Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Visceral leishmaniasis is a neglected disease caused by Leishmania infantum in Brazil. The Ecto-NTPDase activities, described in various parasites including Leishmania, is involved in adhesion, infection and virulence of these parasites, functioning as a molecular mechanism able to modulate the host immune response and promoting the disease progression. E-NTPDases are enzymes that hydrolyze nucleotides tri and/or di-phosphate into monophosphate products. The extracellular metabolism of these nucleotides has an important role in infection by L. infantum and other intracellular pathogens. These nucleotides are powerful extracellular signals involved in various cellular processes, which are part of the purinergic signalling that modulates the immune response. The objective of this study was to evaluate the role of ecto-NTPDase activities in adherence and infection of L. infantum in human macrophages. The ecto-NTPDase activities of parasites were evaluated in four different media or conditions: (1) purine-depleted, (2) adenosine-enriched, (3) with inhibitor of ecto-NTPDase activities, and (4) with anti-E antibody NTPDase 1. The effects of these treatments on the adhesion and infection of these parasites in human macrophages were investigated. Immunolocalization of the E-NTPDase in the membrane of L. infantum was also evaluated. The ecto-nucleotidase activity is modulated according to the availability of adenosine in the medium. Parasites cultivated in a purine-depleted medium showed increased hydrolytic capacity of nucleotides and higher infectivity. Parasites grown in adenosine-enriched medium had lower ecto-nucleotidase activity and infectivity. Growing parasites with an inhibitor of Ecto-NTPDase activities led to an increase in the adherence of Leishmania to non-phagocytic cells. E-NTPDase enzymes responsible for the hydrolysis of nucleotides are present in the membrane of L. infantum. The higher hydrolysis capacity is associated with increased adhesion capacity and infection of these parasites in human macrophages. / A Leishmaniose visceral é uma doença negligenciada causada, no Brasil, pelo protozoário Leishmania infantum. A atividade ecto-nucleotidásica descrita em vários parasitos incluindo Leishmania sp está associada à nutrição, adesão, infecção e virulência destes, funcionando como um mecanismo molecular capaz de modular a resposta imune do hospedeiro, favorecendo a progressão da doença. As ecto-nucleotidases da família E-NTPDases são enzimas capazes de hidrolisar nucleotídeos tri e/ou di-fosfatados em seus produtos monofosfatados. O metabolismo extracelular destes nucleotídeos tem um papel importante na infecção por L. infantum e outros patógenos intracelulares. Estes nucleotídeos extracelulares são potentes sinalizadores envolvidos em vários processos celulares, incluindo a sinalização purinérgica que está relacionada à modulação da resposta imune. O objetivo deste trabalho foi avaliar o papel da atividade ecto-nucleotidásica em L. infantum na adesão e infecção de macrófagos humanos. Avaliação da atividade ecto-nucleotidásica de parasitos crescidos em meio depletado de purina, meio enriquecido com adenosina, incubados previamente com inibidor da atividade NTPDásica, ou na presença do anticorpo Anti E-NTPDase 1 e investigar os efeitos desses tratamentos na adesão e infecção desses parasitos em macrófagos humanos. A atividade ecto-nucleotidásica dos parasitas foram avaliadas em quatro condições diferentes: (1) na meio depletado de purina, (2) meio enriquecido com adenosina, (3) com o inibidor da atividade ecto-nucleotidásica, e (4) incubada com anticorpo anti-E NTPDase 1. foram investigados os efeitos desses tratamentos sobre a adesão e infecção destes parasitas em macrófagos humanos. Imunodetectamos a presença de E-NTPDases presentes na membrana de L. infantum, e comparamos a atividade ecto-nucleotidásica de diferentes cepas de L. infantum. A atividade ecto-nucleotidásica, é modulada de acordo com a disponibilidade de adenosina do meio, parasitos cultivados em meio depletado de purina apresentaram o aumento da capacidade hidrolítica de nucleotídeos, e maior capacidade infectiva, os parasitos cultivados em meio suplementado com adenosina apresentaram uma menor atividade ecto-nucleotidásica e uma redução de 30% na capacidade infectiva. O aumento da atividade ecto-nucleotidásica levou a um aumento na adesão em células não fagocíticas. As enzimas E-NTPDases estão presentes na membrana de L. infantum. Concluímos que atividade ecto-nucleotidásica está associada a maior capacidade de adesão e infecção destes parasitos in vitro.

A produção in vitro de embriões é uma biotecnologia bastante difundida mundialmente. O Brasil, em 2015, foi responsável por aproximadamente 67% dos embriões bovinos produzidos in vitro no mundo (PERRY, 2014). Embora essa tecnologia seja bastante utilizada, é de grande interesse para o mercado desenvolver estratégias que levem ao maior aproveitamento dos oócitos obtidos e compreender os mecanismos, dentro do ambiente folicular, que determinam a competência oocitária. O microambiente folicular é fundamental para o crescimento e a aquisição da competência oocitária, tornando o oócito apto a desenvolver-se e manter o embrião até a transição materno embrionária. Para tanto, os componentes foliculares - células da granulosa, células do cumulus, oócito e líquido folicular - precisam trabalhar em unidade, visto que possuem uma relação de interdependência. Dentro dos mecanismos de comunicação existentes no ambiente folicular estão as vesículas secretadas por células, chamadas vesículas extracelulares, que foram descritas no líquido folicular, contendo material bioativo como proteínas, lipídios e RNAs, incluindo os microRNAs. Contudo, os componentes do ambiente folicular podem refletir na qualidade do oócito que será produzido e a hipótese geral deste trabalho é de que os miRNAs presentes no ambiente folicular regulam vias de sinalização importantes para o desenvolvimento oocitário e que os miRNAs e ou RNAs mensageiros presentes nas células foliculares podem ser explorados como importantes ferramentas para o diagnóstico da qualidade oocitária. O primeiro estudo determinou perfis transcricionais de miRNAs em células da granulosa, em complexos cumulus-oócito e em vesículas extracelulares derivadas destas células e também do fluido folicular. Além de conhecer a origem e o papel dos miRNAs no ambiente folicular, estes perfis de expressão indicaram a regulação no ambiente folicular da via de sinalização da PI3K-Akt. No segundo estudo, componentes desta via de sinalização foram então determinados em células foliculares associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Os resultados demonstram que a ativação da via PI3K-Akt em células foliculares correlaciona-se à maior competência oocitária; de modo oposto, a menor atividade desta via nas células foliculares está relacionada à reduzida competência oocitária. Nos estudos três e quatro, um conjunto de experimentos foram realizados para determinar o perfil de microRNAs e RNAs mensageiros em células do cumulus associadas