Der erste Teil der Arbeit beschreibt die Etablierung einer modifizierten Form des klassichen SILAC-Verfahrens, das in der quantitativen Massenspektrometrie zur Bestimmung von relativen Änderungen in Proteinmengen benutzt wird. Im sog. „pulsed SILAC (pSILAC)“ Verfahren werden Zellen im Zuge einer differentiellen Behandlung in Kulturmedien transferiert, die unterschiedlich Isotop-markierte Aminosäuren enthalten. Da hier die Quantifizierung auf dem Verhältnis der neusynthetisierten Proteinmengen beruht, können gezielt Unterschiede in der Proteinproduktion bestimmt werden. Mit Hilfe von pSILAC konnte im zweiten Teil der Arbeit erstmals quantitativ erfasst werden, welchen Einfluss microRNAs auf die Proteinsynthese ausüben. So konnte gezeigt werden, dass sowohl die Überexpression als auch die Repression einzelner microRNAs die Produktion hunderter Proteine beeinflussen kann. Außerdem konnten Genprodukte identifiziert werden, die ausschließlich translational reguliert werden. Die Messung von Proteinneusynthese ermöglichte auch die Bestimmung von Proteinumsatzraten, dargestellt im dritten Teil der Arbeit. Zusammen mit mRNA-Umsatzraten sowie Protein- und mRNA-Mengen bilden sie die Grundlage für eine dynamische Beschreibung zelluärer Genexpression. Durch den gleichzeitigen Einsatz des Nukleosidanalogons 4-Thiouridin (4sU) und von schweren Aminosäuren (SILAC) konnte eine metabolische Markierung neusynthetiserter mRNAs und Proteine in murinen Fibroblasten erreicht und damit eine Berechnung von Protein- und mRNA-Halbwertszeiten und absoluten Mengen für ca. 5,000 Gene ermöglicht werden. Während mRNA- und Proteinenmengen deutlich korrelierten, war zwischen mRNA- und Proteinhalbwertszeiten nur eine äußerste schwache Korrelation zu erkennen. Dennoch stehen mRNA- und Proteinumsatzraten nicht einem willkürlichen Zusammhang zu einander, da bestimmte Kombinationen von mRNA- und Proteinhalbwertszeiten eine Optimierung von Genen hinsichtlich ihrer biologischen Funktionen erkennen ließen. / The first part of the thesis describes the establishment of a modified version of the classic SILAC approach routinely used in quantitative mass spectrometry (MS) to assay relative changes in protein levels. In the newly-devised approach termed pulsed SILAC (pSILAC) differentially treated cells are transferred to culture medium supplemented with different versions of stable-isotope labeled heavy amino acids. As MS-based relative quantification is exclusively based on the newly-synthesized heavy protein amounts the method enables the detection of differences in protein production resulting from the treatment. The second part of the thesis shows the use of pSILAC to globally quantify the impact of microRNAs onto the proteome. Ectopic over-expression or knock-down of a single microRNA both affected protein production of hundreds of proteins. pSILAC identified several target genes as exclusively translationally regulated as changes in corresponding transcript levels were virtually absent. Measuring newly-synthesized protein amounts with heavy amino acids in a pulsed-labeling fashion has also been used to determine turnover rates of individual proteins, described in the third part of the present work. Along with transcript turnover as well as mRNA and protein levels they are essential for a dynamic description of gene expression. Simultaneous application of the nucleoside analogue 4-thiouridine (4sU) and heavy amino acids (SILAC) to metabolically label newly-produced mRNAs and proteins in mouse fibroblasts resulted in the calculation of mRNA and protein lifetimes and absolute levels for approximately 5,000 genes. While mRNA and protein levels were overall well correlated, a correlation between mRNA and protein half-lives was virtually absent. Yet this seemingly chaotic distribution of mRNA and protein half-lives was highly instructive since specific gene subsets have obviously evolved distinct combinations of half-lives that relate to their biological functions.

