Castration-resistant prostate cancer (CRPC) remains an aggressive incurable disease in men mainly due to treatment resistance. Current treatments do not effectively eradicate cancer stem cells (CSCs), which play a pivotal role in tumour maintenance, progression and drug resistance. Aldehyde dehydrogenases (ALDHs) have been used in some tumour types as CSC markers. Their high expression and high functional activity found in CSCs is also associated with drug resistance. Emerging evidence suggests deregulation of certain ALDH isoforms have implications in cancer. The role of ALDHs in prostate cancer as potential biomarkers and therapeutic targets has not been fully explored yet. Accordingly, this study investigated the expression, regulation and function of selected ALDH isoforms in prostate cancer. This study showed that ALDH1A3, ALDH1B1, ALDH2 and ALDH7A1 are highly expressed in primary prostate cancer cells (n=9) compared to benign (n=9) prostate cells. The expression of ALDH1A3 was high in the stem cells (SCs) (n=3) as well as the more differentiated counterparts (n=16). Treatment of both benign and malignant primary prostate cancer cells with all-trans retinoic acid (atRA) also resulted in increased expression of ALDH1A3 and ALDH3A1, supporting a feedback loop between atRA and ALDHs. Furthermore, SerBob, Bob and LNCaP cells were sensitive to treatment with epigenetic drugs and led to significantly higher expression of ALDH1A2, ALDH3A1 and ALDH7A1 respectively. Importantly, siRNA suppression of ALDH1A3 and ALDH7A1 led to reduced SC properties of primary prostate cultures including reduced cell viability, migration and colony formation, and increased differentiation of transit amplifying (TA) cells to committed basal (CB) cells. Novel ALDH-affinic probes showed reduced cell viability of primary prostate epithelial cultures as a single agent and also when used in combination with docetaxel. The results indicate the potential of using ALDH-affinic compounds as single agents for therapeutic intervention or in combination with docetaxel to sensitise resistant cells to this anticancer drug. The data in this thesis provides novel findings, which supports ALDH1A2, -1A3 and -7A1 as potential biomarkers and/or therapeutic targets for drug intervention. Although, a study analysing a larger number of samples is necessary to fully understand ALDH isoform expression in CSC, TA and CB cells it is envisaged that an ALDH-targeted therapy have potential in future treatment strategies for prostate cancer. / Prostate Cancer UK

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Der humane Stammzellfaktor (SCF) ist ein zentraler Wachstumsfaktor für Mastzellen in der Dermis und für Melanozyten in den Basalzellschichten der Epidermis. Er wird u. a. von Keratinozyten produziert. In dieser Arbeit wurde die mögliche Regulation der Expression von SCF aus Keratinozyten durch All-Trans-Retinsäure (RA) und Dexamethason in vitro an Hand der HaCaT-Zelllinie untersucht. Die HaCaT-Zellen wurden mit den beiden o. g. Substanzen (10 hoch -5 M bis 10 hoch -9 M) über 24 Stunden und 11 Tage inkubiert. Die Auswertung der HaCaT-Zellzahl, des Gesamt-Proteins SCF, dessen Splicevarianten (mSCF, sSCF) und der Rezeptoren von RA (RAR-alpha, -beta, -gamma) und von Dexamethason (GR-alpha, -beta) erfolgte mittels ELISA und RT-PCR. Dabei ergaben sich folgende Resultate: RA bewirkt einen Anstieg von SCF, Dexamethason bewirkt bei Kurzinkubation eine deutliche Zunahme von SCF, bei Dauerinkubation einen starken Abfall. Die RA-Rezeptoren RA-alpha und -gamma waren nach Inkubation mit RA verstärkt nachzuweisen; die Glukokortikoid-Rezeptoren GR-alpha und -beta zeigten nach Inkubation mit Dexamethason ebenfalls eine vermehrte Expression. Die Expression des Mastzellwachstumsfaktors SCF könnte deshalb unter physiologischen, pathologischen und therapeutischen Bedingungen durch Retinoide und Glukokortikoide reguliert sein. / The human stem cell factor (SCF) is a crucial growth factor for mast cells in the dermis and for the melanocytes in the basal layers of the epidermis. SCF is produced, among others, by keratinocytes. This study examines the possible regulation of the expression of SCF from keratinocytes by all-trans retinoic acid (RA) and dexamethasone in vitro by the keratinocyte cell line HaCaT. The HaCaT-cells were incubated for 24 hours or 11 days, respectively, with one of the above mentioned substances (10 to the power of -5 M to 10 to the power of -9 M). The analysis of the number of HaCaT-cells, of the total SCF protein, its splice variants (mSCF, sSCF), the receptors of RA (RAR-alpha, -beta, -gamma), and of the dexamethasone (GR-alpha, -beta) was done by ELISA and RT-PCR. The following results were found: RA induces an increase of SCF, dexamethasone at a short incubation period a considerable increase of SCF, and at long-term incubation a strong decrease. The RA-receptors RA-alpha und -gamma expression is increased after incubation with RA, and the glucocorticoid-receptors GR-alpha and -beta after the incubation with dexamethasone. Therefore, it is probable that the increase of the mast cell growth factor SCF under physiological, pathological and therapeutic conditions could be regulated by retinoic acid and glucocorticoids.

