of the same magnitude. Further studies with a larger sample and investigation of other parameters are necessary to better understand how social phobia affects the immune system of men and women and to investigate if the alterations can increase susceptibility to diseases in this group of individuals. Once this interaction is better understood it may provide the basis for an improved design to approach and elaborate prevention/intervention strategies and promote healthy behaviours.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:07:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 mayara MAGGIOLI.pdf: 1675170 bytes, checksum: 97b59ecd07956bdec51efc9f0ffbb42a (MD5) Previous issue date: 2010-03-05 / Curraleiro breed has adapted to the extensive breeding in the Brazilian savanna. These rustic animals seem to be more resistant to regional endemic diseases. Resistance to infection is directly correlated to the host immune response. In order to check if differences might exist among Curraleiro s immune response and the response of other exotic cattle breeds in the savannah region, Curraleiro and Nellore calves were assessed before and after immunization with BCG vaccine. Twelve young calves (around six months of age) were used. After quarantine, the animals were divided into four groups: Control (three calves from each breed) and Vaccinated (three calves from each breed). The mononuclear cells were obtained from peripheral blood at time zero (before vaccination), one, seven and, thirty days after the vaccination. The cells were submitted to phagocytosis test, NO production and analysis by flow cytometry of the following populations: NK, T&#61543;&#61540;, CD4 e CD8 as well as for their IFN-&#61543;production. The intradermic test was realized in all calves forty-five days after vaccination. Macrophages from Curraleiro breed showed superior phagocytosis rates (7.650±3.661) than Nellore macrophages (2.970±1.282). Before BCG vaccination, Curraleiro calves had higher numbers of CD4+ cells (2049±402.3), CD8+ cells (1207±166), T&#61543;&#61540;WC1+ cells (1443/mL±384,6) in peripheral blood, than Nellore calves (CD4: 1240/mL ±337; CD8: 772.1/mL ±278.3; T&#61543;&#61540;WC1+: 745.5/mL ±67.22). The CD4 and CD8 IFN-&#61543; positive cells were also higher in Curraleiro animals. Vaccination was able to generate specific immune response on both breeds. Thirty days after vaccination, Curraleiro animals presented greater levels of CD4IFN-&#61543;&#61472;positive (202.8±44.96) cells than Nellore ones (143.7±40.43). The findings of this study support the Curraleiro resistance profile in comparison to Nellore breed, due to a better capacity to induce specific immune response to M. bovis-BCG vaccine. / A raça Curraleiro se desenvolveu e se adaptou à criação extensiva na região do cerrado brasileiro. Estes animais rústicos parecem ser mais resistentes às doenças endêmicas regionais. A resistência às infecções esta diretamente correlacionada a resposta imune do hospedeiro. Para verificar se existe alguma diferença na resposta imune de animais Curraleiros e outras raças exóticas criadas na região do cerrado, bezerros das raças Curraleiro e Nelore foram avaliados após a vacinação com Mycobacterium bovis- BCG. Foram utilizados animais com idade variando de 6 a 7 meses (n=12), provenientes do estado de Goiás. Depois da quarentena, os animais foram divididos em grupos: controles (3 de cada raça) e vacinados (3 de cada raça). Após obtenção das células mononucleares do sangue periférico nos dias zero (antes da vacinação), um, sete, quinze e trinta dias apos a vacinação, as mesmas foram submetidas a ensaios de fagocitose, produção de NO, quantificação por citometria de fluxo das populações celulares NK, T&#61543;&#61540;, CD4 e CD8 e de suas produções de IFN-&#61543;. Quarenta e cinco dias após a vacinação, os animais foram submetidos ao teste intradérmico. Macrófagos provenientes da raça Curraleira apresentaram naturalmente maiores índices de fagocitose de leveduras não sensibilizadas (7,650±3,661) quando comparados aos dos Nelore (2,970±1,282). Além disso, antes da vacinação, bezerros Curraleiros tiveram no sangue periférico maior número de TCD4+(2049±402,3), TCD8+(1207±166), T&#61543;&#61540;WC1+(1443/mL±384,6) que os bezerros Nelores (CD4-1240/mL ±337; CD8-772,1/mL ±278,3; T&#61543;&#61540;WC1+-745,5/mL ±67,22). Em adição, as células CD4 e CD8 IFN-&#61543; positivas foram superiores nos animais Curraleiros. A vacinação foi capaz de induzir resposta imune específica nas duas raças testadas. Trinta dias após a vacinação os Curraleiros apresentavam CD4IFN-&#61543;&#61472;positivas (202,8±44,96) superiores aos Nelores (143,7±40,43). Os resultados apresentados nesta dissertação favorecem o perfil de resistência da raça bovina Curraleira quando comparada a raça Nelore devido a melhor capacidade de induzir resposta imune específica à vacina M. bovis-BCG.

