Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / The diagnosis of strongyloidiasis is difficult the irregular larval excretion and in most cases, individuals are asymptomatic; detection of latent cases of Strongyloides stercoralis in immunosuppressed may decrease morbidity and mortality. In this sense, the improvement of reliable diagnostic methods is essential. The objective of the study was to compare the release of eggs in the feces by the technique of Egg counts per gram of feces (EPG), coproantigens detection by ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) and amplification bands by conventional (Polymerase Chain Reaction) PCR from feces of non immunosuppressed and immunosuppressed mice experimentally infected with Strongyloides venezuelensis. In the experimental kinetic days 0 and 5, 8, 13, and 21 after infection p.i. were used. Comparing the EPG, coproantigens detection by ELISA and PCR, it was observed in the non immunosuppressed group the release of eggs from the EPG test day on 5 to day 13 p.i, being absent on day 21 p.i. Coproantigen positivity was observed in 33.3% 5 and 8 p.i. and 100% on days 13:21 p.i. and PCR, the presence of amplified bands was observed along the entire kinetics. In immunosuppressed animals, 100% of the released eggs in the feces, the data of the ELISA, 100% of the animals were evaluated in both positive and PCR, the presence of amplified bands during kinetics. It is concluded that detection of coproantigens by ELISA and PCR diagnosis could be useful tools for diagnosis of strongyloidiasis especially in cases of immunosuppression. / O diagnóstico da estrongiloidíase é difícil, pois, a excreção larval é irregular e na maioria dos casos, os indivíduos são assintomáticos; a detecção de casos latentes de Strongyloides stercoralis em imunossuprimidos pode diminuir a morbidade e mortalidade da infecção. Assim, o aprimoramento de métodos confiáveis de diagnóstico são imprescindíveis. O objetivo do estudo foi comparar a liberação de ovos nas fezes pela técnica de Contagem de Ovos por Grama de Fezes (OPG), a detecção de coproantígenos pelo ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) e amplificação de bandas pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) convencional de fezes de ratos não imunossuprimidos e imunossuprimidos e experimentalmente infectados por Strongyloides venezuelensis. Na cinética experimental foram utilizados os pontos 0 e 5, 8, 13 e 21 pós-infecção (d.p.i). Para o cálculo dos resultados foram utilizadas porcentagens simples e descrição dos resultados obtidos. Comparando-se o OPG, a detecção de coproantígenos pelo ELISA e a PCR, observou-se no grupo não imunossuprimido a liberação de ovos no teste OPG do dia 5 ao dia 13 p.i, sendo ausente no 21 d. p.i. Para a detecção de coproantígeno observou-se positividade de 33,3% no 5 e 8 d. p.i e de 100% no 13 e 21 d. p.i e na PCR, a presença de bandas amplificadas em todos os dias da cinética. Nos animais imunossuprimidos, 100% liberaram ovos nas fezes, no teste ELISA, 100% dos animais foram positivos e na PCR, a presença de bandas amplificadas em toda a cinética. Concluiu-se que a detecção de coproantígenos pelo ELISA e o diagnóstico por PCR podem ser ferramentas úteis para o diagnóstico em animais não imunossuprimidos e imunossuprimidos. Em comparação ao OPG, a detecção de coproantígenos pelo ELISA e amplificação de bandas pela PCR mostraram mais sensíveis nos dias analisados e podem ser métodos de escolha para diagnóstico da estrongiloidíase principalmente nos casos de imunossupressão. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Rickettsiosis is a human disease caused by bacteria of the genus Rickettsia, and its main vector ticks (Ixodidae), which are also considered reservoirs of the Spotted Fever Group rickettsiae in Brazil. Small mammals are frequent hosts for immature stages of rickettsial diseases vector ticks, and it is known that some species of small mammals are hosts amplifiers for Rickettsia sp..The aim of this study was to determine seropositivity against five species of Rickettsia and tick fauna of small mammals captured in periurban region of Uberlândia, MG, Brazil. For this purpose, 416 small mammals representing 13 species of wild rodents and marsupials were captured between the months of July 2011 to August 2012. Of these, 48 were infested with ticks of the genus Amblyomma and Ixodes, and 70 (16.8%) of the animals were seropositive for Rickettsia spp.. Our results indicate the circulation of four species of Rickettsia, R. rickettsii, R. parkeri, R. rhipicephali and R. bellii, in the periurban area of Uberlândia. The first two Rickettsia species are considered pathogenic to man and thus a more thorough investigation to confirm the species of bacteria and epidemiological aspects related to these Rickettsia spp. is the detection locations. / Riquetsiose é uma doença causada em humanos por bactérias do gênero Rickettsia, e tem como principais vetores os carrapatos, que são considerados também reservatórios de riquétsias do grupo da febre maculosa no Brasil. Frequentemente os estágios imaturos de carrapatos vetores de riquetsioses têm pequenos mamíferos como hospedeiros, e sabe-se que algumas espécies de pequenos mamíferos são hospedeiros amplificadores para Rickettsia sp.. O objetivo deste trabalho foi determinar a sororreatividade contra cinco espécies de riquétsias e a fauna de carrapatos de pequenos mamíferos na região periurbana de Uberlândia, MG, Brasil. Foram capturados, entre julho de 2011 a agosto de 2012, 416 animais representando 13 espécies de roedores silvestres e marsupiais. Destes, 48 estavam infestados com carrapatos dos gêneros Amblyomma e Ixodes, e 70 (16,8%) dos animais foram soropositivos para Rickettsia spp.. Nossos resultados indicam a circulação de quatro espécies de riquétsias, R. rickettsii, R. parkeri, R. rhipicephali e R. bellii, próximo à área urbana do município de Uberlândia. As duas primeiras espécies são consideradas patogênicas ao homem, evidenciando a necessidade de se realizar uma investigação mais minuciosa tanto para a confirmação das espécies de bactérias circulantes, quanto para a compreensão do ambiente que mantém as riquétsias nos locais de detecção. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Handwashing frequency may result in harmful effects on the skin, promoting the increase of the prevalence of nosocomial important microorganisms. This study purpose was to assess the quantitative and qualitative changes of the total microbiota (both permanent and transient) from hands of nursing professionals and university laboratory technicians and students due to the irritant action provoked by frequent washing and/or wearing gloves. Sixty health professionals were enrolled from whom collections were performed by the sterile polyethylene bag, before and after washing hands with 3 mL of nonantimicrobial soap for 30 seconds. In the group formed by students and laboratory technicians (n=30), these collections were performed before and after consecutive washings with water and soap. Damaged hands health professionals hands contamination was higher when compared with healthy hands. Hygiene proved to be efficient in both students and laboratory technicians without complaints of irritation after successive washings, a fact not seen among health care workers. Nurses with damaged hands presented higher frequency of S. aureus, Gram negative bacteria and yeast than the healthy ones (P>0.05), as well as the sum of these microorganisms (P=0.07) and presence of S. haemolyticus (P=0.02). The frequency of S. aureus and antimicrobial resistant Gram negative bacteria was higher among nurses damaged hands. The irritation caused on the skin by the frequent washing and/or wearing of gloves may cause changes of hands microbiota and should be considered when choosing hygiene products. / A freqüência da lavagem de mãos pode resultar em efeitos prejudiciais na pele promovendo aumento da prevalência de microrganismos de importância hospitalar. Os objetivos deste trabalho foram avaliar quantitativa e qualitativamente as alterações na microbiota total (residente e transitória) das mãos de profissionais de enfermagem e estudantes universitários e técnicos de laboratório associadas à ação irritante provocada pela freqüente lavagem e/ou uso de luvas. Foram incluídos 60 profissionais de saúde, nos quais foram realizadas coletas, pelo método do saco estéril de polietileno, antes e após a lavagem com 3 mL de sabão não medicamentoso, por 30 segundos. No grupo constituído por estudantes e técnicos de laboratório (n=30), estas coletas foram realizadas antes e após lavagens consecutivas com água e sabão. A contaminação das mãos de profissionais de saúde com danos na pele foi maior em relação às sadias. A higiene se mostrou eficiente nos estudantes e técnicos de laboratório sem queixas de irritação após lavagens sucessivas, fato não observado entre profissionais de saúde. Enfermeiras com mãos com danos apresentaram maior freqüência de S. aureus, bacilos Gram-negativos e fungos leveduriformes do que as sadias (P>0,05), assim como quanto à soma destes microrganismos (P=0,07) e a presença de S. haemolyticus (P=0,02). A freqüência de S. aureus e bacilos Gram-negativos resistentes aos antibióticos foi maior nas mãos lesadas de enfermeiras. A irritação causada na pele devido à lavagem freqüente e/ou uso de luvas pode provocar alterações da microbiota das mãos e deve ser considerada pelas instituições quando da escolha de produtos de higiene. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The incidence of infections caused by multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa producing metallo-β-lactamase is increasing, especially in critically ill patients. The objective of this study was to evaluate the incidence of ventilator associated-pneumonia (VAP) caused by P.aeruginosa producing metallo-β-lactamase (MBL-PA) or non-MBL-PA in patients admitted at a adult intensive care unit (ICU) of a Uberlândia Federal University Hospital Clinic, looking epidemiologic and molecular aspects. A cohort study was performed including 93 patients with VAP caused by P.aeruginosa from January/2004 to November/2006. The collection of the tract respiratory superior secretions was made by the swab-rinse sampling method and of the endotracheal aspirate when for suspicion of VAP. In total, 40 (43%) patients had VAP by MBL-PA and 53 (57%) by non-MBL-PA. The study was approved by the Ethical Committee of the University. The results of univariate analysis of risk factors for MBL-PA VAP showed that the ASIS score, clinical condition in admission, prior hospitalization, prolonged stay in the ICU, prolonged time of mechanical ventilation, exposure of carbapenems, fluorquinolones and use of three or more antibiotics were risk factors for VAP by MBL-PA. After logistic regression the following risk factors continued significant: prior hospitalization and prolonged time of mechanical ventilation. Additionally, the mortality was also independently associated with MBL-PA VAP. During the study period we identified 40 (43%) isolates of P.aeruginosa presumptive