Das Neuroblastom, ein embryonaler Tumor des sympathischen Nervensystems, stellt durch seine außerordentliche Heterogenität klinisch eine große Herausforderung dar. Ziel dieser Arbeit war es, die Expression der GATA-Transkriptionsfaktoren GATA-2, -3, -4 und des Kofaktors friend-of-GATA (FOG)-2 im Neuroblastom und im sich entwickelnden sympathischen Nervensystem zu vergleichen. Davon ausgehend wurde die Rolle der Proteine im Neuroblastom näher untersucht. Es wurde gezeigt, dass alle vier Proteine in humanem Neuroblastom-Gewebe sowie in einer humanen Neuroblastom-Zelllinie (SH-SY5Y) exprimiert werden und nukleär lokalisiert sind. Lediglich Gata-4 wurde jedoch im sich entwickelnden sympathischen Nervensystem der Maus nicht exprimiert. Die Einzigartigkeit von GATA-4 bestätigte sich auch durch Microarray-Analysen von 251 Neuroblastom-Proben. Während GATA-2, -3 und FOG-2 signifikant mit Markern für eine günstige Prognose assoziiert wurden, korrelierte die GATA-4 Expression mit MYCN-Amplifikation. Interessanterweise führte die lentivirale Überexpression von GATA-4 zu einer Proliferationsinhibition humaner Neuroblastomzellen (SH-SY5Y und SH-EP) sowie zu der verstärkten Expression von DPYSL3 und Bcl-2. Zudem konnte durch das Differenzierungsagens Retinsäure die GATA-4 Expression induziert werden. So wurde in dieser Arbeit bestätigt, dass normale Entwicklungsprozesse in prognostisch günstigen Neuroblastomen intakt sind. Umgekehrt sind in Tumoren mit schlechterer Prognose diese Prozesse gestört. Die in vitro verlangsamte Proliferation sowie die Induktion von Bcl-2 nach Überexpression von GATA-4 könnten in vivo bei der schlechteren Therapierbarkeit der prognostisch ungünstigen Neuroblastome eine Rolle spielen. Es ist bekannt, dass die Behandlung mit Retinsäure u. a. durch Bcl-2 zu einer Chemoresistenz führen kann. Da die Expression von GATA-4 durch Retinsäure induziert werden und GATA-4 die Expression von Bcl-2 verstärken kann, könnte GATA-4 an der Chemoresistenz beteiligt sein. / Neuroblastoma, an embryonal tumor of the sympathetic nervous system, remains clinically challenging due to its extreme heterogeneity. The aim of this study was to compare the expression of GATA transcription factors GATA-2, -3, -4 and the cofactor friend-of-GATA (FOG)-2 in neuroblastoma and in the developing sympathetic nervous system. The functional role of these proteins in neuroblastoma was subsequently investigated based on the results of the GATA expression studies. The analysis showed that all four proteins are expressed in human neuroblastoma tissue as well as in a human neuroblastoma cell line (SH-SY5Y) and are localized in the cell nuclei. Only Gata-4, however, was not expressed in the developing murine sympathetic nervous system. Its uniqueness was also confirmed by microarray analyses of 251 neuroblastoma specimens. While GATA-2, -3 and FOG-2 were significantly associated with favorable prognostic markers, GATA-4 expression correlated with MYCN-amplification. Interestingly, lentiviral GATA-4 overexpression led to inhibited proliferation of human neuroblastoma cells (SH-SY5Y and SH-EP) as well as to increased expression of DPYSL3 and Bcl-2. In addition, GATA-4 expression could be induced by the differentiation agent retinoic acid. In conclusion, it was confirmed that normal developmental molecular pathways are intact in prognostically favorable neuroblastoma. In contrast, these developmental processes seem to be defective in tumors with unfavorable prognosis. The slowed proliferation, as observed in vitro, as well as the induction of Bcl-2 brought about by GATA-4 overexpression may contribute in vivo to the difficult treatability of prognostically unfavorable neuroblastoma. It is known that treatment of neuroblastoma with retinoic acid can lead to chemoresistance, mediated by Bcl-2 amongst others. Since retinoic acid can induce the expression of GATA-4 and GATA-4 itself can enhance the expression of Bcl-2, GATA-4 could be involved in chemoresistance.

