In der vorliegenden Arbeit werden zwei Enzymsysteme – Ni-haltige Kohlenmonoxid-Dehydrogenase (CODH) und [NiFe]-haltige Hydrogenase – strukturell untersucht. Im 1. Teil werden die Untersuchungen des ACDS-Komplexes aus A. fulgidus mittels Transmissionselektronenmikroskopie (Negativkontrastierung und der Kryo-Einbettung) geschildert. Die 3D-Rekonstruktion mit einer Auflösung von 29 Å wird de novo ermittelt und drei mögliche Positionen für die CODH-Untereinheit vorgeschlagen. Im 2. Teil wird die Röntgenkristallstrukturanalyse der CODH-Untereinheit des ACDS Komplexes aus A. fulgidus geschildert. Das Protein besteht aus α- und ε-Untereinheiten, die zusammen eine α2ε2-Stöchiometrie bilden (Afα2ε). Während die Gesamtstruktur von Afα2ε2 jener von M. barkeri (Mbα2ε2) ähnelt, führt der Austausch der koordinierenden Cys zu Asp und Glu zu einer Deletion des verbrückenden FeS-Zentrums. Die Rolle der ε-Untereinheit wird durch kinetische Studien untersucht. Die CO-abhängige FAD-Reduktionsaktivität von Afα2ε2 folgt einer Michaelis-Menten Kinetik. Die Mbα2ε2 hat ein ähnliches Kinetikverhalten. Im Gegensatz dazu weist die CODH-II von C. hydrogenoformans, die keine ε-Untereinheit hat, eine lineare Abhängigkeit der CO-abhängigen FAD-Reduktionsaktivität von Flavin auf. Diese Beobachtungen sind im Einklang mit der Annahme, dass die ε-Untereinheit ein Gerüst für die Flavinbindung bereitstellt. Der 3. Teil ist der F420-reduzierenden Hydrogenase aus M. barkeri (MbFRH) gewidmet. Die Struktur von MbFRH wird mittels Röntgenkristallographie bestimmt und ergibt eine dodekamerische Anordnung von ca. 1.2 MDa. Zusammen mit der etablierten Elektronenübertragungskette, beobachtet in FRH aus M. marburgensis, wird in MbFRH auch ein [2Fe2S]-Cluster und eine Fe-Stelle detektiert. Schließlich führen die schwingungsspektroskopischen Analysen zusammen mit der Röntgenkristallographie zu dem Schluss, dass MbFRH in einem bisher strukturell nicht charakterisierten, katalytisch aktiven Nia-S Zustand isoliert wird. / In this work, we structurally characterize two metal-based enzyme systems from archaea: Ni-containing CO dehydrogenase (CODH) and [NiFe] containing hydrogenase. In the first chapter we investigate, using transmission electron microscopy, the ACDS complex from A. fulgidus (AfACDS). The purified ACDS complex can be visualized as an intact globular protein particle by negative stain and vitrification techniques. The 3D reconstruction is determined de novo to 29 Å-resolution by single-particle analysis. We suggest three possible positions for the CODH subunit within ACDS by rigid-body fitting. In the second chapter we determine the X-ray crystal structure of the CODH subunit. The 220 kDa protein is composed of α- and ε-subunits that form a heterodimer with (α2ε2) stoichiometry (Afα2ε2). While the overall structure of Afα2ε2 resembles the previously reported structure of the α2ε2-subunit from M. barkeri (Mbα2ε2), the naturally-occurring exchange of the Cys to Asp and Glu results in a depletion of the bridging iron-sulfur cluster. The role of the ε-subunit is investigated by kinetics studies. CO-dependent FAD reduction activity of Afα2ε2 exhibits Michaelis-Menten type kinetics. The same kinetic type is demonstrated for the Mbα2ε2-subunit. In contrast, the ε-subunit lacking CODH-II from C. hydrogenoformans shows linear dependency between CO-dependent FAD reduction activity and flavin concentration. The data suggests that the ε-subunit provides a scaffold for the flavin binding. In the third chapter we study the F420-reducing hydrogenase from M. barkeri (MbFRH). Its structure is solved by X-ray crystallography, revealing a dodecameric arrangement of 1.2 MDa. Along with the established ET chain observed in FRH from M. marburgensis, one solvent-exposed [2Fe2S] cluster and an additional Fe metal site are detected. The combined approach of X-ray crystallography and vibrational spectroscopy reveals that MbFRH is isolated in the previously structurally uncharacterized Nia-S state.