MBL producers according to the disk approximation tests and of the 59% of the AmpC phenotype. Resistance to β-lactam and non-β-lactam agents was significantly higher among MBL-PA isolates with the 82,5% of this multidrug-resistant. Only 18,8% (3/16) of MBLproducing strains were positive for the blaSPM-1 gene. To determine the genomic diversity of P.aeruginosa multidrug-resistant 20 isolates were analysed by macrorestriction profile analysis following PFGE. That showed of polyclonal Pseudomonas aeruginosa (16 genotypes). Altogether the detection of horizontal dissemination was observed in three patients (Clone A), two (Genotype C) and more two patients (Genotype E). The two epidemic MBL-PA isolates from the outbreak in 2003 presented macrorestriction profiles different from the endemic MBL-PA. The presence of MBL-PA in our unit indicates problems in nosocomial infection control practice, likely associated with low adherence to hand hygiene and especially in the abusive use of antibiotics. / A incidência de infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa multiresistente produtora de metalo-β-lactamase está aumentando mundialmente, especialmente em pacientes críticos. O objetivo deste estudo foi determinar a incidência de pneumonia associada à ventilação mecânica (PAV) por Pseudomonas aeruginosa produtora ou não de metalo-β- lactamases em pacientes internados na Unidade de Terapia Intensiva (UTI) de adultos do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia (HC-UFU), caracterizando aspectos epidemiológicos, dentre os quais fatores de risco dos pacientes, e moleculares das amostras. Foi realizado um estudo de coorte incluindo 93 pacientes com PAV por Pseudomonas aeruginosa no período de janeiro/2004 a novembro/2006. Foram realizadas coletas de secreção de orofaringe das primeiras 48 horas de internação, depois em quatro dias, e a seguir semanalmente, e de aspirado endotraqueal quando da indicação clínica da pneumonia. No estudo epidemiológico, 40 (43 %) pacientes tiveram PAV por P.aeruginosa produtora de metalo-β-lactamase (PA-MBL) e 53 (57 %) PAV por não-PAMBL, com os seguintes fatores de risco significativos (p≤0,05) associados com PAV por PA-MBL: escore ASIS, diagnóstico clínico na admissão, hospitalização prévia, estada prolongada na UTI, uso prolongado de ventilação mecânica (VM), uso de carbapenemas, fluorquinolonas e de três ou mais antibióticos, na análise univariada; e, confirmados como independentes por análise multivariada apenas hospitalização prévia e tempo mais longo de VM. Adicionalmente, a taxa de mortalidade foi significantemente maior no grupo de PAV por PA-MBL, tanto na análise univariada quanto na regressão logística. Quarenta (43 %) amostras de P.aeruginosa foram identificadas como produtoras de MBL pelo teste fenotípico de sinergismo com duplo-disco e a maioria (59 %) comportou-se como do fenótipo AmpC. A resistência aos agentes β-lactâmicos assim como aos demais antibióticos foi significantemente maior entre as amostras de PA-MBL, detectando-se a presença de multiresistência na maioria (82,5%) daquelas MBL positivas. O gene blaSPM-1 foi detectado em apenas três (18,8%) das 16 amostras do fenótipo MBL testadas. O estudo de epidemiologia molecular através da técnica de PFGE revelou a ocorrência de uma policlonalidade (16 genótipos em 20 amostras), com evidência de transmissão cruzada em três pacientes (clone A), dois (genótipo C) e outros dois pacientes (genótipo E) e de similaridade entre amostras recuperadas de dois pacientes colonizados e posteriormente infectados. As duas amostras associadas ao surto responsável pela emergência das PAMBL em nosso hospital, diferiram das amostras de PA-MBL recuperadas em condições endêmicas no nosso estudo. A presença destas amostras representa uma grave ameaça aos pacientes, exigindo uma revisão quanto a uma política do uso mais racional de antibióticos e na implementação de programas de controle e prevenção de infecções hospitalares mais efetivos. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais / Neospora caninum is an intracellular parasite that has the dog as its definitive host and other mammals, especially cattle, as intermediate hosts. Economically, neosporosis is an important disease in Veterinary medicine due to the induction of relevant clinical signs, as abortions in cattle and neuromuscular paralysis in dogs. The aim of this study was to evaluate the role of the TLR adaptor protein TRIF in the resistance against N. caninum infection. For this, in vitro experiments with bone marrow derived macrophages (BMDMs) from C57BL/6 wild-type (WT) and TRIF knockout (TRIF-/-) mice, stimulated by tachyzoites and in vivo infections, were performed in order to investigate the production of cytokines and antibodies, cellular and tissue parasitism, histological changes during different phases of infection and survival analysis. We observed that TRIF-/- BMDMs presented notable defects in inflammatory cytokine production in relation to WT macrophages. Additionally, we found that the concentration of NO, IL-12p40, IFN-y and TNF were decreased in peritoneal fluids and lungs of TRIF-/- mice, while IL-2, IFN-γ, TNF and IL-17 were reduced in sera of these animals compared to WT mice. Higher parasite burden was observed in peritoneal cells, lungs and brain during the acute and chronic phases of infection, which were associated with inflammatory changes in the analyzed tissues, while TRIF-/- mice survival rate decreased 2-fold compared to WT. In conclusion, our results show that TRIF is required for resistance against the infection induced by N. caninum, regulating the production of key Th1 cytokines and participating in the control of the tissue parasitism and inflammatory lesions induced against the parasite. / Neospora caninum é um parasito intracelular que tem como hospedeiro definitivo o cão e outros mamíferos, especialmente bovinos, como hospedeiros intermediários. Economicamente, a neosporose é uma doença de grande importância na medicina veterinária por induzir relevantes sinais clínicos, como abortos em bovinos e paralisia neuromuscular em cães. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel da molécula adaptadora TRIF da via de sinalização dos TLRs na resistência contra a infecção por N. caninum. Para isso, experimentos in vitro com macrófagos derivados de medula óssea (BMDMs) obtidos de camundongos do tipo selvagem (WT) e TRIF knockout (TRIF-/-) estimulados com taquizoítos e infecções in vivo foram realizadas a fim de se investigar a produção de citocinas e anticorpos, parasitismo celular e tecidual, alterações histológicas durante diferentes fases da infecção e análise de sobrevida. Nós observamos que BMDMs TRIF-/- apresentaram reduções significativas na produção de citocinas inflamatórias em relação a macrófagos WT. Adicionalmente, foi visto que as concentrações de NO, IL-12p40, IFN- e TNF foram diminuídas no lavado peritoneal e nos pulmões de camundongos TRIF-/-, enquanto que IL-2, IFN-γ, TNF e IL-17 foram reduzidas no soro desses animais em comparação aos WT. Alta carga parasitária foi encontrada nas células peritoneais, pulmões e cérebro durante as fases aguda e crônica da infecção, associada com alterações teciduais inflamatórias significativas nos pulmões. Além disso, camundongos TRIF-/- tiveram uma taxa de sobrevida 2 vezes menor quando comparada aos animais WT. Concluindo, nossos resultados mostram que TRIF é requerido para a resistência contra a infecção induzida por N. caninum, regulando a produção de citocinas chave do perfil Th1 de resposta imune e participando no controle do parasitismo tecidual e das lesões inflamatórias oriundas desta infecção. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Successful pregnancy is related to Th2 immune response profile, including molecules encoded by the major histocompatibility complex (MHC); however, Toxoplasma gondii infection induces Th1 immune response that is associated with adverse pregnancy outcome. To investigate the influence of MHC haplotype in pregnancy outcome in T. gondii-infected animals, congenic mice, C57BL/KsJ and CB10-H2 females, were orally infected with ME-49 strain on the first day of pregnancy and sacrificed on 8 and 18 days post-infection. C57BL/KsJ showed higher number of parasites in the lungs at 8dI, irrespective of pregnancy, compared with CB10-H2; and both CB10-H2 and C57BL/KsJ showed high number of parasites in the brain at 18dI, irrespective of pregnancy. Parasites were not found in the uterus/placenta in both lineages of mice irrespective of the day of infection and there was no difference in abortion rate of infected mice, although CB10-H2 mice presented higher histological damage compared with C57BL/KsJ at 8 and 18 days of pregnancy and infection. Infection of non-pregnant C57BL/KsJ increased mast cell infiltration in the uterus, and gestation decreased this cell numbers. Furthermore, C57BL/KsJ presented higher IFN-γ levels systemically on 8dI; and TNF and IL-6 on 8 and 18dI compared with CB10-H2, despite gestation or not. Additionally, in the uterus/placenta of CB10-H2, pregnancy increased FOXP3 and under infection IL-10, IL-13 and IL-17 expression levels. Our data suggest that both genetic background and MHC haplotypes are essential to protect against reabsorption rate and abortion in congenital toxoplasmosis. / O sucesso da gestação está relacionado com um perfil de resposta imunológica tipo Th2 e envolvimento de vários mecanismos para manutenção da tolerância materno-fetal, incluindo as moléculas codificadas pelo complexo principal de histocompatibilidade (MHC). Entretanto, a infecção por Toxoplasma gondii induz um perfil de resposta tipo Th1 que é associada aos resultados prejudiciais da gestação. Para investigar a influência do haplotipo do MHC na toxoplasmose congênita, fêmeas de camundongos congênicos, C57BL/KsJ (H-2d) e CB10-H2 (H-2b) foram oralmente infectadas com 5 cistos da cepa ME-49 no primeiro dia de gestação e sacrificadas aos 8 e 18 dias após a infecção. As fêmeas C57BL/KsJ apresentaram alto número de parasitos nos pulmões aos 8dI, comparadas às fêmeas CB10-H2 e ambas as linhagens apresentaram alto número de parasitos no cérebro aos 18dI, independentemente da gestação. Não foram encontrados parasitos no útero/placenta em nenhuma das linhagens, independente do tempo de infecção e não houve diferença no índice de aborto dentre as fêmeas infectadas, apesar da linhagem CB10-H2 ter apresentado maiores danos histológicos comparada à C57BL/KsJ aos 8 e 18 dias de gestação e infecção. A infecção nas fêmeas C57BL/KsJ não-gestantes provocou aumento na migração de mastócitos para o útero enquanto que a gestação diminui tal migração. Além disso, camundongos C57BL/KsJ apresentaram altos níveis sistêmicos de IFN-γ aos 8dI e TNF e IL-6 aos 8 e 18dI comparados aos CB10-H2 gestantes e não-gestantes. Ainda, no útero/placenta das fêmeas CB10-H2 a gestação aumentou os níveis de expressão de FOXP3 e, sob a infecção, houve aumento no nível de expressão de IL-10, IL-13 e IL-17. Nossos resultados sugerem que, tanto o background genético como o haplotipo do MHC sejam essenciais na proteção contra os índices de reabsorção fetal e aborto nos casos de toxoplasmose congênita. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Paracoccidioidomycosis is one of the most prevalent systemic mycosis in Latin America, including Brazil. It is caused by chronic infection with Paracoccidioides brasiliensis, a thermally dimorphic fungus. Calomys callosus, Rengger 1830 (Rodentia, Cricetidae), is a wild rodent found in Central Brazil and has been shown to be susceptible to experimental infection with P. brasiliensis. The objective of this work was to study the clinicopathological aspects of this experimental infection in Calomys. callosus infected with 0.6 x 105 yeast isolated from P. brasiliensis (strain Pb18) and to compare it with two others susceptible animals: A / Sn and B10.A mice. For this, five animals from each group were sacrificed at 7, 15, 30, 60, 90 and 120 days post inoculation (d.p.i.). Samples of the lung, liver and spleen were processed for mycological examination to determine the number of counts of colony forming units (CFU) as well as for histopathological examination using hematoxilyn and eosin (H&E), reticulin Gomori, trichromic (Masson), and Grocott´s stains. Blood samples from each mice were collected from orbital venous plexus and used to detect IgG and IgM specific anti-P. brasiliensis by ELISA. To determine of survival post-infection, others eight animals from each group was used. The mortality rate was higher in C. callosus than A / Sn and B10.A mice, being all deaths occurring up to 118 d.p.i. IgM levels tended to rise in all groups, but in B10.A mice and Calomys callosus groups, the level of IgG was significantly elevated during the all experimental period. Granulomatous lesions were observed in the roots of all animal groups and all granulomas were composed by Langhans giant cells, epithelioid cells, macrophages, lymphocytes, plasma cells, eosinophils, and necrosis. In C. callosus, the development of granulomas in lung was observed with 15 d.p.i. and exhibited extensive necrosis, especially at the end of the experiment. The presence of granulomas in liver was detected with seven d.p.i. in all animals, but the extensive necrosis was observed especially in samples of Calomys callosus. Similar pattern was also observed in spleen samples. In addition, in Calomys callosus the granulomatous lesions were more extensive in lung and spleen than in liver. The assessment of differential deposition of collagen showed that in Calomys callosus and B10.A the lesions were predominantly composed by collagen type III, although in B10.A animals a predominance of collagen type I was observed without, however, exceed the levels observed for collagen type III at the end of the experiment. On the other hand, the levels of collagen were lower in A / Sn mice than Calomys callosus and B10.A. and, apparently, it was not identified in the lung. On the other hand, in this group was observed a tendency to increase the deposition of collagen type I in the liver at the end of experiment. Callomys callosus showed a higher number of CFU in the three organs studied, especially in the lungs. The proportion of viable fungi in liver, lung and spleen was always higher in Calomys callosus than A / Sn and B10.A and tend to increase in liver and lung during the infection progression with the presence of budding fungi. Conclusions: Ours results indicate that the experimental infection by Paracoccidioides brasiliensis (Pb18) was more aggressive and widespread in Calomys callosus than A/Sn and B10, especially in the lung. So, Calomys callosus can be considered as an alternative animal model in studies of paracoccidioidomycosis infection. / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo termodimórfico causador da paracoccidioidomicose, a mais prevalente micose profunda e sistêmica da América Latina, ocorrendo principalmente no Brasil. Calomys callosus, Rengger 1830 (Rodentia, Cricetidae), é um roedor selvagem encontrado no Brasil Central, que tem se mostrado susceptível a infecção experimental pelo P. brasiliensis. O objetivo deste trabalho foi estudar aspecctos clínico-patológicos desta infecção em C. callosus inoculados com 0,6 x 105 leveduras de P. brasiliensis, cepa Pb18, comparando-o aos camundongos A/Sn e B10.A. Cinco animais de cada grupo foram sacrificados aos 7, 15, 30, 60, 90 e 120 dias pós inóculo (d.p.i.), e fragmentos dos pulmões, fígado e baço foram processados para exame micológico direto, cultura em Mycosel, contagem de unidades formadoras de colônias (UFC), e para exame histopatológico, através das colorações de hematoxilina e eosina, reticulina de Gomori, tricrômico de Masson, metenamina prata de Gomori-Grocott. Sangue foi coletado do plexo venoso orbital para realização de ELISA e dosagem de IgG e IgM específicos anti-P. brasiliensis. Outro grupo, contendo oito animais de cada espécie, foi usado para observação da sobrevida pós-infecção. A mortalidade foi maior em C. callosus, com todas as mortes ocorrendo até os 118 d.p.i. Os níveis de IgM mostraram tendência a elevação nos três grupos avaliados. Os camundongos B10.A e Calomys callosus mostraram tendência a elevação dos níveis de IgG, observada durante o período experimental. Lesões granulomatosas foram observadas nos órgãos analisados dos três grupos de animais testados, constituídos por células gigantes tipo Langhans, células epitelióides, macrófagos, linfócitos, plasmócitos, eosinófilos e necrose. Nos pulmões os granulomas foram mais precocemente observados em Calomys callosus (15 d.p.i.), evoluindo com maior presença de necrose no final