Amostras espermáticas provenientes do epidídimo podem ser utilizadas com diversas finalidades tais como: modelo experimental para pesquisa com sêmen, aproveitamento do sêmen de animais de alto valor genético que vierem a óbito e possibilidade da coleta e aproveitamento do sêmen de animais em perigo de extinção. No entanto, para a utilização desta técnica é necessário o estudo de diversos fatores que poderiam influenciar sua eficiência, como por exemplo, as formas de armazenamento dos testículos, efeitos da criopreservação, diluidores utilizados, entre outros. O presente estudo teve como objetivos: 1- determinar a temperatura mais adequada para o armazenamento do testículo após o abate do animal (4 ou 34ºC) levando-se em consideração testes funcionais e fecundação in vitro; 2- avaliar o efeito desta temperatura de armazenamento no sêmen epididimário fresco e criopreservado e; 3- verificar a eficiência do tratamento com ácido decosaexanóico (DHA) e antioxidantes adicionados ao diluidor. Para isso, amostras espermáticas foram coletadas da cauda do epidídimo de touros provenientes de abatedouros. Para testar o efeito da temperatura de acondicionamento dos testículos, os mesmos foram armazenados entre 2 e 4 horas após o abate, à temperatura de 4 ou 34º C. O sêmen foi então coletado da cauda do epidídimo, submetido ou não à criopreservação e avaliado quanto a análise computadorizada da motilidade espermática (CASA), integridade de membrana e potencial mitocondrial (iodeto de propídeo, SYBR e JC1), fertilização in vitro e susceptibilidade ao estresse oxidativo (TBARS). Visto que os resultados deste experimento indicaram que a temperatura de 4ºC era a mais indicada, a mesma foi utilizada para a avaliação do efeito da suplementação com DHA e antioxidantes adicionados ao diluidor. Nesta fase, o sêmen foi avaliado quanto à integridade de membrana e acrossomo (eosina/nigrosina e fast green/rosa bengala, respectivamente), atividade mitocondrial (diaminobenzidina), integridade do DNA (ensaio da estrutura da cromatina espermática SCSA) e susceptibilidade ao estresse oxidativo (TBARS). Os resultados do presente estudo indicam que o tratamento com o DHA tornou os espermatozóides mais susceptíveis aos danos causados pelo estresse oxidativo. Por outro lado, resultados diversos foram encontrados com a associação entre DHA e antioxidantes. A associação entre DHA e superóxido dismutase (SOD) e DHA e glutationa reduzida (GSH) apresentaram os melhores resultados em relação à motilidade espermática e à integridade de membrana, respectivamente. No entanto, o DHA, quando associado à Vitamina E, apresentou resultados negativos para a atividade mitocondrial. Os resultados do presente estudo indicam que o tratamento com DHA e SOD ou DHA e GSH em amostras espermáticas coletadas de epidídimos armazenados a 4ºC por até 4 horas, pode melhorar a qualidade espermática pós criopreservação. / Sperm recovery from the cauda epididymis can be very advantageous, for example: in case of the unexpected death of a genetically highly valuable animal, as an experimental model for research on semen and for the use in endangered species. However, the efficiency of this technique demands the study of several issues such as the storage conditions of the testicles prior semen collection, the effects of cryopreservation and semen extenders, among others. The objective of the present study was: 1- to evaluate the ideal temperature for testicles storage after slaughter (4 or 34ºC) based on functional tests and on in vitro fertility; 2- to evaluate the effect of storage temperature on fresh and cryopreserved semen samples, and; 3- to test the addition of decosaexanoic acid (DHA) and antioxidants to the semen extender. Sperm samples were collected from the caudae epididymides of testicles collected from abattoirs. To test the effect of temperature of storage, testicles were kept under 4 or 34ºC, between two to four hours after slaughter. Semen was then collected from the caudae epididymides and cryopreserved or not. Samples were then evaluated for computer assisted sperm analysis (CASA), membrane integrity and mitochondrial potential (propidium iodide, SYBR and JC1), in vitro fertilization outcomes, and susceptibility to the oxidative stress (TBARS). Results of this study indicated that, with no doubt, storage of testicles under 4ºC is the most appropriate in order to improve post-thaw sperm quality and in vitro fertility. Therefore, this temperature was used in the rest of the study to test the effect of DHA and antioxidant treatments to the semen extender. In this part of the study, semen was evaluated for membrane and acrosome integrities (eosin/nigrosin and fast green/bengal rose stain, respectively), mitochondrial activity (diaminobenzidine stain), DNA integrity (sperm chromatin structure assay SCSA) and, sperm susceptibility to the oxidative stress (TBARS). Results of the present study indicate that due to the treatment with DHA, epididymal sperm became more susceptible to the oxidative stress. On the other hand, different results were found regarding the association between DHA and antioxidant. The association between DHA and superoxide dismutase (SOD) and between DHA and reduced glutathione (GSH) showed better results on sperm motility and membrane integrity, respectively. On the other hand, when associated to the Vitamin E, the DHA showed poor results on mitochondrial activity. Results of the present study indicate that the treatment with DHA and SOD or GSH to epididymal sperm samples collected from testicles stored at 4ºC for up to 4 hours, may improve post-thaw sperm quality.