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:30:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSSERTACAO CRISTINA.pdf: 3986017 bytes, checksum: add734135c93af474b22c106a3a51d41 (MD5) Previous issue date: 2007-02-23 / Tuberculosis (TB) caused by the Mycobacterium tuberculosis is responsible for more than 2 million deaths annually in the world. Although one third of the world population carries the bacilli, only 5% of the infected people develop active disease. 80% of TB cases are concentrated among 21 countries and Brazil is one of them. Due to the flaws existent inherent to the TB diagnostic, many works try to discover TB antigens to be used on an ELISA assay to detect active TB in underdeveloped countries, endemic for other mycobacterias such as leprosy (L). Several researches are identifying bacilli proteins obtained under nutritional culture stress, in order to mimic the intracellular milieu. It has been selected the immunodominant ones as a disease marker. The objective of this work was to characterize the humoral immune response among TB patients to rMPT-51 and rGlcB using an ELISA indirect test. It was included voluntaries that were HIV negative and the ones without pregnancy, chronic disease or under immunosuppressant treatment. Serum IgM and IgG against MPT-51 and GlcB recombinant antigen from 49 patients with active tuberculosis were measured by indirect ELISA, paired by sex and age with: healthy PPD negative individuals (controls) and lepromatous leprosy patients (LL). Patients with TB (0.810±0.319) showed higher levels of IgM against rMPT-51 than both LL individuals (0.454±0.195) and control (0.448±0.162) with statistical significant, p= 0.001 and p<0.001) respectively. These test showed 96.9% specificity and 67.3% sensitivity. Conversely, tuberculosis, controls, and LL individuals showed lower of MPT-51 IgG levels, which could not be distinguished among the groups. rGlcB antigen was able to distinguished TB patients from controls for IgM levels (specificity, 95.9 % and sensitivity, 8.2% ) and IgG levels (specificity, 99% and sensitivity, 18.2%). In order to evaluate the profiles of IgM and IgG against rMPT-51 and rGlcB before and after chemotherapy, the sera from 11 patients was collected and paired according to the treatment status (before or after). IgM and IgG against MPT-51 remained with the same profile levels before and after the treatment. The levels of serum IgG against rGlcB clearly diminished after the chemotherapy (p<0.01). Our results suggest that serum IgM levels against recombinant MPT-51 could to be useful to distinguish between active TB, controls and LL individuals. In addition, after TB treatment the IgG response to rGlcB diminished suggesting that it could be used to follow up of the TB treatment / A tuberculose (TB) causada pelo Mycobacterium tuberculosis, resulta em mais de dois milhões de óbitos anualmente. Segundo dados da OMS cerca de 30% da população mundial está infectada com o bacilo e 5% desses infectados desenvolvem a doença ativa. O Brasil juntamente com outros 21 países albergam 80% de todos os casos de TB no mundo. Devido às falhas existentes nos diagnósticos atuais, muitos estudos tentam descobrir antígenos do Mycobacterium tuberculosis que podem ser usados no ensaio ELISA, um teste de baixo custo. Esse teste seria de grande valia na identificação da tuberculose, principalmente em países em desenvolvimento endêmicos também para outras micobactérias como M. leprae, causador da hanseníase. Várias pesquisas têm identificado componentes do bacilo, como as proteínas secretadas pelas micobactérias em cultura, sob condições de estresse nutricional, mimetizando a situação vivida pelo bacilo no meio intracelular. Dessas proteínas são selecionadas aquelas imunodominantes que podem ser usadas como marcadores da doença. O objetivo desse trabalho foi avaliar o reconhecimento de duas dessas proteínas: os antígenos recombinantes MPT-51 e GlcB do M. tuberculosis, por anticorpos séricos da classe IgM e IgG de pacientes com tuberculose ativa, pelo método imunoenzimático indireto (ELISA). Foram adotados como critério