Der Gestationsdiabetes betrifft etwa 5 von 100 Schwangeren. In unserer prospektiven, randomisierten Studie mit Crossover-Design untersuchten wir den Einfluß der Kohlenhydrataufnahme auf den Glukosestoffwechsel Schwangerer. 18 Gestationsdiabetikerinnen, 9 Frauen mit eingeschränkter Glukosetoleranz und 25 Kontrollen haben jeweils eine Woche eine kohlenhydratarme (35 Energieprozent) und eine kohlenhydratreiche (55 Energieprozent) Diät durchgeführt. Auswirkungen wurden anhand des konventionellen BZTPs und des kontinuierlich messenden Glukosesensors CGMS® untersucht. Die KH-Aufnahme wurde mittels einer Ernährungsberatung deutlich beeinflußt, und lag bei 39 % in der KH-reduzierten, und bei 49 % in der KH-reichen Woche. Nach DDG-Kriterien hatte der KH-Anteil bei keiner Gruppe einen signifikanten Einfluß bezüglich der Insulinpflicht. Dagegen waren der BZTP-Mittelwert und die AUC (area under the curve des CGMS®) der GDMs und der Kontrollen signifikant niedriger in der KH-armen Woche. In dieser Woche nahmen die Probandinnen auch eine niedrigere Energiemenge zu sich. Bei einer selektierten Untergruppe konnten wir diesen Einfluß ausgrenzen, und für die Kontrollgruppe eine signifikante Erniedrigung bezüglich der BZTP-Mediane und der AUCs nachweisen. Diese Beobachtungen belegen, daß ein höherer Kohlenhydratanteil mit erhöhten Blutzuckerwerten assoziiert ist. Außerdem wurde ein größerer Einfluß einer kohlenhydratarmen Ernährung auf die postprandialen als auf die Nüchternwerte festgestellt. Wegen der Auswirkungen auf das fetale Wachstum soll man bei Gestationsdiabetikerinnen eine kohlenhydratarme Ernährung empfehlen. / Gestational diabetes affects about 5 % of pregnancies. In our randomized prospective study with crossover design we examined the influence of carbohydrate intake on the glucose metabolism of pregnant women. 18 women with gestational diabetes, 9 with impaired glucose tolerance and 25 controls were put on a low (35 energy %) carbohydrate diet for one week and a high (55 energy %) carbohydrate diet for another. Blood glucose levels were recorded by self-monitoring and with a continuous glucose monitoring sensor (CGMS ®). Carbohydrate intake was strongly influenced by dietary advice, amounting to 39% into the low carbohydrate and 49% in the high carbohydrate week. According to DDG criteria, carbohydrate intake had no significant influence on insulin requirements. In contrast, mean blood glucose levels and the AUC (area under of the curve of the CGMS ®) were significantly lower for both gestational diabetics and controls in the low carbohydrate week. During this week, the average caloric intake was also reduced. We could exclude this influence for a selected subgroup, in which the controls displayed a significant reduction in median glucose levels and the AUCs. We could thus show that a higher carbohydrate content is associated with raised blood glucose levels. Furthermore, the influence of a low carbohydrate diet was greater on postprandial than on fasting levels. Because of the effects on fetal growth, one should recommend a low carbohydrate diet for gestational diabetics.

Die biotechnologischen Entwicklungen der letzten Jahre ermöglichen eine immer detailliertere Untersuchung von genetischen und molekularen Markern mit multiplen komplexen Traits. Allerdings liefern vorhandene statistische Methoden für diese komplexen Analysen oft keine valide Inferenz. Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit ist, zwei neue statistische Methoden für Assoziationsstudien von genetischen Markern mit multiplen Phänotypen zu entwickeln, effizient und robust zu implementieren, und im Vergleich zu existierenden statistischen Methoden zu evaluieren. Der erste Ansatz, C-JAMP (Copula-based Joint Analysis of Multiple Phenotypes), ermöglicht die Assoziation von genetischen Varianten mit multiplen Traits in einem gemeinsamen Copula Modell zu untersuchen. Der zweite Ansatz, CIEE (Causal Inference using Estimating Equations), ermöglicht direkte genetische Effekte zu schätzen und testen. C-JAMP wird in dieser Arbeit für Assoziationsstudien von seltenen genetischen Varianten mit quantitativen Traits evaluiert, und CIEE für Assoziationsstudien von häufigen genetischen Varianten mit quantitativen Traits und Ereigniszeiten. Die Ergebnisse von umfangreichen Simulationsstudien zeigen, dass beide Methoden unverzerrte und effiziente Parameterschätzer liefern und die statistische Power von Assoziationstests im Vergleich zu existierenden Methoden erhöhen können - welche ihrerseits oft keine valide Inferenz liefern. Für das zweite Ziel dieser Arbeit, neue genetische und transkriptomische Marker für kardiometabolische Traits zu identifizieren, werden zwei Studien mit genom- und transkriptomweiten Daten mit C-JAMP und CIEE analysiert. In den Analysen werden mehrere neue Kandidatenmarker und -gene für Blutdruck und Adipositas identifiziert. Dies