a oócitos de alta ou baixa competência ao desenvolvimento. Buscou-se esclarecer alguns dos mecanismos responsáveis pela melhor qualidade oocitária e levar a identificação de biomarcadores de qualidade oocitária permitindo o avanço e o desenvolvimento de novas ferramentas para intensificar a produção in vitro de embriões bovinos. Por fim, estes resultados demonstram respostas integradas entre oócitos e células foliculares durante o desenvolvimento folicular e o processo de aquisição de competência oocitária e identificaram marcadores de qualidade oocitária. / In vitro embryo production of is a widespread biotechnology worldwide. In 2015 Brazil was responsible for approximately 67% of bovine embryos produced in vitro in the world (PERRY, 2014). Although widely used, to develop strategies that lead to better use of oocytes and understand the mechanisms (in follicular microenvironment) that determine oocyte competence is of great interest to national market. The follicular microenvironment is fundamental for oocyte growth and acquisition of competence, making the oocyte able to develop and maintain the embryo until the embryonic maternal transition. For this end, the follicular components - granulosa cells, cumulus cells, oocytes and follicular fluid - need to work in unity, since they have arelation of interdependence. Within the mechanisms of communication existing within the follicular environment are vesicles secreted by cells, called extracellular vesicles, which were described in follicular fluid, containing bioactive material such as proteins, lipids and RNAs, including microRNAs. The components of follicular environment may reflect the quality of the oocyte that will be produced and the general hypothesis of this work is that the miRNAs present in the follicular environment regulate signaling pathways important for oocyte development and that the miRNAs and/or messenger RNAs present in the follicular cells can be explored as important tools for the diagnosis of oocyte quality. The first study determined profiles of miRNAs in granulosa cells, cumulus-oocyte complexes and extracellular vesicles derived from these cells and also in follicular fluid. In addition, by knowing the origin and role of miRNAs in the follicular environment, the expression profiles indicated the PI3K-Akt signaling pathway regulation in the follicular environment. In the second study, components of this signaling pathway were then determined in follicular cells associated with oocytes of high or low developmental competence. The results demonstrated that the activation of the PI3K-Akt pathway in follicular cells correlates with increased oocyte competence; conversely, the lower activity of this pathway in follicular cells is related to reduced oocyte competence. In studies three and four, experiments were performed to determine the profile of microRNAs and messenger RNAs in cumulus cells associated with oocytes of high or low developmental competence. Aiming to clarify some of the mechanisms responsible for the best oocyte quality that lead to the identification of oocyte quality biomarkers, allows the advancement and development of new tools to intensify the in vitro production of bovine embryos. Finally, results obtained demonstrate integrated responses between oocytes and follicular cells during follicular development and give new insights to the study of oocyte competence acquisition process and identified oocyte quality markers.

[ES] La cardiopatía isquémica, caracterizada por la falta de suministro adecuado de oxígeno al tejido cardíaco, es una afección grave que puede desencadenar un infarto agudo de miocardio y contribuir al desarrollo de la insuficiencia cardíaca (IC). A pesar de las terapias actuales, la IC sigue siendo una enfermedad con alta morbilidad y mortalidad, lo que destaca la necesidad de estrategias terapéuticas más efectivas. En este contexto, las células madre mesenquimales (MSCs) y, en especial sus vesículas extracelulares (EVs), han surgido como opciones prometedoras por sus propiedades regenerativas, pro-angiogénicas e inmunomoduladoras. Sin embargo, el reto actual se centra en mejorar la eficacia terapéutica de las EVs, ya sea mejorando su biodisponibilidad en el tejido cardíaco o potenciando sus capacidades intrínsecas, con el fin de hacer viable una terapia basada en las mismas. En este trabajo, nos hemos centrado en la mejora de las EVs mediante la modificación genética de las MSCs. Hemos seguido dos enfoques: la carga de oncostatina M (OSM) en la superficie de las EVs y la sobreexpresión inducible del dominio intracelular de Notch1 (N1ICD) junto con el factor inducible por hipoxia 1-alfa (HIF1A) en MSCs para enriquecer las EVs con factores terapéuticos, con la expectativa de mejorar su eficacia en el contexto de la isquemia cardíaca. Los resultados obtenidos muestran que las EVs cargadas con OSM poseen propiedades antifibroticas superiores a las EVs nativas, además de reducir el daño cardíaco provocado por la infusión de isoproterenol in vivo. Por otro lado, la sobreexpresión de N1ICD y HIF1A actúa a modo de precondicionamiento genético favoreciendo la carga de diferentes moléculas terapéuticas en las EVs. Estas EVs han demostrado ejercer efectos beneficiosos in vitro como la reducción de la fibrosis, la protección de los cardiomiocitos y reducción de la hipertrofia, la disminución de especies reactivas de oxígeno, y el aumento de la angiogénesis. En el estudio in vivo estas EVs redujeron el daño provocado por la infusión de isoproterenol. En conclusión, hemos generado dos tipos de EVs con un potencial terapéutico superior a las EVs nativas en el contexto de la patología cardíaca. Este trabajo abre la puerta al diseño de nuevas estrategias terapéuticas basadas en EVs, abordando de manera integral los diversos aspectos de la enfermedad cardíaca. / [CA] La cardiopatia isquèmica, caracteritzada per la falta de subministrament adequat d'oxigen al teixit cardíac, és una afecció greu que pot desencadenar un infart agut de miocardi i contribuir al desenvolupament de la insuficiència cardíaca (IC). Malgrat les teràpies actuals, la IC continua sent una malaltia amb alta morbiditat i mortalitat, la qual cosa destaca la necessitat d'estratègies terapèutiques més efectives. En este context, les cèl·lules mare mesenquimals (MSCs) i, especialment les seues vesícules extracelul·lars (EVs), han sorgit com a opcions prometedores per les seues propietats regeneratives, pro-angiogèniques i inmunomoduladores. No obstant això, el repte actual se centra en millorar l'eficàcia terapèutica de les EVs, ja siga millorant la seua biodisponibilitat en el teixit cardíac o potenciant les seues capacitats intrínseques, amb la finalitat de fer viable una teràpia basada en estes. En este treball, ens hem centrat en la millora de les EVs mitjançant la modificació genètica de les MSCs. Hem seguit dos enfocaments: la càrrega d'oncostatina M (OSM) en la superfície de les EVs i la sobreexpressió induïble del domini intracel·lular de Notch1 (N1ICD) juntament amb el factor induïble per hipòxia 1-alfa (HIF1A) en MSCs per a enriquir les EVs amb factors terapèutics, amb