de inclusão aqueles indivíduos de qualquer grupo que fossem HIV negativos, sem doenças crônicas ou uso de medicamentos imunossupressores e mulheres não gestantes. Quarenta e nove pacientes com tuberculose ativa foram selecionados e comparados com os grupos: controles saudáveis PPD não reatores e pacientes hansenianos portadores da forma Virchoviana, pareados por sexo e idade. Os pacientes com TB (0,810±0,319) mostraram maiores concentrações de IgM anti-MPT-51 que os seus respectivos controles: pacientes com hanseníase 0,454±0,195) e controles saudáveis (0,448±0,162), com diferença estatística, p=0,001 e p<0,001 respectivamente. Os ensaios de ELISA nas dosagens de IgM e IgG anti-MPT-51 mostraram especificidade de 96,9% e 98,0% e sensibilidade 67,3% e 4,1% respectivamente. Para o antígeno GlcB, os ensaios de ELISA na dosagem de IgM e IgG mostraram especificidade de 95,9% e 99% e sensibilidade 8,2% e 18,2%. Onze pacientes com TB foram monitorados durante o tratamento, com realização de dosagens dos níveis de anticorpos IgM e IgG específicos ao rMPT-51 e rGlcB antes e após a terapia. Os níveis de anticorpos IgM e IgG anti-MPT-51 antes e após a terapia não sofreram alterações significativas. Entretanto, os níveis de IgG anti-GlcB diminuíram após a terapia (p<0,01). Nossos resultados sugerem que o rMPT-51 pode ser usado como marcador da tuberculose, quando mensuradas as concentrações de IgM específicos, pois foram capazes de discriminar pacientes TB, de controles e hansenianos. Apesar do ELISA ter demonstrado baixa sensibilidade quando o antígeno rGlcB foi utilizado, os níveis séricos dos anticorpos da classe IgG diminuíram após o tratamento da tuberculose (p<0,01) sugerindo que essa técnica poderia ser utilizada para o acompanhamento da terapêutica

A doença do enxerto contra o hospedeiro (DECH) é uma das maiores causas de mortalidade e morbidade pós-transplante de células-tronco hematopoiéticas. A DECH, em sua manifestação crônica (DECHc), ainda não tem sua fisiopatologia totalmente esclarecida; entretanto, o envolvimento do sistema imunológico, por meio de respostas imunes inatas e adaptativas é bem estabelecido na literatura. A DECHc afeta múltiplos órgãos, incluindo as glândulas salivares, o que tem, como causa imediata, a xerostomia. Essas alterações são largamente desconhecidas e sub-relatadas. Assim, esse estudo indagou se o sintoma de xerostomia na DECHc é decorrente de alterações morfológicas e funcionais das glândulas salivares. Para responder essa pergunta analisamos de forma qualitativa e por meio da morfometria, espécimes de biopsias de glândulas salivares labiais de pacientes com DECHc e com sintoma de xerostomia. Foram utilizados como controles, espécimes de biopsias de glândulas salivares de pacientes diagnosticados com Síndrome de Sjögren (SSp) (que é um modelo clássico de xerostomia) e de pacientes com líquen plano oral (LPO) (cujas manifestações clínicas orais podem se assemelhar às da DECHc) e queixa de xerostomia. Também foram analisadas, por meio de ensaio multiplex, as citocinas relacionadas à resposta imune Th17 (importante via imunológica na patogenia da DECHc) na saliva de 21 pacientes de DECHc, 27 de SSp, 10 de LPO e 15 voluntários saudáveis. Os principais achados morfológicos nas glândulas salivares dos pacientes de DECHc foram a extensa fibrose, fibroplasia periductal, atrofia ductal e acinar; alterações vasculares representadas pela congestão e formação de trombos hialinos; e infiltrado inflamatório intersticial difuso de aspecto leve a moderado. As glândulas salivares de SSp, entretanto, apresentaram um infiltrado inflamatório na forma de focos de linfócitos ao redor dos ductos excretores de intensidade moderada a severa; os ductos excretores apresentaram-se atróficos, ectásicos, exibindo metaplasia oncocítica e fibroplasia periductal; as alterações vasculares, por sua vez, se apresentaram em maior proporção na forma de vasculite. No LPO as alterações teciduais foram menos intensas. Quando analisadas as concentrações das citocinas, na DECHc, foram encontradas maiores concentrações de IL-17A, IL-4, IL-17F e IL-10, em relação aos