A resistência de bovinos Bos taurus taurus a ambientes tropicais é menor quando comparada com a de Bos taurus indicus. Essa característica influencia os aspectos reprodutivos e vem sendo amplamente descrita na literatura. No que diz respeito aos touros, esta influência torna-se ainda mais significativa, visto que uma menor fertilidade destes impõe enorme impacto na produção animal. Vários são os estudos que comprovam o efeito negativo do estresse térmico sobre os parâmetros seminais de touros europeus provocando diminuição da fertilidade, porém a patogenia deste quadro não está confirmada. Uma hipótese para esta menor fertilidade seria um maior nível de estresse oxidativo nos touros europeus, no qual haveria um desequilíbrio entre a produção de espécies reativas ao oxigênio (EROs) e os níveis de proteção antioxidante. Para testar esta hipótese, foram utilizados 20 touros Simental (Bos taurus taurus) e 20 touros Nelore (Bos taurus indicus), criados a campo, na região de Dourados, Mato Grosso do Sul, submetidos a duas coletas anuais, durante o verão e inverno, no período de dois anos consecutivos. As amostras foram analisadas através da análise espermática padrão, dos níveis das enzimas antioxidantes, catalase e superóxido dismutase (SOD), e dos níveis de malondialdeído (MDA), produto da peroxidação lipídica, que foi utilizado como índice de estresse oxidativo. Os dados foram analisados pela análise de variância ONEWAY, levando em conta as classes raça (Nelore e Simental) e estação do ano (verão e inverno), através do programa SAS for Windows. As variáveis defeitos menores, defeitos totais e motilidade não apresentaram diferenças quanto a raça ou estação do ano. Observou-se efeito de estação do ano sobre as variáveis defeitos maiores (20,32±15,30% e 12,17±12,27%, verão e inverno respectivamente; p=0,02) e MDA (842,66±527,98 e 419,30±434,14 ng/ml, verão e inverno respectivamente; p=0,006), apenas no sêmen dos touros de raça Simental. As concentrações das enzimas antioxidantes SOD e catalase, não diferiram entre as raças e tampouco entre as estações do ano. Observou-se correlação entre MDA e formas anormais de cabeça (r=0,39, p=0,0035) e entre SOD e defeitos primários (r= - 0,31, p=0,0075). Os resultados obtidos sugerem que houve um maior nível de estresse oxidativo nos animais de origem européia criados a campo em clima tropical em relação aos animais de origem indiana, provavelmente relacionado a uma produção excessiva de EROs sem a devida compensação antioxidante. / Resistance to tropical environments is lower in Bos taurus taurus than in Bos taurus indicus cattle. This trait influences reproductive aspects, and is greatly discussed in publications worldwide. This negative influence is much more significant in bulls, since lower fertility in them highly impacts animal production. There are many studies demonstrating that exposure of European bulls to heat stress will negatively affect their seminal parameters, leading ultimately to lower fertility rates, but the pathogenic pathway has not been clarified. One hypothesis is that this lower fertility is due to higher levels of oxidative damage in these bulls, in which there would be an imbalance between reactive oxygen species (ROS) production and antioxidant capacity. In order to test this hypothesis, 20 Simmental bulls (Bos taurus taurus) and 20 Nelore bulls (Bos taurus indicus) kept under extensive breeding in the Dourados region, in Mato Grosso do Sul state were used. Semen collection occurred twice a year, during summer and winter, for a two year period. Samples were submitted to standard semen analysis and the levels of the antioxidant enzymes catalase and superoxide dismutase (SOD) dismutase were measured. To evaluate oxidative damage to the cells the levels of the lipid peroxidation product malondialdehyde (MDA) were measured. Data were analyzed for breed (Nelore or Simmental) and season (summer or winter) by the ONEWAY analysis of variance, using the SAS for Windows. Minor defects, total defects and motility did not differ in breed or in season. Season showed an effect on major defects (20.32±15.30% and 12.17±12.27%, summer and winter respectively; p=0.02) and MDA (842.66±527.98 and 419.30±434.14 ng/mL, summer and winter respectively; p=0.006), only in the Simmental animals. SOD and catalase levels did not differ between breeds or seasons. Correlations were observed between MDA and sperm head defects (r=0.39, p=0.0035) and between SOD and primary defects (r= -0.31, p=0.0075). Results suggest a higher level of oxidative stress in European bulls raised in field conditions, when compared to Indian bulls under the same conditions, and this is probably due to a higher ROS production, without a concomitant increase in antioxidant levels.