Kanalrhodopsine (ChRs) sind lichtaktivierte Ionenkanäle motiler Algen. Heterolog exprimiert erlauben sie es, Ionenflüsse durch Licht zu steuern. Bevorzugt geleitet werden von den meisten ChRs Protonen. Ausprägung und Wirkung lichtaktivierter Protonenflüsse sowie der molekulare Mechanismus protonenselektiver ChRs werden in vorliegender Arbeit untersucht und zur Entwicklung neuer optogenetischer Werkzeuge genutzt. Eine besonders hohe Protonenselektivität zeigten die grün- und rotlicht-aktivierten Kanäle CsChR und Chrimson aus den Algen Chloromonas subdivisa und Chlamydomonas noctigama. Im spektroskopisch detailliert untersuchten CrChR2 aus Chlamydomonas reinhardtii änderte sich die Protonenselektivität nach Anregung mit einem ns-Laserblitz sogar innerhalb eines Aktivierungszyklus und war insbesondere nach Öffnung des Kanals sowie in Folge der Lichtadaptation hoch. Als unentbehrlich für eine effiziente Protonenleitung erwiesen sich in allen drei Kanälen konservierte, titrierbare Reste entlang der Pore, deren individuelle Bedeutung für die Protonenleitung sich je nach Protein wesentlich unterschied. Entsprechend genügte in Chrimson der Austausch einzelner Glutaminsäuren des extrazellulären Halbkanals, dieses in einen grün- oder rotlichtaktivierten Natriumkanal zu transformieren. Aminosäuresubstitutionen der unmittelbaren Retinalumgebung verschoben hingegen das Aktionsmaximum von Chrimson röter als 600 nm und damit röter als in allen bisher beschriebenen ChRs. In Chrimson versperrt hierbei ein zusätzliches äußeres Tor den extrazellulär Halbkanal, während die Retinalbindetasche in Struktur und funktionaler Bedeutung der einzelnen Reste wesentlich jener der Protonenpumpe Bacteriorhodopsin ähnelt. Als Zwei-Komponenten-Optogenetik wurden schließlich protonen-, kationen- und anionenleitende ChRs unterschiedlicher Farbsensitivität fusioniert sowie lichtgetriebene Protonenpumpen mit protonenaktivierten Ionenkanälen kombiniert und neue optogenetische Perspektiven eröffnet. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels from green algae. Expressed in host cells they are used to control ion fluxes by light and are widely applied in Neurosciences. Although generally classified as either cation or anion channels, most ChRs preferentially conduct protons. This thesis compares proton conductance of different ChRs, examines the molecular mechanism of proton selective ChRs and explores the usage of light regulated proton fluxes in two-component-optogenetics. Proton selectivity varied strongly among different ChRs and was most pronounced for the green- and red-light activated channels CsChR and Chrimson from the algae Chloromonas subdivisa and Chlamydomonas noctigama, that conducted predominantly protons even at high pH. In CrChR2 from Chlamydomonas reinhardtii proton selectivity also changed during a single activation cycle and was especially high directly after channel opening and later on following light adaptation. In all three channels efficient proton conductance depended on conserved titratable residues along the pore with different contribution of the individual side chains in each protein. The substitution of single glutamic acids in the extracellular half pore converted Chrimson into a green or red-light activated sodium channel. A single point mutation close to the retinal chromophore shifted peak absorption of Chrimson beyond 600 nm - further red than all other cation conducting ChRs. Whereas the retinal binding pocket of Chrimson resembles the proton pump Bacteriorhodpsin, the overall pore structure corresponds to other ChRs, but features an additional outer gate, that occludes the extracellular half pore and is important for both, proton selectivity and red light absorption. Finally different Two-Component-Optogenetic approaches combined proton and anion selective ChRs of distinct colour as well as light-driven proton pumps and proton-activated ion channels with major prospect for future optogenetic applications.