l'expectativa de millorar la seua eficàcia en el context de la isquèmia cardíaca. Els resultats obtinguts mostren que les EVs carregades amb OSM posseeixen propietats antifibròtiques superiors a les EVs natives, a més de reduir el dany cardíac provocat per la infusió d'isoproterenol in vivo. D'altra banda, la sobreexpressió de N1ICD i HIF1A actua a mode de precondicionament genètic afavorint la càrrega de diferents molècules terapèutiques en les EVs. Estes EVs han demostrat exercir efectes beneficiosos in vitro com la reducció de la fibrosi, la protecció dels cardiomiòcits i reducció de la hipertròfia, la disminució d'espècies reactives d'oxigen, i l'augment de l'angiogènesis. En l'estudi in vivo estes EVs van reduir el dany provocat per la infusió d'isoproterenol. En conclusió, hem generat dos tipus de EVs amb un potencial terapèutic superior a les EVs nadiues en el context de la patologia cardíaca. Este treball obri la porta al disseny de noves estratègies terapèutiques basades en EVs, abordant de manera integral els diversos aspectes de la malaltia cardíaca. / [EN] Ischemic heart disease, characterized by a lack of adequate oxygen delivery to the heart tissue, is a serious condition that can trigger acute myocardial infarction and contribute to the development of heart failure (HF). Despite current therapies, HF remains a disease with high morbidity and mortality, highlighting the need for more effective therapeutic strategies. In this context, mesenchymal stem cells (MSCs) and, especially their extracellular vesicles (EVs), have emerged as promising options due to their regenerative, pro-angiogenic and immunomodulatory properties. However, the current challenge focuses on improving the therapeutic efficacy of EVs, either by improving their bioavailability in cardiac tissue or by enhancing their intrinsic capabilities, in order to make a therapy based on them viable. In this work, we have focused on the improvement of EVs through genetic modification of MSCs. We have followed two approaches: loading of oncostatin M (OSM) on the surface of EVs and inducible overexpression of Notch1 intracellular domain (N1ICD) together with hypoxia-inducible factor 1-alpha (HIF1A) in MSCs to enrich EVs with therapeutic factors, with the expectation of improving its effectiveness in the context of cardiac ischemia. The results obtained show that OSM-loaded EVs have superior antifibrotic properties than native EVs, in addition to reducing cardiac damage caused by isoproterenol infusion in vivo. On the other hand, the overexpression of N1ICD and HIF1A acts as genetic preconditioning, favouring the loading of different therapeutic molecules in EVs. These EVs have been shown to exert beneficial effects in vitro such as reducing fibrosis, protecting cardiomyocytes and reducing hypertrophy, decreasing reactive oxygen species, and increasing angiogenesis. In the in vivo study, these EVs reduced the isoproterenol-induced myocardial damage. In conclusion, we have generated two types of EVs with a therapeutic potential superior to native EVs in the context of cardiac pathology. This work opens the door to the design of new therapeutic strategies based on EVs, comprehensively addressing the various aspects of heart disease. / Buigues Caravaca, M. (2024). Modificación genética de células estromales mesenquimales para potenciar la eficacia de las vesículas extracelulares en el ámbito de la terapia cardíaca [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/204408

Os objetivos deste trabalho foram avaliar o desempenho do reator anaeróbio operado em batelada seqüencial quando submetido ao aumento progressivo da concentração de glicose e estimar os parâmetros cinéticos da degradação da glicose. Inicialmente o reator foi operado com ciclos de 8 horas, tratando glicose nas concentrações, aproximadas, de 500, 1000 e 2000 mg/L. Não foi detectada glicose no efluente nas três condições. O reator operou de maneira estável, tratando aproximadamente 500 mg/L de glicose, com eficiência na remoção da DQO filtrada entre 93% e 97%. Na operação com concentrações de glicose no afluente próximas de 1000 mg/L e 2000 mg/L, observou-se instabilidade operacional, principalmente devido à produção de polímeros extracelulares (EPS) que comprometeram a hidrodinâmica e a transferência de massa no sistema. Os valores médios da concentrações de ácidos voláteis no efluente foram de 159 ± 72 mg/L e 374 ± 92 mg/L, respectivamente. Aos perfis de concentração de glicose foi ajustado modelo de primeira ordem, enquanto que um modelo modificado, contemplando concentração residual de matéria orgânica, foi ajustado aos perfis temporais de DQO. Para verificar a formação do EPS, operou-se o reator com 3 horas de ciclo nas concentrações, aproximadas, de 500 e 1000 mg/L. Esta fase teve como objetivo verificar a hipótese, segundo a qual, a produção de EPS seria resultado da exposição da biomassa a baixas concentrações de matéria orgânica por longo período. Dessa forma, reduzindo o tempo de ciclo, a exposição a baixas concentrações também seria reduzida. No entanto, embora o reator tenha operado com relativa estabilidade, verificou-se formação de grande quantidade de EPS logo na primeira condição operacional, com aproximadamente, 500 mg/L de glicose no afluente, indicando que a hipótese não estava correta. / The main objectives of this study were to evaluate the performance of the anaerobic sequencing batch reactor when subjected to a progressive increasing of the influent glucose concentration and estimate the kinetic parameters of glucoses degradation. Initially the reactor was operated with 8-hour cycles, treating glucose at concentrations of 500, 1000 and 2000 mg/L. Glucose was not detected in the effluent in all these three conditions. The reactor showed operating stability treating glucose concentration of approximately 500mg/L, with efficiencies between 93% to 97% in the filtrated COD removal. In the operation with glucose concentrations of 1000 mg/L and 2000 mg/L, approximately, it could be noticed an operational instability, caused mainly by a production of extracellular polymers (EPS) leading to hydrodynamic and mass transfer problems in the reactor. The mean values of volatile acids concentration in the effluent were about 159 ± 72mg/L and 374 ± 92mg/L, respectively. A first order model was adjusted to glucose concentration profiles, and a modified model, including a residual concentration of substrate, was adjusted to COD temporal profiles. To verify the EPS formation, the reactor was operated with 3-hour cycle in the concentrations of 500 and 1000 mg/L This stage had the objective of verifying if the EPS production would result from the exposure of the biomass to low concentration of substrate for a long period of time. Thus, reducing the time cycle, the exposure to low concentrations would also be reduced. Nevertheless, even with the reactor operating with relative stability, the hypotheses could not be verified due the formation of a large amounts of EPS right in the first operational condition with approximately to 500 mg/L of glucose in the influent, showing that the hypothesis was not right.