Introdução: Recentes pesquisas têm indicado o enorme potencial de certas substâncias alimentares, como polifenóis antioxidantes e fibras na redução de riscos de doenças crônicas. O bagaço de uva, subproduto do processamento de vinhos e sucos, representa uma ótima fonte de fibras e antioxidantes naturais de baixo custo. Objetivo: Avaliar o potencial hipolipemiante, antioxidante e sensorial de subprodutos do processamento do vinho e do suco. Métodos: Para avaliar a capacidade antioxidante in vitro, foi utilizado o método do DPPH. O potencial antioxidante e hipolipemiante in vivo foi avaliado mediante ensaio biológico, no qual sessenta hamsters foram divididos em seis grupos diferenciados pelas dietas: controle, hiperlipemiante, extrato de bagaço do vinho (BV), extrato de bagaço do suco (BS), suplementada com BV e suplementada com BS. Amostras de sangue e fígado foram coletadas após 4 semanas de experimento para avaliação do perfil lipídico, capacidade de inibição da oxidação de LDL-colesterol (LDL-c) e atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx). Para a avaliação sensorial, foram desenvolvidos sorbet e picolé de BV e BS, cujos atributos sensoriais foram avaliados por 43 pessoas aplicando-se o método afetivo de escala hedônica de 9 pontos. Resultados: Extratos de BV e BS apresentaram uma expressiva capacidade antioxidante in vitro. No modelo animal, os grupos tratados com BV e BS apresentaram uma melhora significativa do perfil lipídico e da atividade da enzima CAT, em relação aos grupos controle e hipercolesterolêmico (p<0,05). Com relação aos valores de SOD, GPx e inibição da oxidação de LDL-c, observou-se melhores resultados em relação ao grupo hipercolesterolêmico, embora não significativamente em todos os grupos tratados. Na análise sensorial, somente o picolé de BV não preencheu totalmente os requisitos de aceitação. Conclusão: Os subprodutos de ambas as espécies de uva apresentaram potencial biológico e sensorial para serem utilizados como ingredientes funcionais. / Introduction: Recent studies have shown the great potential of certain food components such as antioxidant polyphenols and fiber in reducing the risk of chronic diseases. Grape pomace, a wine and juice processing byproduct, is a low cost material and a very good source of fiber and natural antioxidants. Objectives: To evaluate the hypolipidemic, antioxidant and sensory potential of wine and grape byproducts. Methods: To evaluate the in vitro antioxidant capacity, the DPPH method was used. The in vivo antioxidant and hypolipidemic potential was evaluated through an animal model, in which sixty hamsters were divided into six groups according to their diets: control, hyperlipidemic, wine pomace (WP) extract, juice pomace (JP) extract, WP supplemented diet and JP supplemented diet. Samples of blood and liver were collected after a 4-week experimental period to evaluate the lipid profile, ability to inhibit the LDL-cholesterol (LDL-c) oxidation and antioxidant activity of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) enzymes. For the sensory evaluation, BV and BS sorbet and popsicle were developed, and the sensory attributes were evaluated by 43 tasters according to a 9- point affective hedonic scale. Results: WP and JP extracts showed a very good in vitro antioxidant capacity. In the animal model, both WP and JP treated groups presented a significant improvement in the lipid profile and CAT enzyme antioxidant activity in comparison to hypercholesterolemic and control groups (p <0.05). Regarding the values of SOD, GPx and inhibition of LDL-c oxidation, there values were better when compared to hypercholesterolemic group, even though they were not significant in all treated groups. In the sensory evaluation, only the BV popsicle was not fully accepted. Conclusion: Both grapes byproducts showed a biological and sensory potential to be used as functional ingredients.