Natural resins have been in use for a long time and for manifold purposes resulting in a long and complex terminological history. The investigation of this history has so far been based on the connection between nomenclature and chemical composition. Because resin chemistry and the botanical classification of source plants are connected as well, the investigation of natural resins can be enhanced by adding taxonomy as an additional dimension, providing a more complex and complete picture of resin chemistry and resin use. The Vigani Cabinet, a collection of 300-year-old pharmaceutical and chemical materials owned by Queens’ College, Cambridge (UK), allows doing just that. A wide range of historical literature provides information about contemporary terminology, botanical and geographical origin, manufacture, trade and properties of resinous materials from the 18th century. This contemporary context is a particular feature of the Cabinet, which allows adding a historical dimension to the correlations between terminology, chemical composition and taxonomy. The dissertation thesis presented here provides an investigation of 17 botanical, 80 reference materials and samples from 24 natural resins from the Vigani Cabinet, studying these complex correlations and changes over time. The analytical method employed in this study was gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) with and without methylation with trimethylsulfoniumhydroxide. This technique provided detailed molecular compositions of the studied materials. Analysed botanical samples are taken from Pinaceae, Cupressaceae and Pistacia resins, commerical references from Araucariaceae, Copaifera, Fabaceae, Myroxylon and Burseraceae. Additionally, the soluble fraction of Baltic amber was analysed. Materials from the Vigani Cabinet analysed in this work were labelled as "turpentines", "pix burgundica", "sandaracha", "copaiba", "balsamum peruvianum and tolutanum", "mastiche", "anime", "copal", "elemi", "tacamahaca" and "succinum". Historical nomenclature of natural resins has not always been unequivocally associated with a botanical origin. The availability of natural resins changed throughout the centuries. Lack of knowledge, in particular about resins from over-seas, or adulterations resulting from changing harvesting methods, led to changes in trade names or variations in the composition of products traded under the same name. Generic names were used for resins with similar properties but different botanical (and geographical) origin. The thesis shows that a chemotaxonomic reference system is suitable for the identification of unknown resinous materials, and a number of new insights into the nomenclature of natural resins from the 17th and 18th century is obtained. The study of historical literature contributed in a significant way to the historico-cultural and archeometric research of the samples from the Vigani Cabinet and of natural resins in general and provided a basis for the interpretation of the chemical data from the Vigani samples.:CONTENTS 1 INTRODUCTION 1 1.1 Natural resins in a historical and modern context 1 1.2 The Vigani Cabinet and its historical background 3 1.3 Aim of the thesis - outline 6 2 LITERATURE REVIEW 8 2.1 Gymnosperm resins – conifer resins and products 9 2.1.1 Pinaceae 9 2.1.2 Cupressaceae 17 2.1.3 Araucariaceae 20 2.2 Angiosperm resins I – Fabales 21 2.3 Angiosperm resins II – Sapindales 30 2.3.1 Anacardiaceae 30 2.3.2 Burseraceae 35 2.3.3 Rutaceae 43 2.4 Fossil resins 45 2.5 Summary and research deficits 49 3 EXPERIMENTAL 53 3.1 Coupled gas chromatography and mass spectrometry 53 3.1.1 Materials 53 3.1.2 Sample preparation 54 3.1.3 Instrumentation 54 3.1.4 Data-Evaluation 58 3.2 Fourier transformation infrared spectroscopy 60 3.2.1 Sample preparation 61 