Retinoide sind Steroide, Derivate des Vitamin A, die ihre Wirkung durch Interaktion mit Retinoid-Rezeptoren, lokalisiert im Zellkern, entfalten. Diese Retinoid-Rezeptoren, weisen funktionelle und strukturelle Ähnlichkeiten mit dem Androgenrezeptor auf. Untersuchungen an Zellkulturen zeigen, daß der Effekt von Retinoiden auf das Zellwachstum von Prostata-Epithelzellen und Prostatakarzinomzellen keiner einfachen Kinetik folgt, sondern neben der Abhängigkeit von der Retinoid-Dosis, auch von der Zellinie, insbesondere deren Androgenrezeptor abhängt. So zeigten LNCaP-Zellen Unterschiede in der Zellproliferation im Vergleich zu PC3 oder NRP154 (Prostatakarzinom Ratte) und NRP152 (Prostataepithel Ratte). Northern-blots mit Poly(A)RNA von verschiedenen Prostata-Zellinien (benigne und maligne) nach Behandlung mit Retinoic acid (RA) bestätigte dosisabhängige Unterschiede in der Expression der Androgenrezeptor (AR)-mRNA.Umgekehrt verursachte die Behandlung mit Testosteron in verschiedenen Prostata-Zellinien (benigne und maligne) Unterschiede in der Expression der Retinoid-Rezeptor-mRNA für RAR( und RAR(. Die Ergebnisse unterstützen somit die Hypothese einer Interaktion von Retinoiden und Androgenen mit deren respektiven Rezeptoren. Untersuchungen an humanem Prostatagewebe bestätigten Unterschiede in der Expression von RAR(mRNA und RAR(mRNA mittels RT-PCR. Durch immunhistochemische Untersuchungen an humanem Prostatagewebe mit Antikörpern gegen RAR ( und RAR( konnten deren Lokalisation und Expression nachgewiesen werden. Dabei zeigte sich wiederum eine erhöhte Immunreaktivität von RAR( beim Prostatakarzinom, im Gegensatz zu RAR(, das bei benignem Prostataepithelium eine deutlich stärkere Immunreaktivität aufwies. Zusammenfassend belegen unsere Untersuchungen, daß Retinoide einen meist wachstumshemmenden Effekt auf Prostatakarzinomzellinien verursachen, der wahrscheinlich neben Bindung an Retinoid-Rezeptoren (RARs`) durch Interaktion mit dem Androgenrezeptor (AR), vermittelt durch Hemmung verschiedener membrangebundener Zellproteine und Rezeptoren, wie EGF-R verursacht wird. / Retinoids are steroids, derivatives of vitamine A, that excert their activities by interaction with the retinoic acid receptors (RARs') located in the cell nucleus. The RARs possess structural and functional similarities to the androgen receptor (AR). Investigations in cell cultures demonstrated that the effect of retinoic acid (RA) on cell proliferation is dependent not only on the RA dosage, but also on the androgen receptor status of the cell line. LNCaP cells showed a difference in cell proliferation when treated with RA, as opposed to PC3 or NRP154 (rat prostate cancer cell line) and NRP152 (rat prostate epithelial cell line). Northern blots with Poly(A)RNA from different prostate cell lines (benigne and maligne, with different androgen dependency) when treated with different concentrations of RA, demonstrated a dose-dependent expression of the androgen receptor (AR)mRNA. Conversely resulted the treatment with different concentrations of testosterone to different expressions of the RAR-mRNAs. The results, therefore, support the hypothesis of an interaction of retinoids and androgen with their respective receptors. Investigations with human prostate tissue (malignant and benign) confirms differences in RAR-expression byRT-PCR and immunhistochemistry. Again, prostate cancer showed an overexpression of RAR(, whereas benign prostate tissue demonstrated an overexpression of RAR(. Our investigations, in summary, demonstrate the overall inhibitory effect of retinoids with respect to cell proliferation in prostate cancer cell lines. There is evidence , that this biologic effect is not only triggert by interaction of retinoids and androgens with their own receptors, but occurs by cross-interaction of retinoids with the androgen receptor and androgens with the RARs. Furthermore, the biologic effect of retinoids on cell growth is dependent on membrane bound receptors, such as EGF-R.