unterstreicht den Wert, neue statistische Methoden zu entwickeln, evaluieren, und implementieren. Für beide entwickelten Methoden sind R Pakete verfügbar, die ihre Anwendung in zukünftigen Studien ermöglichen. / In recent years, the biotechnological advancements have allowed to investigate associations of genetic and molecular markers with multiple complex phenotypes in much greater depth. However, for the analysis of such complex datasets, available statistical methods often don’t yield valid inference. The first aim of this thesis is to develop two novel statistical methods for association analyses of genetic markers with multiple phenotypes, to implement them in a computationally efficient and robust manner so that they can be used for large-scale analyses, and evaluate them in comparison to existing statistical approaches under realistic scenarios. The first approach, called the copula-based joint analysis of multiple phenotypes (C-JAMP) method, allows investigating genetic associations with multiple traits in a joint copula model and is evaluated for genetic association analyses of rare genetic variants with quantitative traits. The second approach, called the causal inference using estimating equations (CIEE) method, allows estimating and testing direct genetic effects in directed acyclic graphs, and is evaluated for association analyses of common genetic variants with quantitative and time-to-event traits. The results of extensive simulation studies show that both approaches yield unbiased and efficient parameter estimators and can improve the power of association tests in comparison to existing approaches, which yield invalid inference in many scenarios. For the second goal of this thesis, to identify novel genetic and transcriptomic markers associated with cardiometabolic traits, C-JAMP and CIEE are applied in two large-scale studies including genome- and transcriptome-wide data. In the analyses, several novel candidate markers and genes are identified, which highlights the merit of developing, evaluating, and implementing novel statistical approaches. R packages are available for both methods and enable their application in future studies.

Die Strukturen in Lösung dreier unterschiedlich modifizierter DNA Doppelstränge wurden mittels NMR Spektroskopie gelöst. Sie alle besitzen polare Sonden im Zentrum der Helix, welche sensitiv für die nähere Umgebung sind. Ihr Schmelzverhalten wurde mit Hilfe einer neuen Methode charakterisiert, welche komplette Absorptionsspektren in Kombination mit Singularwertzerlegung (SVD) nutzt. Letztere erlaubt die Analyse der Spektren als Ganzes, die notwendig ist um der Blauverschiebung des Sondensignals zu folgen, welche durch die zuvor genannte Sensitivität zur Umgebung verursacht wird. Auf diese Weise kann der Schmelzprozess des Duplex lokal und global beschrieben werden. Die erste Modifikation, 2-Hydroxy-7-Carboxyfluoren (HCF), wurde gegenüber einer abasischen Seite platziert, um sterische Spannungen zu vermeiden. Die NMR Spektroskopie deckte zwei gleichverteilte Konformationen auf, da die Rotation des HCF Chromophors nur durch die Stapelwechselwirkung innerhalb der Helix unterbunden wird. Der zweite Doppelstrang enthält ein über R-Glycerol gebundenes 6-Hydroxychinolinium (6HQ) gegenüber Cytosin. Der Einbau von 6HQ als Mononukleotid einer Glykolnukleinsäure (GNA) ist ein strukturelles Alleinstellungsmerkmal. Bisher sind nur Kristallstrukturen von vollständiger GNA bekannt, daher ist die Struktur in Lösung dieses Doppelstranges von generellem Interesse. Die geringe Größe von R-Glycerol stört das Rückgrat des 6HQ-Stranges, welche eine von der helikalen Achse abweichende Stapelachse für die drei zentralen Basen verursacht. Die letzte Modifikation ist ein künstliches Basenpaar bestehend aus 4-Aminophthalimid (4AP) und 2,4-Diaminopyrimidin (DAP). Anstatt der gewünschten drei Wasserstoffbrücken wurden zwei Strukturen, die entweder eine oder zwei Wasserstoffbrücken beinhalten, beobachtet, welche durch die Verbindung von 4AP zur 2’-Deoxyribofuranose erklärt werden können. / The solution structures of three differently modified DNA double strands were solved by NMR spectroscopy. They all incorporate polarity probes in the center of the helix that are sensitive to the immediate environment. Their melting behavior was characterized by a new method that utilizes complete absorption spectra in combination with Singular Value Decomposition (SVD). The latter allows to analyze the spectra in their entirety, which is required to follow the blue shift of the probe signal that is caused by the aforementioned sensitivity to the environment. In this way the duplex melting process is characterized in local and global terms.The first modification, 2-hydroxy-7-carboxyfluorene (HCF), is placed opposite an abasic site to avoid steric strain. NMR spectroscopy revealed two equally distributed conformations, since