3.2.2 Instrumentation 61 3.2.3 Data evaluation 61 4 RESULTS – REFERENCE MATERIALS 62 4.1 Gymnosperm resins – conifer resins and products 62 4.1.1 Pinaceae – Coniferous turpentines 62 4.1.1.1 Phytochemical markers – detection of adulterations 62 4.1.1.2 Aging by heat and light 73 4.1.2 Cupressaceae – Sandarac 80 4.1.3 Araucariaceae – Coniferous copals 88 4.1.4 Discussion 91 4.2 Angiosperm Resins I - Fabales 94 4.2.1 Copaifera – Copaiba balsam 94 4.2.2 Legume copals 102 4.2.3 Myroxylon – Balsam of Tolu and Peru 108 4.2.4 Discussion 117 4.3 Angiosperm resins II - Sapindales 120 4.3.1 Anacardiaceae – Pistacia resins 120 4.3.2 Burseraceae – Elemi, copal and others 127 4.3.3 Discussion 142 4.4 Fossil resins 144 4.4.1 Baltic amber 144 4.4.2 Discussion 153 4.5 Summary and research deficits 155 5 RESULTS – RESINOUS MATERIALS FROM THE VIGANI CABINET 160 5.1 Gymnosperm resins – conifer resins and products 162 5.1.1 1/8 Terebin. Strasb. 163 5.1.2 1/9 Tereb Com 170 5.1.3 1/10 Venice Turpentine 176 5.1.4 1/11 Venic. Turpent. 183 5.1.5 1/13 Tereb E Chio 188 5.1.6 A/23 Pix Burgundica 194 5.1.7 A/26 Sandaracha 203 5.2 Angiosperm resins I - Fabales 210 5.2.1 1/4 Balsam Cipivi 211 5.2.2 A/5 Gum Animi 218 5.2.3 La2/7 Unknown resin 228 5.2.4 1/31 Bals Peruv 230 5.2.5 2/1 Bals Peru 237 5.2.6 Z/17 Balsam Tolutanum 240 5. 3 Angiosperm resins II – Sapindales 245 5.3.1 A/11 Mastiche 246 5.3.2 1/14 Tereb i E Cypri 252 5.3.3 A/21 Gum Copal 258 5.3.4 A/24 [.] Elemi 268 5.3.5 A/22 Tacamahaca 276 5.3.6 Z/1 Tacamahaca 283 5.4 Fossil Resins 287 5.4.1 E/13 Succinum Citrinum 288 5.4.2 E/14 Succinum flavan 295 5.4.3 E/15 Succinum albam 302 5.4.4 E/16 Succinum nigram 307 5.4.5 F/13 L. Gagatis 313 6 CONCLUSIONS 316 7 REFERENCES 324 APPENDIX 365 Investigated materials from the Vigani Cabinet 366 Annotated list of historical literature 367 List of figures 374 List of tables 379 Compound lists 381 Atlas of mass spectra 422 / Naturharze werden schon lange für sehr unterschiedliche Zwecke verwendet. Dies hat zu einer oft komplizierten Terminologie geführt, deren Untersuchung sich bisher auf den Zusammenhang zwischen dem Namen des Harzes und seiner chemischer Zusammensetzung stützte. Letztere ist aber auch mit der botanischer Herkunft und damit der Biochemie der Stammpflanze verknüpft, weshalb man chemotaxonomische Aspekte für die systematische Untersuchung von Naturharzen als zusätzliche Variablen nutzen kann. Dadurch erhält man, wie die gezeigt werden soll, ein vollständigeres und komplexeres Bild der Chemie und Nutzung von Naturharzen. Die hier präsentierte Untersuchung beschäftigt sich mit dem Vigani-Kabinett, einer 300 Jahre alten pharmazeutischen Materialiensammlung, die sich im Queens‘ College, Cambridge (UK), befindet. In der Literatur des ausgehenden 17. und des 18. Jahrhunderts finden sich zahlreiche Informationen zu Terminologie, botanischer und geographischer Herkunft, Verarbeitung, Handel und Eigenschaften von Naturharzen. Dadurch wird die historische Dimension des oben beschriebenen Zusammenhangs zwischen Terminologie, chemischer Zusammensetzung und Taxonomie erfahrbar. In der Arbeit werden 17 botanische Proben, 80 moderne Referenzmaterialien und 24 Proben aus dem Vigani-Kabinett im Hinblick auf diese Zusammenhänge und Veränderungen untersucht.Die chemischen Analysen wurden mit gekoppelter Gaschromatografie-Massenspektrometrie mit und ohne Methylierung mit Trimethylsulfoniumhydroxid durchgeführt. Damit konnte die molekulare Zusammensetzung der Proben detailliert untersucht werden. Die untersuchten botanischen Proben stammten von Pinaceae, Cupressaceae und Pistaciaharzen, kommerzielle Referenzen von Araucariaceae, Copaifera, Fabaceae, Myroxylon und Burseraceaeharzen. Zusätzlich wurde noch die lösliche Fraktion von Baltischem Bernstein untersucht. Die untersuchten Proben aus dem Vigani-Kabinett waren sowohl englisch als auch Latein mit "turpentines", "pix burgundica", "sandaracha", "copaiba", "mastiche", "anime", "copal", "elemi", "tacamahaca", "balsamum peruvianum and tolutanum" und "succinum" beschriftet. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die historische Nomenklatur von Naturharzen nicht immer eindeutig mit ihrem botanischen Ursprung verknüpft war. Zusätzlich veränderte sich die Erhältlichkeit der Harze im Laufe der Jahrhunderte. Durch fehlendes Wissen, insbesondere für Materialien und Pflanzen aus Übersee, oder Verfälschungen aufgrund von veränderten Fördermethoden veränderten sich die Handelsnamen dieser Materialien oder die Zusammensetzung von Materialien, die unter demselben Namen gehandelt wurden. Harze mit ähnlichen Eigenschaften aber unterschiedlichen botanischen (und geographischen) Ursprungs trugen generische Namen. Die Arbeit zeigt jedoch, dass ein chemotaxonomisches Bezugssystem die Identifizierung von unbekannten Harzen ermöglicht, und zeigt eine Reihe neuer Erkenntnisse über die Nomenklatur von Naturharzen des 17. und 18. Jahrhunderts. Die Untersuchung historischer Quellen trug dabei sehr zur Erhellung des historisch-kulturellen und archeometrischen Hintergrundes und zur Interpretation der chemischen Daten der Vigani-Proben bei.:CONTENTS 1 INTRODUCTION 1 1.1 Natural resins in a historical and modern context 1 1.2 The Vigani Cabinet and its historical background 3 1.3 Aim of the thesis - outline 6 2 LITERATURE REVIEW 8 2.1 Gymnosperm resins – conifer resins and products 9 2.1.1 Pinaceae 9 2.1.2 Cupressaceae 17 2.1.3 Araucariaceae 20 2.2 Angiosperm resins I – Fabales 21 2.3 Angiosperm resins II – Sapindales 30 2.3.1 Anacardiaceae 30 2.3.2 Burseraceae 35 2.3.3 Rutaceae 43 2.4 Fossil resins 45 2.5 Summary and research deficits 49 3 EXPERIMENTAL 53 3.1 Coupled gas chromatography and mass spectrometry 53 3.1.1 Materials 53 3.1.2 Sample preparation 54 3.1.3 Instrumentation 54 3.1.4 Data-Evaluation 58 3.2 Fourier transformation infrared spectroscopy 60 3.2.1 Sample preparation 61 3.2.2 Instrumentation 61 3.2.3 Data evaluation 61 4 RESULTS – REFERENCE MATERIALS 62 4.1 Gymnosperm resins – conifer resins and products 62 4.1.1 Pinaceae – Coniferous turpentines 62 4.1.1.1 Phytochemical markers – detection of adulterations 62 4.1.1.2 Aging by heat and light 73 4.1.2 Cupressaceae – Sandarac 80 4.1.3 Araucariaceae – Coniferous copals 88 4.1.4 Discussion 91 4.2 Angiosperm Resins I - Fabales 94 4.2.1 Copaifera – Copaiba balsam 94 4.2.2 Legume copals 102 4.2.3 Myroxylon – Balsam of Tolu and Peru 108 4.2.4 Discussion 117 4.3 Angiosperm resins II - Sapindales 120 4.3.1 Anacardiaceae – Pistacia resins 120 4.3.2 Burseraceae – Elemi, copal and others 127 4.3.3 Discussion 142 4.4 Fossil resins 144 4.4.1 Baltic amber 144 4.4.2 Discussion 153 4.5 Summary and research deficits 155 5 RESULTS – RESINOUS MATERIALS FROM THE VIGANI CABINET 160 5.1 Gymnosperm resins – conifer resins and products 162 5.1.1 1/8 Terebin. Strasb. 163 5.1.2 1/9 Tereb Com 170 5.1.3 1/10 Venice Turpentine 176 5.1.4 1/11 Venic. Turpent. 183 5.1.5 1/13 Tereb E Chio 188 5.1.6 A/23 Pix Burgundica 194 5.1.7 A/26 Sandaracha 203 5.2 Angiosperm resins I - Fabales 210 5.2.1 1/4 Balsam Cipivi 211 5.2.2 A/5 Gum Animi 218 5.2.3 La2/7 Unknown resin 228 5.2.4 1/31 Bals Peruv 230 5.2.5 2/1 Bals Peru 237 5.2.6 Z/17 Balsam Tolutanum 240 5. 3 Angiosperm resins II – Sapindales 245 5.3.1 A/11 Mastiche 246 5.3.2 1/14 Tereb i E Cypri 252 5.3.3 A/21 Gum Copal 258 5.3.4 A/24 [.] Elemi 268 5.3.5 A/22 Tacamahaca 276 5.3.6 Z/1 Tacamahaca 283 5.4 Fossil Resins 287 5.4.1 E/13 Succinum Citrinum 288 5.4.2 E/14 Succinum flavan 295 5.4.3 E/15 Succinum albam 302 5.4.4 E/16 Succinum nigram 307 5.4.5 F/13 L. Gagatis 313 6 CONCLUSIONS 316 7 REFERENCES 324 APPENDIX 365 Investigated materials from the Vigani Cabinet 366 Annotated list of historical literature 367 List of figures 374 List of tables 379 Compound lists 381 Atlas of mass spectra 422