Mastzellen (MZ) reifen zu terminal differenzierten Zellen erst in peripheren Geweben. ATRA ist ein wesentlicher Regulator der Hämatopoese und kann auf positive wie auf negative Weise deren Differenzierung beeinflussen – die Qualität ist dabei häufig abhängig vom Reifegrad. Die Arbeit beschäftigte sich daher mit der Frage, ob die Effekte von ATRA auf MZ ebenfalls abhängig von deren Reifegrad sind. Unreife HMC-1 5C6 Zellen, differenziertere LAD 2 Zellen und reife kutane MZ (KMZ) wurden mit ATRA behandelt und die Effekte auf spezifische Mastzellmarker auf Protein- und mRNA-Ebene untersucht. Die Proteinexpression von c-kit, FceRI, Tryptase und Chymase wurde bei allen drei Zellsystemen herunterreguliert. Änderungen der Proteinexpression wurden qualitativ, wenngleich nicht immer quantitativ auf mRNA-Ebene reflektiert, d.h. es gab Marker, bei denen die Herunterregulation auf der einen oder anderen Ebene überwog. Eine genaue Quantifizierung der ATRA-Effekte auf die Tryptase und Chymase zeigte eine prozentual erheblich stärkere Herunterregulation der mRNA als des Proteins. Invers dazu war der Effekt bei c-kit, ein Effekt, der besonders deutlich bei HMC-1 5C6 auszumachen war. Zur Klärung, welcher Mechanismus der von der mRNA-Ebene unabhängigen Herunterregulation des c-kit-Proteins zugrunde liegt, wurden HMC-1 5C6 zusätzlich zu ATRA mit Inhibitoren fundamentaler Zellfunktionen inkubiert. Cycloheximid allein war dabei in der Lage, die Wirkung von ATRA zu imitieren. Es kann also vermutet werden, dass die starke Herunterregulation des Proteins im Vergleich zur mRNA einem translationellen Mechanismus folgt. Betrachtet man alle Effekte gemeinsam, so zeigte ATRA den stärksten Einfluss auf das am weitesten differenzierte Mastzellsystem, nämlich KMZ. Geringer waren die Effekte bei LAD 2, wohingegen bei HMC-1 5C6 das schwächste Ansprechpotential gegenüber ATRA gefunden wurde. Dies ist von besonderem Interesse, weil ATRA normalerweise wesentlich potenter auf unreif-proliferierende Systeme wirkt. ATRA hat auf humane MZ einen deutlich dedifferenzierenden Effekt, der weitgehend unabhängig vom Reifegrad der Zellen operiert. Die Effekte scheinen dabei in Abhängigkeit vom betrachteten Marker nicht auf die transkriptionelle Ebene beschränkt zu sein, sondern könnten auch einem translationellen Mechanismus unterliegen. / Mast cells (MC) are of hematopoietic origin but complete their differentiation exclusively within tissues. A large number of mediators positively or negatively affect the maturation process of MC. ATRA is a potential master regulator of haematopoiesis, where it primarily affects immature and proliferative leukocytes. Here, the effects of ATRA (3-7d) on MC that span different stages of maturation, i. e. immature-leukemic HMC-1 5C6 cells, intermediately matured LAD 2 cells, and terminally differentiated skin MC were analyzed. The expression of the lineage markers c-kit, FceRI, tryptase, chymase und histidindecarboxylase (HDC) was studied in parallel at protein level by flow-cytometric analysis and at mRNA level by RT-PCR. ATRA exposure led to a down-regulation at protein and at mRNA level of c-kit, FceRI, tryptase and chymase by all MC subtypes. Comparing protein and transcript levels, however, substantial differences between c-kit and the proteases were noted. c-kit down-regulation was more pronounced at protein level, whereas the opposite was found with proteases. Further analysis revealed the existence of a second mechanism of c-kit down modulation that proceeded rapidly and independently of mRNA changes. This pathway was restricted to immature MC and could be mimicked by cycloheximide, suggesting that altered translation may account for the phenomenon. Taken together, the study indicates that MC are significant target cells of ATRA throughout their lifespan, but that the molecular events underlying down-regulation of lineage markers may be shifted in the course of MC differentiation. The strongest effects of ATRA were observed in mature MC, while this accounts to a lesser degree for LAD 2 cells. In contrast, the immature and highly proliferating HMC-1 5C6 cells presented even less sensitive to ATRA. Therefore, ATRA has dedifferentiating potential towards human MC that is most pronounced in mature MC. Depending on the specific marker, protein down regulation can underlie various mechanisms. In this regard, c-kit seems to follow a translational rather than transcriptional inhibitory process.