rotation of the HCF chromophore is only hindered by stacking interactions inside the helix. The second double strand comprises R-glycerol linked 6-hydroxyquinolinium (6HQ) opposite cytosine. The incorporation of 6HQ as glycol nucleic acid (GNA) mononucleotide is a unique structural feature. Until now, only crystal structures of full GNA backbone duplexes are known, so the solution structure of this double strand is of general interest. The small size of R-glycerol disturbs the backbone of the 6HQ strand, which causes a stacking axis that differs from the helical long axis for the three central bases. The last modification is an artificial base pair made of 4-aminophthalimide (4AP) and 2,4-diaminopyrimidine (DAP). Instead of the desired three hydrogen bonds, two structures containing either a single or two hydrogen bonds are observed that can be explained by the linkage of 4AP to 2’-deoxyribofuranose.

Information spielt in der Natur eine zentrale Rolle. Als intrinsischer Teil des genetischen Codes ist sie das Grundgerüst jeder Struktur und ihrer Entwicklung. Im Speziellen dient sie auch Organismen, ihre Umgebung wahrzunehmen und sich daran anzupassen. Die Grundvoraussetzung dafür ist, dass sie Information ihrer Umgebung sowohl messen als auch interpretieren können, wozu Zellen komplexe Signaltransduktionswege entwickelt haben. In dieser Arbeit konzentrieren wir uns auf Signalprozesse in S.cerevisiae die von osmotischem Stress (High Osmolarity Glycerol (HOG) Signalweg) und der Stimulation mit α-Faktor (Pheromon Signalweg) angesprochen werden. Wir wenden stochastische Modelle an, die das intrinsische Rauschen biologischer Prozesse darstellen können, um verstehen zu können wie Signalwege die ihnen zur Verfügung stehende Information umsetzen. Informationsübertragung wird dabei mit einem Ansatz aus Shannons Informationstheorie gemessen, indem wir sie als einen Kanal in diesem Sinne auffassen. Wir verwenden das Maß der Kanalkapazität, um die Genauigkeit des Phosphorelays einschränken zu können. In diesem Modell, simuliert mit dem Gillespie Algorithmus, können wir durch die Analyse des Signalverhaltens den Parameterraum zusätzlich stark einschränken. Eine weitere Herangehensweise der Signalverarbeitung beschäftigt sich mit dem “Crosstalk” zwischen HOG und Pheromon Signalweg. Wir zeigen, dass die Kontrolle der Signalspezifizität vor allem bei Scaffold-Proteinen liegt, die Komponenten der Signalkaskade binden. Diese konservierten Motive zellulärer Signaltransduktion besitzen eine geeignete Struktur, um Information getreu übertragen zu können. Im letzten Teil der Arbeit untersuchen wir potentielle Gründe für die evolutionäre Selektion von Scaffolds. Wir zeigen, dass ihnen bereits durch die Struktur des Mechanismus möglich ist, Informationsgenauigkeit zu verbessern und einer verteilten Informationsweiterleitung sowohl dadurch als auch durch ihre Robustheit überlegen sind. / Information plays a ubiquitous role in nature. It provides the basis for structure and development, as it is inherent part of the genetic code. It also enables organisms to make sense of their environments and react accordingly. For this, a cellular interpretation of information is needed. Cells have developed sophisticated signaling mechanisms to fulfill this task and integrate many different external cues with their help. Here we focus on signaling that senses osmotic stress (High Osmolarity Glycerol (HOG) pathway) as well as α-factor stimulation (pheromone pathway) in S.cerevisiae. We employ stochastic modeling to simulates the inherent noisy nature of biological processes to assess how systems process the information they receive. This information transmission is evaluated with an information theoretic approach by interpreting signal transduction as a transmission channel in the sense of Shannon. We use channel capacity to both constrain as well as quantify the fidelity in the phosphorelay system of the HOG pathway. In this model, simulated with the Gillespie Algorithm, the analysis of signaling behavior allows us to constrain the possible parameter sets for the system severely. A further approach to signal processing is concerned with the mechanisms that conduct crosstalk between the HOG and the pheromone pathway. We find that the control for signal specificity lies especially with the scaffold proteins that tether signaling components and facilitate signaling by trans-location to the membrane and shielding against miss-activation. As conserved motifs of cellular signal transmission, these scaffold proteins show a particularly well suited structure for accurate information transmission. In the last part of this thesis, we examine the potential reasons for an evolutionary selection of the scaffolding structure. We show that due to its structure, scaffolds are increasing information transmission fidelity and outperform a distributed signal in this regard.