Este trabalho de mestrado descreve a avaliação do emprego de radicais sulfato (SO42-.), obtidos a partir do oxidante persulfato de potássio (K2S2O8) , na degradação de soluções aquosas de fenol. A deterioração dos recursos hídricos tem assumido um caráter preocupante uma vez que as demandas deste bem estão se tornando cada vez maiores. Dentre os compostos responsáveis pela degradação da qualidade dos sistemas aquáticos, destacam-se os compostos orgânicos poluentes como os organoclorados, organofosforados, carbamatos, triazinas, hidrocarbonetos aromáticos polinucleares, fenólicos, etc. Dentre esta série de compostos poluentes, atenção especial tem sido dada ao fenol devido as grandes quantidades em que são gerados e pela diversidade tipos de atividades produtivas que o empregam. Assim, este trabalho avaliou a aplicação de radical SO4 2- do fenol Estudos utilizando ressonância paramagnética eletrônica (EPR) mostraram que o radical SO42- é a principal espécie radicalar obtida a partir da fotólise e termólise do oxidante S2O8-2. A presença de radiação UV contribuiu beneficamente para a degradação do composto orgânicos. Altas temperaturas como 40 0C e 70 <SÙP>0C também levaram a uma maior taxa na degradação do fenol devido a uma maior produção de espécies radicalares oxidantes. Além dos processos fotoassistidos e térmicos, investigou-se também processos de geração dos radicais a partir da ativação do oxidante em diferentes pH (3,0, 5,0, 7,0 e 9,0) e tambem na presença de metais de transição (Co2+, Mn2+, Fe2+, Fe3+ e Cu2+). A processo não foi afetada pelo pH. Com relação a presença dos metais de transição na solução obteve-se um ganho na eficiência do processo principalmente com o emprego do Fe2+, caracterizando a reação como uma reação do tipo Fenton. De uma maneira geral a utilização de SO4 2- na degradação de fenol mostrou-se bastante promissora para uma aplicação deste processo no tratamento de efluentes contendo estes compostos. / This work describes the evaluation of radicals sulphate (SO42-), obtained from the oxidant potassium persulphate (K2S2O8), in the degradation of phenol aqueous solutions. The deterioration of the aquatic resources has been assumed a preoccupying situation, since a time its demands has been increased constantly. Amongst many compounds in the degradation of aquatic systems quality, special attention has been dispensed to organic compounds such as organochlorinated, organophosphorated, aromatic carbamates, triazines, polynuclear hydrocarbons, phenolic, etc. This work evaluated the application of SO42- radicals in the degradation of phenol. Studies using electron paramagnetic resonance (EPR) showed that SO4-2 is the main radical species obtained by the S2O8-2 oxidant photolysis and thermolysis. The presence of UV radiation contributed to improve phenol degradation due to the increase in oxidant radicals production. Higher temperatures (40 0C and 70 0C) have also led to an increment in the phenol degradation rate. Beyond the photoassisted and thermal processes, it was also investigated processes of radicals\' generation from the activation of the oxidant in different pH (3.0, 5.0, 7.0 and 9.0) and also in the presence of transition metals (Co2+, Mn2+ , Fe2+ , Fe3+ and Cu2+ ). The efficiency of the process was not affected by the pH. On the other hand, the presence of transition metals in the solution led to considerably better degradation rates, specially applying Fe2+, which could be characterized as a Fenton-like reaction. In a general way, the use of SO42- in the phenol degradation showed promising results for its future application in the treatment of effluent containing these composites.