Inositolpolyphosphate (InsPs) bilden eine ubiquitäre Gruppe an hochphosphorylierten, intrazellulären Signalmolekülen in eukaryotischen Zellen. Trotz deren Beteiligung an unzähligen biologischen Prozessen bleibt die Detektion von InsPs (insb. einzelner Enantiomere) eine Herausforderung, da die momentan verfügbaren Analysemethoden immer noch limitiert sind. In der vorliegenden Arbeit wird die stabile Isotopenmarkierung von myo-Inositol (Ins) und InsPs in Kombination mit Kernspinresonanzspektroskopie (engl. Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy, NMR) erkundet, um diese Lücke zu schließen. Die Abhängigkeit von NMR-Daten und chemischer Struktur erlaubte die Analyse komplexer Mixturen aus InsPs aus in vitro-Experimenten und biologischen Proben. Durch stereospezifische 13C-Markierung konnten sogar Enantiomere voneinander unterschieden werden. Mit Hilfe dieser Methode wurden mehrere InsP-Stoffwechselwege untersucht. Als Erstes wurde das menschliche, Phytase-artige Enzym MINPP1 (engl. Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatase 1) detailliert in vitro und in lebenden Zellen charakterisiert. Dabei wurde ein bisher unbeschriebener InsP-Stoffwechselweg in menschlichen Zellen erstmals beschrieben. Als Zweites wurden InsP verdauende Bakterien aus der menschlichen Darmflora untersucht, sodass der Abbauweg von Inositolhexakisphosphat beleuchtet werden konnte. Als Drittes wurden DUSP-Enzyme (engl. Dual-Specificity Phosphatases) identifiziert und in vitro charakterisiert, die in der Lage sind, die Phosphoanhydrid-Bindung von Inositolpyrophosphaten (PP-InsPs) zu spalten. Die vorliegende Arbeit demonstriert, dass 13C-Markierung in Verbindung mit NMR ein mächtiges Werkzeug darstellt, um InsP-Stoffwechselvorgänge zu untersuchen. / Inositol polyphosphates (InsPs) comprise a ubiquitous group of densely phosphorylated intracellular messengers in eukaryotic cells. Despite their contributions to a myriad of biological processes the detection of InsPs remains challenging to this day, especially with regards to differentiating enantiomers, as the available analytical toolset is still limited. In this thesis the use of stable isotope labelling of myo-inositol (Ins) and InsPs is explored to address this shortcoming. Combining 13C-labelling and nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) provides both enhanced sensitivity and makes use of NMR’s strong structure-data dependency. This enabled the deconvolution of complex mixtures of InsPs from in vitro experiments or biological samples. With stereo-specific 13C-labels InsP mixtures could be resolved to individual enantiomers. Using this technique several InsP metabolic pathways were examined. Firstly, the human phytase-like enzyme Multiple Inositol Polyphosphate Phosphatase (MINPP1) was characterized in depth in vitro and in living cells, establishing a hitherto undescribed inositol polyphosphate metabolic path in humans. Secondly, inositol phosphate digesting bacteria isolated from the human gut microbiome were investigated, shedding light on the metabolic fate of inositol hexakisphosphate in the digestive track. Thirdly, a set of Dual-Specificity Phosphatases (DUSPs) were identified to be able to hydrolyze the phosphoanhydride bond of inositol pyrophosphates (PP-InsPs) and characterized in vitro. The 13C-labelling approach of InsPs in junction with NMR represents a powerful tool for the study of inositol polyphosphate metabolism. In the thesis at hand, this method has facilitated our understanding of inositol polyphosphate pathways and it will be continuing doing so in the future in several biological contexts.