Submitted by PPG Pediatria e Sa?de da Crian?a (pediatria-pg@pucrs.br) on 2018-11-01T18:12:18Z No. of bitstreams: 1 disserta??o Josiane Silva Silveira vers?o final corrigida.pdf: 4036302 bytes, checksum: cdea806bf90b79da9a4047282152d203 (MD5) / Approved for entry into archive by Sheila Dias (sheila.dias@pucrs.br) on 2018-11-05T12:55:20Z (GMT) No. of bitstreams: 1 disserta??o Josiane Silva Silveira vers?o final corrigida.pdf: 4036302 bytes, checksum: cdea806bf90b79da9a4047282152d203 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-11-05T13:36:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 disserta??o Josiane Silva Silveira vers?o final corrigida.pdf: 4036302 bytes, checksum: cdea806bf90b79da9a4047282152d203 (MD5) Previous issue date: 2018-10-26 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Cient?fico e Tecnol?gico - CNPq / INTRODUCTION: asthma is a chronic inflammatory disease characterized by secretion of elevated levels of cytokines (interleukin (IL)-4, IL-5 and IL-13), reactive oxygen species (ROS), autophagy and eosinophil extracellular traps (EETs) release in airway. Moreover, respiratory syncytial virus (RSV) infection may facilitate allergic sensitization development as well as exacerbate asthma symptoms. Recently, studies have demonstrated an increase of autophagy in eosinophils of asthmatic patients, contributing to an increase in inflammatory response. In asthma, an increase in EETs release may cause tissue damage and an increase in mucus viscosity, which contribute to airway obstruction and reduction of lung function. However, the mechanism of EETs formation and its pathophysiologic role in asthma are poorly understood. OBJECTIVE: the aim of this dissertation was to elucidate some mechanisms involved in EETs release in asthma. We investigated whether the respiratory syncytial virus (RSV) could induce EETs in vitro in bronchoalveolar lavage fluid (BALF) eosinophils of an experimental asthma model. Moreover, we evaluated ROS and autophagy participation in mechanisms involved in EETs formation. METHODS: in order to perform the experimental model of asthma, BALB/cJ mice were sensitized with two subcutaneous injections of ovalbumin (OVA) on days 0 and 7, followed by three intranasal challenges with OVA on days 14, 15 and 16 of the protocol. In paper 1, BALF eosinophils of OVA group and control group were stimulated with RSV (103 PFU/mL) in vitro for 3 hours. After that, culture supernatant was collected in order to perform the analyses proposed in this study which were evaluated according to the specific objectives of this paper. In paper 2, during the experimental asthma protocol, mice were treated intranasally with a nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase (NDPH oxidase) inhibitor, diphenyleneiodonium (DPI), or a glutathione precursor, N-acetylcysteine (NAC). In paper 3, mice were treated intranasally with an autophagy inhibitor, 3-Methyladenine (3-MA). Treatments were performed 45 minutes before of the three intranasal administrations with OVA. At the end of the protocol, BALF and lung tissue were collected to perform the techniques discribed in each of the papers, according to their specific objectives. RESULTS: in paper 1, we verified an increase in EETs release in BALF eosinophils from OVA group stimulated with RSV in vitro. RSV in vitro decreased IFN-? in BALF cells when compared to the OVA group. In paper 2, we showed that in NAC-treated OVA group there was a decrease in the inflammatory cells in BALF and lung tissue. DPI or NAC treatments reduced EPO activity, goblet cells hyperplasia, inflammatory cytokines and NF?B p65 immunocontent in lung, and they helped in decreasing ROS production in lung. Furthermore, NAC increased catalase (CAT) activity in lung. However, only NAC treatment improved mitochondrial energy metabolism in lung. We showed that DPI or NAC reduced EETs formation in BALF from the OVA group. In paper 3, we showed that in 3-MA-treated OVA group there was a decrease in the inflammatory cells, EPO activity, goblet cells hyperplasia, inflammatory cytokines, NF?B p65 immunocontent, and oxidative stress in airway. Moreover, 3-MA was able to improve mitochondrial energy metabolism and increase Na+,K+-ATPase activity. We also demonstrated that 3-MA decreased light chain 3B (LC3B) in BALF cells and lung tissue as well as reduced EETs formation in BALF. CONCLUSION: our results verified an important role for RSV in the induction of EETs release. Moreover, DPI, NAC and 3-MA treatments decreased airway inflammation, oxidative stress and EETs release in asthma. Our data suggested that RSV, ROS and autophagy participate in the mechanisms for EETs release in asthma. Thus, identification of mechanisms that regulate EETs formation in asthma may contribute to a better understanding of the pathogenesis of this chronic inflammatory disease which damages patients? quality of life and is responsible for a high economic cost for the Brazilian Single Health System (SUS). / INTRODU??O: a asma ? uma doen?a inflamat?ria cr?nica caracterizada pela secre??o de elevados n?veis de citocinas do perfil T helper 2 (Th2) como interleucina (IL)-4, IL-5 e IL-13, esp?cies reativas de oxig?nio (EROs), aumento da autofagia e forma??o redes extracelulares de eosin?filos (EETs). A infec??o pelo v?rus sincicial respirat?rio (VSR) pode facilitar o desenvolvimento da sensibiliza??o al?rgica bem como exacerbar os sintomas da doen?a. Recentemente, estudos t?m demonstrado o aumento da autofagia em eosin?filos das vias de pacientes asm?ticos, contribuindo para o aumento da resposta inflamat?ria nas vias a?reas. Na asma, a produ??o excessiva de EETs pode causar dano tecidual e aumento da viscosidade do muco, podendo contribuir para o aumento da obstru??o da via a?rea e redu??o da fun??o pulmonar. Entretanto, os mecanismos de forma??o das EETs e seu papel fisiopatol?gico na asma s?o pouco compreendidos. OBJETIVO: esta disserta??o teve como objetivo elucidar alguns mecanismos envolvidos na libera??o de EETs na asma. Avaliamos a participa??o do VSR in vitro, das EROs e da autofagia nos mecanismos envolvidos na libera??o das EETs em eosin?filos do lavado broncoalveolar (LBA) em um modelo experimental de asma. METODOLOGIA: para o desenvolvimento do modelo experimental de asma, camundongos BALB/cJ foram sensibilizados com duas inje??es subcut?neas de ovalbumina (OVA) nos dias 0 e 7 seguidos por tr?s desafios intranasais com OVA nos dias 14, 15 e 16 do protocolo. No artigo cient?fico 1, eosin?filos do LBA de animais do grupo OVA e do grupo controle foram estimulados com VSR (103 PFU/mL) in vitro por 3 horas. Ap?s este per?odo, o sobrenadante da cultura foi coletado para a realiza??o das t?cnicas avaliadas conforme os objetivos espec?ficos deste artigo cient?fico. No artigo cientifico 2, durante o protocolo experimental de asma, os animais foram tratados via intranasal com um inibidor da nicotinamida adenina dinucleot?deo fosfato oxidase (NADPH oxidase), difenileno-iod?nio (DPI), ou com um precursor da glutationa, N-acetilciste?na (NAC), 45 minutos antes dos tr?s desafios intranasais com OVA. J? no artigo cientifico 3, os animais foram tratados via intranasal com um inibidor de autofagia, 3-metiladenina (3-MA), 45 minutos antes dos tr?s desafios intranasais com OVA. Ao final do protocolo o LBA e o tecido pulmonar foram coletados para a realiza??o das t?cnicas avaliadas em cada um dos artigos cient?ficos, conforme seus objetivos espec?ficos. RESULTADOS: no artigo cientifico 1, observamos um aumento na libera??o de EETs em eosin?filos do LBA de animais submetidos ao modelo experimental de asma e estimulados com VSR in vitro. Por outro lado, o VSR in vitro foi capaz de diminuir os n?veis de IFN-? no sobrenadante da cultura de eosin?filos do LBA. Em rela??o aos resultados do artigo cient?fico 2, verificamos que no grupo OVA tratado com NAC ocorreu uma diminui??o no n?mero de c?lulas inflamat?rias no LBA bem como uma redu??o no infiltrado inflamat?rio pulmonar. Al?m disso, os animais do grupo OVAM tratados com DPI ou NAC apresentaram uma redu??o da enzima EPO, hiperplasia de c?lulas caliciformes, citocinas inflamat?rias e da prote?na fator nuclear kappa B (NF?B p65). Os tratamentos com DPI ou NAC foram capazes de reduzir a forma??o de EROs, aumentar a atividade da enzima catalase antixidante (CAT). Por outro lado, par?metros do metabolismo energ?tico mitocondrial aumentaram somente com o tratamento com NAC. Por fim, demonstramos que os tratamentos com DPI ou NAC foram capazes de reduzir a forma??o de EETs do LBA. No artigo cient?fico 3, observamos que no grupo OVA tratado com o inibidor de autofagia, 3-MA, ocorreu uma diminui??o no n?mero de c?lulas inflamat?rias no LBA bem como uma redu??o do infiltrado inflamat?rio pulmonar. Al?m disso, os animais tratados com 3-MA apresentaram uma redu??o nos n?veis da enzima EPO, hiperplasia de c?lulas caliciformes, citocinas inflamat?rias e da prote?na NF?B p65. O tratamento com 3-MA foi capaz de reduzir a forma??o de EROs bem como aumentar os n?veis da enzima antioxidante CAT. O tratamento com 3-MA tamb?m melhorou par?metros do metabolismo energ?tico mitocondrial e a atividade da enzima Na+,K+ATPase. Demonstramos tamb?m que o tratamento com 3-MA diminuiu o imunoconte?do da prote?na light chain 3B (LC3B) em eosin?filos do LBA e no tecido pulmonar e reduziu a forma??o de EETs no LBA. CONCLUS?O: Nossos resultados demonstram um importante papel do VSR na indu??o da libera??o de EETs. Al?m disso, verificamos que os tratamentos com DPI, NAC e 3-MA foram capazes de reduzir a inflama??o das vias a?reas, o estresse oxidativo e a libera??o de EETs no LBA. Demonstramos que o VSR, as EROs e a autofagia participam dos mecanismos que regulam o processo de libera??o das EETs na asma. Assim, a identifica??o de alguns desses mecanismos envolvidos na libera??o de EETs na asma pode contribuir para uma melhor compreens?o da patog?nese desta doen?a inflamat?ria cr?nica que prejudica a qualidade de vida dos pacientes e ? respons?vel por um alto custo econ?mico para o Sistema ?nico de Sa?de (SUS).