Die Reprogrammierung somatischer Zellen hat sich kürlich als leistungsfähige Technik für die Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS Zellen) aus terminal differenzierten Zellen bewährt. Trotz der großen Hoffnung, die sie speziell im Bezug auf patientenspezifische Stammzelltherapie darstellt, gibt es viele Hindernisse auf dem Weg zur Anwendung in der Humanmedizin, die sich von niedrigen Effizienzen bei der technischen Umsetzung bis hin zur unerwünschten Integration von Onkogenen in das menschliche Genom erstrecken. Aus diesem Grund ist es unabdingbar, unser Verständnis der zugrundeliegenden Prozesse und Mechanismen zu vertiefen. Durch neue Datengewinnungsmethoden und stetig wachsende biologische Komplexität hat sich der Denkansatz der Systembiologie in den letzten Jahrzehnten stark etabliert und erfährt eine fortwährende Entwicklung seiner Anwendbarkeit auf komplexe biologische und biochemische Zusammenhänge. Verschiedene mathematische Modellierungsmethoden werden auf den Reprogrammierungsprozess angewendet um Engpässe und mögliche Effizienz-Optimierungen zu erforschen. Es werden topologische Merkmale eines Pluripotenznetzwerkes untersucht, um Unterschiede zu zufällig generierten Netzen und so topologische Einschränkungen des biologisch relevanten Netzwerkes zu finden. Die Optimierung eines Booleschen Modells aus einem selbst kuratierten Netzwerk in Bezug auf Genexpressionsdaten aus Reprogrammierungsexperimenten gewährt tiefgreifende Einblicke in die ersten Schritte und wichtigsten Faktoren des Prozesses. Der Transkriptionsfaktor SP1 spielt hierbei eine wichtige Rolle zur Induktion eines intermediären, transkriptionell inaktiven Zustands. Ein probabilistisches Boole''sches Modell verdeutlicht das Zusammenspiel epigenetischer und transkriptioneller Kontrollprozesse zusammen, um Pluripotenz- und Zelllinien-Entscheidungen in Reprogrammierung und Differenzierung zu treffen. Erklärungen für die geringe Effizienz werden versucht. / Somatic Cell Reprogramming has emerged as a powerful technique for the generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from terminally differentiated cells in recent years. Although holding great promises for future clinical development, especially in patient specific stem cell therapy, the barriers on the way to a human application are manifold ranging from low technical efficiencies to undesirable integration of oncogenes into the genome. It is thus indispensable to further our understanding of the underlying processes involved in this technique. With the advent of new data acquisition technologies and an ever-growing complexity of biological knowledge, the Systems Biology approach has seen an evolution of its applicability to the elaborate questions and problems of researchers. Using different mathematical modeling approaches the process of somatic cell reprogramming is examined to find out bottlenecks and possible enhancements of its efficiency. I analyze the topological characteristics of a pluripotency network in order to find differences to randomly generated networks and thus deduce constraints of the biologically relevant network. The optimization of a Boolean model from a curated network against early reprogramming gene expression profiles reveals profound insights into the first steps and most important factors of the process. The transcription factor SP1 emerges to play an important role in the induction of an intermediate, transcriptionally inactive state. A probabilistic Boolean network (PBN) illustrates the interplay of transcriptional and epigenetic regulatory processes in order to explain pluripotency and cell lineage decisions in reprogramming and differentiation. Explanations for the low reprogramming efficiencies are tried.

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