do experimento. O fígado mostrou granulomas já aos sete d.p.i. em todos os animais, sendo mais necrosante em Calomys callosus. Padrão semelhante foi observado também para o baço. Em todos os órgãos analisados, as lesões granulomatosas foram mais extensas em Calomys callosus no pulmão e no baço, ocupando aos 90 d.p.i. respectivamente, 90% e 70% dos parênquimas examinados, sendo mais reduzida no fígado. Em relação à avaliação da deposição diferencial de colágeno, observou-se que as lesões em Calomys callosus e B10.A tiveram predominantemente deposição de colágeno tipo III. No fígado e baço dos animais B10.A identificou-se deposição crescente de colágeno tipo I, sem entretanto superar os níveis observados para o colágeno tipo III, até o final do experimento. Nos camundongos A/Sn os níveis de colágeno depositados foram mais baixos, comparativamente aos outros animais, não sendo aparentemente identificados nas lesões pulmonares, mostrando tendência a aumento de deposição de colágeno tipo I, nos períodos finais do experimento, verificado no fígado. Calomys callosus apresentaram maior número de UFC nos três órgãos estudados, especialmente nos pulmões. As proporções de fungos viáveis identificadas nos diferentes órgãos de Calomys callosus foram maiores que aquelas observadas nos outros animais, tendendo a aumento no fígado e pulmões, com o transcorrer da infecção, ocorrendo o mesmo em relação aos brotamentos fúngicos. Conclusões: A infecção experimental produzida pela inoculação de 0,6 x 105 leveduras de Paracoccidioides brasiliensis, cepa virulenta Pb18 produziu a doença no C. callosus, que sob o ponto de vista clínico-patológico foi mais grave e disseminada do que a observada nos modelos murinos de susceptibilidade e de resistência, sobretudo nos pulmões. Calomys callosus pode ser considerado como modelo animal alternativo no estudo da paracoccidioidomicose infecção. / Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas / Acinetobacter baumannii emergiu como um dos patógenos hospitalares mais importantes em UTIs nos últimos anos devido principalmente a sua maior resistência aos antimicrobianos. Os fatores de risco associados a PAV por A. baumannii variam de acordo com a unidade e há controvérsias sobre sua virulência e mortalidade atribuída. O objetivo deste estudo foi avaliar os fatores de risco e a mortalidade hospitalar no prazo de 30 dias em pacientes com PAV por A. baumannii bem como diferenças quanto a essa mortalidade hospitalar e o uso de terapêutica adequada ou inadequada em pacientes com PAV por A. baumannii multirresistente versus não-multirresistente. Um estudo de pacientes com PAV por A. baumannii (casos) versus pacientes em uso de ventilação mecânica sem PAV (controles) quanto aos fatores de risco e evolução, foi realizado na UTI de adultos, mista, do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia no período de 09/2008 a 08/2009. O hospital de Clínicas é de ensino e assistência terciária e sua UTI tem 15 leitos. O diagnóstico de PAV foi por critérios clínicos, radiológicos e microbiológicos com contagem &#8805;106 UFC/mL. A identificação das amostras foi feito com o Kit BD BBL Crystal Nonenteric e o antibiograma por difusão de disco seguindo as orientações do CLSI. Os resultados foram submetidos a análise univariada e multivariada e a investigação foi aprovada pelo Comitê de Ética e Pesquisa da UFU. As PAVs foram usualmente tardias (90,0%), com A. baumannii como o segundo agente etiológico mais frequente (25,7%) seguindo a Pseudomonas aeruginosa (32,5%). Os fatores de riscos significantes associados à infecções por este microrganismo na análise univariada foram: gênero masculino (p= 0,0144; OR= 4,814), diagnóstico clínico na admissão (p= 0,0129. OR=0,239), diagnóstico cirúrgico na admissão (p= 0,0321, OR= 4.607) ventilação mecânica &#8805; 7 dias (p= 0,0315, OR= 5,939), tempo de internação na UTI &#8805; 20 dias (p=0,0002, OR= 9,578), uso prévio de antibióticos (p=0,0006, OR=6,333) e uso prévio de carbapenêmicos (p< 0,0001, OR=10,250), persistindo como fatores independentes na análise multivariada uso prévio de carbapenêmicos (p=0,0249, OR= 6,280) e tempo de internação na UTI &#8805; 20 dias (p=0,0148, OR= 7,427). A. baumannii foi responsável por cerca de um quarto das PAVs, com o uso prévio de carbapenêmicos e internação na UTI &#8805; 20 dias comportandose como fatores de risco independentes. Embora a mortalidade hospitalar nas PAVs por este microrganismo não fosse diferente do grupo controle, elas foram causadas na sua maioria (87,5%) por amostras multiresistentes em pacientes em uso de terapêutica antibiótica empírica incorreta (87,5%).

Breast cancer is the most common malignancy among women and represents a serious health problem around the world. Despite of the progression in cancer research, there is a few biomarker validated to be used in clinical routine. Thus, this work aimed to investigate the levels of four serum proteins related with the mostly earlier events of breast cancer. For this purpose, serum levels of EGFR1, HER-2, TSP-1 and RANKL were investigated in twenty-eight patients with breast cancer in the early and advanced stage by ELISA method. Nineteen volunteers with no breast cancer were included in this study as controls. The results showed that serum EGFR1 (sEGFR1) levels decrease with disease progression. The mean sEGFR1 concentration in control group was 61.7 ng/mL, 38.0 ng/mL in initial breast cancer and 34.2 ng/mL in metastatic breast cancer. The best cutoff value was 46.85 ng/mL, it was able to distinguish volunteers and breast cancer patients