Esta memoria doctoral forma parte del proyecto financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación (CICYT, CTQ2010-21183-C02-01), el cual tiene entre sus objetivos la búsqueda de nuevas cepas con capacidad para producir emulsionantes naturales poliméricos. Existe un interés real en el aislamiento y caracterización estructural y funcional de nuevos exopolímeros (EPS) obtenidos a partir de microorganismos de ambientes extremos que pudieran ser utilizados con estos fines en diversas industrias. Para ello, se realizó en primer lugar el estudio de los EPS desde el punto de vista ultraestructural, de cepas antárticas adaptadas al frío, mediante técnicas de microscopía electrónica de transmisión (MET) después de procesar las muestras por criofijación a alta presión seguida de criosustitución (HPF-FS). Estas técnicas aportaron numerosos detalles sobre la ultraestructura de las distintas cepas y el material extracelular que producen, al lograr preservar el material biológico próximo a su estado natural. Se observó que este material polimérico extracelular es para la mayoría de las cepas complejo con la presencia de material capsular alrededor de las células y abundantes estructuras vesiculares dispersas en la matriz extracelular secretada por las bacterias. Es la primera vez que se describen y visualizan de manera tan clara y abundante las vesículas de membrana externa (VME) que producen bacterias no patógenas de ambientes naturales antárticos. De igual forma, es la primera vez que se reporta la presencia de estas estructuras en cepas de los géneros Marinobacter y Psychrobacter. Asimismo, se estudió el origen de las proteínas presentes en las VME mediante geles SDS-PAGE donde se mostraron los perfiles proteicos comparados con las proteínas de membrana externa. Esto evidenció el origen de estas VME formadas a partir de esta membrana, al presentar proteínas en la fracción de VME, que comigraron con proteínas que estaban presentes en la fracción de membrana externa, además en el perfil proteico de la membrana externa se detectaron proteínas adicionales que no estaban presentes en VME. Se estudió la influencia de la temperatura sobre la producción y morfología de VME producidas en la cepa S. livingstonensis NF22T Para esta bacteria psicrotolerante se demostró que la temperatura influye en la producción de VME. A bajas temperaturas la cantidad de VME que produce la cepa es mayor, su tamaño es menor y más regular y el perfil electroforético muestra la expresión diferencial de algunas proteínas, viéndose sobrexpresadas proteínas relacionadas con funciones de transporte a nivel de membrana. Se realizaron análisis proteómicos para identificar las proteínas presentes en las VME producidas a 4 y 16 ºC a partir de S. livingstonensis NF22T y S. vesiculosa M7T. Para ambas cepas se identificaron fundamentalmente proteínas de membrana externa y periplasmáticas con diferentes funciones fisiológicas, destacando por su abundancia las proteínas implicadas en el transporte y metabolismo de iones inorgánicos así como las relacionadas en la biogénesis de las envueltas celulares. El material extracelular (EPS) obtenido y purificado a partir de Shewanella vesiculosa M7T presentó mayor actividad emulsionante frente a aceites comestibles que los emulsionantes comercializados goma arábiga y xantano y su caracterización reveló que contiene abundantes VME y polímeros polisacarídicos, siendo sus componentes químicos mayoritarios azúcares neutros y aminados, lípidos de membrana y aminoácidos. / The present work is part of the research project (CICYT, CTQ2010-21183-C02-01), which has among its objectives the search for new strains capable to produce natural polymeric emulsifiers. There is a real interest in the isolation and structural and functional characterization of new exopolymers (EPS) derived from microorganisms of extreme environments that could be used for these purposes in various industries. Many Gram-negative, cold-adapted bacteria from the Antarctic environment produce large amounts of extracellular matter, which has potential biotechnology applications. We examined the ultrastructure of extracellular matter from Antarctic bacteria by transmission electronic microscopy after high pressure freezing and freeze substitution. All analyzed extracellular matter appeared as a netlike mesh composed of a capsular polymer around cells and large numbers of outer membrane vesicles (OMV), which have not been described for members of the genera Psychrobacter and Marinobacter so far. OMV showed the typical characteristics described for these structures, and seemed to be surrounded by the same capsular polymer as that found around cells. The analysis of OMV proteins from Antarctic strains by SDS-PAGE showed different banding profiles in OMV compared to the outer membrane, suggesting some kind of protein sorting during membrane vesicle formation. For the psychrotolerant bacterium, S. livingstonensis NF22T, the growth temperature seemed to influence the amount and morphology of OMV. In an initial attempt to elucidate the functions of OMV from S. livingstonensis NF22T and S. vesiculosa M7T we conducted a proteomic analysis on membrane vesicles obtained at 4 and 16°C. At both temperatures, OMV were highly enriched in outer membrane proteins and periplasmic proteins related to nutrient processing and transport in Gram-negative bacteria, suggesting that OMV could be related with nutrient sensing and bacterial survival. Differences were observed in the expression of some proteins depending on incubation temperature but further studies will be necessary to define their roles and implications in the survival of bacteria in the extreme Antarctic environment. The extracellular material (EPS) obtained and purified from Shewanella vesiculosa M7T had a higher emulsifying activity against edible oils than commercial emulsifiers like arabic and xanthan gums. Characterization of this EPS revealed that it contains abundant OMV and polysaccharides polymers, with neutral and amino sugars, membrane lipids and aminoacids as its major chemical components.