Kanalrhodopsine (ChRs), lichtgesteuerte Ionenkanäle, vermitteln phototaktische Reaktionen in beweglichen Algen und sind als optogenetische Werkzeuge zur Manipulation der Zellaktivität mittels Lichts weit verbreitet. Viele Kationen- und Anionen-leitende ChRs (CCRs und ACRs) wurden aus kultivierbaren Chlorophyten- und Cryptophytenarten identifiziert. Die meisten mikrobiellen Organismen kann jedoch nicht kultiviert werden, was zu einem unvollständigen Bild der ChR-Vielfalt führt. Die Metagenomik öffnet die Tür für Erkenntnisse über die Verteilung von ChRs in unkultivierten Organismen. Diese Arbeit beschreibt die biophysikalische Charakterisierung von zwei Gruppen metagenomisch identifizierter ChRs. Die MerMAIDs (Metagenomically discovered marine, anion-conducting, and intensely desensitizing ChRs) sind eine neue ChR-Familie und zeigen nahezu komplette Photostrom-Inaktivierung unter Dauerlicht. Die Photoströme lassen sich durch einen Photozyklus erklären, der zur Akkumulation eines langlebigen und nicht-leitenden Photointermediats führt. Ein konserviertes Cystein ist für dieses Phänomen entscheidend, da seine Substitution zu einer stark reduzierten Inaktivierung führt. Die Prasinophyten ChRs, die große carboxyterminale Domänen aufweisen, wurden in großen, marinen Viren identifiziert, die sie von ihren beweglichen und einzelligen Grünalgen-Wirten durch lateralen Gentransfer übernommen haben. Heterolog exprimiert, sind die viralen ChRs nur nach Ergänzung von Transportsequenzen und carboxyterminaler Kürzung funktional. Die Grünalgen- und viralen ChRs sind Anionen-leitend mit nicht-inaktivierenden Photoströmen, wenn sie in Säugetierzellen exprimiert werden, obwohl die viralen Vertreter weniger leitfähig und zytotoxisch sind. Nichtsdestotrotz repräsentiert diese ChR-Gruppe die ersten Grünalgen- und Virus-ACRs. Diese Arbeit zeigt eine breite Verteilung der ACRs unter marinen mikrobiellen Organismen und die Bedeutung der Funktionsmetagenomik bei der Entdeckung neuer ChRs. / Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated ion channels mediating phototactic responses in motile algae and widely used as optogenetic tools to manipulate cellular activity using light. Many cation- and anion-conducting ChRs (CCRs and ACRs) have been identified from culturable chlorophyte and cryptophyte species. However, most microbial organisms cannot be cultured, resulting in an incomplete view of the diversity of ChRs. Metagenomics opens the door to gather insights on the distribution of ChRs in uncultured organisms. Here, the biophysical characterization of two groups of metagenomically identified ChRs is described. The MerMAIDs (Metagenomically discovered marine, anion-conducting, and intensely desensitizing ChRs) represent a new ChR family with near-complete photocurrent desensitization under continuous illumination. The photocurrents can be explained by a single photocycle leading to the accumulation of a long-lived and non-conducting photointermediate. A conserved cysteine is critical for this phenomenon, as its substitution results in a strongly reduced desensitization. The prasinophyte ChRs, harboring large carboxy-terminal extensions, were identified in marine giant viruses that acquired them from their motile and unicellular green algal hosts via lateral gene transfer. Expressed in cell culture, the viral ChRs are only functional upon the addition of trafficking sequences and carboxy-terminal truncation. The green algal and viral ChRs are anion-conducting and display non-desensitizing photocurrents when expressed in mammalian cells, though the viral representatives are less conductive and cytotoxic. Nonetheless, this group of ChRs represents the first green algal and viral ACRs. This thesis highlights a broad distribution of ACRs among marine microbial organisms and the importance of functional metagenomics in discovering new ChRs.