grupos controles, essas citocinas estão envolvidas em mecanismos prófibróticos, o que permitiu a correlação dessa expressão aos eventos escleróticos nas glândulas salivares dos pacientes de DECHc. Entre elas, a IL-17F apresentou uma tendência de aumento em relação a proporção da área de fibrose nas glândulas salivares destes pacientes. A CD40L, que também esteve presente em maior concentração nos pacientes de DECHc, é uma molécula de ligação capaz de amplificar a resposta imunológica no mecanismo de rejeição do enxerto no hospedeiro, além de regular o mecanismo de apoptose e ativar o endotélio para a formação de trombos. As citocinas IL-31, IL-23 e IL-22, também apresentaram relevância na saliva dos pacientes de DECHc, sendo participantes do mecanismo das alterações liquenóides no LPO. Através das análises comparativas foi possível correlacionar a presença de citocinas envolvidas na resposta Th17 com as alterações glandulares e consequente xerostomia nos pacientes de DECHc. / The graft versus host disease (GVHD) is one of the biggest causes of mortality and morbidity after hematopoietic stem cells transplantation. The pathophysiology in the chronical manifestation of the disease (cGVHD), is not entirely elucidated, however the involvement of the immunological system, by means of the innate and adaptive responses are depicted in the literature concerning the disease development. The cGVHD affects multiple organs, including the salivary glands, leading to xerostomia. These alterations are under reported and mostly unknown. Therefore, this study investigated if the symptom of xerostomia in cGVHD is triggered by functional e morphological changes in minor salivary glands. To answer this inquiry specimens of biopsied labial salivary glands from patients of cGVHD and xerostomia were analyzed qualitatively and through morphometry. Specimens of biopsied salivary glands from patients with Sjögren\'s Syndrome (SS) (which is a classic model of xerostomia) and from patients with oral lichen planus (OLP) (whose clinical oral manifestations resemble the cGVHD lesions) were used as controls. Also, the cytokines related to the immunological response Th17 (important immune pathway in cGVHD pathophysiology) in the saliva of 21 cGVHD patients, 27 of SS, 10 patients of OLP and 165 healthy individuals were analyzed using the multiplex assay. The major morphological findings revealed on the salivary glands of cGVHD patients were the extensive fibrosis, periductal fibrosis, ductal and acinar atrophy. Congestion and hyaline thrombi formation were the most important vascular changes shown among these specimens. A diffuse interstitial inflammatory infiltrate was observed, with varied intensity. The SS salivary glands, however, portrayed a focal inflammatory infiltrate, with moderate to severe intensity around the excretory ducts. These ducts exhibited atrophy, ectasia, periductal fibrosis and oncocytic metaplasia. The main vascular change presented in these patients was the manifestation of vasculitis. The salivary glands from the OLP patients showed a lesser amount of alterations. The multiplex assay revealed a higher concentration of the cytokines IL-17A, IL-4, IL-17F and IL-10 in the cGVHD samples, when compared to the other groups. These cytokines are involved within the promotion of fibrosis, which endorsed the association of these secretions with the salivary glands sclerotic mechanisms. The secretion of CD40L was higher in cGVHD samples; this membrane protein is capable of amplifying the immunological response in graft rejection, besides the capacity to regulate apoptosis and activate the endothelium in thrombi formation. The cytokines IL-31, IL-23 and IL-22, also presented a higher concentration in cGHVD patients\' saliva, these secretions are actively involved in the mechanisms of lichenoid lesions in OLP, corroborating the perceived morphological changes. The comparative analysis of the morphological and salivary changes in cGVHD confirmed the correlation of Th17 immunological response within the minor salivary glands injuries and consequent xerostomia in these patients.