Os objetivos deste trabalho foram avaliar o desempenho do reator anaeróbio operado em batelada seqüencial quando submetido ao aumento progressivo da concentração de glicose e estimar os parâmetros cinéticos da degradação da glicose. Inicialmente o reator foi operado com ciclos de 8 horas, tratando glicose nas concentrações, aproximadas, de 500, 1000 e 2000 mg/L. Não foi detectada glicose no efluente nas três condições. O reator operou de maneira estável, tratando aproximadamente 500 mg/L de glicose, com eficiência na remoção da DQO filtrada entre 93% e 97%. Na operação com concentrações de glicose no afluente próximas de 1000 mg/L e 2000 mg/L, observou-se instabilidade operacional, principalmente devido à produção de polímeros extracelulares (EPS) que comprometeram a hidrodinâmica e a transferência de massa no sistema. Os valores médios da concentrações de ácidos voláteis no efluente foram de 159 ± 72 mg/L e 374 ± 92 mg/L, respectivamente. Aos perfis de concentração de glicose foi ajustado modelo de primeira ordem, enquanto que um modelo modificado, contemplando concentração residual de matéria orgânica, foi ajustado aos perfis temporais de DQO. Para verificar a formação do EPS, operou-se o reator com 3 horas de ciclo nas concentrações, aproximadas, de 500 e 1000 mg/L. Esta fase teve como objetivo verificar a hipótese, segundo a qual, a produção de EPS seria resultado da exposição da biomassa a baixas concentrações de matéria orgânica por longo período. Dessa forma, reduzindo o tempo de ciclo, a exposição a baixas concentrações também seria reduzida. No entanto, embora o reator tenha operado com relativa estabilidade, verificou-se formação de grande quantidade de EPS logo na primeira condição operacional, com aproximadamente, 500 mg/L de glicose no afluente, indicando que a hipótese não estava correta. / The main objectives of this study were to evaluate the performance of the anaerobic sequencing batch reactor when subjected to a progressive increasing of the influent glucose concentration and estimate the kinetic parameters of glucoses degradation. Initially the reactor was operated with 8-hour cycles, treating glucose at concentrations of 500, 1000 and 2000 mg/L. Glucose was not detected in the effluent in all these three conditions. The reactor showed operating stability treating glucose concentration of approximately 500mg/L, with efficiencies between 93% to 97% in the filtrated COD removal. In the operation with glucose concentrations of 1000 mg/L and 2000 mg/L, approximately, it could be noticed an operational instability, caused mainly by a production of extracellular polymers (EPS) leading to hydrodynamic and mass transfer problems in the reactor. The mean values of volatile acids concentration in the effluent were about 159 ± 72mg/L and 374 ± 92mg/L, respectively. A first order model was adjusted to glucose concentration profiles, and a modified model, including a residual concentration of substrate, was adjusted to COD temporal profiles. To verify the EPS formation, the reactor was operated with 3-hour cycle in the concentrations of 500 and 1000 mg/L This stage had the objective of verifying if the EPS production would result from the exposure of the biomass to low concentration of substrate for a long period of time. Thus, reducing the time cycle, the exposure to low concentrations would also be reduced. Nevertheless, even with the reactor operating with relative stability, the hypotheses could not be verified due the formation of a large amounts of EPS right in the first operational condition with approximately to 500 mg/L of glucose in the influent, showing that the hypothesis was not right.

[ES] Actualmente la insuficiencia cardiaca es una de las principales causas de mortalidad y co-morbilidad a nivel mundial sobre todo en países desarrollados. Este tipo de patología a su vez, se desglosa en un gran abanico de posibles agentes que perturban el funcionamiento del músculo cardiaco en función de su causa. Uno de los problemas más importantes a niveles de afectación cardiaca se centra en pacientes que sufren algún tipo de cáncer y son tratados con antraciclinas. Estas drogas ampliamente usadas en el mundo de la oncología, tienen una serie de efectos secundarios entre los cuales destaca su posible efecto cardiotóxico. Este trabajo ahonda sobre este proceso y sobre la existencia de un perfil de paciente con una susceptibilidad a sufrir este tipo de episodios de toxicidad cardiaca. En este sentido, se investiga una serie de miRNAs que se encuentran diferencialmente expresados en pacientes que sufren este tipo de episodios frente a los que no. Una vez se detectan estos miRNA generamos un algoritmo predictor mediante el cual somos capaces de predecir si un paciente sufrirá cardiotoxicidad en función de la cantidad de ciertos miRNAs presentes en suero. Una vez descubiertos estos miRNAs nos centramos en la búsqueda de una posible opción terapéutica para esta serie de eventos. Para ello usamos las vesículas extracelulares (EVs) derivadas de células mesenquimales estromales (MSC), unas células que han demostrado tener un alto potencial terapéutico y de gran seguridad. Se evaluó su capacidad terapéutica en el daño inducido por doxorrubicina y posteriormente se amplió el estudio añadiendo el daño por isquemia reperfusión en diferentes frentes como puede ser la regeneración cardiaca, inhibición de la fibrosis o neoangiogénesis. Aunque es necesario un estudio más exhaustivo de los perfiles de cardiotoxicidad y de los mecanismos de acción tanto de los miRNAs como de las EVs, esta tesis demuestra la capacidad de ambos como una potente herramienta tanto de diagnóstico como terapéutica. / [CA] Actualment la insuficiència cardíaca és un dels principals causes de mortalitat i co-morbiditat a nivell mundial sobretot en països desenvolupats. Aquest tipus de patologia al seu torn, es desglossa en un gran ventall de possibles agents que pertorben el funcionament de l'múscul cardíac en funció de la seva causa. Un dels problemes més importants a nivells d'afectació cardíaca se centra en pacients que pateixen algun tipus de càncer i són tractats amb antraciclines. Aquestes drogues àmpliament usades en el món de l'oncologia, tenen una sèrie d'efectes secundaris entre els quals destaca el seu possible efecte cardiotòxic. Aquest treball aprofundeix sobre aquest succés i sobre ha un perfil de pacient amb una susceptibilitat a patir aquest tipus d'episodis de toxicitat cardíaca. En aquest sentit s'investiga una sèrie de miRNAs que es troben diferencialment expressats en pacients que pateixen aquest tipus d'episodis enfront dels que no. Un cop es detecten aquests miRNA generem un algoritme predictiu mitjançant el qual, som capaços de predir si un pacient patirà cardiotoxicitat en funció de la quantitat de certs miRNAs presents en sèrum. Un cop descoberts aquests miRNAs ens centrem en la recerca d'una possible opció terapèutica per a aquesta sèrie d'esdeveniments. Per a això fem servir les vesícules extracelulres derivades de cèl·lules mesesnquimales, unes cèl·lules que han demostrat tenir un alt potencial terapèutico i de gran seguretat. Es testen la seva capacitat terapèutica en el dany per doxurbicina i posteriorment s'amplia l'estudi afegint el dany per isquèmia reperfusió en diferents fronts com pot ser la regeneració cardíaca, inhibició de la fibrosi o neoangiogènesi. Encara que és necessari un estudi més exhaustiu dels perfils de cardiotoxicitat i dels mecanismes d'acció tant dels miRNAs com de les EVs, aquesta tesi demostra la capacitat de tots dos com una potent eina tant de diagnòstic com terapèutica. / [EN] Heart failure is currently