Made available in DSpace on 2015-04-14T13:54:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 391944.pdf: 113050 bytes, checksum: c1a3c0bb9fecfbbcc9629f83a84a0330 (MD5) Previous issue date: 2004-08-13 / Diversos estudos t?m demonstrado o potencial ben?fico dos flavon?ides sobre v?rios aspectos biol?gicos, o que levou a prescri??o de diversas destas subst?ncias como suplementos alimentares para prevenir ou corrigir altera??es funcionais, principalmente no que diz respeito ?quelas relacionadas ao envelhecimento. A morina apresenta potencial protetor do sistema cardiovascular contra o estresse oxidativo e apresenta efeitos antitumorais bastante promissores no tratamento de neoplasias. Entretanto, outros estudos demonstram que ela pr?-oxidante por induzir a produ??o de super?xido (O2 ?-) e per?xido de hidrog?nio (H2O2), causar dano ao DNA em cultura de linf?citos e inibir a enzima glutationa redutase. Visto que v?rios estudos apontam que os radicais livres al?m de estarem envolvidos com a patog?nese de muitas doen?as, est?o envolvidos com as mudan?as e doen?as associadas ? idade, entre elas, o decl?nio da performance cognitiva, em particular, o aprendizado e a mem?ria, o presente estudo tem por fun??o analisar o efeito agudo de diferentes doses da morina sobre a mem?ria de reconhecimento e esquiva inibit?ria em ratos submetidos a tarefas comportamentais. Os animais submetidos ? tarefa de reconhecimento do objeto novo receberam inje??es intraperitoneais de ve?culo ou morina (Sigma) (5mmol/Kg e 50mmol/Kg ) 96 horas antes da sess?o de treino ou imediatamente ap?s o treino da tarefa. Os ratos que receberam morina pr?-treino, em ambas as doses, apresentaram bloqueio completo de STM e LTM. Nos ratos que receberam a dose de 5,0mmol/Kg imediatamente p?s-treino foi observado efeito amn?sico na STM e LTM enquanto que os ratos que receberam a dose de 50,0mmol/Kg apresentaram bloqueio apenas na LTM. O tempo total de explora??o dos objetos durante a sess?o de treino da tarefa onde os animais receberam morina pr? treino foi diferente estatisticamente entre os grupos que receberam solu??o ve?culo e os grupos que receberam morina. Tal fato, nos leva a considerar que a morina pode ter algum outro efeito inespec?fico sobre a atividade locomotora explorat?ria, motiva??o ou ansiedade. Expostos ? tarefa de esquiva inibit?ria os animais receberam inje??es intraperitoneais de morina na dose de 50,0mmol/Kg 96 horas antes da sess?o de treino e nas doses de 5,0mmol/Kg e 50,0mmol/Kg em dois diferentes tempos: 30 pr?-treino e imediatamente p?s- treino. Em nenhuma das doses ou tempos foram encontrados d?ficts de mem?ria. Em conjunto os resultados obtidos neste estudo indicam que os efeitos da morina sobre a mem?ria dependem do conte?do da tarefa comportamental, uma vez que ela causou preju?zo em uma tarefa neutra e n?o provocou altera??es em uma tarefa aversiva. Entretanto, sugere-se a realiza??o de estudos adicionais que avaliem o efeito deste flavon?ide em outros aspectos neurocomportamentais, os quais poderiam influenciar o desempenho dos animais nas tarefas de mem?ria.

Submitted by PPG Biotecnologia Farmac?utica (mpbf@pucrs.br) on 2017-08-01T13:00:08Z No. of bitstreams: 1 SARAH_LEDUR_SELBACH_DIS.pdf: 2769655 bytes, checksum: 75da9b372aa505302e3bba0e64bdc393 (MD5) / Rejected by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br), reason: Devolvido devido a diverg?ncia entre o t?tulo de capa e o t?tulo da folha de rosto. Confirmar qual o correto. on 2017-08-04T13:28:42Z (GMT) / Submitted by PPG Biotecnologia Farmac?utica (mpbf@pucrs.br) on 2017-08-08T13:07:34Z No. of bitstreams: 1 SARAH_LEDUR_SELBACH_DIS.pdf: 2769655 bytes, checksum: 75da9b372aa505302e3bba0e64bdc393 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-08-10T18:18:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 SARAH_LEDUR_SELBACH_DIS.pdf: 2769655 bytes, checksum: 75da9b372aa505302e3bba0e64bdc393 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-10T18:24:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SARAH_LEDUR_SELBACH_DIS.pdf: 2769655 bytes, checksum: 75da9b372aa505302e3bba0e64bdc393 (MD5) Previous issue date: 2016-02-29 / According to INCA (National Institute of Cancer) the cases of skin cancer are increasing exponentially, and it is the world's largest incidence. The increase in ultraviolet index, due to the depletion of the ozone layer, and excessive sun exposure contribute to this fact. The formation of reactive oxygen species (ROS) can be from endogenous and exogenous factors, mainly by exposure to ultraviolet (UV). This are directly linked to the development of several types of