A exposição limitada ao Plasmodium chabaudi induz proeminente imunidade celular, associada à proteção de células T da apoptose. Este estudo tem como objetivo verificar a influência da carga parasitária na geração e manutenção dos linfócitos T e B de memória ao P. chabaudi. Assim, camundongos C57BL/6 foram submetidos à infecção tratada (subpatente) ou não (patente) com cloroquina após a inoculação de 106 eritrócitos parasitados (EP) e analisados nos dias 0, 20, 60, 120 e 200. Com relação à memória de linfócitos T, no dia 20, as freqüências de células CD4+ memória/ativadas e respondedoras aos EP foram significativamente maiores nos animais do grupo subpatente. Os níveis máximos de IgG2a específica foram encontrados no dia 120 em ambos os grupos. O desafio dos animais com 108 EP mostrou que a imunidade protetora declina progressivamente, mas os grupos ainda são capazes de estabelecer resposta secundária eficiente que elimine o parasita. Assim, podemos concluir que a carga parasitária influencia a fase aguda, mas não impede a geração e manutenção das células T e B de memória. / One of the main characteristics of malaria is the intense policlonal activation of splenic T and B lymphocytes induced by the parasite and the consequent elimination, through apoptosis, of part of these cells. However, the limited exposure to the bloodstage malaria seems to induce a prominent cellular immunity, associated with the protection of T lymphocytes from apoptosis. With this in mind, this study aimed to verify the influence of the parasite load in the generation and maintenance of memory T and B cells specific for Plasmodium chabaudi chabaudi AS. In order to evaluate this idea, C57BL/6 mice were infected with 106 parasitized red blood cells (pRBC) and submitted to a patent (untreated) or subpatent infection (controlled with sub-curative doses of chloroquine every time parasitemia reached 1%). Splenocytes from these mice were analyzed at 20, 60, 120 and 200 days after infection, regarding the pRBC-specific T cell proliferation and the expression of surface molecules, as CD4, CD8, CD62L, CD45RB, CD44, CD45R-B220 and IgG. The parasitemia and the splenocyte phenotype were also monitored after the challenge with 108 pRBC. Regarding T cell memory, at day 20 of infection, the frequencies of effector/activated CD4+ T cells (CD62LLOW CD45RBLOW/HIGH) were significantly increased in animals from the patent group, which was strict linked with the highest cellular activation observed in these animals. On the other hand, the total numbers of pRBCproliferating T (CD4+ and CD8+) cells per spleen were approximately 3-fold increased in subpatent animals, indicating that these cells were protected from apoptosis as a result of the limited exposure to the parasite. However, in both groups, these parameters decreased to values similar to those in controls at day 200. The splenocytes from both groups produced Th1 cytokines in response to pRBC in all times of analysis, but at the early phase of infection, Th2 cytokines were also observed, but without differences between the infected groups. Regarding memory B cells, the frequency of sIgG+ cells was increased at day 20 of infection, when 11% and 9% of CD45R+ cells from patent and subpatent animals were positive, respectively. For both groups, specific IgG2a antibodies attained maximum serum levels at day 120, but at day 200, it is possible to observe a significant decrease of these levels only in the serum of patent mice. Moreover, at day 200 of infection, mice of subpatent group showed significantly higher amounts of IgG2a that recognized the intra-erythrocytic forms of the parasite and the surface of infected erythrocytes. Challenge of mice with 108 pRBC showed that protective immunity progressively decline with time and despite the higher levels of specific antibody in subpatent mice, both groups showed similar protection. In experiments of adoptive transference to CD28-/- mice, cells from 200-day infected mice were able to produce specific IgG2a antibodies, in a T CD4+ cell dependent way. In addition, we verified that CD45R+ cells of subpatent mice, when transferred to CD28-/- mice, secreted higher amounts of specific IgG2a and IgG1 antibodies, comparing to cells of patent mice. So, from this work, we can conclude that the parasite load has a great influence in the early immune response to P. chabaudi malaria and it also affects the generation and/or maintenance of memory B cells. Furthermore, according to our data, at least during the analyzed period, the loss of protective immunity against this parasite does not seem to be influenced by the acute-phase parasite load, but it can be a consequence of the progressive decline of T-cell memory response that occurs in patent and subpatent groups with time of infection.