Des défauts dans la réponse à l’acide rétinoïque, un métabolite de la vitamine A essentiel au développement embryonnaire, entraîne des conséquences très sévères dans la formation et la fonction de plusieurs organes. En particulier, on retrouve, parmi les anomalies congénitales graves, de l'anophtalmie/microphtalmie (absence/réduction du globe oculaire) et de l'hypoplasie/agénésie pulmonaire. Ce patron clinique est associé au syndrome MCOPS12, une maladie pédiatrique rare causée par des mutations génétiques dans le récepteur RARb. Dans les cellules, l’acide rétinoïque interagit avec les récepteurs nucléaires RARa, RARb et RARg. Leur activation favorise la transcription de gènes essentiels au développement embryonnaire normal. Notre laboratoire vise à comprendre les mécanismes de régulation des RARs, pour mieux orienter nos approches thérapeutiques du syndrome MCOPS12. Dans le cadre de ce projet, nous avons étudié plus particulièrement la phosphorylation sur RARb. Nos objectifs étaient de déterminer les rôles des sites de phosphorylation dans le domaine AF-1 sur l’activité transcriptionnelle de RARb et de déterminer l’impact de la phosphorylation sur les variants de RARb associés au syndrome MCOPS12. Nos résultats par essais luciférases démontrent que RARb est régulé par les MAPKs. De plus, les sérines de l’AF-1 semblent essentielles pour maximiser la réponse du récepteur à l’acide rétinoïque et en réponse à la phosphorylation. Également, la phosphorylation sur les variants génétiques gain-de-fonction associés au MCOPS12 semble induire une augmentation de l’activité du récepteur. Avec son implication dans le syndrome MCOPS12, la compréhension des mécanismes régulateurs de RARb devient essentielle pour l’apport de solutions thérapeutiques efficaces. / Defects in the response to retinoic acid, a vitamin A metabolite essential to embryonic development, lead to very severe consequences in the formation and function of several organs. Among serious congenital anomalies, anophthalmia/microphthalmia (loss or reduction in size of the ocular globe) and hypoplasia/pulmonary agenesis are observed. This clinical pattern is linked with MCOPS12 syndrome, a rare pediatric disease caused by mutations in the RARb receptor. In our cells, retinoic acid interacts with nuclear receptors RARa, RARb et RARg. Activation of these receptors favors gene transcription for normal embryonic development. Our laboratory aims to understand the regulation mechanisms of RARs, to better orient our therapeutic approaches for the MCOPS12 syndrome. In this project, we studied the phosphorylation of RARb. Our objectives were to determine the roles of phosphorylation sites in the AF-1 domain on the transcriptional activity of RARb and to determine the impact of phosphorylation on the RARb variants associated with MCOPS12 syndrome. Our results from luciferase assays demonstrate that RARb is regulated by MAPKs. Furthermore, our results show that AF-1 serines seem essential to maximize receptor response to retinoic acid and phosphorylation. Additionally, phosphorylation of gain-of-function genetic variants associated with MCOPS12 syndrome appears to induce an increase in receptor activity. With its implication on MCOPS12 syndrome, the understanding the regulatory mechanisms of RARb becomes essential for providing effective therapeutic solutions.