with 75% sensitivity, and 94.7% specificity. Regarding sHER-2, its levels were found to increase with disease progression. Serum HER-2 (sHER-2) median in control group was 5.13 ng/mL, and in initial breast, and metastatic breast cancer women the mean was 5.99 ng/mL and 6.18 ng/mL, respectively. A cutoff value of 5.38 ng/mL of HER-2 was able to distinguish healthy and breast cancer individuals with 81.5% of sensitivity and 78.9% of specificity. Regarding TSP-1, women with metastatic breast cancer had significantly lower levels than control group and initial breast cancer. Besides although initial patients tend to have a higher concentration than control group, no statistical difference was observed. Concerning serum RANKL no differences was observed between the groups. In conclusion, our results bring evidence that sEGFR1 and sHER-2 should be investigated in a large clinical trial in an attempt to validate these proteins as potentials biomarkers for earlier detection of breast cancer. / O câncer de mama é a neoplasia maligna mais comum entre as mulheres e representa um sério problema de saúde pública em todo o mundo. Apesar dos avanços em pesquisas na área de cancerologia, há poucos biomarcadores validados para uso na rotina clínica. Assim, este trabalho teve como objetivo investigar os níveis de quatro proteínas do soro relacionadas com os eventos em sua maioria anteriores do câncer de mama. Para este efeito, os níveis séricos de EGFR1, HER-2, TSP-1 e RANKL foram investigados em vinte e oito pacientes com câncer de mama em estádio inicial e avançado, pelo método de ELISA. Dezenove voluntárias sem câncer de mama foram incluídas neste estudo como grupo controle. Os resultados mostraram que os níveis séricos de EGFR1 (sEGFR1) diminui com a progressão da doença. A concentração média de sEGFR1 no grupo controle foi de 61,7 ng/mL, 38,0 ng/mL no câncer de mama inicial e 34,2 ng/mL no câncer de mama metastático. O melhor valor de cutoff foi 46,85 ng/mL, com sensibilidade de 75% e 94,7% de especificidade para distinguir entre pacientes com câncer de mama e grupo controle. Com relação ao sHER-2, as concentrações foram encontradas para aumentar com a progressão da doença. A concentração mediana de sHER-2 no grupo de controle foi de 5,13 ng/mL, e em pacientes com a neoplasia em sua fase inicial e com câncer de mama metastático a mediana foi de 5,99 ng/mL e 6,18 ng/mL, respectivamente. Um valor de cutoff de 5,38 ng/mL de HER-2 foi capaz de distinguir indivíduos saudáveis e de câncer de mama, com 81,5% de sensibilidade e 78,9% de especificidade. Quanto à sTSP-1, mulheres com câncer de mama metastático têm níveis mais baixos do que o grupo controle e pacientes com câncer inicial. Além disso, embora as pacientes iniciais tendessem a ter uma concentração mais elevada do que o grupo controle, não houve diferença estatística. Quanto ao sRANKL nenhuma diferença foi observada entre os grupos. Por último, os nossos resultados trazem evidências de que os níveis de sEGFR1 e sHER-2 devem ser investigados em ensaios clínicos com tamanho amostral significativo na tentativa de se validar estas proteínas como potenciais biomarcadores para a detecção precoce do câncer de mama. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

CHAPTER I: Leishmania spp are obligate intracellular protozoan that can cause a complex of known infectious diseases such as leishmaniasis, affecting millions of people worldwide. The host-pathogen interaction involves the parasite surface molecules and cellular receptors that culminate in phagocytosis. This internalization process involves changes in cytoskeleton through interaction with proteins related to actin polymerization, as AFAP, Arp 2/3 complex, Galectin-3, Septins and WASp, as well as activation and signaling pathways. It is known that L. amazonensis promastigotes after entry into phagocytes are present in phagosomes, and these vesicles undergo a maturation process, forming phagolysosome, important for differentiation of the promastigote forms to amastigotes. This study aimed to understand which proteins related to actin cytoskeleton exert role in the process of invasion and multiplication of L. amazonensis and which signaling pathways are involved in the formation of phagolysosome, the invasion and multiplication of this protozoan process the host cell. For this, we did invasion and multiplication assays with macrophages C57 BL/6 and BALB/c peritoneal treated or not with cytochalasin D, invasion assay with macrophages C57 BL/6 previously fixed in formaldehyde (0.01%), assay with macrophages C57 BL/6 knockdown for AFAP-1L1, Arp2, Galectin-3, Septin 4, 14 and WASP proteins compared to wild type cells. And yet, assays phagolysosome kinetics of formation and proliferation and invasion assays using inhibitors of Akt, ERK2, MEK1, MEK1/2, mTOR, PI3K and Ras signaling pathways. The results show that L. amazonensis invaded cells defective in actin polymerization, as well as fixed cells as well as decreased expression of Arp2, Galectin-3 and WASp proteins increased internalization of these parasites. The signaling pathways MEK1/2, ERK2 and AKT delayed the recruitment of the lysosomes to phagosome, and inhibition of PI3K, MEK1/2 and ERK2 pathways drastically decreased internalization of the parasite in the cells. We concluded that L. amazonensis were able to actively invade phagocytic cells, and that the Arp2, Galectin-3 and WASp proteins are involved in the process of entry into host cells. In addition, the MEK1/2, AKT and ERK2 signaling pathways are involved in the formation of phagolysosome