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Antikörper und Antigen-bindende Proteine, die an Fluorophore, Tracer und Wirkstoffe konjugiert sind, sind einzigartige Moleküle, welche die Entwicklung wertvoller diagnostischer und therapeutischer Werkzeuge ermöglichen. Allerdings ist der Konjugationsschritt sehr anspruchsvoll und trotz intensiver Forschung noch immer ein bedeutender Engpass. Zusätzlich sind Antigen-bindende Proteine oftmals nicht dazu in der Lage, die Zellmembran zu durchdringen und im Zellinneren nicht funktionsfähig. Daher ist ihre Verwendung auf extrazelluläre Targets beschränkt, was eine bedeutende Anzahl wichtiger Antigene vernachlässigt. Beide Limitierungen bilden Kernaspekte dieser Arbeit. Mit Tub-tag labeling wurde ein neuartiges und vielseitiges Verfahren für die ortsspezifische Funktionalisierung von Biomolekülen und Antigen-bindenden Proteinen entwickelt, und so die Palette der Proteinfunktionalisierungen bedeutend erweitert. Tub-tag wurde erfolgreich für die ortsspezifische Funktionalisierung verschiedener Proteine und Antigen-bindender Nanobodies angewendet, die für konfokale Mikroskopie, Proteinanreicherung und hochauflösende Mikroskopie eingesetzt wurden. In einem weiteren Projekt wurden zellpermeable Antigen-bindende Nanobodies hergestellt und somit das schon lange Zeit bestehende Ziel, intrazelluläre Targets durch in vitro funktionalisierte Antigen-bindende Proteine zu visualisieren und manipulieren, erreicht. Hierzu wurden zwei verschiedene Nanobodies an ihrem C-Terminus cyclischen zellpenetrierenden Peptiden unter Verwendung von Expressed Protein Ligation funktionalisiert. Diese Peptide ermöglichten die Endozytose-unabhängige Aufnahme der Nanobodies mit sofortiger Bioverfügbarkeit. Mit Tub-tag labeling und der Synthese von zellpermeablen Nanobodies konnten wichtige Bottlenecks im Bereich der Proteinfunktionalisierung und Antikörperforschung adressiert werden und neue Tools für die biochemische und zellbiologische Forschung entwickelt werden. / Antibodies and antigen binding proteins conjugated to fluorophores, tracers and drugs are powerful molecules that enabled the development of valuable diagnostic and therapeutic tools. However, the conjugation itself is highly challenging and despite intense research efforts remains a severe bottleneck. In addition to that, antibodies and antigen binding proteins are often not functional within cellular environments and unable to penetrate the cellular membrane. Therefore, their use is limited to extracellular targets leaving out a vast number of important antigens. Both limitations are core aspects of the presented thesis. With Tub-tag labeling, a novel and versatile method for the site-specific functionalization of biomolecules and antigen binding proteins was developed expanding the toolbox of protein functionalization. The method is based on the microtubule enzyme tubulin tyrosine ligase. Tub-tag labeling was successfully applied for the site-specific functionalization of different proteins including antigen binding nanobodies which enabled confocal microscopy, protein enrichment and super-resolution microscopy. In addition to that, cell permeable antigen binding nanobodies have been generated constituting a long thought goal of tracking and manipulating intracellular targets by in vitro functionalized antigen binding proteins. To achieve this goal, two different nanobodies were functionalized at their C-terminus with linear and cyclic cell-penetrating peptides using expressed protein ligation. These peptides triggered the endocytosis independent uptake of the nanobodies with immediate bioavailability. Taken together, Tub-tag labeling and the generation of cell-permeable antigen binding nanobodies strongly add to the functionalization of antibodies and their use in biochemistry, cell biology and beyond.

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