Existeix certa controvèrsia sobre els efectes del b-carotè com a promotor o protector del càncer de pulmó. A més, el b-carotè, com a precursor de l'àcid retinoic, podria estimular la termogènesi i regular l'adipositat corporal. La fura representa un bon model per estudiar els efectes de la ingesta de b-carotè ja que l'absorbeix de manera pràcticament intacta (semblant als humans). Hem demostrat que el b-carotè ingerit amb altres antioxidants no sembla tenir efectes inductors del càncer ja que no augmenta la proliferació cel·lular al pulmó i a més prevé els efectes del carcinogen benzo[a]pirè. D'altra banda, dosis farmacològiques de b-carotè fan a la fura efectes contraris als de l'àcid retinoic, ja que augmenten l'adipositat i resulten en una menor capacitat termogènica, principalment al teixit adipós retroperitoneal que, a la fura, presenta certes característiques de teixit adipós marró, ja que té un percentatge considerable d'adipòcits multiloculars i expressa quantitats significatives d'UCP1. / Existe controversia sobre los efectos del b-caroteno como promotor o protector del cáncer de pulmón. Además, el b-caroteno, como precursor del ácido retinoico, podría estimular la termogénesis y regular la adiposidad corporal. El hurón representa un buen modelo para estudiar los efectos de la ingesta de b-caroteno pues lo absorbe de manera prácticamente intacta (similar a los humanos). Hemos demostrado que el b-caroteno ingerido con otros antioxidantes no parece tener efectos inductores del cáncer puesto que no aumenta la proliferación celular del pulmón y además previene los efectos del carcinógeno benzo[a]pireno. Por otra parte, dosis farmacológicas de b-caroteno producen en el hurón efectos contrarios a los del ácido retinoico, ya que aumentan la adiposidad y reducen la capacidad termogénica, principalmente del tejido adiposo retroperitoneal que, en el hurón, presenta ciertas características de tejido adiposo marrón, al contener un porcentaje considerable de adipocitos multiloculares y expresar cantidades significativas de UCP1. / The effects of b-carotene promoting or protecting against lung cancer are unclear. Furthermore, b-carotene, as retinoic acid precursor, could induce thermogenesis and regulate body adiposity. The ferret represents a good model to study the effects of oral administration of b-carotene because it absorbs it almost intact (similarly to humans). We have shown that the intake of b-carotene together with other antioxidants does not seem to inducecancer as it does not increase cellular proliferation in lung and prevents the effects of the carcinogen benzo[a]pyrene. In addition, pharmacological b-carotene doses in ferrets have different effects from retinoic acid, increasing adiposity and decreasing thermogenic capacity, especially in the retroperitoneal adipose tissue which, in ferrets, resembles brown adipose tissue, since it has an important percentage of multilocular adipocytes and expresses significant amount of UCP1.

En un intento de optimizar el sistema de fecundación in vitro en la especie porcina se estudió la influencia de distintas condiciones de maduración y de cocultivo de los gametos. Se evaluó la reducción del tiempo de coincubación de los gametos a 10 min observándose un claro efecto del ratio espermatozoides:ovocito. El estudio de las necesidades de los espermatozoides en términos de aditivos del medio de fecundación y tiempo de coincubación reveló variaciones entre verracos. La utilización de un tiempo de coincubación tan corto como 2 min fue suficiente para obtener unas tasas de penetración y monospermia similares a las alcanzadas por los sistemas de FIV tradicionales. El sistema de FIV en pajuela con 10 min de coincubación aumentó la penetración monoespérmica y mejoró la calidad de los blastocistos. La adición de 5 nM de 9- cis ácido retinoico al medio de maduración aumentó significativamente la formación de blastocistos. / The present study was conducted in an attempt to optimize porcine in vitro fertilization system. For this purpose, the influence of maturation and gamete coculture conditions were studied. The coincubation time may be reduced to 10 min to increase the efficiency of fertilization depending on the sperm:oocytes ratio. The needs of boar spermatozoa for IVF, in terms of additives to IVF medium and coincubation times vary among boars. The use of coincubation time as brief as 2 min is long enough to obtain good fertilization rates similar to those achieved from current long term exposure times in IVF. A straw IVF system in combination with a 10 min coincubation increased monospermic penetration and the quality of blastocysts compared with the microdrop-IVF system. The addition of 5 nM of 9- cis retinoic acid in the IVM medium increased blastocyst formation rate, suggesting that RA may play an important role during IVM.

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