as well as PI3K, MEK1/2 and ERK2 pathways seem to favor infection with L. amazonensis. CHAPTER II: The flagellate protozoan Trypanosoma cruzi is the causative agent for Chagas disease. It is estimated that there are eight million people infected worldwide. T. cruzi has different surface proteins related to cell invasion. In this context, our research group identified in T. cruzi, a protein of 21 kDa (P21) showed that pro-phagocytic and chemotactic activities, playing an important role in the internalization of this parasite in vitro. This study aimed to evaluate the role of recombinant protein P21-His6 based on native P21 of T. cruzi in Leishmania amazonensis in order to seek greater understanding of the mechanism of action of this protein and its relationship with the host in vivo. To this end, the footpad infect BALB/c mouse treated with 40&#956;g of active and denatured recombinant P21, BSA and PBS for 6 weeks and assess the footpad size, parasitic load (real time PCR) and cytokine production of IL-1&#946; in the paws, the popliteal lymph nodes and spleen. The results showed an increase in the footpad area, as well as increased parasite load in the infected and treated animals with P21-His6. Also, increased production of IL-&#946; in the footpad and the popliteal lymph nodes also in animals treated with P21-His6. We conclude that the P21 protein plays a role in pro-phagocytic also in vivo experiments, favoring infection. / CAPÍTULO I: Leishmania spp são protozoários intracelulares obrigatórios, que podem causar um complexo de doenças infecciosas conhecidas como leishmanioses, que afetam milhões de pessoas mundialmente. A interação entre patógeno-hospedeiro envolve moléculas de superfície do parasito e receptores celulares que culminam na fagocitose. Este processo de internalização envolve modificações no citoesqueleto celular por meio da interação com proteínas relacionadas à polimerização de actina, como AFAP, Complexo Arp2/3, Galectina-3, Septinas e WASp, bem como a ativação de vias de sinalização. Sabe-se que formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis após a entrada nos fagócitos, estão presentes em fagossomos, e essas vesículas sofrem um processo de maturação, formando o fagolisossomo importante para a diferenciação da forma promastigota em amastigota. Este trabalho teve como objetivo, entender quais proteínas relacionadas ao citoesqueleto de actina exercem papel no processo de invasão e na multiplicação de L. amazonensis, bem como, quais vias de sinalização estão envolvidas no processo de formação do fagolisossomo, na invasão e na multiplicação deste protozoário na célula hospedeira. Para isso, fizemos ensaios de invasão e multiplicação em macrófagos imortalizados C57 BL/6 e peritoneais de BALB/c tratados ou não com citocalasina D, ensaio de invasão em macrófagos C57 BL/6 previamente fixadas em formaldeído, ensaio com macrófagos C57 BL/6 knockdown para as proteínas AFAP-1L1, Arp2, Galectina-3, Septina 4 e 14 e WASp, comparando com células Wild Type. E ainda, ensaios de cinética de formação do fagolissomo e ensaios de invasão e multiplicação utilizando inibidores das vias de sinalização envolvendo Akt, ERK2, MEK1, MEK1/2, mTOR, PI3K e Ras foram realizados. Os resultados mostram que L. amazonensis invadiu células deficientes na polimerização de actina, e também células fixadas, bem como a diminuição da expressão das proteínas Arp2, Galectina-3 e WASp aumentaram a internalização desses parasitos. As vias de sinalização MEK1/2, ERK2, AKT atrasaram o recrutamento de lisossomos para o fagossomo, e a inibição das vias PI3K, MEK1/2 e ERK2 diminuíram drasticamente a internalização do parasito nas células. Concluímos que L. amazonensis foi capaz de invadir ativamente células fagocíticas, e que as proteínas Arp2, Galectina-3 e WASp estão envolvidas no processo de entrada na células hospedeira. Além disso, as vias de sinalização MEK1/2, ERK2 e AKT estão envolvidas na formação do fagolisossomo, bem como as vias PI3K, MEK1/2 e ERK2 parecem favorecer a infecção por L. amazonensis. CAPÍTULO II: O protozoário flagelado Trypanosoma cruzi é o causador da Doença de Chagas. Estima-se a existência de 8 milhões de pessoas infectadas em todo o mundo. T. cruzi apresenta diferentes proteínas de superfície relacionadas ao processo de invasão celular. Nesse contexto, nosso grupo de pesquisa identificou em T. cruzi, uma proteína de 21 kDa (P21) que apresentou atividades pro-fagocíticas e quimiotáticas, exercendo papel importante na internalização desse protozoário in vitro. O presente trabalho teve como finalidade avaliar o papel da proteína recombinante P21-His6 baseada na P21 nativa de T. cruzi na infecção por Leishmania amazonensis, a fim de buscar maior entendimento no mecanismo de ação dessa proteína e sua relação com o hospedeiro in vivo. Para isso, infectamos as patas de animais BALB/c e tratamos os animais com 40&#956;g de P21 recombinante ativa e desnaturada, PBS e BSA por 6 semanas e avaliamos o tamanho da pata, a carga parasitária (PCR em tempo real) e a produção da citocina IL-1&#946; nas patas, linfonodos do poplíteo e baços. Os resultados mostraram aumento na área da pata, bem como aumento da carga parasitária nos animais infectados e tratados com a P21-His6. E ainda, aumento da produção da citocina Il-1&#946; na pata e no linfonodo do poplíteo também nos animais tratados com a P21-His6 também foram observados. Concluímos que a proteína P21 exerce papel pro-fagocítico também em experimentos in vivo, favorecendo a infecção. / Mestre em Imunologia e Parasitologia Aplicadas