one of the main causes of mortality and co-morbidity worldwide, especially in developed countries. This type of pathology, can be broken down into a wide range of possible agents that disturb the functioning of the cardiac muscle depending on its cause. One of the most important problems in terms of cardiac involvement is centered on patients who suffer from some type of cancer and are treated with anthracyclines. These drugs, widely used in the world of oncology, have a series of side effects, among which their possible cardiotoxic effect stands out. This work delves into this event and into the existence of a patient profile with a susceptibility to suffer this type of episodes of cardiac toxicity. In this sense, we investigate a series of miRNAs that are differentially expressed in patients who suffer this type of episodes versus those who do not. Once these miRNAs were detected, we generated a predictive algorithm by which we are able to predict whether a patient will suffer cardiotoxicity based on the amount of certain miRNAs present in serum. Once these miRNAs were discovered, we focused on the search for a possible therapeutic option for this series of events. For this we used extracellular vesicles (EVs) derived from mesenchymal cells (MSC), cells that have been shown to have a high therapeutic potential and high safety. We tested their therapeutic capacity in doxorubicin injury and later extended the study by adding ischemia reperfusion injury on different fronts such as cardiac regeneration, inhibition of fibrosis or neoangiogenesis. Although a more exhaustive study of the cardiotoxicity profiles and mechanisms of action of both miRNAs and EVs is needed, this thesis demonstrates the capacity of both as a powerful diagnostic and therapeutic tool. / Sánchez Sánchez, R. (2021). Estudio del papel de los miRNAs y las vesículas extracelulares derivadas de células mesenquimales estromales en la patología cardiaca [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/177178

[ES] Las células mesenquimales estromales (MSC) poseen una serie de cualidades inmunológicas, pro-angiogénicas y regenerativas que las convierten en un excelente candidato para el tratamiento de diversas patologías. A pesar de las pruebas contundentes obtenidas en modelos preclínicos que demuestran la actividad terapéutica de las MSC, los ensayos clínicos no han podido mostrar hasta ahora un beneficio consistente, probablemente debido a deficiencias metodológicas y a la falta de estandarización, así como a la variabilidad genética intrínseca a los estudios en humanos. Debido a ello, ha sido necesario profundizar en los mecanismos responsables del beneficio terapéutico y rediseñar las estrategias clínicas. En los últimos años, se ha observado que la reparación tisular mediada por las MSC se produce de forma paracrina, y se ha constatado que las vesículas extracelulares (EVs) secretadas por las MSC (EVMSC) son capaces de recapitular las propiedades inmunosupresoras de las células parentales. Además, las estrategias terapéuticas basadas en vesículas tienen grandes ventajas en términos de bioseguridad y producción en condiciones de grado clínico, reduciendo significativamente el coste de dichas terapias. Sin embargo, la dosis efectiva en grandes mamíferos, incluidos los humanos, es bastante elevada y la producción industrial de EVs se ve dificultada en parte, por la senescencia proliferativa que afecta a las MSC durante la expansión celular masiva. En este trabajo hemos intentado solventar los principales escollos de la terapia con EVs incrementando su potencial inmunosupresor y reduciendo por tanto la dosis efectiva. Este incremento se ha conseguido gracias a la sobreexpresión del factor inducible por hipoxia 1-alpha y al desarrollo de un medio de acondicionamiento en cultivo basado en citoquinas. Además, la inmortalización de las células secretoras mediante la transducción del gen de la telomerasa humana ha permitido tanto la estandarización del producto como su producción a gran escala. La eficacia de estas EVs ha sido testada en diferentes poblaciones celulares in vitro: linfocitos T, monocitos, células Natural Killer, macrófagos, células endoteliales y fibroblastos; y en dos modelos de ratón: hipersensibilidad retardada y colitis aguda inducida por TNBS. En conclusión, hemos desarrollado una fuente de EVs de larga duración que secreta grandes cantidades de vesículas con mayor capacidad inmunosupresora y antiinflamatoria, facilitando un producto terapéutico más estándar y fácil de producir para el tratamiento de enfermedades inflamatorias inmunomediadas. / [CA] Les cèl·lules mesenquimals estromals (MSC) posseeixen una sèrie de qualitats immunològiques, pro-angiogèniques i regeneratives que les converteixen en un excel·lent candidat per al tractament de diverses patologies. Tot i les proves contundents obtingudes en models preclínics que demostren l'activitat terapèutica de les MSC, els assaigs clínics no han pogut mostrar fins ara un benefici consistent, probablement degut a deficiències metodològiques i a la manca d'estandardització, així com a la variabilitat genètica intrínseca als estudis en humans. A causa d'això, ha calgut aprofundir en els mecanismes responsables del benefici terapèutic i redissenyar les estratègies clíniques. En els últims anys, s'ha observat que la reparació tissular intervinguda per les MSC es produeix de forma paracrina, i s'ha constatat que les vesícules extracel·lulars (EVs) secretades per les MSC (EVMSC) són capaços de recapitular les propietats immunosupressores de les cèl·lules parentals. A més, les estratègies terapèutiques basades en vesícules tenen grans avantatges en termes de bioseguretat i producció en condicions de grau clínic, reduint significativament el cost d'aquestes teràpies. No obstant això, la dosi efectiva en grans mamífers, inclosos els humans, és bastant elevada i la producció industrial de les EVs es veu dificultada en part, per la senescència proliferativa que afecta les MSC durant l'expansió cel·lular massiva. En aquest treball hem intentat solucionar els principals esculls de la teràpia amb EVs incrementant el seu potencial immunosupressor i reduint per tant la dosi efectiva. Aquest increment s'ha aconseguit gràcies a la sobreexpressió del factor induïble per hipòxia 1-alpha i a el desenvolupament d'un mitjà de condicionament en cultiu basat en citoquines. A més, la immortalització de les cèl·lules secretores mitjançant la transducció del gen de la telomerasa humana ha permès tant l'estandardització del producte com la seva producció a gran escala. L'eficàcia d'aquestes EVs ha estat testada en diferents poblacions cel·lulars in vitro: limfòcits T, monòcits, cèl·lules Natural Killer, macròfags, cèl·lules endotelials i fibroblasts; i en dos models de ratolí: hipersensibilitat retardada i colitis aguda induïda per TNBS. En conclusió, hem desenvolupat una font de EVs de llarga durada que secreta grans quantitats de vesícules amb major capacitat immunosupressora i antiinflamatòria, facilitant un producte terapèutic més estàndard i fàcil de produir per al tractament de malalties inflamatòries inmunomediades. / [EN] Mesenchymal stromal cells (MSC) possess several immunological, pro-angiogenic and regenerative qualities that make them an excellent candidate for the treatment of various pathologies. Despite compelling evidence from preclinical models demonstrating the therapeutic activity of MSCs, clinical trials have so far failed to show consistent benefit, probably due to methodological shortcomings and lack of standardisation, as well as the genetic variability intrinsic to human studies. As a result, it