A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um dos principais agentes etiológicos da diarréia infecciosa tanto em crianças no primeiro ano de vida, como em adultos. As infecções por EPEC são prevalentes nos países em desenvolvimento, principalmente nas populações de baixo nível sócio-econômico, como as encontradas no Brasil. A resposta imune na infecção por EPEC permanece pobremente caracterizada. O uso das novas tecnologias no desenvolvimento de vacinas vem reforçar à importância de se levar em consideração a via natural de infecção do patógeno e utilizá-la como tema de estudo, quando se pretende estudar a resposta imune a um determinado agente infeccioso. O objetivo deste trabalho foi efetuar o estudo da resposta imune em animais inoculados com bactérias vivas ou mortas, por meio de diferentes vias de imunização. As bactérias em estudo foram: a cepa de E. coli O86:H34 e a cepa protótipo de E. coli O127:H6. A cepa de E. coli pertencente ao sorotipo O86:H34 foi isolada de fezes de crianças com diarréia. Foram empregadas as cepas : E2348/69, DH5&#945; e as mutantes E2348/69 flic-, E2348/69 &#916;tir, E2348/69 EscN-, CVD 206 &#916;eaeA, UMD 872 &#916;EspA, UMD 864 &#916;EspB, UMD 870 &#916;EspD. No presente estudo os camundongos BALB/c foram inoculados pela via intragástrica com a cepa de E. coli O86:H34 viva ou cepas O86:H34 e O127:H6 mortas por formol, que foram utilizadas nas imunizações pela via intragástrica e pela via intramuscular. Por meio de ELISA foram determinados os níveis de anticorpos específicos dos isotipos IgG, IgA e IgM, assim como o direcionamento da resposta imune para importantes antígenos que participam do mecanismo de patogenicidade da bactéria. De acordo com o perfil de reatividade no Immunoblot foi avaliada a especificidade dos anticorpos presentes nos soros imunes obtidos, frente aos antígenos de \"whole cells\" ou complexo de membrana externa bacteriana, empregados na técnica de \"immunoblotting\". A resposta imune a proteínas, como EspA, EspB, Tir, intimina, flagelos e BFP observada em camundongos, tem um importante papel no esclarecimento da infecção por este patógeno .Pela primeira vez foi realizado um estudo utilizando diferentes vias de imunização por EPEC em camundongos. Este estudo permitiu a análise de antígenos de E. coli reconhecidos pelos anticorpos produzidos pelas inoculações de bactérias vivas ou mortas por meio de vias intragástrica e intramuscular em camundongos, em comparação com aqueles reconhecidos na infecção natural ou experimental humana. Por conseguinte, os dados obtidos poderão auxiliar no esclarecimento desse complexo mecanismo de patogenicidade e orientar na seleção de peptídeos a serem utilizados no preparo de produtos vacinais específicos. / Enteropathogenic Escherichia coli is one of the major ethiologic agent that causes infectious diarrhoea in both infants and adults individuals. EPEC infections are prevalent in developing countries, mainly in low social-economic populations, as those found in Brazil. The immune response of this infection is still insufficiently known. Use of new technologies in the development of vaccines has been reinforced the importance of taking in account the natural route of infeccion of pathogens and use of it in investigation on immune response to be elicited against a certain to infectious agent. The aim of the present investigation was to study the immune response in mice inoculated with dead or alive bacteria, by means of diverse immunization routes. E. coli O86:H34 strain and E. coli O127:H6 prototype were employed for immunization. E. coli strain belonging to O86:H34 serotype was isolated from faeces from infants with diarrhoea. The strains: E2348/69, DH5 &#945; and the mutants strains E2348/69 flic-, E2348/69 &#916;tir, E2348/69 EscN-, CVD 206 &#916;eaeA, UMD 872 &#916;EspA, UMD 874 &#916;EspB, UMD 870 &#916;EspD were employed. BALB/c mice were inoculated by intragastric route with alive E. coli O86:H34 strain or formalin-killed O86:H34 and O127:H6 strains intragastric and intramuscular immunization routes. The specific antibodies of isotypes IgA, IgG and IgM were determinated by means of ELISA and the course of the immune response for important antigens that participate in the patogenicity mechanism of bacteria could be analysed. By means of reactivity profile on immunobloting, the specificity of antibodies present in obtained sera against whole cells or the outer membrane complex of the bacteria were analysed. Immune response to proteins like EspA, EspB, Tir, intimin, flagelin and BFP in immunized mice may have an important meaning for elucidation of infection in this pathogen At the first time a research using different routes of immunization with EPEC strains in mice has been conducted. This study allowed to compare antigens from E. coli recognized in natural or experimental human infection, and consequentently these data may help in the elucidation of this complex mechanism of pathogenicity, and also to orientate the selection of peptides to be used in preparation of specific vaccines.

A Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) é um dos principais agentes etiológicos da diarréia infecciosa tanto em crianças no primeiro ano de vida, como em adultos. As infecções por EPEC são prevalentes nos países em desenvolvimento, principalmente nas populações de baixo nível sócio-econômico, como as encontradas no Brasil. A resposta imune na infecção por EPEC permanece pobremente caracterizada. O uso das novas tecnologias no desenvolvimento de vacinas vem reforçar à importância de se levar em consideração a via natural de infecção do patógeno e utilizá-la como tema de estudo, quando se pretende estudar a resposta imune a um determinado agente infeccioso. O objetivo deste trabalho foi efetuar o estudo da resposta imune em animais inoculados com bactérias vivas ou mortas, por meio de diferentes vias de imunização. As bactérias em estudo foram: a cepa de E. coli O86:H34 e a cepa protótipo de E. coli O127:H6. A cepa de E. coli pertencente ao sorotipo O86:H34 foi isolada de fezes de crianças com diarréia. Foram empregadas as cepas : E2348/69, DH5&#945; e as mutantes E2348/69 flic-, E2348/69 &#916;tir, E2348/69 EscN-, CVD 206 &#916;eaeA, UMD 872 &#916;EspA, UMD 864 &#916;EspB, UMD 870 &#916;EspD. No presente estudo os camundongos BALB/c foram inoculados pela via intragástrica com a cepa de E. coli O86:H34 viva ou cepas O86:H34 e O127:H6 mortas por formol, que foram utilizadas nas imunizações pela via intragástrica e pela via intramuscular. Por meio de ELISA foram determinados os níveis de anticorpos específicos dos isotipos IgG, IgA e IgM, assim como o direcionamento da resposta imune para importantes antígenos que participam do mecanismo de patogenicidade da bactéria. De acordo com o perfil de reatividade no Immunoblot foi avaliada a especificidade dos anticorpos presentes nos soros imunes obtidos, frente aos antígenos de \"whole cells\" ou complexo de membrana externa bacteriana, empregados na técnica de \"immunoblotting\". A resposta imune a proteínas, como EspA, EspB, Tir, intimina, flagelos e BFP observada em camundongos, tem um importante papel no esclarecimento da infecção por este patógeno .Pela primeira vez foi realizado um estudo utilizando diferentes vias de imunização por EPEC em camundongos. Este estudo permitiu a análise de antígenos de E. coli reconhecidos pelos anticorpos produzidos pelas inoculações de bactérias vivas ou mortas por meio de vias intragástrica e intramuscular em camundongos, em comparação com aqueles reconhecidos na infecção natural ou experimental humana. Por conseguinte, os dados obtidos poderão auxiliar no esclarecimento desse complexo mecanismo de patogenicidade e orientar na seleção de peptídeos a serem utilizados no preparo de produtos vacinais específicos. / Enteropathogenic Escherichia coli is one of the major ethiologic agent that causes infectious diarrhoea in both infants and adults individuals. EPEC infections are prevalent in developing countries, mainly in low social-economic populations, as those found in Brazil. The immune response of this infection is still insufficiently known. Use of new technologies in the development of vaccines has been reinforced the importance of taking in account the natural route of infeccion of pathogens and use of it in investigation on immune response to be elicited against a certain to infectious agent. The aim of the present investigation was to study the immune response in mice inoculated with dead or alive bacteria, by means of diverse immunization routes. E. coli O86:H34 strain and E. coli O127:H6 prototype were employed for immunization. E. coli strain belonging to O86:H34 serotype was isolated from faeces from infants with diarrhoea. The strains: E2348/69, DH5 &#945; and the mutants strains E2348/69 flic-, E2348/69 &#916;tir, E2348/69 EscN-, CVD 206 &#916;eaeA, UMD 872 &#916;EspA, UMD 874 &#916;EspB, UMD 870 &#916;EspD were employed. BALB/c mice were inoculated by intragastric route with alive E. coli O86:H34 strain or formalin-killed O86:H34 and O127:H6 strains intragastric and intramuscular immunization routes. The specific antibodies of isotypes IgA, IgG and IgM were determinated by means of ELISA and the course of the immune response for important antigens that participate in the patogenicity mechanism of bacteria could be analysed. By means of reactivity profile on immunobloting, the specificity of antibodies present in obtained sera against whole cells or the outer membrane complex of the bacteria were analysed. Immune response to proteins like EspA, EspB, Tir, intimin, flagelin and BFP in immunized mice may have an important meaning for elucidation of infection in this pathogen At the first time a research using different routes of immunization with EPEC strains in mice has been conducted. This study allowed to compare antigens from E. coli recognized in natural or experimental human infection, and consequentently these data may help in the elucidation of this complex mechanism of pathogenicity, and also to orientate the selection of peptides to be used in preparation of specific vaccines.