cancer, especially skin cancer and photoaging. ROS or free radicals alter the DNA and other biomolecules of the skin, causing genetic mutations that promote and induce cancer incidence. Consequently, the search for new antioxidant substances for topical use is of utmost importance for the prevention of photodamage and skin cancer. This project of master dregree aims to develop a topical nanoemulsion containing these active substances Green tea (Camellia sinensis) and Buriti Oil (Mauritia flexuosa), which have antioxidant properties, and to study their stability in vitro and assess its properties. As a result it is expected to develop a cosmetic raw material that meets a demand of the consumer market, contributing to the prevention of skin cancer and to decrease the signs of cutaneous photoaging. / Segundo o INCA (Instituto Nacional de C?ncer), o c?ncer de pele possui a maior incid?ncia mundial e seus casos v?m aumentando exponencialmente. O aumento do ?ndice ultravioleta devido ? diminui??o da camada de oz?nio e a exposi??o solar excessiva contribuem para este fato. A forma??o de esp?cies reativas de oxig?nio (EROs), se d? por fatores end?genos e ex?genos, principalmente pela exposi??o aos raios ultravioleta (UV). Esta est? diretamente ligada ao desenvolvimento de diversos tipos de c?ncer, especialmente o de pele. As EROs, ou radicais livres, alteram o DNA e demais biomol?culas da pele, ocasionando muta??es gen?ticas que favorecem e induzem a incid?ncia de c?ncer, e causam fotoenvelhecimento. Consequentemente, a busca de novos ativos com propriedades antioxidantes de uso t?pico ? de extrema import?ncia para a preven??o de fotodanos e c?ncer de pele. Este projeto de mestrado teve como objetivo desenvolver uma nanoemuls?o t?pica contendo estas subst?ncias ativas, Ch? Verde (Camellia sinensis) e ?leo de Buriti (Mauritia flexuosa), que apresentam propriedades antioxidantes, estudar sua estabilidade e avaliar in vitro suas propriedades. Como resultado, espera-se obter um insumo cosm?tico que atenda uma demanda do mercado de consumidores, contribuindo para preven??o do c?ncer de pele e para diminui??o dos sinais do fotoenvelhecimento cut?neo.

A ação de espécies reativas de oxigênio e/ou de nitrogênio (ERO/ERN), produzidas por neutrófilos através do complexo NADPH oxidase (Nox2) e óxido nítrico sintase (iNOS), estão diretamente associadas à capacidade microbicida de fagócitos. Entretanto, se a produção destes oxidantes escapa ao controle da homeostase bioquímica, ocorrem danos oxidativos aos tecidos circunvizinhos do foco inflamatório, quando, então, há necessidade de intervenção farmacológica. Neste trabalho foi testado o efeito dos nitróxidos piperídinicos 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidina-1-oxil (Tempo) e 4-((9 acridinecarbonil)amino)-2,2,6,6-tetrametil-1-piperidina-1-oxil (Ac-Tempo) sobre a atividade de Nox2 de neutrófilos inflamatórios e suas consequências sobre a capacidade fungicida dos fagócitos. Neutrófilos isolados de cavidade peritoneal de camundongos foram incubados (37°C, 10 min) com Tempo (50-400 μM) ou Ac-Tempo (25-200 μM) e estimulados com Candida albicans (ATCC 10231) opsonizadas (107 C. albicans/105 neutrófilos). A atividade de Nox2 foi determinada polarograficamente, pelo consumo de oxigênio mensurado através de eletrodo de Clark, ou espectrofotometricamente, medindo-se a redução de citocromo c (550nm). A atividade de Nox2 (119,311,6 nmol de O2-•.min-1) foi diminuída pelo tratamento com ambos os nitróxidos, de forma dose-dependente, embora Ac-Tempo tenha sido mais eficaz (ED50 31 M) que Tempo (ED50 160 M). Paralelamente, foi verificada a fluorescência (λexc361, λemi440) emitida pelo grupo acridina após reação de espécies radicalares com Ac-Tempo, corroborando a hipótese de que nitróxidos depletam radicais produzidos por neutrófilos estimulados com C. albicans. O nitróxido Tempo não mostrou nenhuma ação direta sobre culturas de C. albicans, conforme análises de antifugigramas padrões. Entretanto, testes de capacidade microbicida de neutrófilos mostraram que o tratamento prévio das células com Tempo (300 µM) causou decréscimo de 80% na efetividade fungicida sobre C. albicans. Testes in vivo mostraram que Tempo administrado em dose oral única (26,52 mg/kg) foi capaz de diminuir o edema de pata originado em resposta à inoculação do fungo (107 C. albicans) cujo ponto máximo de efeito foi 18 horas após a administração do nitróxido, bem como determinou significativa diminuição de nitração de proteínas em tecido muscular das patas dos animais, conforme resultados de ensaios com anticorpos anti-nitrotirosina. Em conjunto, os resultados