has been necessary to further investigate the mechanisms responsible for therapeutic benefit and to redesign clinical strategies. In recent years, it has been observed that MSC-mediated tissue repair occurs in a paracrine pathway, and it has been confirmed that extracellular vesicles (EVs) secreted by MSC (EVMSC) are able to recapitulate the immunosuppressive properties of the parental cells. Moreover, vesicle-based therapeutic strategies have great advantages in terms of biosafety and production under clinical-grade conditions, significantly reducing the cost of such therapies. However, the effective dose in large mammals, including humans, is quite high and the industrial production of EVs is hampered in part by the proliferative senescence that affects MSC during massive cell expansion. In this work, we have attempted to overcome the main challenges of EVs therapy by increasing their immunosuppressive potential and thus reducing the effective dose. This increase has been achieved by overexpression of hypoxia-inducible factor 1-alpha and the development of a cytokine-based culture conditioning medium. In addition, immortalization of secretory cells by transduction with the human telomerase gene has allowed both product standardisation and large-scale production. The efficacy of these EVs has been tested in different cell populations in vitro: T lymphocytes, monocytes, Natural Killer cells, macrophages, endothelial cells and fibroblasts; and in two mouse models: delayed-type hypersensitivity and TNBS-induced acute colitis. In conclusion, we have developed a long-lasting source of EVs that secretes large amounts of vesicles with enhanced immunosuppressive and anti-inflammatory capacity, providing a more standard and easier-to-produce therapeutic product for the treatment of immune-mediated inflammatory diseases. / Gómez Ferrer, M. (2022). Terapias innovadoras basadas en vesículas extracelulares derivadas de células madre mesenquimales modificadas genéticamente [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/182560

O operon groESL de C. crescentus apresenta dupla regulação. A indução deste operon por choque térmico é dependente do fator sigma de choque térmico σ32. A temperaturas fisiológicas, a expressão de groESL apresenta regulação temporal durante o ciclo celular da bactéria e o controle envolve a proteína repressora HrcA e o elemento CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin expression). Para estudar a atividade da proteína repressora in vitro, produzimos e purificamos de E. coli a HrcA de C. creseentus contendo uma cauda de histidinas e a ligação especifica ao elemento CIRCE foi analisada em ensaios de migração retardada em gel de poliacrilamida (EMRGP). A quantidade de DNA retardada pela ligação a HrcA aumentou significativamente na presença de GroES/GroEL, sugerindo que estas proteínas modulam a atividade de HrcA. Corroboração desta modulação foi obtida analisando fusões de transcrição da região regulatória de groESL com o gene lacZ, em células de C. crescentus produzindo diferentes quantidades de GroES/EL. HrcA contendo as substituições Pro81 AJa e Arg87Ala, aminoácidos que se localizam no domínio putativo de ligação ao DNA da proteína, mostraram ser deficientes na ligação a CIRCE, tanto in vitro como in vivo. Em adição, HrcA Ser56Ala expressa na mesma célula juntamente com a proteína selvagem produziu um fenótipo dominante-negativo, indicando que a HrcA de C. crescentus liga-se a CIRCE como um oligômero, provavelmente um dímero. As tentativas de obtenção de mutantes nulos para os genes groESL ou dnaKJ falharam, indicando que as proteínas GroES/GroEL e DnaK/DnaJ são essenciais em C. crescentus, mesmo a temperaturas normais. Foram então construídas no laboratório as linhagens mutantes condicionais SG300 e SG400 de C. crescentus, onde a expressão de groESL e de dnaKJ, respectivamente, está sob controle de um promotor induzido por xilose (PxyIX). Estas linhagens foram caracterizadas quanto á sua morfologia em condições permissivas ou restritivas, assim como quanto à capacidade de sobrevivência frente a vários tipos de estresse. As células da linhagem SG300, exauridas de GroES/GroEL, são resistentes ao choque térmico a 42°C e são capazes de adquirir alguma termotolerância. Entretanto, estas células são sensíveis aos estresses oxidativo, salino e osmótico. As células da linhagem SG400, exauridas de DnaKlJ, são sensíveis ao choque térmico, à exposição a etanol e ao congelamento, e são incapazes de adquirir termotolerância. Além disso, tanto as células exauridas de GroES/GroEL quanto as exauridas de DnaK/DnaJ apresentam problemas na sua morfologia. As células de SG300 exauridas de GroES/GroEL formam filamentos longos que possuem constrições fundas e irregulares. As células de SG400 exauridas de DnaK/DnaJ são apenas um pouco mais alongadas que as células pré-divisionais selvagens e a maioria das células não possuem septo. Estas observações indicam bloqueio da divisão celular, que deve ocorrer em diferentes estágios em cada linhagem. / In Caulobacter crescentus, the groESL operon presents a dual type of control. Heat shock induction of the operon is dependent on the heat shock sigma factor σ-32. At physiological temperatures, groESL expression is cell cycle regulated and the control involves the repressor protein HrcA and the element CIRCE (controlling inverted repeat of chaperonin ~xpression). To study the activity of HrcA in vitro, we produced and purified from E. coli a histidine-tagged version of the protein, and specific binding to the CIRCE element was analyzed in electrophoretic mobility shift assays (EMSA). The amount of retarded DNA increased significantly in the presence of GroES/GroEL, suggesting that these proteins modulate HrcA activity. Further evidence of this modulation was obtained using lacZ transcription fusions with the groESL regulatory region in C. crescentus cells producing different amounts of GroES/GroEL. The mutants proteins HrcA Pro81Ala and HrcA Arg87Ala, that contain amino acid substitutions in the putative DNA-bindíng domain of the protein, were found to be deficient in binding to CIRCE in vitro and in vivo. Furthermore, HrcA Ser56Ala expressed together with the wild type protein within the same cell, produced a dominant-negative phenotype, indicating that C. crescentus HrcA binds to CIRCE in an oligomeric form, most likely as a dimer. Attempts to obtain null mutants for groESL or dnaKJ were unsuccessful indicating the importance of GroES/GroEL and DnaK/lDnaJ to the survival of C. crescentus cells. Conditional mutants were then constructed in our laboratory in which groESL and dnaKJ expression is under the control ofaxylose inducible promoter (PxyIX) , giving rise to strains SG300 and SG400, respectively. These strains were characterized in regard to their morphology under permissive and restrictive conditions, as well as their viability under different types of environmental stresses. SG300 cells depleted of GroES/GroEL are resistant to heat shock at 42°C and can acquire some thermotolerance, but they are sensitive to oxidative, saline and osmotic stresses. SG400 cells depleted of DnaKlJ are quite sensitive to heat shock, ethanol and freezing, and are unable of acquiring thermotolerance. Cells depleted of either GroES/EL or DnaKlJ also present morphological problems. SG300 cells depleted of GroES/EL form long and pinched filaments. SG400 cells depleted of DnaKlJ are only somewhat more elongated than wild-type predivisional cells and most cells do not present septum. These observations indicate a cell division arrest, which should occur at different stages in each strain.