corroboram a premissa de que a atividade de Nox2 é essencial para a resposta do hospedeiro a C. albicans e que a administração de nitróxidos para modular a produção de oxidantes nos focos infecciosos pode diminuir a resposta do sistema imune à infecção fúngica. / Production of oxidants species by neutrophils through NADPH oxidase complex (Nox2) is directly associated with the microbicidal activity of phagocytes. In this work we tested the effect of the nitroxides 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-piperidine-1-oxil (Tempo) and 4-((9 acridinecarbonil)amino)-2,2,6,6-tetramethyl-1-piperidine-1-oxil (Ac-Tempo) on the activity of inflammatory neutrophil Nox2 complex and the consequences on the fungicidal phagocytes capability. Neutrophils were incubated with Tempo (50-400 mM) or Ac-Tempo (25-200 mM) and stimulated with Candida albicans. Nox2 activity was determined polarographically by oxygen consumption measured by Clark electrode. Oxidase activity decreased by treatment with both nitroxides in a dose-dependent manner. However, Ac-Tempo was more effective (ED5044M) that Tempo (ED50160M). In parallel, the fluorescence intensity elicited by acridine after reaction with free radicals was determined. Neutrophils stimulation elicited significant fluorescent response in direct correlation with Ac-Tempo doses (R2=0.997), supporting the hypothesis that nitroxide is consumed by free radicals neutrophils-released. Fungicidal neutrophils activity assay explicited that pretreatment of cells with Tempo caused 80% decrease in the effectiveness on C. albicans death. Oral administration of a Tempo single dose was able to reduce paw edema elicited in response to inoculation of the fungus. Also, a significant decrease in protein nitration in paw tissues was found in this condition. Together, the results support the premise that Nox2 activity is essential for the host response against C. albicans and that nitroxides cause a decrease on the oxidant immune response to fungal infection.

Os tióis são importantes para manter as funções celulares. A glutationa (GSH) é um importante peptídeo redutor que repara biomoléculas oxidadas envolvidas na sinalização celular e atua como “scavenger” de bioradicais, quando, neste último caso, forma-se o radical glutationila (GS•). Para investigar o papel dos radicais tiila (RS•) durante o “burst” respiratório de macrófagos, foi usado o nitróxido 4-9((- acridinecarbonil)-amino)-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-oxil (Ac-Tempo) o qual reage com radicais, particularmente tiila e radicais centrados no carbono, apagando o sinal de EPR, enquanto ocorre aumento de fluorescência da acridina (lex 361 nm, lem 440 nm) (Borisenko et al. JACS 126, 9221, 2004). Macrófagos de focos inflamatórios peritoneais não estimuladas mostraram um baixo sinal de fluorescência acompanhado pela manutenção do sinal de EPR característico do Ac-Tempo. Estímulo celular com PMA, na presença de Ac-Tempo, elicitou sinal de fluorescência dose-dependente, em sincronia com a redução do sinal de EPR e com consumo de O2. Mudanças na intensidade do sinal de fluorescência e de EPR foram dependentes dos níveis celulares de GSH, demonstrado pelo pré-tratamento das células com butionina sulfoximina (BSO) e N-etilmaleimida (NEM ). O tratamento celular com o nitróxdio determinou diminuição do processo de S-glutationação protéica associado à atividade do complexo NADPH oxidase. Os resultados sugerem um papel central de radicais tiila, provavelmente GS•, na manutenção do “burst” respiratório de macrófagos e apontam os nitróxidos como protótipos de antiinflamatórios. / Thiols are required to maintain cellular functions. For instance, glutathione (GSH) is an important reductant to repair oxidized biomolecules, to cycle proteins involved in cell signaling and to scavenge bioradicals, although the relatively reactive glutathionyl radical (GS•) is produced in the latter case. To investigate GS• participation in macrophage respiratory burst, we employed the nitroxide 4-9((-acridinecarbonil)-amino)- 2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxil (Ac-Tempo) whose interaction with GS• and carbon centered radicals switches off Ac-Tempo EPR signal while switching on acridine moiety fluorescence (ëexc 361 nm, ëemi 440 nm) (Borisenko et al JACS 126, 9221,2004). Inflammatory macrophages unstimulated displayed low fluorescence accompanied by maintenance of Ac-Tempo EPR signal. Cells stimulated with PMA in the presence of Ac- Tempo elicited a dose-dependent fluorescence in synchrony with EPR signal decay and O2 consumption. Changes in fluorescence and EPR signal intensity were dependent on GSH levels as demonstrated by pre-treatment of cells with buthionine sulfoximine and N-ethylmaleimide. The macrophage protein S-glutathionylation process due to NADPH oxidase activation was significantly decreased under Ac-Tempo cellular treatment. These results suggest a role of thiyl radicals in the maintenance of the macrophages respiratory burst and may provide a therapeutic target for inflammation management. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Sem resumo / Sem abstract

Orientador: Durvalina Maria Mathias dos Santos / Coorientador: Alberto José Cavalheiro / Banca: Rogério Falleiros de Carvalho / Banca: Paulo Alexandre Monteiro de Figueiredo / Banca: Gustavo Habermann / Banca: Gustavo Maia Souza / Resumo: Neste estudo foram avaliadas duas cultivares de cana-de-açúcar sob estresse salino. O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado em esquema fatorial 2 x 4, representado pelas cultivares SP81-3250 e IAC87-3396 e concentrações salinas de 0, 200, 400 e 800 mg dm-3 de NaCl, com avaliações aos 15 e 30 dias após a aplicação dos tratamentos salinos. Foram avaliados os teores foliares de sódio e potássio, o potencial de água de antemanhã, o conteúdo relativo de água, a concentração de prolina e glicina betaína, a atividade enzimática da dismutase do superóxido, ascorbato peroxidase e catalase, a concentração de aldeído malônico, o extravasamento de eletrólitos, a concentração de clorofilas a e b, a eficiência fotoquímica máxima do fotossistema II e o perfil de metabólitos secundários baseado em técnicas metabolômicas. Os tratamentos salinos promoveram aumento do teor foliar de sódio nas cultivares estudadas, com maior teor no 30° dia de avaliação, enquanto que os teores de potássio apresentaram leve redução. Por outro lado, o potencial de água de antemanhã e o conteúdo relativo de água foram reduzidos em ambas as cultivares e dias de avaliação com o aumento da severidade do estresse salino. Foi observado aumento na concentração de prolina e glicina betaína, sendo este incremento mais evidente na cv. IAC87-3396 em ambos os dias de avaliação. Similarmente, as enzimas ascorbato peroxidase e catalase tiveram aumento em suas atividades, em particular na cv. IAC87-3396 no 30° dia. Inclusive, esta cultivar de cana-de-açúcar apresentou maior concentração de aldeído malônico e extravasamento de eletrólitos em comparação a cv. SP81-3250 em ambos os dias de avaliação. Verificou-se que o estresse salino reduziu a concentração de ambos os pigmentos clorofilianos sem diferenças pronunciadas entre as cultivares nos dois dias. A eficiência fotoquímica máxima do fotossistema... / Abstract: In the present study was evaluated two cultivars of sugarcane under salt stress. The experiment was conducted in a greenhouse with temperature and relative humidity average of 30.2 ± 1 ° C and 40.7 ± 1%. The experimental design was completely randomized in a factorial 2 x 4, represented by the cultivars SP81-3250 and IAC87-3396 and salt concentrations of 0, 200, 400 and 800 mg dm-3 NaCl. The study was evaluated 15 and 30 days after application of the saline treatments. We evaluated foliar concentrations of sodium and potassium, predawn leaf water potential, relative water content, proline and glycine betaine concentration, enzymatic activity of superoxide dismutase, catalase and peroxidase ascorbate, malondialdehyde concentration, electrolyte leakage, chlorophyll a and b concentration, the maximum photochemical efficiency of photosystem II and the profile of secondary metabolites based on metabolomics techniques. Saline treatments caused an increase in leaf sodium content in cultivars and both days of evaluation, while the potassium had a mild reduction. On the other hand, predawn leaf water potential and relative water content were reduced in both cultivars and evaluation days with increasing severity of salt stress. There was an increase in the concentration of proline and glycine betaine. This increase was more evident in cultivar IAC87-3396 in both days of evaluation. Similarly, enzymes ascorbate peroxidase and catalase had an increase in their activities, particularly in cultivar IAC87-3396 in the 30th day. This cultivar of sugarcane had malondialdehyde concentration and electrolytes leakage higher compared to cv. SP81-3250 in both days of evaluation. Salt stress reduced the concentration of both chlorophyllian pigments with no pronounced differences among cultivars in two days evaluated. The cultivar IAC87-3396 not presented photochemical efficiency of photosystem II with significant differences between the salt ... / Doutor